Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat Vybrané faktory ovlivňující spermiogram mužů Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. Vypracoval: Iva Balajková Brno

2 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Ústav chovu a šlechtění zvířat Agronomická fakulta 2004/2005 ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Řešitelka: Studijní program: Obor: Iva Balajková Zemědělská specializace Agroekologie Název tématu: Vybrané faktory ovlivňující spermiogram mužů Zásady pro vypracování: 1. Studium doporučené literatury a zpracování jejího přehledu 2. Získávání a vyhodnocení podkladů k hodnocení fertility spermií u mužů 3. Periodické zpracovávání vzorků spermatu mužů 4. Stanovení motility a koncentrace spermií u mužů 5. Zjistit frekvenci výskytu jednotlivých druhů změn u patologicky změněných spermií mužů 6. Stanovení sledovaných vlivů na kvalitativní ukazatele spermatu u mužů 7. Vyhodnocení dosažených výsledků statistickými metodami 8. Sepsání bakalářské práce podle pokynů vedoucího DP a její předání k oponentuře Rozsah práce: cca 45 stran, 15 tabulek, 5 grafů Seznam odborné literatury: 1. GAMČÍK, P. a kol.: Umelá inseminácia a andrológia hospodárskych zvierat. Príroda Bratislava, 1992, 298 s 2. Periodika: Czech J. Anim. Sci., Veterinární medicína, Náš Chov, Farmář 3. Věžník, Z. a kol.: Repetitorium spermatologie a andrologie a metodiky spermatoanalýzy. VÚVel Brno, 2004, 192 s Datum zadání bakalářské práce: prosinec 2005 Termín odevzdání bakalářské práce: duben

3 Iva Balajková řešitelka bakalářské práce prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. vedoucí bakalářské práce prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. vedoucí ústavu prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc. děkan AF MZLU v Brně 3

4 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Vybrané faktory ovlivňující spermiogramy mužů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU. V Brně, dne. podpis diplomanta. 4

5 PODĚKOVÁNÍ Děkuji prof. Ing. Ladislavu Máchalovi, DrSc. za vedení bakalářské práce, za připomínky a pomoc při jejím vypracování. Děkuji embryoložce Kliniky pro léčbu neplodnosti a ženských nemocí UNICA Evě Blahové za pomoc a odborné rady. Děkuji prof. MUDr. Zdeňkovi Malému, CSc., přednostovi Kliniky pro léčbu neplodnosti a ženských nemocí UNICA za poskytnutá data. 5

6 ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá převážně popisem reprodukčních orgánů samce, ejakulátu, laboratorních metod používaných k vyšetření čerstvého ejakulátu a vybraných faktorů, které ovlivňují plodnost. V závěru bakalářské práce je popsán materiál, se kterým se bude pracovat v navazující práci diplomové, tedy počet spermiogramů vyšetřených za rok 2005 na Klinice pro léčbu neplodnosti a ženských nemocí UNICA. Dále je nastíněna metodika, tzn. postup vyšetření a parametry sledované u ejakulátů mužů na již zmíněné klinice. Na bakalářskou práci bude navazovat práce diplomová, ve které budou popsány výsledky a závěry sledování. Klíčová slova: pohlavní orgány samce, ejakulát, spermie, spermiogram. ABSTRACT This bachelor thesis deals primarily with the description of male reproductive organs, ejaculate, laboratory methods used to examine fresh ejaculate and selected factors influencing fertility. At the end of the thesis is described material which will be used in the continuing dissertation, namely the number of spermiograms examined in 2005 at the UNICA Institute of Reproductive Medicine and Sterility Treatment. Furthermore, there is an outline of methodology, i.e. the examination procedure and monitored parameters of ejaculate of men at the above mentioned Institute. This bachelor thesis will be followed by a dissertation in which the results and findings of the observation will be presented. Key terms: male reproductive organs, ejaculate, sperm, spermiogram. 6

7 OBSAH 1. ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Samčí pohlavní orgány Varle Vývodné pohlavní cesty Nadvarle Chámovod Přídatné pohlavní žlázy Pyj Předkožka Šourek Semeno Semenná plazma Spermie Laboratorní metody určené k vyšetření čerstvého ejakulátu Makroskopické hodnocení ejakulátu Mikroskopické hodnocení ejakulátu Biologické zkoušky ejakulátu Biochemické zkoušky spermatu Morfologické metody vyšetření spermatu Morfologické vyšetření změn v nukleoplazmě Stanovení aktivity endogenních dehydrogenáz podle Hrudky Použití fluorescenční mikroskopie ve spermiologii Penetrační aktivita spermií Hodnocení zmrazeného spermatu Tepelný test rozmraženého spermatu Měření spermií Mikrobiologické vyšetření ejakulátů Vlivy působící na plodnost Prostředí Věk

8 4. MATERIÁL A METODIKA Materiál Metodika SEZNAM LITERATURY

9 1. ÚVOD S vynálezem mikroskopu Holanďanem Antony van Leewenhookem v roce 1677 byla poprvé popsána lidská spermie. Od této doby jsou spermie předmětem pečlivého sledování. Proto také lze konstatovat, že se kvalita i kvantita lidských spermií zhoršuje. V roce 1940 měl průměrný muž v jednom mililitru ejakulátu 110 miliónů spermií. V šedesátých letech byl normální nález 60 miliónů. Poté se norma snížila na 40 miliónů a dnes se za normu považuje 20 miliónů spermií v mililitru. Kvalitu spermií snižuje mimo jiné znečištěné životní prostředí, uspěchaný životní styl, stres a kouření. K oplodnění vajíčka dochází pouze jedinou spermií, Příroda tu pracuje s obrovskou funkční rezervou. Přesto se mužské poruchy podílejí nejméně čtyřiceti procenty na příčinách neplodnosti, která postihuje téměř každou pátou partnerskou dvojici. Důležitými sledovanými prvky jsou kromě počtu i pohyblivost a morfologie spermií, které se také zhoršují. Všechny tyto parametry jsou zjišťovány dostupnými laboratorními metodami z čerstvého ejakulátu. Stanovení hodnot spermiogramy lze využít i u hospodářských zvířat, což umožňuje výběr samců s nejlepší reprodukční schopností v chovech. Zavedení takového vyšetření slouží pro uplatnění vybraného jedince v plemenitbě a je z pohledu prevence poruch plodnosti jednou z podmínek zdravého chovu. 9

10 2. CÍL PRÁCE Práce je zaměřena na sledování kvality a kvantity spermatu mužů. Cílem bakalářské práce je popis reprodukčních orgánů samce, laboratorních metod určených k vyšetření čerstvého ejakulátu a vlivů působících na plodnost. Cílem navazující diplomové práce je získání a vyhodnocení podkladů k hodnocení fertility spermií u mužů, periodické zpracování vzorků spermatu mužů a stanovení motility a koncentrace spermií u mužů. Dále pak zjištění frekvence výskytu jednotlivých druhů změn u patologicky změněných spermií mužů a stanovení sledovaných vlivů na kvalitativní ukazatele spermatu u mužů. Všechny dosažené výsledky budou vyhodnoceny statistickými metodami 10

11 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1. Samčí pohlavní orgány Samčí pohlavní orgány se skládají z pohlavních žláz, vývodných cest, přídatných pohlavních žláz a kopulačního orgánu (Gamčík, Kozumplík, 1984) Varle Varle (testis) je párová samčí pohlavní žláza tuhoelastické konzistence, velmi citlivá na tlak (Marvan, 2003). Vzniká z pohlavní řasy, ve které dochází k rozrůstání zárodečného epitelu a tvorbě semenoplodných kanálků (Gamčík, Kozumplík, 1984). Ve varleti se tvoří samčí pohlavní buňky spermie a samčí pohlavní hormon testosteron. Má vejčitý, ze stran mírně zploštělý tvar a v závislosti na druhu různou velikost a hmotnost. Většina povrchu varlete je volná, pouze k jednomu okraji se podélně přikládá nadvarle. Varlata jsou uložena v šourku, jejich poloha je však druhově odlišná a podmiňuje i různé utváření šourku. (Marvan, 2003) Vývodné pohlavní cesty Vývodné cesty, tj. nadvarle a chámovod včetně semenných váčků vznikají z Wolfových vývodů (Gamčík, Kozumplík, 1984). Slouží u samce k odvodu spermií, jako jejich dočasný rezervoár, a k odvodu výměšků přídatných pohlavních žláz. Tvoří je několik vývojově, morfologicky i funkčně odlišných oddílů, které na sebe navazují (Marvan, 2003) Nadvarle Nadvarle (epididymis) je důležitý úsek vývodných cest, v němž se spermie jednak shromažďují, jednak i funkčně dozrávají (Marvan, 2003). Nadvarle je uloženo v šourku (Sova, 1990) a rozlišujeme na něm tři části: hlavu, tělo a ocas. Hlava nadvarlete je rozšířená a pevně připojená k hlavovému konci varlete, který široce překrývá. Skládá se z lalůčků, složených z kliček odvodných kanálků varlete. Na přechodu hlavy a těla nadvarlete se všechny odvodné kanálky vzájemně spojují v jednotný vývod nadvarlete. Tělo nadvarlete navazuje plynule na hlavu a má tvar 11

12 úzkého protáhlého oblouku, volně připojeného k varleti. Před dosažením ocasního konce varlete se tělo nadvarlete zřetelně rozšiřuje a přechází v ocas nadvarlete. Ten má tupě zaoblený kuželovitý tvar a o 2 3 cm přesahuje ocasní konec varlete. Podstatou těla a ocasu je vývod nadvarlete, silně zprohýbaný v četné meandrické kličky, navzájem spojené řídkým vazivem. Vývod nadvarlete není v celé své délce stejně široký, ale směrem k chámovodu pozvolna zesiluje (Marvan, 2003) Chámovod Chámovod (ductus deferens) je párová silnostěnná trubička tloušťky stébla až brku, spojující vývod nadvarlete s močovou trubicí. Stěna chámovodu je relativně velmi silná a skládá se ze sliznice, svaloviny a serózy. Sliznici kryje jednovrstevný nebo pseudovrstrevný cylindrický epitel, vybavený místy mikroklky. V úseku ampuly je sliznice chámovodu výrazně ztluštělá přítomností rozvětvených tubulózních žláz. Jejich viskózní hlenovitý sekret je vylučován do lumenu chámovodu a stává se součástí ejakulátu. Svalovina tvoří nejsilnější vrstvu stěny chámovodu a je uspořádána v podobě hustých i protáhlých spirál. Při ejakulaci svými stahy vypuzuje sperma do močové trubice (Marvan, 2003) Přídatné pohlavní žlázy Na tvorbě semene se kromě vlastních spermií a výměšku žlázových buněk nadvarlete a chámovodových ampulí podílejí ještě sekrety zvláštních samostatných orgánů přídatných pohlavních žláz. Jejich sekrety, vylučované do močové trubice, tvoří jednak přirozené ředidlo spermií, jednak obsahují látky, které slouží k výživě spermií, a konečně upravují spermiím prostředí během průchodu močovou trubicí a v pohlavním ústrojí samice (Marvan, 2003). Měchýřkovitá žláza Měchýřkovitá žláza (glandula vesicularis) je párová orgán protáhlého tvaru. Strukturálně je to složitá tubulózní žláza a vylučuje bělavý, slabě zásaditý sekret, který se hromadí v rozšířených nitrolalůčkových a mezilalůčkových vývodech. Při ejakulaci je tento sekret stahy hladké svaloviny vývodů vypuzován vyměšovacím kanálem do močové trubice (Marvan, 2003). 12

13 Předstojná žláza Předstojná žláza (prostata) je nepárová a leží na začátku močové trubice, kaudálně od vyústění chámovodů a měchýřkovitých žláz. Řídký mlékovitý sekret prostaty je zásadité reakce, má charakteristický pach a četnými drobnými vývody je odváděn do močové trubice (Marvan, 2003) jako první složka ejakulátu. Sekret prostaty neutralizuje kyselou reakci poševního prostředí, na kterou jsou spermie velmi citlivé. Slabě alkalická reakce aktivizuje pohyblivost spermií (Klika, 1980). Bulbouretrální žláza Bulbouretrální žláza (glandula bulbourethralis) je párová a leží na dorzolaterální ploše rozšířeného bulbu močové trubice, tj, v místě jejího přechodu přes sedací oblouk. Je protáhlá, bilaterálně oploštělá, o délce cm a šířce 3 cm. Přikládá se ze stran k pánevnímu úseku močové trubice. Výměšek žlázy se shromažďuje v rozšířených prostorech nitrolalůčkových a mezilalůčkových vývodů a je nakonec odváděn do močové trubice jedním nebo několika vývody (Marvan, 2003) Pyj Pyj (penis) je pářící orgán, který slouží k dopravě semene do pohlavního ústrojí samice. Vzhledem k této funkci má zvláštní stavbu, která mu umožňuje, že se při pohlavním vzrušení napřimuje a zpevňuje, aby mohl být zasunut do genitálu samice. Mechanismus ztopoření je založen na naplnění dutinek topořivého tělesa pyje krví. Pyj má válcovitý tvar a skládá se z fixované části kořene pyje a volné části těla pyje. Kraniální konec pyje je volný, zakončuje se žaludem a je v ochablém stavu ukryt ve zvláštním kožním vaku, v předkožce. Podstatu pyje tvoří párové topořivé těleso pyje, nepárové houbovité těleso pyje, močová trubice, pomocné svaly (příčně pruhovaný napřimovač pyje a hladký zatahovač pyje), cévy a nervy (Marvan, 2003). U přežvýkavců a kance je pyj poměrně tenký a dlouhý, v klidovém stavu vytváří uprostřed své délky esovité ohbí, jež se při erekci vyrovnává. Délka a průměr pyje jsou u jednotlivých druhů savců různé; u býka je délka cm, průměr 3 cm, u malých přežvýkavců cm a 1,5 cm, u kance cm a 1,0-1,5 cm a u hřebce cm a 5 6 cm (Žižlavský, 2006). 13

14 Předkožka Předkožka (praeputium) je kožní ochranný kryt v podobě úzkého a dlouhého toulce, v němž je uložena distální volná část pyje. Skládá se z vnějšího listu, který se při předkožkovém otvoru vchlipuje dovnitř a přechází ve vnitřní list. Zatímco vnější list předkožky je tvořen ochlupenou kůží břicha, vnitřní list je bezchlupý a má charakter sliznice. V klidu vystýlá vnitřní list dutinu předkožky a přechází na pyj jako pyjový list. Při vysunutí ztopořeného pyje se záhyb vnitřního listu předkožky vyrovnává a celý se přesouvá na pyj. Ve vnitřním listu předkožky jsou vedle mízních uzlíků zastoupeny ještě předkožkové žlázy, vyměšující zapáchající předkožkový maz smegma (Marvan, 2003) Šourek Šourek (scrotum) je kožní vak, ve kterém jsou uložena varlata, nadvarlata a semenný provazec. Podle polohy varlat má šourek odlišný tvar a velikost. U přežvýkavců je dlouhý, visí mezi stehny a je při bázi zřetelně zaškrcen. Šourek kance není zaškrcen, má širokou základnu a obloukovitě se vyklenuje kaudálním směrem, přičemž přesahuje zadní linii stehen. Šourek představuje v podstatě vychlípeninu břišní stěny a má tedy podobnou stavbu. Na povrchu šourku je tenká kůže s hojnými potními a mazovými žlázami. Pod kůží je podkožní svalová vrstva, která ve střední rovině vytváří přepážku, rozdělující šourkovou dutinu na dvě poloviny. Je složena z hladkosvalových buněk a elastických vláken a citlivě reaguje na změny teploty prostředí. V chladném prostředí se smršťuje, svrašťuje kůži šourku a zmenšuje tím jeho ochlazovací plochu. Naopak v teplejším prostředí ochabuje, čímž se ochlazovací plocha šourku zvětšuje. Je to termoregulační mechanismus, který udržuje v šourku teplotu o 3 4 C nižší než v konečníku, což je optimální teplota pro správný vývoj spermií ve varleti. Pod touto vrstvou je uložen příčně pruhovaný sval zvedač varlete a pod ním se nachází silná vazivová blána vnitřní povázka varlete, k níž zevnitř přirůstá tenká serózní blanka nástěnný list poševního obalu (Marvan, 2003). 14

15 Reprodukční orgány muže: Semeno Semeno (sperma, chám, ejakulát) je tekutina, která se skládá z buněčné části, tj. spermií, a z tekuté části čili semenné plazmy (Marvan, 2003). Je produktem přídatných pohlavních žláz a varlat. Složení spermatu záleží na poměru spermií a semenné plazmy (Gamčík, Kozumplík, 1984). Sperma má druhově specifickou barvu, konzistenci a pach a jeho množství vyloučené při jednom vysemenění (ejakulaci) druhově značně kolísá. Všeobecně malým objemem ejakulátu, s velkou koncentrací spermií, se vyznačují všichni přežvýkavci. Naproti tomu u všežravců, šelem a lichokopytníků je objem ejakulátu relativně velký a koncentrace spermií nízká. Tyto základní hodnoty ejakulátu mají však poměrně velkou individuální variabilitu a kolísají i u jednoho jedince. Je to podmíněno celou řadou zevních a vnitřních faktorů, jako je roční období, světlo, teplo, věk, úroveň výživy a ustájení, zdravotní stav a pohlavní využívání samce. Tyto faktory ovlivňují nejen spermatogenní funkci varlat, ale i sekreční aktivitu přídatných pohlavních žláz. 15

16 Charakteristiky ejakulátu muže Ejakulát má průměrný objem 3,5 ml a krajními hodnotami 2 6 ml. Spermie se pohybují rychlostí 2 3 mm za minutu v závislosti na ph prostředí, ve kterém se nalézají. Během skladování v nadvarleti jsou nepohyblivé a jejich pohyb začíná až v ejakulátu. V kyselém prostředí pochvy se pohybují pomalu, avšak alkalické ph dělohy spermie urychlí. Místa oplození dosáhne jen kolem 200 spermií. Většina z nich zaniká a je resorbována ženským pohlavním traktem (Moore, Persaud, 2002). Počet spermií Z celkového množství představují spermie méně než 10 %. Zbytek ejakulátu sestává ze sekretu přídatných pohlavních žláz, tj. semenných váčků (60 %), prostaty (30 %) a bulbouretrální žlázy (10 %). Jeden ml ejakulátu normálních zdravých mužů obsahuje přes 100 milionů spermií. Přestože se toto číslo individuálně různí, počet 20 milionů v 1 ml a 50 milionů v celém ejakulátu stačí zajistit plodnost. Muž, který má méně než 10 milionů na 1 ml, je pravděpodobně sterilní. Hodnocení fertility bere v úvahu nejen počet, ale též pohyblivost spermií. Pro potenciální plodnost je třeba, aby po 120 minutách bylo pohyblivých nejméně 40 % spermií a některé ještě i po 24 hodinách. Předpokládá se, že mužská sterilita je příčinou jedné třetiny až poloviny bezdětných manželství. Sterilita u mužů bývá zaviněna endokrinními poruchami, abnormální spermatogenezí nebo obstrukcí pohlavních cest (Moore, Persaud, 2002). Životnost spermií Většina lidských spermií nepřežívá v ženském genitálním traktu více než 48 hodin. Některé spermie se uhnízdí ve slizničních řasách děložního hrdla a postupně se uvolňují do cervikálního kanálu, cestujíce dělohou do vejcovodů. Krátkodobý pobyt spermií v cervixu zajišťuje plynulé uvolňování spermatu a zvyšuje tím pravděpodobnost početí. Zmrazení při nízkých teplotách umožňuje zachovat spermie po mnoho let (Moore, Persaud, 2002). Morfologie spermií Ne všechny spermie, které jsou produkovány jsou normálně vyvinuté. Vliv na tento stav, který platí i za optimálních podmínek, má velká řada faktorů vnitřního i vnějšího prostředí. Při hodnocení musí být brána v úvahu celá spermie. Role morfologického posouzení je jednou z prvořadých predikátorů fertilizace. Morfologie spermií má výhodu v přesnosti 16

17 a preciznosti hodnocení, je jednoduchá a pokud se týká vybavení je dosažitelná pro většinu laboratoří (Věžník, 2000). Pohyb (motilita) spermií Exaktní vyhodnocení motility spermií má predikační hodnotu při odhadu fertility, a to zejména v rámci asistované reprodukce. Klasické hodnocení motility je ovlivněno řadou subjektivních faktorů. Proto existuje snaha zavést objektivní metodu (Věžník, 2000). Koncentrace spermií Posuzuje se fotometricky (nefelometricky), počítačem částic a hemocytometricky. Fotometrické stanovení koncentrace je orientační a provádí se především v rutinních provozních laboratořích. V kontrolních laboratořích je doporučeno automatické posouzení počtu spermií elektronickým počítačem částic nebo hemocytometrickou metodou s použitím klasické metody počítání spermií v Bürkerově komůrce po naředění ejakulátu roztokem dle Hayema v melanžeru na červené krvinky. Hodnocení se provádí ve světelném mikroskopu při zvětšení 200x (Věžník, 2000). Spermiogram Spermiogram představuje základní laboratorní metodu při vyšetření mužské fertility; umožňuje klasifikovat závažnost mužského faktoru. Před odběrem spermatu se doporučuje pohlavní abstinence 2 až 7 dnů. Kratší odstup od předchozí ejakulace může snížit objem ejakulátu a koncentraci spermií. Při delší abstinenci může být snížená motilita spermií. K posouzení oplozovací schopnosti muže je nutné vyšetřit pohlavní orgány, ejakulát a ve spolupráci s gynekology i sexuální partnerku. Pro plodnost je nejdůležitějším ukazatelem kvalita pohybu spermií. Ani závažná oligospermie (počet nižší než 20 mil/ml) však nevylučuje fertilitu. Normální spermiogramy (po 5ti denní abstinenci) 1. objem: 2-6 ml 2. ph spermatické tekutiny: 7,2-7,8 3. počet spermií: mil/ml 4. pohyblivost spermií krátce po zkapalnění: více než 60 % dobře propulsivně pohyblivých 5. morfologie spermií: více než 60 % normálně konfigurováno 17

18 Aspermie znamená žádný ejakulát. Azoospermie znamená nepřítomnost spermií v ejakulátu. Oligospermie znamená méně než 40 miliónů spermií v 1 ml. Astenozoospermie znamená pohyblivost u méně než 60 % spermií. Nekrozoospermie znamená přítomnost jen vitálních spermií. Pyospermie znamená zmnožení leukocytů v ejakulátu. Hemospermie znamená přítomnost erytrocytů v ejakulátu (Dvořáček, 1999) Semenná plazma Semenná plazma představuje svým objemem hlavní podíl ejakulátu (u berana a kozla %, u býka %, u kance a hřebce %) a tvoří ji hlavně výměšky přídatných pohlavních žláz. V malém množství se na jejím složení podílí i tekutina, která má svůj původ ve varleti, nadvarleti, chámovodu a v močové trubici. Svým pestrým chemickým složením (anorganické látky, lipidy, sacharidy) vytváří semenná plazma pro spermie přirozené prostředí, které je chrání před nepříznivými vlivy, umožňuje jejich pohyb, je zdrojem jejich výživy (Marvan, 2003) a zvětšuje celkový objem ejakulátu (Gamčík, Kozumplík, 1984) Spermie Spermie, samčí gameta, je vysoce specializovaná pohlavní buňka. V porovnání se somatickými buňkami obsahují poloviční (haploidní) počet chromozomů (Moore, Persaud, 2002). Je schopna samostatného pohybu, s cílem aktivního vyhledávání a oplození vajíčka (Marvan, 2003). Spermie jsou nejdůležitější složkou ejakulátu, jejich hlavním biologickým znakem v ejakulátu je pohyblivost, schopnost přežívání a schopnost oplození (Gamčík, Kozumplík, 1984). Zralá spermie je volně plovoucí aktivně pohyblivá buňka, skládající se z hlavičky a bičíku. Spojení mezi hlavičkou a bičíkem je zajištěno pomocí krčku. Hlavička spermie, v níž je soustředěna většina hmoty, obsahuje haploidní jádro. Přední dvě třetiny jádra jsou kryty akrozómem, což je vezikulární organela tvaru čepičky obsahující některé enzymy důležitý z nich je akrozin. Uvolnění těchto enzymů usnadňuje během fertilizace proniknutí spermie skrze Corona radiata a zona pellucida vejce. 18

19 Bičík spermie sestává ze tří segmentů: střední (spojovací) části, hlavní části a koncové části. Bičík propůjčuje spermii pohyblivost, jež přispívá k transportu k místu oplození. Střední část bičíku obsahuje mitochondrie poskytující adenozintrifosfát (ATP) potřebný k aktivnímu pohybu. Mitochondriální (fibrózní) pochva je strůjce švihavých pohybů bičíku (Moore, Persaud, 2002) Složení spermií Cytoplazmatická membrána Cytoplazmatická membrána, pokrývající celou spermii, obsahuje bílkovinu podobnou keratrinu, která je pravděpodobně vázána na lipidy. Je bohatá na cystin, histidin a arginin. Membrána je acidorezistentní s vysokou schopností permeability, která zabezpečuje látkovou výměnu spermií (Gamčík, Kozumplík, 1984). Hlavička spermie Hlavička spermie v podstatě kondenzované jádro, je oploštělá. Při pohledu shora má oválný tvar a při pohledu ze strany tvar hruškovitý (Klika, 1980), je µm dlouhá (Sova, 1990). Jádro je vyplněno chromatinem obsahujícím převážně DNA. Množství DNA je ve zralých spermiích proti ostatním tělním buňkám poloviční, avšak pro každý živočišný druh relativně konstantní. Změna obsahu DNA, stejně jako její poškození, vede k poruchám až ztrátě oplozovací schopnosti spermií. V procesu oplodnění má hlavička spermie významnou funkci. Jejím úkolem je přenést dědičný materiál lokalizovaný v nukleoplazmě, přičemž je potřebný správně vyvinutý a intaktní akrozomální systém a nukleoplazma. Jádro obaluje nukleární membrána, která je dvojvrstvá, při bázi hlavičky o něco hrubší. Jádrové póry, které jsou místem výměny materiálu mezi jádrem a cytoplazmou se u spermií nevyskytují. Akrozóm Akrozóm pokrývá přední část hlavičky. Je to cytoplazmatický útvar čepičkovitého tvaru, který se nachází mezi buněčnou a jadernou membránou. Akrozóm zabírá téměř 50% plochy hlavičky. Akrozóm je složen z mukopolysacharidů. Obsahuje fruktózu, manózu, galaktózu, ale i lipidy, kalium, kyselou a alkalickou fosfázu aj. V akrozómech spermií byla zjištěna 19

20 také proteináza a další enzymy samčího semene, které umožňují spermiím pronikání přes zonu pellucidu do vajíčka. V čerstvém ejakulátu člověka se nachází převážně jen proakrozin, zatímco po kapacitami nebo porušení akrozómu v průběhu konzervace semene se zjišťuje v semenné plazmě i akrozin. Akrozóm spermie nemá takovou pevnou konzistenci jako ostatní části hlavičky. Je citlivý na osmotické změny vnějšího prostředí. Postakrozomální čepička Je to útvar obalující tu část jádra, kterou nepokrývá akrozóm. Na neporušené spermii je spojena s buněčnou membránou. Je mnohem odolnější proti vnějším vlivům než akrozóm (Gamčík, Kozumplík, 1984). Střední část Střední část spermie je složen z krčku a spojovací části. Je motorickým centrem bičíku spermie, ve kterém se chemická energie přeměňuje v kinetickou (Klika, 1980). Krček Krček spermie je poměrně krátký, měří jen 2 3 µm a obsahuje dva za sebou uložené ventrikuly, mezi nimiž je rozepjato devět příčně segmentovaných provazců neboli chord (Sova, 1990). Bičík Bičík jako nástroj pohybu zprostředkovává transport spermie na místo oplodnění. Přitom má důležitou úlohu mitochondriální aparát, který vyrábí energii (ATP), a komplex axiálních vláken jako místo, kde se tato energie mění na mechanickou na pohyb spermie. Bičík spermie se dělí na několik částí, které se liší lokalizací, strukturou a funkcí. Jsou to krček spermie, střední (mitochondriální), hlavní a koncový oddíl (Gamčík, Kozumplík, 1984). Více než polovina hmotnosti spermie je tvořena bílkovinami, jejichž základní stavební jednotkou jsou aminokyseliny. Minerální látky tvoří asi 1-2 % hmotnosti spermie. V ejakulátu byly prokázány také enzymy, a to alkalické a kyselé fosfáty, adenozintrifosfáza, hexokináza, aldoláza, cytochromoxidáza, akrozin aj. (Gamčík, Kozumplík, 1984). 20

21 Spermie: Vývoj spermií Gametogeneze Gametogeneze (vytváření gamet) je proces formování a vývoje specializovaných zárodečných buněk, nazývaných gamety. Tento pochod, týkající se chromozomů i cytoplazmy zárodečných buněk, připravuje pohlavní buňky pro fertilizaci. V průběhu gametogeneze se počet chromozomů snižuje na polovinu a tvar buňky se mění. Tento zrací proces nazýváme spermatogeneze (Moore, Persaud, 2002). Spermatogeneze Spermatogeneze zahrnuje celý sled událostí, kterými jsou primitivní zárodečné buňky spermatogonie proměněny na spermie, čili spermetozoa. Maturace zárodečných buněk začíná v pubertě (mezi rokem) a pokračuje do pozdního stáří. Spermatogonie, které dřímaly v semenotvorných kanálcích varlat od fetální periody vývoje, zvyšují v pubertě svůj počet. Po několika mitotických děleních spermatogonie rostou a podléhají procesům, které je mění v primární spermatocyty, největší ze zárodečných buněk v semenotvorných kanálcích. Každý primární spermatocyt postupuje redukční 21

22 dělení první fázi meiózy -, aby dal vznik dvěma haploidním sekundárním spermatocytům, které mají zhruba poloviční objem. Následně probíhá v sekundárních spermatocytech druhé meiotické dělení, jehož výsledkem jsou čtyři haploidní spermatidy, které jsou opět o polovinu menší. Spermatidy se postupně promění ve čtyři zralé spermie v procesu nazývaném spermiogeneze. Celý průběh spermatogeneze, zahrnující i spermiogenezi, trvá přibližně dva měsíce. V okamžiku dovršení spermiogeneze se spermie uvolňuje do lumen semenotvorných kanálků. Sertoliho buňky vystýlají semenotvorné kanálky, podporují a vyživují zárodečné buňky a pravděpodobně se podílejí na regulaci spermatogeneze. Spermie jsou pasivně transportovány ze semenotvorných kanálků do nadvarlat (epididymis), kde jsou skladovány a zvolna dozrávají (Moore, Persaud, 2002) Transport spermií Z místa svého skladování v nadvarleti jsou spermie rychle dopravovány do močové trubice peristaltickými vlnami silné svalové vrstvy chámovodu. Při průchodu kolem přídatných pohlavních žláz jsou do tekutiny v chámovodu a močové trubici, obsahující spermie, vyměšovány jejich sekrety. Během sexuálního styku je do okolí zevního ústí čípku a poševní klenby uloženo milionů spermií, které vlastním pohybem bičíku zvolna plují cervikálním kanálem. Enzym vezikuláza, obsažený v sekretu semenných váčků, část spermatu (ejakulát obsahující spermie) koaguluje, čímž vzniká vaginální zátka bránící zpětnému toku semene z pochvy. V období kolem ovulace cervikálního hlenu přibývá a klesá jeho viskozita, což usnadňuje transport spermií. Průchod spermií dělohou a vejcovody je umožněn především stahy hladkého svalstva stěn těchto orgánů. Prostaglandiny obsažené v semeni pravděpodobně stimulují děložní motilitu během soulože a urychlují tak transport spermií dělohou a vejcovody do místa oplození v ampule. Fruktóza obsažená v sekretu vasiculae seminales slouží spermiím jako zdroj energie (Moore, Persaud, 2002) Zrání spermií Bezprostředně po ejakulaci nejsou spermie schopny vajíčko oplodnit. Musí před tím projít přípravným obdobím kapacitace, které trvá zhruba 7 hodin. Během tohoto období je z povrchu akrozomu odstraněn glykoproteinový potah a vrstva seminárních proteinů. 22

23 Poměr mezi cholesterolem a fosfolipidy i membránový potenciál se v buněčném obalu mění. Kapacitovaná spermie nepodléhá žádným morfologickým změnám, avšak je podstatně aktivnější. Dovršení kapacitace je podmínkou započetí akrozomální reakce (Moore, Persaud, 2002), při které vznikají ve stěně akrozomu malé otvůrky, perforace. Tyto otvůrky dovolují výstup enzymů, jimiž si spermie natravuje, tj. enzymaticky uvolňuje cestu přes corona radiata a zona pellucida k plazmatické membráně vajíčka (Klika, 1980) Laboratorní metody určené k vyšetření čerstvého ejakulátu Makroskopické hodnocení ejakulátu Makroskopické hodnocení ejakulátu se provádí okamžitě po jeho odběru ve sběrači. Hodnotí se hmotnost nebo objem, smyslové hodnocení zrnitosti hustoty, barvy, pachu, čistoty, případně cizích přimísenin. Objem ejakulátu Je variabilní a značně kolísá. Zjišťuje se měřením v kalibrovaném válci nebo vážením na laboratorní automatické váze (v gramech). Konzistence, zrnitost Se posuzuje u každého ejakulátu ve sběrači v dopadajícím nebo procházejícím světle. Husté sperma dobré jakosti je neprůhledná vazká tekutina, zpravidla smetanového mírně zrnitého vzhledu, zrnité shluky spermatu se pomalu pohybují. Řídké sperma špatné jakosti je vodnaté, průsvitné, bez zrnitosti. Barva se posuzuje proti světlu. Dobré sperma je barvy bělavé, v některých případech šedobílé, nebo mírně nažloutlé. Špatné sperma nehodící se k inseminaci bývá zbarveno silně žlutozeleně nebo zeleně přimísením hnisu, moče nebo nežádoucími mikroorganismy. Špatné je i sperma s příměsí krve (Louda, 2001). Pach Se posuzuje čichem ve sběrači. Dobré sperma má slabý specifický pach, připomínající pach kravského mléka. Nazelenalé sperma páchne močí. Hnilobný zápach svědčí o přimísení hnisu (Louda, 2001). 23

24 Cizí přimíseniny Nejčastěji to bývají chlupy, vazelína, nečistoty z předkožky. Hnis se zjišťuje při zánětech semenných váčků, pyje nebo varlat a předkožky. Dobré sperma má být prosté přimísenin (Louda, 2001) Mikroskopické hodnocení ejakulátu Hodnocení aktivity Progresivní pohyb vpřed za hlavičkou je jedním z nejvýznamnějších ukazatelů oplozovací schopnosti čerstvého ejakulátu. Hodnotí se charakter pohybu, určuje se směr a rozsah kmitů hlavičky spermie. Přímý progresivní pohyb spermií je znakem jejich funkční plnohodnotnosti a vyjadřuje se v procentech. S prodlužující se dobou po odběru dochází u ejakulátu k tzv. vitální degeneraci spermií, při které se rychlost přímočarého pohybu zpomaluje a tento se mění na pohyb kruhový, postupně následuje pohyb přerušovaný a trhavý, později pohyb ustává. Vedle pohybu přímočarého vpřed za hlavičkou je třeba sledovat i ostatní druhy pohybu, které se hodnotí jako závadné (kolébavý, kruhový, na místě, zpětný). Nežádoucí je i shlukování spermií, tzv. aglutinace (Louda, 2001). Hodnocení vířivosti pohybu ejakulátu Vyjadřuje společné hodnocení hustoty a pohyblivosti spermií. Hodnotí se neředěný, čerstvý, tzv. nativní vzorek ejakulátu. Ejakuláty podle vířivosti pohybu se hodnotí třemi stupni (3 = velmi rychlý vířivý pohyb, 2 = pomalý vířivý pohyb, 1 = ejakulát bez vířivého pohybu) (Louda, 2001). Stanovení koncentrace ejakulátu Je dána funkční aktivitou semenoplodného epitelu varlat, zdravotním stavem muže, připraveností a technikou odběru ejakulátu. Stanovení koncentrace spermatu fotometricky Přístroj zajišťuje objektivní přesnost, rychlost měření a malou spotřebu spermatu. Přesnost je závislá na dobré funkci přístroje a na přesně vypracované kalibrační křivce. V současné době se používá fotometr digitální. Existují i modifikované fotokolorimetry, určené speciálně pro vyšetření ejakulátu jednotlivých druhů hospodářských zvířat. Stanovení koncentrace spermatu haematocytometricky Koncentrace spermat se stanoví počítáním spermií v Bürkerově komůrce (Louda, 2001). 24

25 1. Počítají se všechny spermie ležící uvnitř čtverečku o velikosti 1/16 mm 2 a všechny spermie, jejichž hlavičky se dotýkají nebo leží na levé a horní straně čtverečku. Počítají se spermie v 10 čtverečcích. 2. Počítají se spermie v 10 menších čtverečcích o velikosti 1/25 mm 2 a všechny spermie, jejichž hlavičky se dotýkají nebo leží na levé a horní straně čtverečku. Počítají se spermie ve čtverečcích ležících úhlopříčně, aby se lépe postihlo rozprostření vzorku po celé ploše (Louda, 2001) Biologické zkoušky ejakulátu V biologických testech se sleduje odolnost spermií vůči různým vnějším vlivům. Provádí se dlouhodobý chladový test, krátkodobý tepelné test, zjišťuje se odolnost spermií vůči chladovému šoku a odolnost spermií vůči působení 1% roztoku NaCl (Louda, 2001). Testy přežitelnosti spermatu Testy přežitelnosti spermatu jsou důležité pro posouzení biologické hodnoty a oplozovací schopnosti spermií. Mezi výsledky těchto testů a skutečnou plodností byla zjištěna vysoká korelace (Louda, 2001). Krátkodobý tepelný test přežitelnosti Do zkumavky se odměří 0,5 1 cm 3 spermatu (ředěného nebo neředěného). Zkumavka se spermatem se vloží do vodní lázně a postupně zahřeje na 38 C. Po dosažení uvedené teploty se zaznamená začátek testu. V hodinových intervalech se ze zkumavky odebírají vzorky a provádí se posouzení aktivity spermií. Doba trvání testu nebývá delší než 6 hodin, jelikož se spermie v teplém prostředí rychle vyžívají a ztrácejí aktivitu. Ejakuláty s větší absolutní délkou životnosti jsou biologicky jakostnější a mají vyšší oplozovací schopnost (Louda, 2001). Dlouhodobý chladový test přežitelnosti Do malé zkumavky se odměří 3 cm 3 naředěného spermatu, posoudí se aktivita spermií, vzorek se vloží do chladničky (teplota 1-3 C) a zapíše se čas. Každý den ve stejnou dobu se sleduje aktivita spermií pod mikroskopem s vyhřívací destičkou. Dobré ejakuláty si zachovávají po dobu 96 hodin od odběru aktivitu alespoň 50% (Louda, 2001). 25

26 Zkouška rezistence spermatu Rezistence spermatu je ukazatelem odolnosti spermií vůči působení 1% roztoku NaCl. Vyjadřuje se stupněm zředění zkouškového spermatu tímto roztokem, který se v určitém časovém sledu přidává ke spermatu, a to až do okamžiku, kdy ustane přímočarý pohyb spermií vpřed ze hlavičkou (Louda, 2001). Zkouška živých spermií na odolnost vůči chladovému šoku Touto zkouškou se posuzuje reakce spermií na rychlé zchlazení (Louda, 2001). Stanovení procenta živých a mrtvých spermií barvením Touto biologickou zkouškou se získá obraz o kvalitě ejakulátu. Je založena na rozdílné afinitě živých a mrtvých spermií k barvivům. Mrtvé nebo oslabené spermie přijímají barvivo, živé spermie nepropouštějí semipermeabilní membránou barvivo a zůstávají bílé. Málo životaschopné spermie se značně sníženým metabolismem se barví bledě růžově až červeně. Barvení se provede buď jen eosínem nebo současně ještě nigrosínem nebo opálovou modří jako kontrastním barvivem (Louda, 2001). Stanovení koncentrace vodíkových iontů ph spermatu Kyselost spermatu je výrazem činnosti a zdravotního stavu přídatných pohlavních žláz. Má být stanovena do 15 minut po odběru, jelikož se životní pochody spermií mění (Louda, 2001) Biochemické zkoušky spermatu Na základě stupně anaerobního nebo aerobního metabolismu spermií se usuzuje na jejich životnost a oplozovací schopnost. Podstatou zkoušky je rychlost anaerobního rozkladu fruktózy obsažené v semenné plazmě (Louda, 2001). Dehydrogenační zkouška Při dehydrogenační zkoušce se sleduje rychlost fruktolýzy ve vztahu k počtu pohyblivých spermií. Methylenová modř má v této zkoušce úlohu akceptoru vodíku uvolněného při anaerobním štěpení cukru a touto redukcí se mění v bezbarvou leukoformu. Bylo prokázáno, že dehydrogenační aktivita, resp. produkce enzymu dehydrogenázy, je vázána jedině na živé spermie a že lze tedy z rychlosti odbarvení methylenové modři 26

27 usuzovat na počet živých spermií ve spermatu, jejich aktivitu, a tím i oplozovací schopnost. Dehydrogenační zkoušky jsou cennou pomůckou při objektivním hodnocení jakosti spermatu, zejména pro začátečníky. Byla prokázána vysoká pozitivní korelace mezi dobou odbarvení methylenové modři a koncentrací spermatu, pohyblivosti spermií, jakož i dobrou přežitelností spermií při dlouhodobém chladovém testu i krátkodobém tepelném testu (Louda, 2001) Morfologické metody vyšetření spermatu Poznatky o morfologii spermií a o morfologických abnormalitách mohou přispět ke zjištění příčin neplodnosti mužů. Využívá se přitom zdokonalené mikroskopické techniky a různých způsobů barvení. Laboratornímu morfologickému a cytochemickému vyšetření musí být podrobeno sperma čerstvé. Všechny pomůcky, které přijdou do styku se spermatem, musí být sterilní, chemicky čisté a musí mít přibližně stejnou teplotu jako vyšetřované sperma. Zřeďovací roztok nesmí vyvolat sekundární změny. Nejvhodnější je fyziologický roztok NaCl. Nesmí však být dlouhodobě uchováván v termostatu při vyšších teplotách, protože by docházelo k odpaření vody a koncentrace NaCl by se zvyšovala. Sperma se ředí na předehřátém hodinovém sklíčku v poměru 1:1 až 1:20 podle hustoty spermatu. Spermie se zřeďovacím roztokem je nutné krouživým pohybem na hodinovém sklíčku promíchat tak, aby se na rozměrech nevytvářely shluky, které znesnadňují posouzení (Louda, 2001). Při vzniku vadných spermií se uplatňuje řada vlivů genetických a negenetických (fyzikálně chemických, vliv výživy, toxicko infekčních, vliv věku a další). Podle místa vzniku se změny spermií rozdělují na primární a sekundární: Primární změny spermií Tyto vady vznikají v průběhu spermatogenního cyklu. Patří sem degenerativní formy spermií, změny tvaru hlavičky, změny v nukleoplazmě, změny na akrozómu, tvarové změny bičíku a další vývojové anomálie (Louda, 2001). 27

28 Sekundární změny spermií Tyto změny nastávají při dlouhém pobytu spermií v ocasu nadvarlete, dále v průběhu ejakulace, špatnou manipulací s odebraným spermatem, nesprávné přípravě preparátů. Tyto změny jsou projevem kvalitativních změn v semenné plazmě a nesprávného technologického postupu při zpracování spermatu. Patří sem změny hlavičky, změny akrozómu, torze bičíku (Louda, 2001). Při posuzování morfologických změn na spermiích rozdělujeme patologické formy spermií do následujících skupin. Vývojové tvarové anomálie degenerativního charakteru Počítáme všechny formy spermií, které se vyvinuly atypicky a nemají normální diferenciaci, hlavičku s akrozómem, spojovací část bičíku a bičík samotný. Nejčastěji jde o atypický tvary hlaviček, kdy hlavička bývá často menší a abnormálně barvitelná. Řadíme sem i takové spermie, u nichž se nevytvořil normální bičík, ale místo bičíku pouze vakovitý nebo kyjovitý útvar, dále spermie s dvojitým bičíkem nebo se zdvojenou hlavičkou a jiné. V normálním ejakulátu se nemá vyskytovat více než 5% těchto změn. Vyšší procento je ukazatelem vážnější poruchy spermiogeneze (Louda, 2001). Patologické formy ve tvaru hlaviček Změny jsou nejčastějšími odchylkami při poruchách spermiogeneze a provázejí nejčastěji vznik generativních nebo zánětlivých procesů ve varlatech. Celkově nemá překročit výskyt těchto anomálií hranici 5%. Nejčastěji se vyskytují hlavičky zúžené, hruškovité, abnormálně veliké, abnormálně malé, asymetrické, ovoidní, oválné, citronovité, dále spermie s abnormální strukturou hlavičky, která může být proláklá, plošná, příliš široká nebo s úzkým klenutím. Všechny tyto změny patří mezi změny primární (Louda, 2001). Změny na akrozómu Někdy se může vyskytnout svlečený akrozóm, který nacházíme na rozměrech nedaleko hlaviček spermií. V takovém případě lze předpokládat, že k jejich uvolnění došlo pravděpodobně až po styku se semennou plazmou, protože jinak dochází k jejich resorpci v nadvarletním traktu. 28

29 Nejčastější anomálií je akrozóm zbobtnalý. K této změně dochází i při manipulaci se spermatem, zejména když se dostane do sběrače voda. Akrozóm obvykle praskne a akrozómová hmota se vylije do prostředí. Mezi další změny vnitřní struktury akrozómu patří kondenzace akrozómové hmoty k přednímu okraji hlavičky, zřasení předních okrajů hlaviček, různé granulace v akrozómové substanci a jiné, které bývají obvykle sekundárního charakteru (Louda, 2001). Změny v zadní části hlavičky Jde převážně o změny v nerovné tinktorické schopnosti kalíšku nebo o výskyt různých granulačních tělísek. Změny na spojovací části Rozpoznání těchto změn vyžaduje již poměrně značné zkušenosti a citlivost oka, aby byly zachyceny jemné změny, mezi které patří hlavně zkrácení spojovací části, její prodloužení, ztluštění, zúžení, přerušení spojovací části v některém úseku, ve kterém probíhá pouze holé osové vlákno, nebo rozvázání mitochondriální spirály, která se při bedlivé prohlídce jeví jako vinoucí se nitkový závit (Louda, 2001). Patologické změny na bičících Nejčastěji se jedná o stočení bičíku kolem protoplazmatické kapky, obvykle na konci spojovací části bičíku. Může to být stočení bičíku do tvaru houslového klíče, zavinutí bičíku do klubka. Řadíme sem i tzv. Dag-defekt, kdy dochází k abnormálnímu vyvinutí bičíku v důsledku toho, že se Boříkové fibrily nevyvinou v uspořádání 2+9+9, ale ve vnějším kruhu obvykle skupina fibril chybí. Tato anomálie je popisována jako změna s dědičnou predispozicí. Dále sem patří abaxiální upevnění bičíku, kdy bičík nevychází ze středu, ale z okraje hlavičky a dekapitace, tj. oddělení hlaviček od bičíků. Velmi často však může jít o artificiální změny, které vznikají při nesprávném zhotovení roztěru. Nezralé spermie Jedná se o spermie se zadrženou protoplazmatickou kapkou na krčku proximální nebo v průběhu spojovací části distální. Při vyšším výskytu nezralých spermií v ejakulátu je třeba sledovat výskyt dalších vývojových vad. 29

30 Změny v nukleoplazmě Tyto změny se posuzují při použití speciálního barvení, znázorňujícího jadernou substanci. Mezi nejčastější změny patří miliární vakuoly při předním okraji hlavičky, makrovakuoly, nepravidelné uspořádání DNA v jádře nebo slabá barevná reakce nukleoplazmy. V ejakulátu nemá být více než 15% těchto anomálií (Louda, 2001). V ejakulátu nemá celkový počet patologických spermií překročit 20%. Při hodnocení patologických spermií je nutno dodržovat zásadu, že z jednorázového vyšetření nelze vyvozovat konečné závěry a že je nutné vyšetření opakovat vždy v 3-5ti denních intervalech. Výsledek pozorování se zapisuje do tabulky. Při jednom vyšetření se pozoruje celkem spermií. Používá se olejové imerze a zvětšení krát (Louda, 2001) Morfologické vyšetření změn v nukleoplazmě Intaktnost nukleoplazmy je jednou ze základních podmínek pro fertilizační schopnost spermie. Řada patologických změn může být lokalizována právě v jaderné substanci (Louda, 2001) Stanovení aktivity endogenních dehydrogenáz podle Hrudky Tato metoda je založena na principu, že spermie pro svůj pohyb potřebují nejen živiny, ve kterých je hlavním činitelem fruktóza, ale i fermenty, které jsou soustředěny ve spojovací části bičíku. S déle trvajícím pohybem spermie postupně ztrácí tyto fermenty, kterých má pouze tolik, kolik se jich vytvořilo během spermiogenního cyklu a po jejich ztrátě končí aktivita spermií (Louda, 2001) Použití fluorescenční mikroskopie ve spermiologii Pomocí fluorescenční mikroskopie při barvení spermií fluorochromy je možné provádět morfologické vyšetření spermií a diferencovat živé a mrtvé spermie. Je možno provádět i vyšetření spermatu ředěného žloutko-citrátovým ředidlem nebo mléčnými ředidly. Touto metodou je možné sledovat pohyb spermií v pohlavním traktu samice. Princip fluorescenční mikroskopie spočívá v tom, že ultrafialové paprsky vyvolávají v celé řadě organických i anorganických látek fluorescenci, přičemž vyvolané světlo má podstatně větší vlnovou délku a je tedy viditelné (Louda, 2001). 30

31 Penetrační aktivita spermií K posouzení aktivity a rychlosti pohybu spermií se používá řada metodických postupů. Kapilárový test penetrace spermií je vhodnou metodou pro hodnocení interakce spermií a prostředí cervikálního hlenu v děložním krčku. Tento test je vhodný pro posouzení předpokladu oplození (Louda, 2001) Hodnocení zmrazeného spermatu Aktivita spermatu po rozmrazení se posuzuje u každého ejakulátu na pracovišti, kde bylo sperma zmraženo, dále pak vždy před expedicí pro inseminačního technika (LOUDA, 2001). Inseminační dávka (peleta) se vyjme pinzetou a rozpustí během 15 vteřin v malé zkumavce naplněné 1,5 cm 3 citrátu sodného zahřátého na teplotu 39+1 C. obsah zkumavky se dokonale promíchá. Inseminační dávka uložená v pejetě se též rozmrazí, promíchá vzduchovou bublinou uvnitř pejety a nanese na podložní sklíčko. Kapátkem se nanese malá kapka takto zředěného spermatu na podložní sklíčko předehřáté na teplotu 39+1 C, přikryje se krycím sklíčkem a posuzuje při zvětšení násobném. Hodnotí se minimálně 3 zorná pole, v nichž se zjišťuje odhadem procentické zastoupení progresivně se pohybujících spermií. Mikroskop má být opatřen fázovým kontrastem, pracovní plocha mikroskopu má teplotu 39+1 C (Louda, 2001) Tepelný test rozmraženého spermatu Inseminační dávka se vyjme z kontejneru a lehce položí na hladinu roztoku citroanu sodného naplněného ve zkumavce. Teplota tohoto roztoku je 39+1 C. zkumavka se vloží do stojánku ve vodní lázni o téže teplotě. Po samovolném rozmražení, po kterém pilulka klesne ke dnu, se obsah zkumavky zvolna rozmíchá. Aktivita se odečítá po uplynutí 30 minutové inkubační doby. Požadovaná minimální hodnota aktivity je 20% (Louda, 2001) Měření spermií Účelem měření spermií je získat podklady pro objektivní posouzení tvaru a velikosti spermií ve vztahu ke stanoveným hodnotám normálních spermií. Velikost i tvar spermií se má pohybovat v rámci stanovených mezních hodnot, není-li tomu tak, označujeme spermie jako nenormální. Mezi tvarem a velikostí spermií, hlavně jejich hlaviček, 31

32 a oplozovací schopností muže je vysoká závislost. Proto spermiogramy mužů, charakterizující tvar a velikost spermií v ejakulátu, jsou vhodným vodítkem při posuzování oplozovací schopnosti (Louda, 2001) Mikrobiologické vyšetření ejakulátů Při odběru spermatu i při dodržení všech hygienických opatření může dojít ke kontaminaci. Čerstvý ejakulát nesmí obsahovat patogenní zárodky ani plísně. Oborové normy připouštějí maximálně 5000 nepatogenních mikroorganismů v inseminační dávce (Louda, 2001) Vlivy působící na plodnost Plodnost je podmíněna nejen druhovou příslušností, ale i dědičným založením a působením činitelů vnějšího prostředí. Určit podíl dědičnosti a vnějšího prostředí je těžké, ale z dlouhodobých pozorování lze vidět, že o úrovni plodnosti rozhodují především vnější vlivy, ale nemůžeme zanedbat ani projevy dědičnosti, s jejichž vlivem se počítá asi ve 20 procentech případů. Z činitelů vnějšího prostředí, které větší nebo menší mírou ovlivňují plodnost, je třeba uvést především výživu, klimatické činitele, u zvířat způsob chovu, užitkovost a jiné (Kliment, 1983) Prostředí Vnější prostředí je soubor činitelů, v kterých jedinec nebo celá skupina žije a kterému se musí přizpůsobovat, aby si zachovala schopnost realizace v přijatelných hranicích bez ohrožení vlastní existence (Kliment, 1983) Výživa Výživa patří mezi nejdůležitější faktory vnějšího prostředí, protože ovlivňuje všechny funkce organismu, i funkce reprodukční. Uplatňuje se na každém stupni reprodukčního procesu. Svojí mnohotvárností působí po stránce kvantitativní i kvalitativní. Kvalita krmiv rostlinného původu závisí na složení půdy, geografických a klimatických činitelích, hnojení, uskladňování a dalších (Kliment, 1983). 32

33 Nedostatky, které mohou vzniknout ve stravě v důsledku nepříznivého působení jednotlivých činitelů, se projeví komplikacemi látkové výměny a mohou vyvolat poruchy plodnosti. Při nedostatečné kvalitativní i kvantitativní výživě se vyřadí takové funkce v organismu, které nejsou bezpodmínečně potřebné. Pohlavní funkce s ohledem na postavení reprodukční soustavy reprezentují právě tento druh funkcí. Pohlavní soustava je z hlediska hierarchie rozdělování hodnot v organismu na samém konci. Pohlavním funkcím jsou nedřeveny dokonce i produkční funkce. To znamená, že při vzniku disproporční situace ve výživě budou postižené jistým stupněm nedostatečnosti právě reprodukční orgány, což se nevyhnutelně projeví poruchami v reprodukci, resp. v plodnosti. Energeticky nedostatečná výživa znamená podvýživu, která se u mladých jedinců projevuje pozdějším pohlavním dospíváním. U pohlavně dospělých jedinců podvýživa potlačuje funkce gonád, pohlavní cyklus neprobíhá apod. dlouhotrvající podvýživa vyvolává vážné změny i na vývodných cestách pohlavního aparátu a umožňuje vznik rozličných infekcí. I když jde o přechodné stavy, jejich dlouhodobý charakter zapříčiní, že se tělesné síly a pohlavní funkce obnovují pomalu. Tím klesá intenzita celoživotní reprodukce a vznikají problémy v organizaci reprodukčního procesu (Kliment, 1983). Podobně jako nedostatečné, tak i nadměrné stravování může vyvolat poruchy reprodukčního procesu. Může vést k tukové degradaci gonád. Nadměrné množství zplodin látkového metabolismu (štěpné produkty bílkovin) může poškodit zárodečný epitel gonád. Bílkoviny Základním stavebním materiálem pro obnovu buněk a tvorbu gamet a některých hormonů jsou bílkoviny. Aby reprodukční funkce probíhaly normálně, musí být ve výživě zabezpečeny také aminokyseliny, které mají rozhodující vliv na plodnost (např. Lucin, izoleucin, tryptofan, arginin, histidin, metionin, tyrozin, treonin, fenylalanin a lyzin. Při nadměrném přívodu bílkovin se narušuje poměr mezi hrubým proteinem a energetickou složkou, což vede k těžkým poruchám reprodukce i přes zdánlivě dobrý zdravotní stav. Ještě nepříznivěji působí nedostatek bílkovin. Slábnou projevy pohlavních funkcí a snižuje se životaschopnost pohlavních buněk. Nedostatek bílkovin v čase dospívání zpomaluje nástup puberty a vyvolává funkční změny pohlavních žláz. 33