AGRONOMICKÁ FAKULTA. Ústav chovu a šlechtění zvířat. Frekvence výskytu morfologicky změněných spermií u býků čekatelů a v plné produkci

Transkript

1 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA Ústav chovu a šlechtění zvířat Oddělení reprodukce hospodářských zvířat Frekvence výskytu morfologicky změněných spermií u býků čekatelů a v plné produkci DIPLOMOVÁ PRÁCE Brno 2007 Vedoucí diplomové práce: Prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc. Vypracovala: Olga Skopalová 1

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Frekvence výskytu morfologicky změněných spermií u býků čekatelů a v plné produkci vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby byla práce uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně dne Podpis diplomantky 2

3 Děkuji vedoucímu diplomové práce Prof. Ing. Ladislavu Máchalovi, Drsc. za pomoc a odborné vedení při vypracování této diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Radku Filipčíkovi za ochotně poskytnuté informace a paní Heleně Divinové za pomoc při vyšetřování vzorků. 3

4 ANOTACE Podstatou této diplomové práce bylo porovnat morfologické změn spermií v jednotlivých kategoriích u býků čekatelů a býků v aktivní produkci. Kvalita ejakulátu a morfologickopatologické změny byly zkoumány u 24 býků čekatelů a u 10 býků v aktivní produkci. Cekem bylo vyšetřováno 46 vzorků býčího spermatu. Odběr vzorků byl od listopadu 2005 do června U býků čekatelů byly zjištěny tyto hodnoty morfologických změny spermií: Průměrná hodnota tvarových změn hlavičky spermií činila 4,8 %. Průměrná hodnota nezralých spermií byla 0,05 %. Hodnota procentických změn na akrozómu spermií u býků čekatelů činila 4,1 %. Průměrná hodnota změn na spojovací části byla rovna 2,55 %. Hodnota morfologických změn na bičíku spermií byla vyhodnocena 6,43 %. Průměrná hodnota změn na nuklezómu u býků neodebíraných činila 0,01 %. Průměrná hodnota morfologických změn u vývojových a tvarových anomálií degenerativního charakteru byla rovna 0,01 %. Celkové procento morfologických abnormit u býků testovaných bylo rovno 17,25 %. U býků v aktivní zátěži byly vyhodnoceny tyto hodnoty morfologických změn spermií: Průměrná hodnota tvarových změn hlavičky spermií činila 4,54 %. Průměrná hodnota nezralých spermií byla 0,06 %. Hodnota morfologických změn na akrozómu spermií u býků v plné produkci činila 4,7 %. Průměrná hodnota změn na spojovací části byla rovna 2,35 %. Průměrná hodnota morfologických změn na bičíku spermií byla vyhodnocena 9,1 %. Procento morfologických změn na nuklezómu spermií bylo rovny 0,0 %. Průměrná hodnota morfologických změn u vývojových a tvarových anomálií degenerativního charakteru byla rovna 0,03 %. Celkové procento morfologických abnormit bylo u býků testovaných rovno 20,76 %. ANNOTATION The main assignment of this work was to compare of the morphologicalchanges of sperm in individual categories of changes in two categories expectant bulls and tested bulls. The quality of ejaculate and morphologicalpathologic change in sperm were examined in 24 expectant bulls and 10 tested bulls. It was assessed 46 samples of semen overall. The sampling were out in period from November till June In the expectant bulls were found out these figures: 4,8 % sperms with morphologicaly 4

5 changed heads of sperms, 0,05 % immature sperms, 4,1 % with changed acrosome, 2,55 % sperms with changed connecting part, 6,4 % sperms with changed flagellum, 0,01 % sperms with morphological changes of karyoplasms and 0,01 % degenerate sperms. Total morphologicaly changed sperms of expectant bulls were 17,25 %. In tested bulls were found out these figures: 4,54 % sperms with morphologicaly changed heads of sperms, 0,06 % immature sperms, 4,7 % with changed acrosome, 2,35 % sperms with changed connecting part, 9,1 % sperms with changed flagellum, 0,0 % sperms with morphological changes of karyoplasms and 0,03 % degenerate sperms. Total morphologicaly changed sperms of tested bulls were 20,76 %. 5

6 OBSAH 1.ÚVOD SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY Morfologie spermie Hlavička spermie Bičík spermie Semenná plazma Chemické složení zralé spermie Chemické složení semenné plazmy Druhové vlastnosti ejakulátu a jeho složení Fyzikální vlastnosti semene Objem ejakulátu Viskozita a specifická váha Koncentrace spermií Osmotický tlak Spermatogeneze Období rozmnožování (období mitotického dělení) Období růstu Období meiózy (období zracích dělení) Období metamorfózy (spermatohistogeneze, spermiogeneze) Semeno býka Laboratorní vyšetření semene Makroskopické hodnocení spermatu Mikroskopické vyšetření ejakulátu Morfologická analýza Výskyt morfologicky změněných spermií Primární změny Sekundární změny Morfologické změny spermií Patologické poruchy hlaviček spermií Změny na akrozómu a vnitřní struktuře nukleoplazmy Změny na bičíku spermie Nezralé formy spermií Vztah morfologických změn k poruchách plodnosti Laboratorní hodnocení býčího spermatu Příprava nátěru při morfologickém vyšetření spermií Barvící metody preparátu Působení vnitřních a vnějších faktorů na produkci a jakost ejakulátu Vliv ročního období, teploty, světla, barometrického tlaku na produkci a jakost ejakulátu Vliv výživy na produkci a kvalitu ejakulátu Vliv onemocnění a abnormit na produkci a jakost ejakulátu Vliv pohybu a věku na produkci a kvalitu ejakulátu

7 Výskyt protilátek proti spermiím v krevním séru samců Normy, pokyny Odběr semene od býka Odběr semene do umělé vagíny Vlastní odběr semene CÍL PRÁCE MATERIÁL A METODIKA VÝSLEDKY A DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM TABULEK PŘÍLOHY

8 1.ÚVOD Chov skotu patří v EU mezi výrazně regulovaná agrární odvětví. Produkce mléka je limitována mléčnými kvótami, produkce jatečného skotu je pak prakticky dána stanovenými početními stavy jatečných zvířat, na něž lze obdržet podporu prostředků EU. Vzhledem k významu skotu, je ve všech vyspělých zemích výrazná snaha pro zachování jeho rozsahu na co nejvyšší úrovni. Přesto je v celosvětovém trendu charakteristické postupné snižování početních stavů skotu, které souvisí jak se zvyšováním jeho výkonnosti, tak i s částečnou změnou ve spotřebě potravin živočišného původu. V současné době jsou v České republice chovány dvě základní, přibližně stejně početné populace dojeného skotu. Nejrozšířenějším zatím zůstává český strakatý skot, který je šlechtěn na kombinovanou a masnou užitkovost. Druhým rozšiřujícím se plemenem je holštýnský skot (BOUŠKA et al., 2006). Zajištění výroby dostatečného množství živočišných produktů je podmíněno vysokou úrovní reprodukce. Z tohoto důvodu jsou na plodnost plemenic kladeny vysoké nároky. Kvalitní úroveň reprodukce je nutné zajistit u všech druhů hospodářských zvířat, zvláště pak u uniparních, s dlouhým generačním intervalem, jako je například skot. Bez dobré plodnosti zvířat není možné obnovit, doplňovat a rozšiřovat chovy. Dobrá plodnost je tedy základním projevem užitkových hospodářských zvířata rozhodujícím faktorem pro zkvalitňování a ozdravování chovů. Reprodukční schopnost je vyjádřena reprodukcí životaschopného potomstva. Dle JELÍNKA et al. (2003) je základním předpokladem plynulého rozmnožování normální funkce pohlavního ústrojí, tj. produkce plnohodnotných, oplození schopných pohlavních buněk, oplození a nerušený nitroděložní vývoj nového jedince. Samec i samice musí být plodní. Pod pojmem plodnost u samic rozumíme produkci oplození schopných vajíček, pravidelně zabřeznout a porodit dobře vyvinutá a životaschopná mláďata v počtu přiměřeném příslušnému druhu až do vysokého věku. U samců pod pojmem plodnost rozumíme schopnost páření a kontinuální produkci fertilního semene až do pozdního věku (JELÍNEK et al., 2003). Vzhledem k tomu, že heritabilita ukazatelů plodnosti je velmi nízká, nemůže být selekce na tuto vlastnost, která je prováděna pouze u plemenic, dostatečně účinná. Kvalitu plemenného býka nelze vidět jen v plemenné hodnotě, ale také v kvalitě reprodukčních funkcí, které limitují využitelnost i u plemenářsky špičkového samce. O genofond špičkových plemeníků je 8

9 obrovský zájem a je tedy snahou, aby byli tito plemeníci maximálně využíváni (VĚŽNÍK et al., 2004). Proto se pozornost zaměřuje na selekci býků podle vlastní oplozovací schopnosti, podle hodnocení plodnosti potomstva dcer, na schopnost použití k plemenitbě a dále na odběr semene přes vagínu a schopnost poskytnout velké množství kvalitního semene. VĚŽNÍK (2007) konstatoval, že plemeník tvoří polovinu plodnosti stáda. Plemenný býk má být schopen zapustit a oplodnit velký počet krav. MIKŠÍK, ŽIŽLAVSKÝ (2005) uvádějí nejčastější hodnocení plodnosti u býků u nás dle: Březosti plemenic po prvních inseminacích Testu nepřeběhlých ( non return test ) Indexu plodnosti býka, ve kterém se bere v úvahu březost po ostatních býcích ve stádě a výsledky práce inseminačního technika. Index se počítá na centrálním počítači z prvotních údajů o inseminaci. Inseminace se během poměrně krátkého období stala v celém světě běžně používanou metodou, která je pevně spjata s procesem reprodukce a šlechtění téměř u všech druhů hospodářských zvířat. Kolébkou inseminace skotu v České republice se stala koncem čtyřicátých let vyspělá chovatelská oblast Litomyšlska. Prvním teletem narozeným u nás po inseminaci byl býček, který se narodil Tento býček byl na nákupním trhu v Litomyšli dne 11. listopadu 1948 vybrán pro inseminaci. Organizovaná inseminace skotu spadá do roku Podle vzoru první inseminační stanice v Osíku byly zřizovány další stanice. Šlechtitelská a plemenářská práce v chovech hospodářských zvířat v České republice je řízena na základě platnosti zákona č. 240/1991 Sb. O šlechtění a plemenitbě hospodářských zvířat a provádějícími vyhláškami. Vlastní šlechtitelskou činnost usměrňuje a podporuje ministerstvo zemědělství ČR prostřednictvím oprávněných organizací. Tyto oprávněné organizace jsou neustále nuceny k co nejefektivnější organizaci své činnosti. Chov plemeníků se významnou měrou podílí na celkových nákladech provozu těchto organizací. Jsou hledány různé varianty jejich chovu. První variantou může být získání velkého množství ejakulátu za poměrně krátkou dobu, uskladnit jej v tekutém dusíku a následně býka porazit. Jiný systém navrhuje odebrat býkům pouze množství ejakulátu potřebného k testaci jejich dcer a umístit plemeníka v odstavné stáji, či jej využít v přirozené plemenitbě u soukromých podnikatelů. Je- li býk po testaci vybrán jako zlepšovatel užitkových vlastností, otevírá se více možností 9

10 ekonomického využití býka, než v případě jeho poražení. Na kvalitu, kvantitu a morfologické ukazatele ejakulátu působí také stresové faktory jako jsou : převoz býka, změna prostředí, změna ošetřovatelů, změna časové posloupnosti odběru, frekvence odběru. Je proto nutné sledovat změny v ejakulátu a provádět případná opatření. Další perspektivu a rozvoj chovu jednotlivých dojených plemen skotu v podmínkách České republiky lze jen obtížně prognózovat. Jejich rozšiřování, nebo útlum bude závislý především na ekonomických aspektech jejich chovu. To znamená na nákladech spojených s jejich chovem a na realizaci produktů, tj. mléka, jatečného a chovného skotu (BOUŠKA et al., 2006). Další rozvoj chovu skotu bude záviset především na ekonomických faktorech a ekologické situaci v souladu s vyspělými státy, které chrání a podporují zemědělce a perspektivu zemědělství spatřují v koncentraci a specializaci, v garanci minimálních cen a v řadě dalších opatření, včetně dotací a v mnoha zemích i v kvótách. 10

11 2. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 2.1. Morfologie spermie JELÍNEK et. al. (2003) uvádí spermie jako nejdůležitější složku ejakulátu. Spermie je zralá, samčí pohlavní buňka schopná samostatného pohybu, s cílem aktivního vyhledávání a oplození vajíčka (MARVAN et. al., 1998). Spermie tvoří nejdůležitější složku ejakulátu. Jejich velikost a tvar jsou druhově rozdílné. (JELÍNEK et al., 2003). Spermie se skládá z hlavičky a bičíku Hlavička spermie Dle KRESANA et al. (1979) má zploštělý oválný tvar. Utváření hlavičky spermie je u jednotlivých druhů zvířat rozdílné. JELÍNEK et al. (2003) udává rozměry hlavičky spermie 10,00 µm dlouhá, 5,00 µm široká a 1,50 µm tlustá. S těmito hodnotami se ztotožňuje i VĚŽNÍK et al. (2004), jenž uvádí délku hlavičky 9,11 µm a šířku 5,05 µm. Hlavička spermie má zploštělý oválný tvar. Dle GAMČÍKA et al. (1976) je tvar hlavičky spermie podmíněn tvarem kondenzované nukleoplazmy. Podstatu hlavičky tvoří jádro pohlavní buňky obalené jadernou membránou. Přední pól hlavičky kryje čepičkový obal akrozóm. Povrch celé hlavičky a bičíku pokrývá cytoplazmatická membrána. Akrozóm Podle JELÍNKA et al. (2003) je akrozóm membránový útvar, pokrývající u býka přední apikální polovinu jádra, který je zakončen ekvatoriálním segmentem poloměsíčitého tvaru. Podle GAMČÍKA et al. (1976) je povrch akrzómu pokrytý cytoplazmatickou membránou. Dle KRESANA et al. (1979) se uvnitř akrozómu nachází akrozómová hmota obsahující řadu enzymů (hyaluronidáza, proakrozín, akrozín aj.), podílejících se na pronikání spermie do ovoplazmy při oplození vajíčka. Podle GAMČÍKA et al. (1976) nastává penetrační funkce akrozómu při kontaktu spermie s vajíčkem v pohlavních ústrojích samice. Autoři GAMČÍK et al. (1976) a KREASAN et al. (1979) poukazují, že akrozóm býka nemá tak pevnou konzistenci jako ostatní části spermie a je citlivý vůči osmotickým změnám vnějšího prostředí podobně jako mitochondrie. Při dlouhodobějším uchování semene podléhá akrozóm některým 11

12 degenerativním změnám, projevující se ztrátou ostrosti obrysů vnější blány a objevením světlých míst v akrozómu a jeho pučením. Nukleoplazma Struktura jádra hlavičky spermie je homogenní a kompaktní. V jádru hlavičky spermií se nachází otcovský genetický materiál v kondenzované formě vázaný na deoxyribonukleovou kyselinu, z které je vytvořený na husto nahromaděný chromatin. (GAMČÍK et al., 1976). Jádro spermie obsahuje pouze poloviční množství deoxyribonukleové kyseliny nesoucí genetické informace pro vlastnosti nového jedince (JELÍNEK et al., 2003) Bičík spermie Bičík jako ústrojí pohybu zprostředkuje transport spermie na místo oplodnění (GAMČÍK et al, 1976). Dle JELÍNKA et al.(2003) se velikost bičíku pohybuje v rozmezí 50,00-70,00 µm a představuje pohybové ústrojí spermie. KREASAN et al. (1979) uvádí, že bičík spermie je nejtenčí a nejdelší část spermie. Centriolový (implantační) oddíl krček spermie Je strukturálně i co do vývoje nejsložitější částí spermie. Jeho morfologickým podkladem jsou dvě ventrikly (proximální a distální) a tzv. segmentované chordy. Z obou cenriol se plně zachovala jen proximální, která dává vznik segmentovaným (hladkým) chordám. Distální centriol, z něhož vzniká axonema, se nachází u zralých spermií jen v podobě rudimentu. Proximální centriol spolu se segmentovanými chordami, které se na něj upínají, vytváří hlavici bičíku. Hlavice bičíku zapadá do implantační jamky na bázi hlavičky. Segmentované chordy nepřesahují krček spermie. Pozvolně se ztenčují a tupě zakončují, přitom se z vnější strany přikládají k hladkým chordám. Mezi segmentovanými a hladkými chordami se tak vytváří pevné klínovité spojení. Podkladem dalších oddílů bičíku spermie je komplex osových vláken. Vlákna mají charakteristické uspořádání. Ve středu se nachází pár vláken, které jsou duté (mikrotubuly), ostatní vlákna jsou uspořádané do dvou koncentrických kruhů (GAMČÍK et al., 1980). 12

13 Mitochondriální (spojovací) oddíl bičíku Mitochondriální oddíl je pokračováním krčku spermie, distálním směrem ohraničen Jensenovým kroužkem. Charakterizuje jej přítomnost mitochondrií. Počet a délka mitochondrií jsou podmíněny druhově a určují jeho délku. U býka je tato část bičíku asi o 50 % delší než hlavička spermie. Mitochondriální aparát spermie býka je složený asi z 90 individuálních mitochondrií. Jedna mitochondrie tvoří zhruba 3/4 závitu spirály. Celá mitochondriální pochva vytváří asi závitů (GAMČÍK et al., 1980). Dle MARVANA et al. (1998) mitochondriální pochva obsahuje ATP a enzymy, jenž jsou nezbytné pro pohyb spermie. Hlavní oddíl bičíku Hlavní oddíl bičíku představuje nejdelší část bičíku i celé spermie vůbec. Jeho podkladem je podobně jako v mitochondriálním oddílu komplex osových vláken. Hrubé vlákna (chordy) jsou v této části spermie o dost tenčí než na úrovni mitochondriálním oddílu a neustále se ztenčují. Z tohoto důvodu zhruba v poslední 1/4 hlavního oddílu bičíku je přítomna fibrózní pochva. Fibrózní pochva přímo pokrývá komplex osových vláken a zajišťuje soudržnost osových vláken a poskytuje pevnost a pružnost při kmitání bičíku (GAMČÍK et al., 1980). Koncový (terminální) oddíl bičíku Dle GAMČÍKA et al. (1976) je koncový oddíl bičíku nejdistálnější část bičíku spermie, dlouhý asi 4 mí. Osová vlákna už nejsou obalená žádnou pochvou, jen cytoplazmatickou membránou (MARVAN et al., 1998). Celá spermie (tj. hlavička a všechny oddíly bičíku) Celá spermie je pokryta nepřerušovanou dvouvrstevnou cytoplazmatickou membránou, která představuje základní ochranu spermie. Je acidorezistentní, vysoce permeabilní a citlivá na změny osmotického tlaku (GAMČÍK et al., 1976). Dle VĚŽNÍKA et al. (2004) se délka celé spermie pohybuje v rozmezí 68,90-73,90 µm. Permeabilita membrány umožňuje látkovou výměnu spermie. Na základě poznatku, že cytoplazmatická membrána u živé spermie nepropouští některá barviva (eozín) a permeabilita se zvýší u mrtvé spermie, byla vypracována metoda vitálně letálního barvení, umožňující rozlišovat živé a mrtvé spermie. Poškození permeability membrán 13

14 může nastat při dlouhodobé konzervaci spermií (při zmrazování) a může tak snížit oplozovací schopnost spermie (GAMČÍK et al., 1976). Vzhledem ke své oplodňovací funkci spotřebuje spermie velké množství energie na pohyb. V metabolismu spermií převládají katabolické reakce. Substrátem pro tyto reakce jsou vlastní zásobní látky (endogenní) a též látky nacházející se v sekretu přídavných pohlavních žláz (exogenní) (KRESAN et. al., 1979) Semenná plazma Semenná plazma obsahuje převážně sekrety přídatných pohlavních žláz. Je to tekutina druhově specifického množství a barvy, rozdílného ph (6,20 7,50) a konzistence. Představuje přirozené prostředí pro spermie, umožňuje jejich výživu a transport v pohlavních orgánech samice. Má relativně stálý osmotický tlak a vyznačujese velkými pufračními schopnostmi. Obsahuje minerální látky, bílkoviny, cukry, kyselinu citrónovou a askorbovou, četné enzymy a kromě dalších látek i biologicky aktivní složky jako jsou prostaglandiny, estrogeny a androgeny (JELÍNEK et al., 2003). Podíl semenné plazmy na celkovém objemu je rozdílný. Stejně tak je i rozdílný podíl sekretu jednotlivých přídatných pohlavních žláz na celkovém objemu ejakulátu. U býka činí podíl semenné plazmy 90 % (JELÍNEK et. al., 2003). Chemická skladba, celkový objem ejakulátu i koncentrace spermií jsou druhově a individuálně značně rozdílné. Semenná plazma rovněž stimuluje pohyb spermií (GAMČÍK et al., 1969) Chemické složení zralé spermie Spermie obsahují kolem 25,00 % sušiny. Chemické složení sušiny základních částí spermie je značně odlišné. Hlavička spermie je složena převážně z kyseliny deoxyribonukleové, vázané na protein. Spojovací část a bičík se vyznačují vysokou koncentrací lipidů a různých enzymů (GAMČÍK et al, 1976). Kyselina deoxyribonukleová vzniká z kyseliny ribonukleové především v období vzniku primárních spermiocytů. Je hlavním genetickým materiálem všech buněk a proto její poškození má za následek ztrátu, nebo snížení oplozovací schopnosti spermií.ve zralých spermiích byla mimo deoxyribonukleové kyseliny zjištěna i kyselina ribonukleová. Její obsah je však velmi malý (GAMČÍK et al., 1976). 14

15 GAMČÍK et al. (1976) udává, že bílkoviny tvoří přes polovinu váhy spermií. Akrosom, pokrývající hlavičku spermie je složen z mukopolysacharidů (obsahuje manozu, fruktozu, galaktozu) (GAMČÍK et al., 1969). Spojovací část a celý bičík spermie jsou bohaté především na fosfolipidy, vázané pravděpodobně na bílkoviny. Plasmogen je hlavní složkou fosfolipidů v semeni. V semeni býka dosahuje plasmogen hodnot od 30,00 90,00 mg/100 ml. Což odpovídá 0,30 0,90 g ve 100 g sušiny spermií. Cytoplazmatická membrána, pokrývající celou spermii,) je mimořádně pružná. Je složena z proteinu, který je podobný keratinu. zevní koloidní vrstvičku lipoproteidovaného charakteru získávají spermie při průchodu nadvarletem (GAMČÍK et al., 1976). Minerální látky byly ve spermiích nalezeny v 1,00 2,00 %. Nejvíce v fosforečné formě, v menší míře v chloridové a síranové podobě. Býčí spermie obsahují 173,00 mg % sodíku, 241,00 mg % draslíku, 17,00 mg % vápníku. Dále bylo v býčích spermiích prokázáno asi 7,00 mg % železa, 9,20 mg % mědi a 7,00 mg % zinku. Železo, měď i zinek byly zjištěny především ve spojovací části bičíku (GAMČÍK et al., 1976). V ejakulátu byla prokázána řada enzymů, jako alkalická a kyselá fosfatáza, adenozintrifosfatáza, hexokináza, aldoláza, cytochromoxydáza, hyaluronidáza, mucináza aj. Některé z uvedených enzymů se nacházejí především ve spermiích, jiné v semenné plazmě (GAMČÍK et al., 1976). Dle GAMČÍKA et al. (1980) je hyaluronidáza enzym savčích spermatozoidů, jemuž se přisuzuje schopnost zkapalňování povrchu ovulovaných vajíček pro usnadnění styku mezi samčími a samičími gametami.semeno obsahuje i ferment mucinázu. Tento enzym zkapalňuje mucin v pochvě jakož i sekret v děloze, čímž umožňuje větší pohyblivost spermiím. Kataláza, rozkládající H 2 O 2, se ve spermiích savců vyskytuje jen v minimálním množství. V čistě odebraném ejakulátu je kataláza přítomna ve velmi malém množství. Na přítomnosti katalázy v odebraném semeni je založena metoda pro hodnocení hygienické kvality ejakulátu býka (GAMČÍK et al., 1976). Indofenoloxydáza se vyskytuje asi v 71,00 % ve spermiích a 29,00 % v semenné plazmě. Označuje se také jako ferment dýchání, neboť v tomto procesu hraje u spermií význačnou úlohu. Hexokináza u býka nebyla zjištěna.v semenné plazmě je několik defosforylačních enzymů, z nichž nejaktivnější je kyselá fosfatáza a alkalická fosfatáza (GAMČÍK et al., 1976). 15

16 Chemické složení semenné plazmy Semenná plazma je tvořena sekrety přídavných pohlavních žláz i vývodných cest (GAMČÍK et al., 1976).Obsahuje minerální látky, bílkoviny, cukry, kyselinu citrónovou a askorbovou, četné enzymy a kromě dalších látek i biologicky aktivní složky jako jsou prostaglandiny, estrogeny a androgeny (GAMČÍK et al., 1969) Druhové vlastnosti ejakulátu a jeho složení Dle GAMČÍKA et al. (1980) dochází v průběhu ejakulace k vypuzování zralých spermií z ocasu nadvarlete a ampulí chámovodu do vývodných pohlavních cest, kde se setkávají se sekrety přídatných pohlavních žláz. Dochází nejen k jejich zředění, ale i k probouzení pohyblivosti spermií. Proces ejakulace, který je výrazem souhrny jednotlivých pohlavních reflexů, neprobíhá u všech druhů zvířat stejně rychle. U přežvýkavců, hlodavců a ptáků vrcholí ejakulační reflex jednorázovou ejakulací trvající 2 4 vteřiny. Pořadí, v jakém jsou spermie a jednotlivé sekrety ejakulovány, jakož i podíl těchto složek na celkovém objemu ejakulátu, není u všech živočišných druhů stejný. (GAMČÍK et al., 1980). Podle GAMČÍKA et al. (1969) u býka dochází při pohlavním vzrušení nejdříve k vylučování sekretů bulbouretrálních žláz a tento sekret, jak je tomu konečně i u jiných druhů zvířat, upravuje ph uretery. GAMČÍK et al. (1976) uvádí, že spermie a další sekrety přídatných pohlavních žláz jsou po této fázi ejakulovány téměř současně. Po odstředění 5,00 ml hustého semene lze získat asi 4,50 ml semenné plazmy, což znamená, že semenná plazma se podílí na celkovém ejakulátu býka asi z 90 %. Větší část semenné plazmy, a tedy i ejakulátu je tvořena sekrety váčků semenných a relativně velký podíl tvoří i sekrety žláz uretrálních, které jsou vylučovány během celé ejakulace a představují i u hustého semene konečnou fázi ejakulát. Dle GAMČÍKA et al. (1976) se sekret prostaty podílí na celkovém objemu ejakulátu jen malou měrou. Ejakuláty přežvýkavců jsou bohaté především na fruktózu, kyselinu citronovou a glycerylfosforylcholin. Fruktoza představuje pro spermie většiny savců nejdůležitější pramen energie. V rozředěném spermatu býka, v případě nepřítomnosti jiných glykolysujících substancí, musí být v 1,00 ml asi 0,25 mg fruktozy, aby byla udržena pohyblivost spermií. Vzhledem k tomu, že tvorba fruktozyje pod vlivem testosteronu, 16

17 je její obsah v semeni dobrým indikátorem pro endokrinní funkci varlat a předního laloku hypofýzy. Nepoukazuje však na kvalitu ejakulátu a je často v obráceném poměru ke koncentraci spermií (GAMČÍK et al., 1976) Fyzikální vlastnosti semene Pro ejakulát je příznačným rysem rozmanitost jeho složení a to nejen při vzájemném srovnání různých druhů, ale také u jedinců jednoho a téhož druhu. Řada faktorů vnitřního a vnějšího prostředí má vliv na chemické složení a fyzikální vlastnosti ejakulátu, a proto přesné zjišťování kvality semene u kteréhokoliv jedince může být učiněno jen na základě opakovaného vyšetření (GAMČÍK et al., 1980) Objem ejakulátu Objem ejakulátu je typický pro daný druh zvířat a jeho velikost a kolísá vždy v určitých hranicích. Na základě pokusů s jednovaječnými dvojčaty býčků bylo zjištěno, že v období intensivního růstu jedince může snížená forma stravitelnosti bílkovin i škrobových jednotek nepříznivě ovlivnit velikost ejakulátu. Přiměřené snížení normy u starších býčků však na produkci semene negativní vliv nemá (GAMČÍK et al., 1976). KLIMENT et al. (1989) uvádí průměrný objem ejakulátu býka s rozpětím 2,00-12,00 ml. BOTTO et al. (1967) udává objem býčího ejakulátu v rozmezí 5,00 6,00 ml. JELÍNEK et. al. (2003) uvádí objem býčího ejakulátu kolem 4,00 ml. Stejná hodnota, tedy 4,00 ml je uváděna i VĚŽNÍKEM et al. (2004). I MIHOLOVÁ, LIPSKÝ (1976) udávají objem ejakulátu u býka v rozmezí 4,00-5,00 ml. S uvedenými hodnotami se shoduje i LOUDA et al. (1980). Objem ejakulátu se dle autora pohybuje v rozmezí od 3,00 do 10,00 ml. Býci dojných plemen mívají zpravidla větší objem ejakulátu než býci masných plemen (BOTTO et al., 1967). Objem ejakulátu u pohlavně dospělých zvířat záleží na pravidelných intervalech odběru, především na stavu endokrinní soustavy a na stupni sexuálního podráždění v době odběru. GAMČÍK et al. (1980) konstatoval, že při snížení objemu pod 4,00 ml a při zvýšení nad 12,00 ml dochází k snížení fertility. Při odběrech semene prováděných bez většího časového intervalu je objem ejakulátu býka z druhého odběru větší než u prvního ejakulátu (GAMČÍK et al., 1976). Dle ČSN je objem stanoven měřením s přesností na 1 cm 3, eventuálně vážením s přesností 17

18 na 1 g. U plemenných býků, pravidelně odebíraných, se potvrdila významná role úrovně koncentrace cholesterolu, celkových lipidů a močoviny v jejich krevní plazmě ve vztahu k aktivitě, koncentraci spermií a objemu ejakulátu (MÁCHAL, 2000) Viskozita a specifická váha Specifická váha spermií je dána složkami kondenzovaných nukleárních a protoplazmatických proteinů, specifická váha semenné plazmy je pak přímým výsledkem skutečného osmotického tlaku, který působí elektrolyty a je tedy ve vztahu ke snížení bodu mrazu. Průměrná specifická váha semene činí 1, ,008. Je předpoklad, že poměrně velké kolísání specifické váhy semene býka je podmíněno také proměnlivým počtem zralých (těžších) spermií a nezralých (lehčích) spermií v ejakulátu. (GAMČÍK et al., 1976). Objektivním indikátorem aktivity spermioetického epitelu je množství spermií v 1 ml a v celém ejakulátu. Viskozita a specifická váha spermatu je závislá z největší části na koncentraci spermií (GAMČÍK et al., 1980) Koncentrace spermií Autoři MIHOLOVÁ, LIPSKÝ (1976) uvádějí množství spermií v 1 mm 3 mezi 1-2 miliony. VĚŽNÍK et al. (1992) konstatoval rozsah variační šíře koncentrace spermií v býčím semeni na 0,20 až 3,20 mld/cm 3. MÁCHAL (2000) uvádí průměrnou koncentraci spermií u býků 1,11 milionu v 1 mm 3. Dle KLIMENTA (1989) je minimální koncentrace spermií v ejakulátu použitého k výrobě inseminačních dávek v 1 mm Osmotický tlak Osmotický tlak spermatu je určován nejčastěji hodnotami deprese (snížením bodu mrazu). Osmotický tlak prostředí musí odpovídat osmotickému tlaku spermií. Semenná plazma tvoří pro spermie přirozené, isotonické prostředí. proto všechny poruchy osmotických poměrů v ejakulátu, ke kterým může dojít při onemocnění pohlavních orgánů včetně přídavných pohlavních žláz, mají nepříznivý vliv na životnost spermií. 18

19 2. 5. Spermatogeneze Dle REECE (1998) se výraz spermatogeneze vztahuje na celý proces, zahrnující transformaci kmenových buněk na spermie. Podle JELÍNKA et al. (2003) se spermie vytvářejí po dosažení pohlavní dospělosti v semenotvorných kanálcích varlete a celý proces jejich tvorby je označován jako spermatogeneze. GAMČÍK et al., (1976) uvádí, že základy semenotvorných kanálků vznikají už v čase embryonálního vývoje jedince v podobě pohlavních provazců. V pohlavních provazcích můžeme rozeznat prvopohlavní buňky (gonocyty) a buňky podpůrné. Podle JELÍNKA et al. (2003) se proces spermatogeneze uskutečňuje v pravidelných cyklech a probíhá kontinuálně v průběhu celého reprodukčního období života.dle GAMČÍKA et. al., (1976) spermiogenezi nelze urychlit ani zpomalit. JELÍNEK et al. (2003) konstatoval, že v počáteční etapě nemá spermatogeneze ještě pravidelný cyklický charakter a výsledkem je vyšší obsah nezralých forem spermií v ejakulátu. Začátek spermatogeneze u býka je MIHOLOVOU, LIPSKÝM (1976) uváděn sedmý měsíc věku zvířete. S dosažením plné pohlavní dospělostia stabilizací neuroendokrinní regulace pohlavních funkcí probíhá, spermatogeneze u většiny hospodářských zvířat v pravidelných cyklech v průběhu celého roku. Spermatogenetické cykly následují za sebou v přesných časových intervalech, přičemž každý cyklus začíná asi o 1 / 4 délky dřív než cyklus předcházející. (GAMČÍK et al., 1976). JELÍNEK et al.(2003) uvádí délku jednoho spermatogenního cyklu býka kolem 54 dnů Období rozmnožování (období mitotického dělení) Období rozmnožování je charakterizováno opakovaným mitotickým dělením původních kmenových buněk A spermatogonií (primordiálních gonocytů). Každá mateřská buňka A spermatogonie se rozdělí na dvě nestejně velké dceřinné buňky. Jednu větší a podobnou mateřské buňce (A spermatogonie), která zůstává po delší dobu v latentním stádiu (interfáze) a druhou, menší intermediární buňku (typ I m ), která se opětovně několikrát dělí a výsledkem jsou buňky typu B (spermatogonie). Dělením B spermatogonií v závěru rozmnožovací fáze vznikají spermatocyty I. řádu - primární spermatocyty (JELÍNEK et al., 2003). 19

20 Období růstu Dle GAMČÍKA et al., (1976) dělením B - spermatogonií vznikají spermatocyty. Na období množení navazuje období růstu, kdy spermatocyt I. řádu zvětší svůj objem (JELÍNEK et al., 2003) Období meiózy (období zracích dělení) Pole GAMČÍKA et al. (1976) je tato fáze charakteristická růstem a zracím dělením spermiocytů.výsledkem meiózy je redukce počtu chromozomů na polovinu, diploidní se mění na haploidní a rekombinace genetických vloh. Vstupují do ní spermatocyty I. řádu a v prvním meiotickém dělení vznikají dva spermatocyty II. řádu. Druhým meiotickým dělením vznikají čtyři spermatidy. Jsou charakterizovány přítomností vždy jen jednoho sexchromozomu X-, nebo Y- chromozomu, poměr spermatid se zřetelem na sexchromozomy je 50 : 50 (JELÍNEK et al., 2003) Období metamorfózy (spermatohistogeneze, spermiogeneze) Spermatohistogeneze je poslední fází spermatogeneze, při níž se okrouhlá a nepohyblivá spermatida mění ve štíhlou, kopinatou a pohyblivou spermii. Probíhá ve výběžcích podpůrných buněk a dílčí stadia metamorfózy jsou označována jako Golgiho stadium (JELÍNEK et al., 2003). Podle GAMČÍKA et al., (1976) se při jádru mladé spermatidy tvoří základ pro akrozóm. Stadium akrozomové čepičky Stádium akrozomové čepičky - základ pro akrozóm se zvětšuje a přikládá se na jádro a nakonec jako akrozomová čepička pokrývá celou přední polovinu jádra spermatidy. Na opačné straně vzniká při jádru základ pro bičík (GAMČÍK et al., 1976). Stádium kaudální manžety Kulaté jádro spermatidy se mění na zploštělou hlavičku spermie. Vzniká kaudální manžeta, jenž se upíná na rovníku jádra. Akrozomóvá čepička podléhá dehydratačním změnám, pravděpodobně k redukci akrozomového materiálu (GAMČÍK et al., 1976). Stádium zrání Kaudální manžeta se rozplývá podél přední části jádra a mizí. Vzniká bičík a akrozóm,nepotřebná cytoplazma odchází. Nejdřív se vyvíjí obal hlavního oddílu bičíku, tzv. fibrózní pochva a potom hrubá mitochondriální pochva. Po odchodu 20

21 nepotřebné cytoplazmy a dehydrataci akrozómu, je skončená přeměna spermatidy na spermii. Spermie se uvolňují ze svazku se Sertoliho buňkou a jako volné buňky odcházejí ze semenotvorných kanálků do lumena semenných kanálků a vývodných cest. Prostup vývodným semenným kanálkem trvá dní. Až do ejakulace jsou spermie uskladněné v hlavě nadvarlete a nevykazují schopnost aktivního pohybu (GAMČÍK et al., 1976). Spermatogenní výkonnost varlat je druhově odlišná, avšak denní produkce spermií je u všech druhů relativně vysoká. U býků je denně vyprodukováno 2,50 9,00 * 10 9 spermií. Jeden gram testikulární tkáně býka má schopnost vyprodukovat za 1 min 5,00 10,00 * 10 3 spermií, za den 7,00 14,00 * 10 6 spermií (JELÍNEK et al., 2003). REECE (1998) uvádí denní produkci spermií u býků okolo 6,00 * U býků se s věkem denní produkce zvyšuje a dosahuje maxima okolo 7 let (REECE, 1998) Semeno býka Požadavky na kvalitativní ukazatele býčího spermatu jsou uvedeny v tabulce č. 1 Tab. č. 1 Požadavky na kvalitativní ukazatele býčího spermatu (Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 471 / 2000 Sb.) a) neobsahuje původce nebezpečných nákaz a nemocí, v intervalu 6 měsíců je laboratorně vyšetřováno na přítomnost patogenních mikroorganismů (včetně patogenních plísní) b) neobsahuje přimíseniny ani shluky spermií Čerstvé c) má bílou barvu s odstínem šedým až krémovým (dovoleno je žlutavé sperma zabarvení) a ostatní charakteristické vlastnosti (pach, zrnitost) d) hustota nemá být nižší než spermií v 1 mm 3 e) aktivita spermií je nejméně 70 % f) obsahuje nejméně 80 % morfologicky normálních spermií a nejvýše 10 % primárních změn 21

22 K hodnocení býčího spermatu slouží Vyhláška Ministerstva zemědělství č.471/2000 Sb. Hodnocení spermatu Tab. č. 2 Hodnocení spermatu (Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 471 /2000 Sb.) Hodnocení: Hodnotí se: Způsob hodnocení: Zdravotní nezávadnost spermatu u odebíraných býků Čerstvého spermatu Barva, konzistence a pach Objem Obsah přimísenin Hustota spermatu Aktivita spermatu (u každého ejakulátu) Výskyt abnormálních spermií Nejméně jednou za půl roku veterinárním vyšetřením Smyslovým posouzením Měřením nebo vážením u každého ejakulátu s přesností na 1 cm 3 (g) Smyslovým posouzením ve sběrači a mikroskopicky Fotometrem u každého ejakulátu (kontrolní propočty, či kalibrace přístrojů se provádějí v Bürkerově komůrce ) Mikroskopicky při zvětšení 1 : 200 až 300 a při teplotě 39 ± 1 C, kdy se odhadem zjišťuje procentické zastoupení spermií pohybujících se vřed za hlavičkou Mikroskopicky při zvětšení 1 : 1000 až 1500 a vyjadřuje se v %; u provozních býků nejméně jednou za měsíc Laboratorní vyšetření semene Laboratorní kontrola semene je důležitým předpokladem pro používání plnohodnotných ejakulátů při zajišťování dobré plodnosti prostřednictvím umělé inseminace. Pravidelné spermiologické zkoušky umožňují včas eliminovat nekvalitní ejakuláty s nevyhovující fertilizační schopností. Při sledování kvality a množství ejakulátu býků využívaných v inseminačních stanicích, je patrné, že kvalita ejakulátu jednoho a téhož plemeníka se mění. Určitá fertilizační schopnost spermií plemeníků není v současné době v našich možnostech, a tak je u ejakulátů, které se používají pro následné zpracování a inseminaci, prováděno hodnocení jejich kvantitativních a kvalitativních ukazatelů prostřednictvím mnoha speciálních laboratorních metod (MÁCHAL, 2000). Kvalita semene se může měnit dle podmínek krmení, ošetřování plemeníka, režimu připouštění, jeho zdravotního stavu, plemenné příslušnosti, věku a ročního období. 22

23 Kontrola semene se provádí hlavně za účelem: I. Určení kvality každého ejakulátu a zjištění jeho vhodnosti pro používání v umělé inseminaci. II. Určení plodnosti plemeníka a jeho schopnosti pro používání v umělé inseminaci. Laboratorní vyšetření semene obsahuje: 1. Makroskopické metody objem, konzistence, barva, pach, obsah hlenu, cizích příměsí 2. Mikroskopické a cytochemické metody A) Stanovení pohyblivosti B) Stanovení koncentrace C) Morfologická analýza - stanovení % malformovaných spermií pomocí barvení. Stanovení buněčných elementů v ejakulátu, měření spermií, zkouška rezistence spermií, zkouška přežitelnosti spermií aj. 3. Biochemické metody stanovení ph, stanovení fruktózy a katalázy Makroskopické hodnocení spermatu Makroskopické hodnoty ejakulátu jsou v značné míře druhově závislé. Posuzují se smyslově, bezprostředně po odběru semene. Při vyšetření se hodnotí objem, hustota, barva, pach ejakulátu, ph, dále obsah hlenu a cizích přimísenin (GAMČÍK et al. 1976). Objem ejakulátu Objem ejakulátu kolísá a závisí na druhu, plemeni, věku, váze plemeníka, intenzity pohlavního využívání, stupně pohlavního vydráždění, způsobu odběru semene, krmení, ošetřování, ročního období, genetického založení a zdravotního stavu plemeníka. Objem ejakulátu se hodnotí přímo v graduovaných sběračů, graduovaných zkumavkách, případně odměrných válců (GAMČÍK et. al. 1976). Hodnoty objemu býčího ejakulátu již byly vedeny v kapitole Objem ejakulátu Barva a zakalení ejakulátu Barva a zakalení ejakulátu závisí od jeho hustoty a konzistence a je posuzován proti světlu. Ejakulát býka je mléčné barvy, někdy šedobílé, mírně nazelenalé při přítomností laktoflavinu (GAMČÍK et. al., 1976). JELÍNEK et. al. (2003), MIHOLOVÁ, LIPSKÝ (1976), LOUDA et al. (1980) se shodují s bělavě nažloutlým, smetanovitým vzhledem býčího ejakulátu. V suchém období bývá často žlutobílé barvy. 23

24 Žluté zbarvení ejakulátu e ovlivněno obsahem karotenu v krmivu (GAMČÍK et. al., 1976). Hustota, zrnitost a konzistence ejakulátu Hustota, zrnitost a konzistence ejakulátu závisí na obsahu sekretů přídatných pohlavních žláz a vývodných pohlavních cest. Hustý ejakulát dobré kvality je táhnoucí se tekutina smetanovitého mírně zrnitého vzhledu, v kterém se pomalu pohybují zrníčka masová aktivita ejakulátu. Tyto vlastnosti jsou typické pro ejakuláty přežvýkavce. Hustota, zrnitost a konzistence ejakulátu se posuzují na okraj sběrače v dopadajícím světle, nebo ve zkumavce přecházejícím světle (GAMČÍK et al., 1976). JELÍNEK et al. (2003) uvádí průměrnou koncentraci spermií kolem 1000 tis. v mm 3. Pach ejakulátu Pach ejakulátu je druhově specifický. Autoři MIHOLOVÁ, LIPSKÝ (1976) společně s LOUDOU et al. (1980) uvádí, že býčí ejakulát páchne po čerstvém mléku. Změna charakteristického pachu upozorňuje na změnu kvality ejakulátu. Změněný pach souvisí zpravidla se zvětšeným množstvím přimísenin jako moče, hnisu a krve. Hnilobný zápach poukazuje na chronické chorobné procesy ve varleti nebo v přídavných pohlavních žlázách. Kvalitní ejakulát býka připomíná pach čerstvě nadojeného mléka. Pach ejakulátu může být ovlivněn krmivem (GAMČÍK et al., 1976).Dle LOUDY et al. (1980) je ejakulát posuzován čichem ve sběrači. Cizí přimíseniny Dle LOUDY et al. (1980) dobré sperma je prosto přimísenin. Z cizích přimísenin se v ejakulátu nejčastěji vyskytují vazelína, chlupy, nečistoty z předkožky, prach, písek a.jiné. takto znečištěny ejakulát se nesmí použít pro inseminaci (GAMČÍK et al., 1976) Mikroskopické vyšetření ejakulátu Ne všechny spermie, které jsou produkovány při spermiogenezi můžeme označit za normálně vyvinuté, proto je nutné přistoupit k mikroskopickému vyšetření, jenž odhalí všechny abnormity vyskytující se ve vyšetřovaném ejakulátu. Mikroskopické vyšetření zahrnuje posouzení koncentraci spermií, aktivity spermií. Koncentrace spermií Koncentrace spermií je hlavním ukazatelem biologické kvality. Vyjadřuje se počtem spermií v 1 mm 3 ejakulátu a je ukazatelem pro určení stupně ředění spermatu. 24

25 Koncentrace je závislá na frekvenci odběru. Stanovení koncentrace spermií hemocytometricky, fotometricky a počítáním částic. Hemocytometrické stanovení: plocha čtverce ve kterém se stanovuje počet spermií je 1/25 mm 2 a hloubka komůrky je 1/10 mm 2. Vzorec pro výpočet obsahuje počet napočítaných spermií v 10 čtvercích, plochu čtverce, stupeň ředění a výšku komůrky. Prohlíží se při zvětšení 200x až 400x. Stanovení spermií fotokolorimetrem: jedná se o stanovení stupně zákalu, který vznikne po standardním naředění 0,1 ml nativního semene ve fyziologickém roztoku. Přibližný odhad hustoty se hodnotí v Bürkerově komůrce podle určitých kritérií (VĚŽNÍK et al., 2004). Aktivita spermií Aktivitou spermií se rozumí pohyb spermií vpřed za hlavičkou a je posuzována u každého spermatu (LOUDA et al., 1980). Posuzuje se mikroskopicky při zvětšení 200 až 300 krát. Vyjadřuje se procentickým odhadem spermií, které se pohybují progresivně a přímočaře vpřed za hlavičkou. Pozorující si musí všímat i abnormálních forem pohybu spermií, mezi něž patří: kolébavý pohyb na místě, pohyb do kruhu, zpětný pohyb, trhavý nepravidelný pohyb a vířivý pohyb. Dle KLIMENTA et al. (1989) a VĚŽNÍKA et al. (2004) minimálně 70 % spermií musí vykazovat aktivní přímočarý pohyb vpřed za hlavičkou. Vedle pohybu přímočarého vpřed za hlavičkou je třeba sledovat i ostatní druhy pohybu, které se hodnotí jako závadné (kolébavý, kruhový aj.) (LOUDA et al. 1980). MÁCHAL (2000) udává průměrnou aktivitu spermií 80 %. K posouzení aktivity se používají metody spermiokinnematografické, jejíž princip spočívá ve fotografickém záznamu pohybujících se spermií za určitý časový úsek. Aktivní spermie se jeví jako neostré stíny (VĚŽNÍK et al., 1992). Další možností stanovení motility spermií a charakteru jejich pohybu je metoda pomocí trajektorií zaznamenaných systémem analýzy obrazu - LUCIA a metoda objektivní analýzy pohybu spermií, jenž je založena na počítačové analýze (CASA) (VĚŽNÍK et al., 2004) Morfologická analýza Poznatky o morfologických abnormalitách mohou přispět ke zjištění příčin neplodnosti plemeníků (LOUDA et al., 2001). Morfologický obraz zjišťujeme mikroskopickým posouzením minimálně 200 spermií a stanovením procenta abnormálních, nebo morfologicky změněných spermií. Hodnocení se provádí na obarveném nátěru a zvětšení krát. Pro přehledné metody barvení se 25

26 používají metody dle Hancocka a Farellyho. V současné době se doporučuje při morfologické analýze postupovat tzv. striktní analýzou spermatické morfologie a k hodnocení využít programu SASMO (LOUDA et al.,2001). Pro býky byly stanoveny hodnoty přípustné frekvence patologicky změněných spermií do 20 %, aniž by byla narušena fertilizace spermií. Maximální výskyt morfologicky změněných hlaviček spermií byl stanoven hodnotou 5 %. Přípustná frekvence morfologických změn na akrozómu spermií byla LOUDOU et al. (1980) stanovena na maximální 10 % hodnotu. Degenerativní formy změněných spermií jsou v ejakulátu přípustné do 5 %. Nezralé spermie se zadrženou protoplazmatickou kapénkou na spojovací části bičíku, nesmí překročit hranici 2 % (KLIMENT, 1989). Pro vývin budoucího jedince hraje důležitou úlohu morfologicky správně vyvinutá spermie, která musí mít především dobře vyvinutý akrozóm a dostatečné množství fermentů, nukleoplazmu s dostatečným obsahem deoxyribonukleové kyseliny a správně formovaný bičík s neporušenou spojovací částí. Morfologicky abnormálně vyvinuté spermie mohou ovlivnit plodnost, a to jako faktor schopný vytvořit jen defektní zygotu, jednak jako faktor, který blokuje fertilitu normálních spermií po vniknutí abnormálního elementu do vajíčka. Morfologicky malformované spermie omezují též pohyb spermií. Některé fyzikální testy dokázaly, že neporušené hlavičky spermií mohou klást až 13 x větší odpor, což při stejné spotřebě energie znamená o 5 % nižší rychlost spermií. Morfologickému studiu spermií se věnuje velká pozornost a přední místo mezi laboratorními vyšetřovacími metodami (GAMČÍK et al., 1976) Výskyt morfologicky změněných spermií Samčí pohlavní buňky překonávají v období spermiogeneze celou řadu změn, následkem kterých vzniká přirozený odpad malformované spermie. Jejich frekvence za normálních okolností nemá přesahovat u býka víc než % patologicky změněných spermií. Z celého počtu patologicky změněných spermií nesmí překročit degenerativní formy 5 %, tvarově změněné hlavičky 5 % a změny na akrozómu 10 %. Nezralé spermie nesmí překročit 2 % hranici (GAMČÍK et al., 1976). Při vzniku defektních spermií se uplatňuje celá řada činitelů toxicko infekčního, fyzikálně chemického, alimentárního a genetického původu.v závislosti od intenzity 26

27 mechanizmu a místa jejich účinku může nastat úplná porucha v produkci spermií, s následnou částečnou či úplnou poruchou tvorby spermií, či tvorba defektních spermií (GAMČÍK et al., 1976). Morfologické změny spermií se rozdělují na primární a sekundární Primární změny Primární změny vznikly v čase spermatogenního cyklu až po příchod do hlavy nadvarlete. Primární změny poukazují na poruchy semenotvorného a vývodného systému. Mezi primární změny se zařazují degenerativní formy spermií, tvarové změny na hlavičce (hruškovitá, vejcovitá, citrónovitá atd.), změny v nukleoplazmě spermií, v nerovnoměrném rozdělení akrozomové hmoty (akrozomový defekt, tvarové změny na spojovací části a vývojové anomálie spermií) (GAMČÍK et al., 1976). PETELÍKOVÁ, MLÁDEK, ZELENKA (1996) rozdělují primární morfologické změny na spermiích takto: Změny na hlavičce tetratoidní formy, zdvojená hlavička, tvarové abnormality, perzistující abroblast, kondenzace akrozomové hmoty, zahuštění kalíšku Změny na bičíku zdvojený bičík, zesílený bičík, kyjovitý bičík, nevyvinutý bičík, zavinutý bičík, torze bičíku, tvarové abnormity spojovací části, abaxiální nasazení, rozvlákněná mitochondriální spirála bičíku Ostatní - dekapitace Sekundární změny Dle LOUDY et al. (2001) sekundární změny vznikající při delším pobytu v hlavě nadvarlete. Dále takové, které vznikají v momentu ejakulačního reflexu, špatnou manipulací s odebraným spermatem, nesprávnou přípravou preparátu. Sekundární změny jsou projevem kvalitativních změn v semenné plazmě, jejich množství závisí na správném dodržení techniky přípravy preparátu a technologického postupu při ředění a chlazení semene. Mezi sekundární změny patří např. změny na hlavičce spermií pučení, uvolnění, potrhání akrozomu, některé dvojité formy, potrhaný bičík, torze bičíku různého stupně a nezralé formy spermií (GAMČÍK et al., 1984). 27

28 PETELÍKOVÁ, MLÁDEK, ZELENKA (1996) rozdělují sekundární morfologické změny na spermiích na tyto: Změny na hlavičce akrozóm zbobtnalý, akrozóm svlečený, uvolnění kalíšku jádra, mapovité zabarvení hlavičky Změny na bičíku nalomení v krčku, zlomená spojovací část, rozvlákněná mitochondriální spirála, retence protoplazmatické kapénky, zlomený v hlavní části Ostatní dekapitace Vývojové a tvarové anomálie degenerativního charakteru se vyskytují jen v ojedinělých případech, většinou jako odpad při produkci spermií. Jejich procento se zvyšuje při poruchách v semenotvorném epitelu. Do této skupiny deformací se zařazují spermie, které se svým tvarem zřetelně liší od normálně formovaných spermií, např. spermie s nedostatečně diferenciovanou hlavičkou, spojovací částí a bičíkem. Dále sem patří tzv. spermie diploidní (dvojité, trojité hlavičky; dvojité, trojité bičíky). Výskyt těchto anomálií ve vyšším % vzbuzuje podezření na genetickou příčinu, případně na vážné degenerativní změny jiné příčiny (GAMČÍK et al., 1976). Diploidní spermie se nenacházejí v semeni normálně fertilních býků (0,104 %). Pro detekci diploidních spermií musí být hodnocených aspoň 1000 spermií. Hlavičky diploidních forem se intenzivněji barví a mají dvojnásobný obsah deoxyribonukleových kyselin, podobný nález je i v primárních a sekundárních spermatocytů a spermatidách. Předpokládá se, že příčinou vzniku diploidních spermií je porucha druhého meiotického dělení. Nálezy dvojitých případně trojitých forem třeba posuzovat opatrně, protože mohou být vyvolané artefaciálně (GAMČÍK et al., 1976) Morfologické změny spermií Ve varlatech plemeníků je denně vytvořeno až 35 miliard spermií. Ne všechny spermie, které jsou vyprodukovány můžeme označit za normálně vyvinuté. Vysoká buněčná produkce je provázena přirozenou tvorbou nedostatečně kvalitních buněk. Morfologické změny na spermiích rozdělujeme na: 28

29 Patologické poruchy hlaviček spermií Odchylky od normálního tvaru hlaviček mají být hodnoceny s přihlédnutím na funkci hlaviček jako nositelky genetické hmoty a penetračního útvaru. Změny se mohou projevit při nesprávném obsahu deoxyribonukleové kyseliny, v tvaru a velikosti hlavičky, v tvaru a uspořádání akrozomálního systému a formou báze hlavičky. Na nerovnoměrné rozdělení deoxyribonukleové kyseliny poukazuje malá, či obrovská hlavička. Dle LOUDY et al. (1980) nemá překročit výskyt těchto anomálií hranici 5 %. Při některých pohlavních nákazách virového původu můžeme pozorovat vyšší % anomálií hlaviček spermií jako jsou hlavičky zúžené, hruškovité, citrónovité (GAMČÍK et al., 1969). Dle VĚŽNÍKA et al. (2004) výskyt malformovaných hlaviček je možno experimentálně navodit i artefaciálním kryptorchismem. Při takovém experimentu měli autoři možnost, setkat se již po 20 dnech od zahájení pokusu, s případy zúžených hlaviček, různých hruškovitých tvarů, později s formami abortivními. Většina případů zúžených spermií a hruškovitých forem hlavičky souvisé s ovlivněním testikulárních funkcí poruchou termoregulace, nebo endokrinních mechanismů v řízení. Báze hlavičky spermie může vykazovat odchylky od normálu jako např. báze plošná, hluboko stáhnutá, široká nebo úzká. Tyto změny vznikají při konečné fázi spermiogeneze, anebo při nepravidelném nahromadění chromatinu (GAMČÍK et al.,1980) Změny na akrozómu a vnitřní struktuře nukleoplazmy Na počtu změněných spermií se ve značné míře podílejí změny na akrozómu. Mezi změny na akrozómu se nejčastěji zařazuje svlečený akrozóm, perzistence ekvatoriálního segmentu a pučením segmentu. Při svlečeném akrozómu je hlavička v přední části zúžená a rovnoměrně zbarvená (GAMČÍK et al., 1976). Dle LOUDY et al. (1980) se svlečený akrozóm často vyskytuje u býků s porušenou plodností. Tato změna se vyskytuje sekundárně při stárnutí spermií v ocase nadvarlete, při biofyzikálních změnách v sekretech přídavných pohlavních žláz, při porušení osmotických poměrů a při vývojových poruchách (GAMČÍK et al., 1976) Změny na bičíku spermie Do komplexu změn můžeme zařadit změny na spojovací části a na vlastním bičíku spermií. Nejčastější změna na spojovací části bičíku je jeho zkrácení, 29