Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat. Patomorfologické vyšetření psích ejakulátů Diplomová práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Patomorfologické vyšetření psích ejakulátů Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Radek Filipčík, Ph.D. Vypracovala: Jana Klementová Brno 2011

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci na téma Patomorfologické vyšetření psích ejakulátů vypracovala samostatně a pouţila jen parametrů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta.

3

4 Poděkování Chtěla bych poděkovat především Ing. Radku Filipčíkovi, Ph.D. za ukázkové vedení práce, dále pak Ing. Marii Vágenknechtové na pomoc při analýze vzorků a poskytnutí dalších potřebných rad a v neposlední řadě i paní Heleně Divinové za pomoc při práci v laboratoři. Diplomová práce byla vytvořena s podporou Interní grantové agentury AF MENDELU TP2/2010.

5 ABSTRAKT Podstatou této diplomové práce bylo vyhodnotit vliv plemenné příslušnosti psa, věkové kategorie a frekvence odběru psů na výskyt patomorfologických vad ve stavbě psích spermií. Celkem bylo zkoumáno osm různých plemen. Psi byli rozděleni dle plemen, dále do dvou věkových skupin a taktéţ do dvou skupin podle různých intervalů odběru. Z patomorfologických vad jsme se zaměřili na hodnocení mnoţství morfologicky normálních spermií, defektů na hlavičce spermie, změn na spojovací části bičíku, změn na bičíku samotném, na počet nezralých spermií, na počet degenerovaných spermií a také na celkovou patologii spermií. Psi byli odebíráni v letech 2009 a Ze vzorků kaţdého psa byly vyhotoveny tři nátěry a z kaţdého nátěru bylo spočítáno 200 spermií. Při srovnání mezi plemeny jasně vyplynulo, ţe nejlepších hodnot dosahovali psi plemene Australský ovčácký pes, kteří měli nejvyšší počet morfologicky normálních spermií (80,3 %) a nejmenší hodnoty celkové patologie spermií (19,7 %). Přesně opačných hodnot dosahovali psi plemene Německý ohař, kteří měli morfologicky normální spermie na hodnotě 19,7 % a celkovou patologii spermií na 80,3 %. Dále jsme prokázali, ţe mladší věková kategorie psů v rozpětí měsíců věku měla větší hodnoty morfologicky normálních spermií a menší celkovou patologii spermií. Psi rozdělí do skupiny dle intervalu odběru v 1., 5. a 9. den dosahovali většího počtu morfologicky normálních spermií neţ psi odebíraní v intervalu 1., 2. a 3. den. Klíčová slova: pes, hodnocení ejakulátu, morfologické změny. ABSTRACT The essence of this thesis was to evaluate dog s pedigree, age category and sapmling interval. We evaluated number of morphologically normal sperm, head s defects, defects in the coupling of the flagellum, defects in the flagellum itself, number of immature sperm, number of degenerated sperm and total pathology. Dogs were collected in 2009 and We conducted three preparations from each dog. In each preparation 200 sperm were evaluated.. Australian sheepdog was the best in breed and he had the highest number of morphologically normal sperm (80,3 %) and the lowest

6 number of total pathology. The German pointer had the lowest number of morphologiccaly normal sperm and the highest number of total pathology. We have demonstrated that the younger age category (18 30 months) had a higher number of morphologically normal sperm and a lower number of total pathogy. Dogs in group of interval collection 1., 5. and 9. day had a higher number of morphologically normal sperm then dogs in group of interval collection 1.,2. and 3. day. Keywords: dog, semen evaluation, morphological defects.

7 OBSAH 1 ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED Odběr semene od psa Frekvence získávání ejakulátu u psa Ejakulát a pohlavní orgány Vlastnosti ejakulátu Spermie Význam Spermatogeneze Morfologická analýza Výskyt morfologicky změněných spermií Klasifikace morfologických malformací spermií Faktory působící na výskyt patomorfologicky změněných spermií CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODIKA Zhotovení nátěru Metody barvení VÝSLEDKY A DISKUZE ZÁVĚR POUŢITÁ LITERATURA... 57

8 1 ÚVOD Umělá inseminace zvířat je velmi účinný a cílevědomý rozmnoţovací postup, který spočívá na vědeckých poznatcích biologie a fyziologie reprodukce. V současnosti se umělá inseminace pouţívá téměř u všech hlavních druhů hospodářských zvířat (krávy, ovce, kozy, kobyly, prasnice, feny, koţešinová zvířata, včely, ryby). Umělá inseminace má také značný význam pro výzkum fyziologie a patologie reprodukce. Zavedením umělé inseminace se získaly nejen nové poznatky o spermiogenezi, vyšetřovacích metodách semene, ale i o dalších vlivech na plodnost, jako například i o čase vhodném na připuštění, o počtu spermií potřebných v inseminační dávce, o vitalitě spermií a vývinu oplodněného vajíčka a o dalších otázkách z oblasti fyziologie a patologie reprodukce. Perspektivně se počítá s plným vyuţitím hluboko zmrazeného semene, které umoţní, aby se v následujících letech při umělé inseminaci pouţívalo pouze sperma prověřených samců. Rozvoj mikroskopické techniky umoţnil dále prohlubovat studium morfologických vlastností spermií a blíţe poznat jejich strukturu. Většina základních poznatků o tvaru a struktuře spermií různých druhů samců pochází z prací na sklonku 19. a začátku 20. století. Významnou úlohu ve studiu morfologie sehrál elektronový mikroskop, prostřednictvím kterého se dospělo k poznání ultrastruktury spermie, čímţ se dořešila nejen funkce spermie jako celku, ale i jejích jednotlivých částí (Gamčík, Kozumplík, 1976). 8

9 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Odběr semene od psa Vyvolání reflexu erekce a ejakulace u psa je relativně snadné, kdyţ v blízkosti psa jako stimulátor působí hárající fena. Ejakulát psa je moţno získat třemi způsoby: masturbací pyje, pomocí umělé pochvy a pomocí elektroejakulace. Odběr semene masáţí pyje (masturbace) je způsob poměrně spolehlivý a nenáročný na vybavení, protoţe mimo sběrače semene nevyţaduje ţádné další pomůcky. Jako sběrače semene je moţno pouţít širší skleněné nádobky. Odběr semene pomocí umělé pochvy umělá pochva je zaloţena na stejném principu jako pochva pro býka, pouze délka kolísá od 15 do 20 cm a někdy se doporučuje i pouţití pulsátoru. Teplota umělé pochvy kolísá mezi C a tlak se přizpůsobuje velikosti pyje psa. Sběrač semene má být chráněn před chladem prostředí. Semeno se odebírá tak, ţe po vzeskoku psa na hárající fenu se pyj zavede do umělé pochvy, drţené po pravé straně feny. Je-li fena agresivní, zůstane pes za fenou, aby byl její přítomností stimulován, provede se masáţ penisu a po vyvolání reflexu erekce se zavede pyj do umělé pochvy. Pochvou se v případě nutnosti, není li pulsátor, jemně pohybuje. Těsně před ejakulací dochází u psa k intenzivní erekci, vyklenutí beder a koitálním pohybům. Odběr semene stimulací elektrickým proudem se doporučuje u psa jen výjimečně. Při tomto způsobu se postupuje v principu stejně jako u beranů. Pes však při elektroejakulaci musí být omámen, coţ komplikuje vlastní zákrok Frekvence získávání ejakulátu u psa Při dlouhodobém plánu odběru semene je vhodný jeden odběr za 48 hodin. V případě nutnosti je moţno získávat semeno denně po 3 dny za sebou, potom má následovat nejméně dvoudenní odpočinek. Je-li nutno odebrat ejakulát dvakrát denně, má následovat dvoudenní přestávka. Po déletrvající pohlavní abstinenci dochází 9

10 k sekundárním změnám na spermiích uloţených v nadvarlatech, coţ se upraví opakovaným odběrem ejakulátu (Louda, 1984). 2.2 Ejakulát a pohlavní orgány Samčí pohlavní orgány jsou tvořeny pohlavními ţlázami (varlata), vývodnými cestami (nadvarlata, chámovody), přídatnými pohlavními ţlázami (u psa pouze prostata) a kopulačním orgánem (pyj). Šourek umoţňuje vytvoření příznivého teplotního prostředí pro vývoj spermií u savců. Varlata se vyvíjejí na stropě břišní dutiny savce a před nebo po narození sestupují do šourku. Sestup varlat je řízen hormonálně, odpovědný je luteinizační hormon. Nesestoupení varlat do šourku označujeme jako kryptorchismus. U psa je šourek v mezistehenní krajině. Je slabě ochlupen krátkými chlupy. Kůţe je tenká a temně pigmentovaná. Sekretem hojných mazových ţláz se leskne. Varle je místem produkce spermií a tvorby samčího pohlavního hormonu testosteronu. Vazivový obal varlete tvoří přepáţky, oddělující lalůčky varlete, ve kterých se nacházejí stočené semenotvorné kanálky varlete, v nichţ probíhají jednotlivé fáze spermatogeneze. U psa je varle téměř kulovitého tvaru, parenchym je na řezu šedé barvy. V šourku je varle uloţeno mírně šikmo, hlavový konec směřuje kraniálně a poněkud ventrálně, ocasní konec kaudodorsálně. U štěňat ještě po porodu jsou varlata v břišní dutině a jsou poměrně malá. Po porodu ve stáří 4 5 týdnů začínají varlata postupně sestupovat tříselným kanálem do šourku. Sestup zpravidla končí v týdnu, a tříselný kanál se zuţuje v úzkou štěrbinu. Nadvarle je orgánem, ve kterém se shromaţďují spermie a funkčně zde dozrávají. Vývodné kanálky varlete se postupně spojují v jednotný, klikatě probíhající vývod. Rozvinutý nadvarletní vývod měří u psa 5 8 m. Chámovod vystupuje z ocasu nadvarlete a dostává se tříselným kanálem po stěně dutiny břišní do dutiny pánevní aţ na dorzální plochu močového měchýře. U samců bez ampul 10

11 chámovodů se spermie dostávají do močové roury při ejakulaci z ocasu nadvarlete kontrakčními vlnami celého chámovodu. Předstojná ţláza, prostata, je tubuloalveolární ţláza, která leţí na krčku močového měchýře a začátku močové trubice, do níţ vyúsťuje četnými vývody. Strukturálně a velikostně se opět druhově značně liší. Největší je u hřebce a psa. Sekret prostaty je vylučován při ejakulaci těsně před spermiemi a současně s nimi. Hodnota ph je rovněţ druhově odlišná. Obsahuje volné aminokyseliny, ne však cukry a relativně vysoký je obsah anorganických solí, které udrţují stejný osmotický tlak v ejakulátu. Prostata psa je diferencována v corpus prostatae a pars disseminata prostatae. Corpus prostatae je kuţelovitého tvaru a svými laloky zcela obdává počáteční úsek pánevní části močové trubice. Ţláza je tuhé konzistence a podle plemene a stáří jedince různě velká, od velikosti lískového ořechu aţ po velikost kaštanu a digitální palpací z rekta je přístupná. Pars disseminata prostatae je zastoupena nečetnými ţlázovými lalůčky ve stěně pánevní části močové trubice. Pyj je kopulačním orgánem, který umoţňuje deponovat semeno do pohlavního ústrojí samice při kopulaci a je současně i odvodnou cestou moči mimo tělo. U psa je přední část pyje vyztuţena pyjovou kostí. Kaudálněji uloţený uzel ţaludu při kopulaci mohutně zduří a způsobuje takzvané svázání. Ţalud pyje, respektive konečná část pyje je intenzivně inervována a v jeho sliznici jsou početná senzitivní tělíska. Pomocné svaly pyje, které spojují kořen penisu s pánví a ocasními obratli, umoţní uvedení pyje do polohy vhodné pro páření napřimovač pyje a po kopulaci zataţení pyje do předkoţky zatahovač pyje (Gamčík, Kozumplík, 1976). Semeno sperma, chám čili ejakulát je tekutina, která se skládá z buněčné části, tj. spermií, a z tekuté části čili semenné plazmy (Marvan et al., 1998). Dle Komárka et al. (1971) je tato tekutina druhově specifická podle barvy, konzistence a pachu, jejíţ mnoţství vyloučené při jednom vysemenění je podle druhové příslušnosti různé. 11

12 Tab. 1: Přehled hodnot u ejakulátu různých druhů zvířat Celkové Druh zvířete Objem ejakulátu (ml) mnoţství spermií v ejakulátu Koncentrace spermií (10 3. mm -3 ) Vzhled ejakulátu v miliardách Býk Kanec tis Hřebec tis Beran Bělavě naţloutlá smetanovitá tekutina, páchne po čerstvě nadojeném mléku Řídká, mléčně vodnatá tekutina, páchne po moči Bělavě opaleskující hlenovitá tekutina Smetanovitá tekutina Komárek et. al, 1971 Reakce ejakulátu kolísá od mírně kyselé aţ po mírně zásaditou, ph 6,2 6,7. Největší jeho podíl tvoří voda, která představuje % celkové váhy. Organické látky v mnoţství 1,2 8,7 % jsou v ejakulátu zastoupeny bílkovinami (1,25 2,85 %), cukry (0,02 1 %) a lipoidy (0,18 0,2 %). Z bílkovin jsou to hlavně albuminy a globuliny, nukleoproteidy, albumózy a mucin. Z cukrů pak fruktóza. Anorganické látky jsou 12

13 v ejakulátu zastoupeny v podobě sloučenin vápníku, fosforu, sodíku a draslíku, chlóru, síry a dalších Vlastnosti ejakulátu Fyzikální a chemické sloţení ejakulátu, jeho mnoţství, koncentrace spermií a jejich ţivotnost jsou závislé na mnoha činitelích, jako je stav výţivy, stáří, ustájení, pohyb, pohlavní vyuţívání samce a jiné (Komárek et al., 1964). Objem ejakulátu je typický pro daný druh zvířat a jeho velikost kolísá vţdy v určitých hranicích. Velikost objemu a koncentrace semene jsou podmíněny více geneticky neţ prostředím, je-li odběr ejakulátu prováděn v patřičných intervalech (Bane et al., 1966). Viskozita a měrná hmotnost spermatu záleţí z největší části na koncentraci spermií. U zvířat, kde ejakulát má charakter ţelatinózní, vykazuje vysokou viskozitu i semenná plazma. Měrná hmotnost spermií je dána sloţkami kondenzovaných nukleárních a protoplazmatických proteinů, měrná hmotnost semenné plazmy je pak přímým výsledkem skutečného osmotického tlaku, který působí elektrolyty a je tedy ve vztahu ke sníţení bodu mrazu. Osmotický tlak spermatu je určován nejčastěji hodnotami deprese, tj. sníţením bodu mrazu, nebo je osmotický tlak prostředí, ve kterém se spermie nacházejí. Osmotický tlak prostředí musí odpovídat osmotickému tlaku spermií. Semenná plazma tvoří pro spermie přirozené, izotonické prostředí. ph semena je obecně blízká neutrální hranici (Gamčík, Kozumplík et al., 1976). 13

14 2.3 Spermie Význam Spermie tvoří nejdůleţitější sloţku ejakulátu. Jejich velikost a tvar jsou druhově rozdílné a společným hlavním znakem je pohyblivost a schopnost oplození. Jsou µm dlouhé. Se zřetelem na přítomnost sexchromozomu jsou mezi nimi nepatrné hmotnostní rozdíly. Spermie s malým heterochromozomem Y (androspermie) jsou lehčí neţ spermie s větším hetefochromozomem X (gynospermie). Hlavička spermie je 5 10 µm dlouhá a její utváření u jednotlivých druhů je rozdílné. Je ze stran oploštělá, oválného tvaru a její přední část je kryta čepičkou, která je dobře barvitelná akrozom. Pokrývá přední část hlavičky spermie. Akrozom je sloţen z mukopolysacharidů a obsahuje četné enzymy uplatňující se při pronikání spermie do vajíčka a jeho oplození. Hlavičku spermie tvoří především jádro s kondenzovaným chromatinem a obsahujícím deoxyribonukleovou kyselinu nesoucí genetické informace pro vlastnosti nového jedince. Bičík spermie je µm dlouhý a představuje pohybové ústrojí spermie. Bičík je spojen s hlavičkou krčkem, respektive centriolovou částí. Bičík spermie je tvořen spojovacím oddílem, hlavním oddílem a koncovým, terminálním oddílem. Krček spermie je krátký, 2 3 µm, a spojuje hlavičku s bičíkem spermie. Obsahuje dva za sebou uloţené centrioly. Distální centriol je obklopen devíti příčně segmentovanými provazci neboli chordami. Z distálního centriolu pak vystupuje osové vlákno tvořené duplety mikrotubulů. Spojovací, mitochondriální oddíl bičíku navazuje na centriol. Je charakterizován přítomností značného počtu mitochondrií. Hlavní oddíl bičíku je nejdelší, µm a jeho podkladem podobně jako v předcházejícím mitochondriálním oddílu je osové vlákno, obklopené nesegmentovanými chordami a obalené fibrózní pochvou z homogenní a silně kontrastní hmoty. Jejím úkolem je zabezpečovat soudruţnost osových vláken, jejich pevnost a pruţnost při kmitání bičíku. Terminální oddíl bičíku měří cca 4 µm a je tvořen pouze osovým vláknem bez chord a fibrózní pochvy. 14

15 Celá spermie je pokryta nepřerušovanou dvouvrstevnou cytoplazmatickou membránou, která představuje základní ochranu spermie. Je acidorezistentní, vysoce permeabilní a citlivá na změny osmotického tlaku. Permeabilita membrány umoţňuje látkovou výměnu spermií. Na základě poznatku, ţe cytoplazmatická membrána u ţivých spermií nepropouští některá barviva (eozin, fluorochromy) a ţe se permeabilita zvýší u mrtvých spermií, byla vypracována metoda vitálně letálního barvení, umoţňující rozlišovat ţivé a mrtvé spermie. Poškození permeability membrán můţe nastat při dlouhodobé konzervaci spermií a stát se tak příčinou sníţené oplozovací schopnosti spermií. Semenná plazma obsahuje převáţně sekrety přídatných pohlavních ţláz. Je to tekutina druhově specifického mnoţství a barvy, rozdílného ph a konzistence. Představuje přirozené prostředí pro spermie, umoţňuje jejich výţivu a transport v pohlavních orgánech samice. Má relativně stálý osmotický tlak a vyznačuje se velkými pufračními schopnostmi. Obsahuje minerální látky, bílkoviny, cukry, kyselinu citronovou a askorbovou, četné enzymy a kromě dalších látek i biologicky aktivní sloţky jako jsou prostaglandiny, estrogeny a androgeny. Podíl semenné plazmy na celkovém objemu ejakulátu je rozdílný. Stejně tak je i rozdílný podíl sekretu jednotlivých přídatných pohlavních ţláz na celkovém objemu ejakulátu. Uvedené vlastnosti určují, ţe chemická skladba a celkový objem ejakulátu, jakoţ i koncentrace spermií, jsou druhově a individuálně značně rozdílné. Semenná plazma rovněţ stimuluje pohyb spermií (Jelínek, Koudela et al., 2003) Spermatogeneze Sperma je tvořeno spermiemi a semennou plazmou. Spermie se vytvářejí po dosaţení pohlavní dospělosti v semenotvorných kanálcích varlete a celý proces jejich tvorby je označován jako spermatogeneze. Proces spermatogeneze se uskutečňuje v pravidelných cyklech a probíhá kontinuálně v průběhu celého reprodukčního období ţivota. V počáteční etapě nemá spermatogeneze ještě pravidelný cyklický charakter a výsledkem je vyšší obsah 15

16 nezralých forem spermií v ejakulátu. S dosaţením plné pohlavní dospělosti a stabilizací neuroendokrinní regulace pohlavních funkcí probíhá spermatogeneze u většiny hospodářských zvířat v pravidelných cyklech v průběhu celého roku a v podstatě se nedá ani urychlit ani zpomalit. Pravidelné cykly následují za sebou v přesných časových intervalech, přičemţ kaţdý cyklus začíná asi o ¼ délky cyklu později neţ předcházející. Délka jednoho spermatogenního cyklu je druhově rozdílná a u domácích zvířat se pohybuje kolem 50 dní, u psa konkrétně 54 dní. Proces spermatogeneze s přihlédnutím na převaţující charakter změn se dělí na: období rozmnoţování, které je charakterizováno opakovaným mitotickým dělením původních kmenových buněk A spermatogonií (primordiálních gonocytů). Kaţdá mateřská buňka A spermatogonie se rozdělí na dvě nestejně velké dceřinné buňky. Jednu větší a podobnou mateřské buňce, která zůstává po delší dobu v latentním stadiu a druhou, menší intermediární buňku, které se opětovně několikrát dělí a výsledkem jsou buňky typu B (spermatogonie). Dělení B spermatogonií v závěru rozmnoţovací fáze vznikají spermatocyty I. řádu, období růstu navazuje na období mnoţení, kdy spermatocyty I. řádu zvětší svůj objem, období zrání, meiozy, je charakterizováno dvěma po sobě následujícími děleními a výsledkem je redukce počtu chromozomů na polovinu diploidní se mění na haploidní a rekombinace genetických vloh. Vstupují do ní spermatocyty I. řádu a v prvním meiotickém dělení vznikají dva spermatocyty II. řádu. Druhým meiotickým dělením vznikají čtyři spermatidy. Jsou charakterizovány přítomností vţdy jednoho sexchromozomu X chromozom nebo Y chromozom, poměr spermatid se zřetelem na sexchromozomy je 50:50. Během spermatogeneze se jednotlivá stadia posunují k lumen semenotvorného kanálku, takţe na příčném řezu lze zaznamenat několik buněčných generací za sebou. Vzhledem k časovému rozdílu začátku jednotlivých cyklů (asi o čtvrtinu délky celého cyklu) se nacházejí v semenotvorném kanálku čtyři buněčné generace za sebou. Vzhledem 16

17 k časovému rozdílu začátku jednotlivých cyklů (asi o čtvrtinu délky celého cyklu) se nacházejí v semenotvorném kanálku čtyři buněčné generace nad sebou. Období metamorfózy je poslední fází spermatogeneze, při níţ se okrouhlá a nepohyblivá spermatida mění ve štíhlou, kopinatou a pohyblivou spermii. Probíhá ve výběţcích podpůrných buněk a dílčí stadia metamorfózy jsou označována jako Golgiho stadium, stadium akrozomové čepičky, stadium kaudální manţety a stadium zrání. V podstatě dochází ke sledu následujících hlavních změn. Jádro spermatidy se prodlouţí, oploští a posune k apikálnímu pólu buňky, formuje se hlavička spermie. Na předním pólu jádra se sloţitým procesem vytváří z Golgiho aparátu akrozom (čepička), který je nositelem specifickým enzymů (hyaluronidáza, akrozin, proakrozin, kyselá fosfatáza, proteináza a jiné), rozpouštějících zónu peloidu a cytoplazmatický obal vajíčka a tak umoţňujících penetraci spermie do vajíčka a oplození. Oba buněčné centroidy se přesouvají k zadnímu pólu hlavičky a dávají vznik krčku a osovému vláknu bičíku spermie a vytváří se tak pohybový aparát spermie. Metamorfozované spermie se uvolňují z výběţků podpůrných buněk a dostávají se do lumen semenotvorných kanálků a do vývodných cest. Postup spermií do ocasu nadvarlete trvá v průměru 12 dní. Spermie se ukládají v ocasu nadvarlete a jsou nepohyblivé. Spermatogenní výkonnost varlat je druhově odlišná, avšak denní produkce spermií je u všech druhů relativně vysoká. 2.4 Morfologická analýza Při formování budoucího individua má důleţitou úlohu morfologicky správně vyvinutý akrozom s potřebným mnoţstvím enzymů, intaktní nukleoplazmou s dostatečným obsahem deoxyribonukleové kyseliny a správně formovaný bičík s neporušeným mitochondriálním oddílem. Morfologicky abnormální spermie mohou ovlivnit plodnost vytvořením defektní zygoty, blokováním fertilizace normálních spermií, případně omezením pohybu spermií. Základním předpokladem na získání objektivních výsledků při morfologickém 17

18 vyšetření spermií je správná příprava nátěru vyšetřovaného ejakulátu. Nátěr má být jemný, souvislý a nepoškozený. Při zhotovování nátěru je téţ důleţité, aby sklíčka byla správně připravená a dokonale čistá. Při nesprávném postupu přípravy nátěru mohou nastat změny, které by se mohly pokládat za morfologické malformace spermií. Jde o změny na hlavičce spermie. Preparáty pro potřeby morfologického vyšetření mají být zhotovené do 30 minut po odběru ejakulátu, protoţe stárnutí semene, bez pouţití konzervačních prostředků, zapříčiňuje změnu hodnot ph. Postupné odumírání některých spermií zapříčiňuje jejich morfologické změny. 2.5 Výskyt morfologicky změněných spermií Při vzniku defektních spermií se uplatňuje vliv mnohých činitelů toxicko-infekčního, fyzikálně-chemického, alimentárního a genetického původu. V závislosti od intenzity mechanismu a místa jejich účinku můţe nastat úplná porucha v produkci spermií s následnou aspermií nebo oligospermií, případně zvýšené tvoření defektních spermií. Změny můţeme rozdělit na primární a sekundární. Primární změny vznikají během spermiogenetického cyklu aţ po příchod spermií do ocasu nadvarlete. Mezi primární změny se zařazují degenerativní formy spermií, změny tvaru hlavičky, změny v nukleoplazmě spermií, změny na akrozomu, tvarové změny na mitochondriálním oddíle bičíku spermií, vývojové anomálie spermií, a podobně. Sekundární změny vznikají při delším pobytu spermií v ocasu nadvarlete. Sem zařazujeme změny, které vznikají od ejakulačního reflexu aţ po posouzení semene a změny způsobené nesprávným zhotovením preparátu. Sekundární změny jsou projevem kvalitativních změn v semenné plazmě. Jejich mnoţství závisí na správnosti dodrţování techniky přípravy preparátu, teploty prostředí (šok z chladu). Vývojové a tvarové anomálie degenerativního charakteru se vyskytují jen v ojedinělých případech, většinou jako odpad při produkci spermií, jejichţ procento se zvyšuje při poruchách v semenotvorném epitelu. Do této skupiny malformací se zařazují spermie, které se svým tvarem zřetelně liší od normálně formovaných spermií, např. buněčné 18

19 útvary s nedostatečně diferencovanou hlavičkou, spojovací částí a bičíkem. Dále sem patří tzv. spermie diploidní (dvojité, trojité hlavičky a bičíky) s intenzivním zbarvením některé části hlavičky. Výskyt takovýchto anomálií ve vyšším procentu vzbuzuje podezření na genetickou etiologii Klasifikace morfologických malformací spermií Teratoidní spermie Tento druh malformací zahrnuje spermie, které nemají vyvinutý typický tvar hlavičky, hlavička se abnormálně silně barví, tvarově je asymetrická, abnormálně malá a spermie s více hlavičkami. Rovněţ sem patří spermie, které mají atypický tvar bičíku a výrazně tmavou vnitřní strukturu, stejně jako spermie s více bičíky. Teratoidní spermie se objevují jako odpad, který vzniká při produkci spermií při metamorfóze spermatidy na spermii. Pokud se vyskytne více neţ 5% teratoidních forem spermií spolu s dalšími primárními změnami, jde o váţnější poruchu spermiogeneze. Morfologické abnormality na hlavičce spermie Mohou se projevit ve tvaru a uspořádání akrozomálního systému, ve tvaru a velikosti hlavičky a ve formě její báze. Na nerovnoměrné rozdělení deoxyribonukleové kyseliny poukazuje malá a obrovská hlavička. Při některých virusových pohlavních infekcí můţeme pozorovat vyšší procento malformací hlaviček spermií, například zúţené, hruškovité, oválné, citrónovité hlavičky. Hruškovité hlavičky se obyčejně vyskytují při chlamydióze. 19

20 akrozomu Vnější cytoplazmatická membrána a akrozomální systém jsou velmi citlivé na osmotické změny vnějšího prostředí. Vyšší počet malformací způsobuje proces hlubokého zmrazování, přičemţ počáteční změny na vnější cytoplazmatické membráně a na akrozomu je moţné zjistit jen elektronovým mikroskopem. Mezi nejfrekventovanější změny spermií patří různé anomálie na akrozomu. Nejčastěji jde o svlečený akrozom, rozličný stupeň bobtnání akrozomu, vlnovité zřasení akrozomu a vakuoly. Nabobtnalý akrozom vzniká jako patologický projev buď při porušené propustnosti protoplazmatického obalu akrozomu, nebo při inadekvátní spermální plazmě. Při prasknutí nabobtnalého akrozomu se akrozomální obsah vylije. U svlečeného akrozomu je hlavička v přední části zúţená a rovnoměrně zabarvená. Tato malformace se vyskytuje sekundárně při stárnutí spermií v ocasu nadvarlete a při změnách v kvalitě sekretů přídatných pohlavních ţláz. Někdy zůstává jako zbytek spermií po svlečeném akrozomu půlměsíčitý útvar, označený jako perzistence ekvatoriálního segmentu. Na akrozomu se vyskytují ještě další malformace související s nerovnoměrným rozdělením akrozomální hmoty. Kondenzace akrozomové hmoty k přednímu okraji hlavičky vzniká nahromaděním akrozomové hmoty, ve formě tmavě zabarveného pásu. Projevuje se to i seskupením do tmavých granul, které kontrastují s plošnými světle zabarvenými částmi nebo normálním zabarvením některých úseků akrozomu, mezi kterými jsou vidět světlé útvary. Při těchto změnách nabývá akrozom mapovitého nebo mramorovitého vzhledu. Většina těchto anomálií vzniká při virových infekcích. V takovýchto případech je spermiologický obraz velmi variabilní. Změny ve vnitřní struktuře nukleoplasmy Malformace zadní části nukleoplasmy se nejčastěji vyskytují v podobě nerovnoměrného zabarvení a nerovnoměrného rozdělení jaderné hmoty. Patří sem spermie, které se tvarem odlišují od normálně formovaných spermií, například buňkové útvary s nedostatečně diferencovanou hlavičkou. Na diagnostiku těchto změn je nejvhodnější elektronový mikroskop. 20

21 Do skupin změn ve vnitřní struktuře nukleoplasmy patří i spermie s granulovanou nukleoplasmou, pravé vakuoly a mikrovakuoly. Granulovaná nukleoplasma, granulární struktura chromatinu je porucha diferenciace nukleoplasmy na začátku fáze kaudální manţety. Vakuoly patří mezi primární změny nukleoplasmy a ve světelném mikroskopu jsou ostře ohraničené a bezbarvé. Nejčastěji se nacházejí na apikálním okraji nukleoplasmy. Je moţné je pozorovat uţ při formování hlavičky v třetí fázi metamorfózy spermie. Vyšší výskyt vakuol nebo větší vakuoly v hlavičkách spermií provází další tvarové a cytochemické změny. Kromě vakuol viditelných světelným mikroskopem se vyskytují mikrovakuoly, které je moţné zjistit jen pod elektronovým mikroskopem. Jejich uloţení je náhodné, nejčastěji je můţeme vidět na bázi hlavičky. Na bázi hlavičky se mohou vyskytovat odchylky jako plošná, hluboko vtáhnutá hlavička, široká hlavička, úzká báze a abaxiální nasazení bičíku. Tyto malformace vznikají buď při konečné fázi spermiogeneze, nebo při nepravidelném nahromadění chromatinu. Morfologické abnormality na bičíku spermie Do komplexu změn můţeme zahrnout různé degenerativní změny na jednotlivých částech bičíku spermií. Tyto změny se hodnotí jako váţný diagnostický defekt. Nejčastější malformací na mitochondriálním oddíle bičíku je jeho zkrácení, prodlouţení, zhrubnutí, zúţení a přerušení. Normálně vyvinuté spermie mají poměr délky hlavičky k délce mitochondriálního oddílu 1 : 1,5. Anomálie, při kterých se oddělí hlavičky od bičíků, se nazývají dezintegrace spermií. Malformaci mitochondriálního oddílu můţeme najít i ve formě přerušení některého jeho úseku, jako holé osové vlákno, nebo jako nitkovité vyvinutí mitochondriální spirály. Všechny tyto anomálie narušují pohybovou aktivitu spermií a podle procenta jejich výskytu vyvolávají i fertilizační poruchy. Tyto defekty jsou většinou dědičné. Na mitochondriálním oddílu se můţe vyskytnout anomálie ve formě lokálního zhrubnutí, často stejné velikosti jako protoplazmatická kapka. Do skupiny tvarových 21

22 změn bičíku patří zdvojený bičík, torze bičíku různého stupně, kličkovitě otočený bičík, nalomený bičík a některé další anomálie. Při zdvojení bičíku bývá mitochondriální systém většinou zachovaný, mitochondrie reagují na endogenní reduktázy. Nezralé spermie Do skupiny těchto malformací patří spermie se zadrţenou protoplazmatickou kapkou, které pochází z vývojového stádia spermiogenetického cyklu. Nezralé spermie mají protoplazmatickou kapku uloţenou proximálně na krčku spermie, s postupným dozráváním se kapka posouvá distálně. Mnoţství protoplazmatických kapek v proximální části můţe ovlivnit fertilitu samce. Existují určité rozdíly podle druhu zvířete. Dalším projevem nezralých spermií je zvýšený výskyt vývojových spermiogenetických forem spermiogonie, spermatocyty I. a II. řádu a spermatidy. Větší mnoţství nezralých a vývojových forem spermií poukazuje na poškození semenotvorného epitelu, nedostatky v exploataci a poruchy v transformaci spermií. Tento nález bývá spojený i s vyšším výskytem primárně malformovaných spermií. V nátěrech se musí hodnotit i příměs jiných buněčných elementů, především přítomnost leukocytů a epitelových buněk z rozmanitých částí pohlavního ústrojí (Gamčík, Kozumplík, 1976). 22

23 Tab. 2: Typy malformací spermií Druh malformace Mladí samci před zařazením do reprodukce (neporušená plodnost) Samci v reprodukci Neporušená plodnost Porušená plodnost Tvarové anomálie hlavičky 3,5 4,7 8,3 Změny vnitřní struktury 1,0 1,7 1,7 nukleoplasmy akrozomu 2,1 3,0 9,5 Změny ve spojovací části 2,1 0,06 0,5 Tvarové anomálie bičíku 1,9 1,14 5,5 Nezralé spermie 0 2,9 6,1 Celkové % malformací 10,6 13,5 31,6 Gamčík, Kozumplík,

24 2.6 Faktory působící na výskyt patomorfologicky změněných spermií Hodnocení psího spermatu Návrh na optimalizaci hodnocení kvality spermatu ve veterinární praxi zahrnuje vytváření standardních protokolů pro hodnocení všech semenných parametrů a aktualizovat tyto protokoly dle potřeby, vytváření formulářů o kontrole kvality, vzdělávat majitele psů o tom, ţe nemohou předem předvídat se 100 % přesností, kteří psi se semenem chudým na spermie nikdy nebudou moci nakrýt fenu, nebo kteří psi s výborným spermatem mohou fenu nakrýt. Dále vytváření protokolů pro další diagnostiku pro psy s abnormální kvalitou semene. Veterinární praktici mohou provádět analýzu semene jako část celkového zdraví chovu, pro konzervaci zchlazením nebo zmraţením, nebo k vyšetření subfertility nebo infertility. Jeden z autorů navrhl, ţe analýza semene můţe být spolehlivě prediktivní na fertilitu, kdyţ kvalita semene bude dobrá, nebo špatná. Spermie zkoumané in vitro nesplňují charakteristiky, které jsou potřeba pro transport reprodukčním traktem feny po inseminaci. Aby spermie mohly plnit svou roli, musí se správně vyvinout ve varlatech, dozrát, projít krčkem a dělohou pomocí kontrakcí dělohy, projít kapacitací a arkozomální reakcí a navázat se na epitel dělohy nebo vejcovod, v pravý čas se odpojit a projít vejcovodem, penetrovat se do vajíčka (Kustritz, 2007). Morfologie Procento morfologicky normálních spermií u psů nemá vliv na interval odběru semene (England, 1999). Naproti tomu věk má roli na procento morfologicky normálních spermií u člověka toto procento klesá po 45. roce věku (Pasqualotto, Sobreiro, Hallak et al., 2005). Také způsoby barvení preparátu mohou ovlivnit výsledky fertility. Doporučené minimální číslo v lidské medicíně je 200 spermií na dvou separovaných vzorcích 24

25 (WHO, 1999). Bylo zjištěno, ţe spermie ve střední třetině nátěru jsou nejméně změněny barvící technikou (Harasymowycz et al., 1976). V další studii byly pouţity čtyři metody barvení. Dvě z těchto metod byly lepší ve srovnání se třetí, která souvisela s větším procentem spermií s oddělenou hlavičkou a čtvrtou, spojenou se zvýšeným procentem abnormálních spermií různých typů. Tím pádem ve srovnání s výsledky z elektronového mikroskopu technika barvení můţe zvýšit defekty na akrozomu, nebo defekty na hlavičce, spojovací části, či bičíku. To můţe být způsobeno osmotickým tlakem nebo ph při barvení (Kustritz, 2007). Morfologické abnormality mohou být rozděleny na primární nebo sekundární, nebo na hlavní a okrajové (Oettlé et al., 1988). Autor nesouhlasí s druhým názvoslovím, protoţe se jedná o vědecké poznatky o vlivu morfologických defektů na plodnost psů. Někteří vědci by raději abnormality rozdělili podrobněji neţ do hlavních tříd. To by mohlo být výhodné, pokud by abnormality byly dědičné (Santos et al., 2006). Dle Oetllého et al. (1988) je u psů 60 % morfologicky normálních spermií ještě přípustné, a podle něhoţ sníţení hranice normálních spermií pod 60% můţe zapříčinit vznik různých defektů a ovlivňovat celkovou plodnost. Normální psí ejakulát by měl obsahovat 80% morfologicky normálních a ţivotaschopných spermií (Johnson et al., 2001). Abnormality spermií spojené s neplodností jsou zřejmě podobné pro všechny savce. U psů je většina primárních defektů spojena s proximální kapkou (Morton and Bruce, 1989). Ve studii byly popsány hlavičky spermie hruškovitého tvaru ve spojitosti s neplodností (Dahlborn a kol., 1997), dále vysoký podíl i jiných abnormalit, jako je například nízká motilita spermií a celková nízká koncentrace spermií. 25

26 Defekt zduřelého akrozomu u čtyř úzce souvisejících psů Podle Santos a kol. (2006) byl defekt zduřelého akrozomu (KAD) ve spermatu psa popsán pouze jednou. Tato zpráva popisovala historii plemene, klinické výsledky a hodnocení semene čtyř úzce spjatých malých kníračů, kteří měli KAD ve spermatu v rozmezí 8 % aţ 44 %. Dva z nich neměli ţádné jiné reprodukční defekty kromě KAD a byli tudíţ normálně plodní. Vzhledem ke své špatné plodnosti byli čtyři malí knírači (A, B, C a D, věk 4, 3, 4 a 7 let) zdravotně testováni. Všichni 4 psi zplodili dříve několik vrhů, ale kaţdému z nich se nepodařilo oplodnit poslední dvě feny, které jimi byly nakryty 4 36 měsíců před těmito testy. Všechny feny, kterým se s těmito psy nepodařilo zabřeznout, měly poté vrhy s jinými psy. Všichni čtyři psi byli zdraví po celý jejich ţivot. V průběhu všech testů byli všichni psi ve skvělé zdravotní formě. Testy pohlavních orgánů se skládaly z testování penisu a předkoţky, z palpace šourku a jeho obsahu, měření celkové šířky šourku, ultrazvukových testů šourku a varlat, transrektální palpace prostaty a z odběru semene a ze serologického vyšetření na Bruccellu canis. Frakce bohatá na spermie a frakce z prostaty byly odebrány k digitální manipulaci. Hodnocení spermatu zahrnovalo stanovení počtu spermií s progresivním pohybem vpřed za hlavičkou, morfologické hodnocení, hodnocení koncentrace a celkový počet spermií. Všichni čtyři psi byli negativní na brucelózu a semenná kultura neobsahovala ţádné patologické bakterie. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3. 26

27 Tab. 3: Hodnocení spermatu čtyř psů plemene Knírač A B C D Obsah (ml) 2 2 1,5 1,5 Progresivně pohyblivé spermie Celkový počet spermií ( spermií/ejakulát) Normální spermie Jiné abnormální spermie neţ KAD Abnormální hlavička Oddělená hlavička Defekty bičíku KAD Santos et al., 2006 Během pěti měsíčního sledování a testování, psi A a B zplodili dva a tři vrhy. Psi C a D nebyli díky své malé semenné kvalitě pouţiti pro plemenitbu. Všichni tito psi spolu jsou spolu úzce spjati zejména z hlediska plemene a proto je moţno očekávat, ţe KAD je u této skupiny zvířat genetického původu. Hodnotil se také jeden vzorek zmraţeného spermatu od kaţdého předka čtyř psů a nenašel se ţádný KAD v jejich spermatu. Po všech vyšetřeních, ţe tento defekt je genetického původu, ale nakaţená zvířata jsou fertilní, je zřejmé, ţe nakaţená zvířata jsou nevhodná pro další chov (Santos et al., 2006). 27

28 3 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce bylo vyhodnotit vliv plemenné příslušnosti psa, věkové kategorie a frekvence odběru psů na výskyt patomorfologických vad ve stavbě psích spermií. 4 MATERIÁL A METODIKA Celkem bylo provedeno 48 odběrů ejakulátu psů. Z kaţdého odběru byly udělány 3 nátěry s vyuţitím metody barvení dle Farellyho, Bydgoště a Čeřovského. Pro výzkum byla pouţita tato plemena: 1) Australský ovčácký pes, věk měsíců, hmotnost kg, krmený granulemi, dosud po něm nejsou ţádní potomci, je drţen v bytě, vyuţívaný především na sport, odebírán byl v intervalu 1., 5. a 9. den a to mimo domov, 2) Irský setr, věk měsíců, hmotnost 3 19 kg, krmený granulemi i masem, dosud po něm nejsou ţádní potomci, je drţen v bytě, vyuţíván je především jako rodinný pes, odebírán byl v intervalu 1., 5. a 9. den doma, 3) Belgický ovčák malinois, věk měsíců, hmotnost kg, krmený granulemi i masem, zplodil jiţ několik potomků, je drţen v kotci, vyuţívaný především na sport, odebírán byl v intervalu 1., 2. a 3. den doma, 4) Belgický ovčák tervueren, věk měsíců, hmotnost kg, krmený granulemi i masem, zplodil jiţ několik potomků, je drţen v kotci, vyuţíván především na sport, odebírán byl v intervalu 1., 2. a 3. den doma, 5) Německý ohař, věk měsíců, hmotnost kg, krmený granulemi, dosud po něm nejsou ţádní potomci, je drţen volně, vyuţíván pro policejní sloţky, odebírán byl v intervalu 1., 2. a 3. den doma, 28

29 6) Německý ovčák, věk měsíců, hmotnost kg, krmený granulemi, zplodil jiţ několik potomků, je drţen v kotci, vyuţívaný pro policejní sloţky, odebírán byl v intervalu 1., 5. a 9. den mimo domov, 7) Pudl, věk měsíců, hmotnost kg, krmený granulemi, zplodil jiţ několik potomků, je drţen v bytě, vyuţíván především jako rodinný pes, odebírán byl v intervalu 1., 2. a 3. den mimo domov, 8) Špic, věk měsíců, hmotnost 3 19 kg, krmený granulemi i masem, dosud po něm nejsou ţádní potomci, je drţen v bytě, vyuţíván především jako rodinný pes, odebírán byl v intervalu 1., 5. a 9. den doma. Všichni psi byli odebírání způsobem manuální stimulace. U kaţdého nátěru bylo hodnoceno 200 spermií. 4.1 Zhotovení nátěru Jedna kapka ejakulátu se rozetře na podloţním sklíčku pod úhlem 45 tahem kapky za hranou sklíčka tak, aby semeno nevniklo pod hranu krycího sklíčka, kterým se udělal nátěr. Mohlo by totiţ nastat mechanické poškození spermií. Nátěry se nechají usušit na ohřívací desce s teplotou 38 C (Gamčík, Kozumplík, 1976). 4.2 Metody barvení Metoda barvení spermatu podle B. T. Farellyho Metoda vhodná k diferenciaci patologických a nezralých spermií, k vyšetření akrozomu a střední části bičíku. Výhodou je rychlost barvení. Reagencie: 29

30 10 % roztok 35 % formaldehydu ve fyziologickém roztoku NaCl 5 % roztok anilinové modři v destilované vodě 0,5 % roztok krystalické violeti v destilované vodě Pracovní postup: 1. Zředění spermatu na předehřátém hodinovém sklíčku nebo ve zkumavce fyziologickým roztokem v poměru 1 : 1 aţ 1 : 20 dle hustoty ejakulátu, opatrně promíchání krouţivým pohybem 2. Zhotovení nátěru zředěného ejakulátu a usušení preparátu 3. Fixace preparátu v roztoku formaldehydu (15 sekund) 4. Opláchnutí slabým proudem vody 5. Barvení preparátu roztokem anilinové modři (15 sekund) 6. Opláchnutí slabým proudem vody 7. Barvení preparátu v roztoku krystalické violeti (4 6 sekund) 8. Opláchnutí slabým proudem vody 9. Usušení preparátu na vyhřívací plotýnce 10. Mikroskopické posouzení preparátu při násobném zvětšení, za pouţití olejové imerze Spermie se zbarví do modrofialova, přičemţ akrozom by měl být zřetelně barevně diferencovaný od ekvatoriálního segmentu aţ po zadní část (bázi) hlavičky. Dobře jsou barevně diferencované i spojovací část a bičík spermie. Metoda podle Bydgoště Tato metoda se pouţívá pro znázornění primárních změn hlavičky a bičíku spermie. Hlavička má zbarvení podobné květu černého bezu a bičík je tmavofialový. Reagencie: barvivo Bydgošť (0,20 g metylénové modři, 0,75 g gencianové violeti, 5,00 ml glycerolu, 100 ml vody) 1 % roztok eosinu 96 % etanol 30

31 Pracovní postup: 1. Sperma se naředí citrátem sodným v poměru 1 : 1 3, dle hustoty ejakulátu 2. Zhotoví se nátěr a usuší na vyhřívací plotýnce 3. Provede se fixace nátěru v 96 % roztoku etanolu (30 sekund) 4. Opláchnutí preparátu vodou a fixace roztokem eosinu (15 30 sekund) 5. Důkladné opláchnutí proudem vody a fixace barvivem Bydgošť (15 sekund 2 minuty) 6. Opláchnutí preparátu vodou a jeho usušení 7. Mikroskopické posouzení preparátu při násobném zvětšení, za pouţití olejové imerze Metoda podle Čeřovského Jednoduchá a pohotová metoda, pouţívaná ke stanovení výskytu abnormálních spermií. Vlivem diferencovaného barvení jednotlivých částí spermie umoţňuje rozeznání konvenční vady na spermiích. Reagencie: nasycený roztok kongo červeně 0,5 % roztok krystalické violeti Pracovní postup: 1. Na hodinovém sklíčku zředíme jednu kapku spermatu deseti kapkami fyziologického roztoku 2. Na podloţním sklíčku se provede tenký nátěr naředěného spermatu a nechá zaschnout při laboratorní teplotě 3. Suchý nátěr se ponoří na 15 sekund do nasyceného roztoku, kongo červeně 4. Vyjme se a opláchne slabým proudem vody 5. Nechá se zaschnout a barví se asi 4 sekundy v 0,5 % roztoku krystalické violeti 6. Opět se opláchne slabým proudem vody a nechá se oschnout 7. Po zaschnutí se vyšetřuje pod mikroskopem při zvětšení 1000 násobném, s olejovou imerzí 31

32 Statistická analýza dat byla provedena pomocí statistického balíku STATISTICA 9.0, kde byla pouţita analýza variance s pevnými efekty: ijklm = + P i + V j + F k + B l + e ijklm kde: P = plemeno psa (Australský ovčácký pes; Irský setr; Belgický ovčák malinois; Německý ohař; Německý ovčák; Pudl; Špic; Belgický ovčák tervueren), V = věková kategorie (18 30 měsíců; měsíců), F = frekvence odběru (1., 2., 3. den; 1., 5., 9. den), B = metoda barvení (Farelly; Bydgošť; Čeřovský). K určení průkaznosti mezi jednotlivými skupinami byl pouţit z posthoc testu neparametrický HSD test. K vyjádření vzájemných vztahů mezi faktory a sledovanými ukazateli byly spočítány Pearsonovy korelační koeficienty. 32

33 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Tab. 4: Kvalitativní ukazatele ejakulátu psů Plemeno n Odběr Koncentrace Objem (ml) Aktivita (10 3.mm -3 ) x s x x s x x s x Australský ovčácký pes ,7 6, ,0 105,0 22,1 2 4,5 1,4 67,5 20,4 287,5 83,1 3 7,7 4,1 75,0 10,0 157,5 92,2 Irský setr 6 Malinois 6 1 7,3 1,9 78,3 6,8 131,7 30,4 2 10,3 1,4 78,3 2,6 135,0 27,2 3 14,3 4,9 75,0 7,7 106,7 16,9 1 3,9 1,7 75,0 12,2 151,7 109,8 2 9,7 6,6 71,7 12,1 141,3 74,5 3 10,8 4,6 72,5 11,7 155,0 76,2 Německý ohař Německý ovčák ,0 2,4 73,3 5,2 120,0 4,5 2 10,3 6,1 66,7 13,7 85,0 13,4 3 8,4 3,6 81,7 2,6 218,3 177,7 1 11,7 6,3 75,8 12,8 102,5 27,7 2 9,6 5,8 73,3 5,2 158,3 84,9 3 10,1 2,5 69,2 29,4 172,5 115,9 Pudl 6 Špic 6 1 8,0 6,3 83,3 2,6 130,0 20,5 2 6,7 3,6 36,7 10,3 56,7 10,3 3 8,0 4,7 76,7 5,2 187,7 56,5 1 4,5 2,1 64,2 21,5 187,5 91,7 2 4,3 0,8 46,7 13,9 85,8 36,0 3 14,8 5,8 66,7 28,8 160,8 110,7 Belgický ovčák tervueren 6 1 5,8 2,8 76,7 7,5 107,2 72,8 2 4,6 0,7 64,2 27,1 88,3 32,6 33

34 Největší objem ejakulátu (14,8 ml) byl získán při třetím odběru psů plemene Špic. Naopak nejmenší objem semene byl odebrán při prvním odběru plemene Belgický ovčák malinois (3,9 ml). V rámci prvních odběrů byly získány největší odběry u psů plemene Německý ovčák, Německý ohař a Australský ovčácký pes (11,7 > 11,0 > 10,7 ml). U Australských ovčáků došlo při druhém odběru k výraznému poklesu mnoţství semene na průměrných 4,5 ± 1,4 ml, při třetím odběru bylo zjištěno navýšení mnoţství ejakulátu na 7,7 ± 4,1 ml. U psů plemene Irský setr a Belgický ovčák malinois objem ejakulátu s počtem odběrů lineárně vzrůstal (7,3 < 10,3 < 14,3 ml, respektive 3,9 < 9,7 < 10,8 ml). Nejvýraznější navýšení objemu bylo zjištěno u Špice, kde objemy v prvních dvou odběrech mírně převyšovaly 4 ml, zatímco při třetím odběru došlo ke zvýšení na 14,8 ml. Aktivita spermií se pohybovala ve variačním rozpětí od 64,2 % do 81,7 %. Výjimku tvořili psi plemene Pudl a Špic, u kterých došlo při druhých odběrech k poklesu počtu aktivních spermií na 36,7 % respektive 46,7 %. U Pudla toto souvisí s nízkým počtem spermií (56, mm -3 ). Ejakuláty, ve kterých převyšoval počet spermií v mm 3 byly získány při druhých odběrech Australských ovčáckých psů (287 ± 83, mm -3 ) a při třetích odběrech Německých ohařů (218, mm -3 ), kde však byla zjištěna poměrně vysoká variabilita mezi jednotlivými psy (± 177, mm 3 ) (tab. 4). U Australských ovčáckých psů byl v ejakulátu počet normálních spermií a to nejvíce v ejakulátu získaném při druhém odběru (80,3%). Ve vědecké studii bylo prokázáno, ţe pokud se počet morfologicky normálních spermií pohyboval kolem 75,8 %, u zmraţeného ejakulátu jejich hodnota klesla na 48,3 % (Rijsselaere et al., 2003). Z nejvýraznějších morfologických vad byly zjištěny změny na bičíku spermie při prvním odběru, které se však s počtem dalších odběrů částečně redukovaly. U změn na bičíku spermie byla zjištěna průkaznost (P 0,05) mezi prvním a druhým odběrem. Taktéţ byla průkaznost (P 0,05) mezi prvním a druhým odběrem v počtu degenerovaných spermií (tab. 5). 34

35 Tab. 5: Morfologické vyšetření ejakulátu psů plemene Australský ovčácký pes Odběr Faktor x s x x s x x s x Morfologicky normální spermie hlavičce akrozomu spojovací části bičíku bičíku Nezralé spermie Degenerované spermie Celková patologie 73,7 7,2 80,3 1,4 78,0 2,4 3,7 2,3 3,7 1,4 4,0 1,8 4,3 1,4 4,7 1,4 4,0 0,9 4,7 1,1 3,3 1,4 3,0 2,4 10,0 a 1,5 5,0 b 0,9 8,0 4,7 2,0 0,5 2,0 0,5 1,7 0,00 1,7 a 0,5 0,7 b 0,1 1,3 0,5 26,3 7,2 19,7 1,4 22,0 2,4 *odlišná písmena a, b = P < 0,05; A, B = P < 0,01 35

36 Tab. 6: Morfologické vyšetření ejakulátu psů plemene Irský setr Odběr Faktor x s x x s x x s x Morfologicky normální spermie hlavičce akrozomu spojovací části bičíku bičíku Nezralé spermie Degenerované spermie Celková patologie 51,7A 3,6 64,7B 7,6 49,7A 4,0 3,0a 0,9 5,7 3,6 7,3b 2,1 0,3A 0,5 1,3 0,4 2,3B 0,5 0,7 0,1 0,7 0,0 1,7 0,0 34,7A 2,9 23,0B 5,0 35,3A 3,7 9,7A 2,3 3,0B 0,9 2,7B 0,7 0,0A 0,0 1,7B 0,4 1,0 0,0 48,3A 3,6 35,3B 7,6 50,3A 4,0 *odlišná písmena a, b = P < 0,05; A, B = P < 0,01 U Irských setrů bylo zjištěno téměř o 20 % méně morfologicky normálních spermií neţ u Australských ovčáckých psů. Nevětší počet byl opět ve druhém odběru, a to v počtu 36

37 64,7 %. Dále byl zjištěn poměrně výrazný nárůst změn na hlavičce spermie s rostoucím počtem odběrů (3 5,7 7,3 %). Nejvýraznější změny byly u změn na bičíku spermie a to při třetím odběru v počtu 35,3 %. Poměrně vysoké procento patřilo i nezralým spermiím, zejména při prvním odběru (9,7 %). Nejvyšší průkaznost (P 0,01) je u změn na hlavičce spermie a to mezi prvním a třetím odběrem. Menší průkaznost (P 0,05) byla prokázána u morfologicky normálních spermií a to mezi prvním a druhým odběrem a mezi druhým a třetím odběrem, dále pak u změn na akrozomu mezi prvním a třetím odběrem, u změn na bičíku spermie mezi prvním a druhým odběrem i mezi druhým a třetím odběrem, u degenerovaných spermií mezi prvním a druhým odběrem, čímţ byla ovlivněna také celková patologie jak mezi prvním a druhým odběrem, tak mezi druhým a třetím odběrem. Celková patologie přesahuje optimální hranici 20 %. Obdobné výsledky publikoval Blom (1983) i u Zlatého retrievera, který byl v podobné hmotnostní kategorii (tab. 6). V tabulce 7 můţeme vidět, ţe u Belgických ovčáků malinois převaţovaly morfologicky normální spermie v nejvyšším počtu při prvním odběru (72,7 %), jejichţ hodnota byla optimálně vysoká. Dále stojí za zmínku zvýšené procento defektů na hlavičce spermie, zvláště při druhém a třetím odběru (13,8 14,7 %) se zvyšující se tendencí, dále pak vyšší procento defektů na bičíku spermie, které se u všech tří odběrů pohybovalo přibliţně okolo 10 %. Naopak velmi dobré výsledky byly zjištěny u degenerovaných spermií, kterých bylo ve všech odběrech zanedbatelné mnoţství a jejich hodnota byla nejmenší při druhém odběru (0,5 %). U Německých ohařů byly zjištěny nejmenší hodnoty morfologicky normálních spermií, jejichţ hodnoty byly natolik nízké (přibliţně 20 % u všech odběrů), ţe mohou výrazně ovlivnit fertilitu psa, protoţe podle Johnstona (2001) by se mělo procento morfologicky normálních a ţivotaschopných spermií pohybovat kolem 80 %. Dále bylo zjištěno vysoké procento patomorfologických změn na bičíku, které vzrůstalo s kaţdým následujícím odběrem (34,7 43,3 46,0 %), kde byla také zjištěna vysoká průkaznost (P 0,01) mezi prvním a druhým odběrem a menší průkaznost (P 0,05) mezi prvním a třetím odběrem. Celková patologie (79,0 80,3 %) měla proto převaţující hodnoty nad normálními spermiemi (19,7 21,0 %), coţ vypovídá o velmi nízké reprodukční kvalitě daných jedinců (tab. 8). 37

38 Tab. 7: Morfologické vyšetření ejakulátu psů plemene Belgický ovčák malinois Odběr Faktor x s x x s x x s x Morfologicky normální spermie hlavičce akrozomu spojovací části bičíku bičíku Nezralé spermie Degenerované spermie Celková patologie 72,7 5,5 67,3 8,7 66,8 27,0 5,2 1,8 13,8 8,5 14,7 4,7 2,0 0,3 2,0 0,4 1,5 0,6 4,8 2,0 3,2 1,3 4,2 1,5 9,8 4,1 10,8 2,9 10,3 4,2 4,7 2,1 2,3 0,9 1,8 1,0 0,8 0,1 0,5 0,1 0,8 0,1 27,3 5,5 32,7 8,7 33,2 7,0 *odlišná písmena a, b = P < 0,05; A, B = P < 0,01 38