MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BRNO 2015 NIKOLA ZEMÁNKOVÁ

2 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat ASPEKTY SPERMATOLOGICKÉHO VYŠETŘENÍ INSEMINAČNÍCH DÁVEK BÝKŮ Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Martin Hošek, Ph.D. Vypracovala: Nikola Zemánková - Brno 2015

3

4

5 ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem práci: Aspekty spermatologického vyšetření inseminačních dávek býků vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše. V Brně dne:.... Podpis

6 PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala Ing. Martin Hošek, Ph.D. za odborné vedení práce, věcné připomínky, dobré rady a vstřícnost při konzultacích a vypracovávání bakalářské práce.

7 ABSTRACT Title: Aspects spermatological examination doses of semen of bulls The aim of this work is to focus on the reproductive system of bulls, identify methods used for breeding cattle. The work aims to describe the methods used in obtaining insemination doses and how they obtained the insemination dose can be assessed. At work, I will address in particular the issue of evaluating the quality of long-term conservation doses of semen of bulls. I will focus on evaluating the quality of insemination doses of conventional methods of microscopic and microbiological examination. Furthermore, even a special examination of benefits and automatic systems evaluation of their quality. Key words: Reproductive system of bull, insemination dose, semen collection, semen examination ABSTRAKT Název práce: Aspekty spermatologického vyšetření inseminačních dávek býků Cílem této práce je se zaměřit na reprodukční soustavu býků, zjistit metody používané při rozmnožování skotu. Práce má za cíl popsat jaké metody se používají při získávání inseminační dávky a jak se získaná inseminační dávka může hodnotit. V práci se budu zabývat zejména problematikou hodnocení kvality dlouhodobě uchovávaných inseminačních dávek býků. Zaměřím se na hodnocení kvality inseminačních dávek běžnými metodami mikroskopického a mikrobiologického vyšetření. Dále pak i na speciální vyšetření dávek a automatické systémy hodnocení jejich kvality. Klíčová slova: Pohlavní soustava býka, inseminační dávka, odběr ejakulátu, hodnocení ejakulátu

8 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED POHLAVNÍ SOUSTAVA BÝKY Pohlavní orgány Varlata Nadvarlata Chámovody Přídatné pohlavní žlázy Pyj Šourek Pohlavní buňky Spermie Ejakulát METODY ROZMNOŽOVÁNÍ Přirozená plemenitba Inseminace INSEMINAČNÍ DÁVKY Metody odběru ejakulátu Metody vyšetření ejakulátu Makroskopické posouzení ejakulátu Metody uchování ejakulátu HODNOCENÍ INSEMINAČNÍCH DÁVEK Hodnocení kvality dlouhodobě uchovávaných inseminačních dávek Hodnocení kvality inseminačních dávek běžnými metodami mikroskopického vyšetření Stanovení hustoty spermatu Hodnocení pohybu spermií Hodnocení kvality inseminačních dávek běžnými metodami mikrobiologického vyšetření Prověrka rezistence spermií Testy přežitelnosti spermatu Odolnost živých spermií vůči chladovému šoku Prověrka respirace spermatu Stanovení procenta živých a mrtvých spermií barvením Test fruktózy a fruktolýzy Prověrka koncentrace hyaluronidázy Prověrka pohybu spermií přídavkem glukózy Zjišťování hodnoty katalázy Speciální vyšetření dávek... 36

9 Hypoosmotic swelling (HOS) test Automatické systémy hodnocení kvality inseminačních dávek CASA (Computer asisted semen analysis) ZÁVĚR PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ... 42

10 1 ÚVOD V mé práci především nastíním možnosti hodnocení inseminačních dávek býků. Tomuto tématu bude předcházet popis pohlavní soustavy býka, metody rozmnožování, inseminační dávky, které zde rozdělím do tří důležitých částí, jež předchází hodnocení získané inseminační dávky. Pohlavní orgány býka se morfologicky tolik neliší od pohlavních orgánů samců jiných savců. Samozřejmě jsou tu jisté druhové odlišnosti, které se týkají stavby pyje. I pohlavní buňky býků se liší od jiných pohlavních buněk savců. Především pak tvarem hlavičky. Inseminace je v dnešní době nejvíce využívanou možnou formou reprodukce v chovech zvířat. Je pro chovatele velkou výhodou, pomocí inseminace se zamezí zbytečnému přenosu nemocí z plemenného býka na plemenici, je větší procento zabřezávání, v neposlední řadě má pak chovatel pod kontrolou probíhání říje. Přirozená plemenitba se dnes využívá v zájmových chovech, v některých chovech koní či pak v chovech skotu bez tržní produkce mléka. Tvorbě inseminační dávky předchází metoda odběru, vyšetření a uchování ejakulátu. Odběr ejakulátu je nejdůležitější částí pro zisk inseminační dávky, kvalitu a následné zpracování ejakulátu posoudí jeho vyšetření, jestliže je s ním vše v pořádku následuje uchování ejakulátu. Hodnocení inseminačních dávek slouží k zjištění kvality a vhodnosti inseminační dávky pro použití v plemenitbě. Zahrnuje v sobě hodnocení kvality dlouhodobě uchovávaných inseminačních dávek, hodnocení kvality inseminačních dávek běžnými metodami mikroskopického vyšetření, hodnocení kvality inseminačních dávek běžnými metodami mikrobiologického vyšetření, speciální vyšetření dávek a automatické systémy hodnocení kvality inseminačních dávek. 10

11 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce je: 1. Problematiku hodnocení kvality dlouhodobě uchovávaných inseminačních dávek býků. 2. Hodnocení kvality inseminačních dávek běžnými metodami mikroskopického a mikrobiologického vyšetření. 3. Speciální vyšetření dávek a automatické systémy hodnocení jejich kvality. 4. Získání a zpracování podkladů a dat nezbytných pro vypracování diplomové práce. 11

12 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Pohlavní soustava býky U skotu znamená reprodukce obnovení stáda. (KOPECKÝ, 1981) Reprodukce patří mezi znaky, které jsou ovlivněny jak genetickými vlivy, tak také vlivy okolního prostředí. (BEZDÍČEK, LOUDA, 2015) Reprodukční funkce samců zahrnuje tvorbu spermií a jejich dopravu do samičích pohlavních orgánů. Spermie jsou tvořeny v semenotvorných kanálcích varlat a potom jsou transportovány přes síť kanálků varlete do nadvarlete. Zde jsou uloženy a dozrávají. Produkce spermií se od počátku jejího vzniku po dosažení pohlavní dospělosti stává nepřetržitým procesem. Činnost samčí pohlavní soustavy je řízena hormony a autonomním nervovým systémem. (REECE, 2011) Pohlavní orgány Funkce pohlavních orgánů samců (organa genitalia maskulina) záleží především v tvorbě samčích pohlavních buněk, spermií, a v jejich vpravení do pohlavních cest samice. K samčím pohlavním orgánům patří varlata, nadvarlata, chámovody, přídatné žlázy pohlavní a pářící orgán (pyj). Varle s nadvarletem je uloženo v šourku, pyj v předkožce. (KOMÁREK, 1964) Varlata Varle (testis) je párová samčí pohlavní žláza, která vytváří spermie a samčí pohlavní hormon testosteron. U našich druhů domácích zvířat má varle zhruba vejčitý tvar a je u přežvýkavců postaveno v šourku svou dlouhou osou svisle. (KOMÁREK, 1964) Ačkoliv existují mezidruhové rozdíly ve velikosti, tvaru a umístění varlat, mají varlata všech druhů podobnou strukturu. Spermie se tvoří ve stočených semenotvorných kanálcích, což je hlavní a největší součást parenchymu varlat. Varlata jsou obklopena vazivovým obalem, který se nazývá bělavá blána (tunica albuginea). Z ní vycházejí do nitra parenchymu septa (trabeculae) neboli vazivové přepážky rozdělující parenchym na menší úseky a zajišťující ochranu a integritu parenchymatózní tkáně. (REECE, 2011) Na svém povrchu je kryto tenkou serózní blankou pobřišnice, pod níž leží tuhá blána z fibrózního vaziva (tunica albuginea). Tato blána, tvořící obalové pouzdro křehkého parenchymu varlete, vysílá dovnitř vazivové trámce, které rozdělují 12

13 parenchym na pyramidovité lalůčky. Každý lalůček je složen ze dvou až tří stočených semenoplodných kanálků. Tyto slepě začínající kanálky jsou velmi jemné trubičky a jsou složeny v četné kličky. Prostory mezi kličkami jsou vyplněny řídkým vmezeřeným vazivem, obsahujícím zvláštní polygonální buňky Leydigovy. (KOMÁREK, 1964) Mimo různá vývojová stádia spermií jsou ve varleti i další dva důležité typy buněk, a to Sertoliho buňky (podpůrné) a Leydigovy buňky (intersticiální). (REECE, 2011) Leydigovy buňky se podílejí na tvorbě samčího pohlavního hormonu. (KOMÁREK, 1964) Sertoliho buňky poskytují opatrovnickou péči" (ochranu a výživu) vyvíjejícím se spermiím. Výběžky Sertoliho buněk obklopují spermatidy a spermatocyty a zajišťují intimní kontakt mezi všemi vývojovými stádii spermií. Z tohoto hlediska se označují jako buňky podpůrné. Sertoliho buňky mají základnu na periferii semenotvorných kanálků a dosahují jejich lumen. Bazální spojení (těsné spojení) se sousedními buňkami vytváří tzv. krevní bariéru, která kontroluje prostředí uvnitř kanálku a zabraňuje spermiím vstupovat do intersticia. (REECE, 2011) Sertoliho buňky rozdělují semenotvorné kanálky na dvě části: 1) vnější bazální část umožňuje kontakt s intersticiální tekutinou a poskytuje prostor pro zárodečné epitelové buňky tzv. bazální kompartment 2) vnitřní část, ve které jsou prostory mezi Sertoliho buňkami, komunikující centrálně s lumen kanálku tzv. adluminální kompartment. Dělení zárodečné epitelové buňky (spermatogonie) v bazální části kanálku zajišťuje obměnu a produkci dalších buněk, které musí projít přes spoje Sertoliho buněk, aby mohly postoupit k lumen kanálku. Přitom dochází k dalšímu meiotickému dělení a k vývoji konečné podoby spermií. Sertoliho buňky tvoří dále sekret, který zajišťuje výživu vyvíjejících se spermií. (REECE, 2011) Nadvarlata Nadvarle (epididymis) tvoří kyjovitý útvar připojený vazem k varleti. (KOMÁREK, 1964) Nadvarle shromažďuje a ukládá do zásoby spermie. Tvoří jej odvodné kanálky z varlete, které vyúsťují do vývodu nadvarlete. Nadvarle začíná na té části varlete, kde do něho vstupují cévy a nervy. Tato část se nazývá hlava nadvarlete. Dalšími částmi 13

14 jsou tělo a ocas nadvarlete. Do hlavy nadvarlete se dostávají spermie a varletní tekutina vývodnými kanálky z varletní sítě (rete testis). (REECE, 2011) Hlavu nadvarlete tvoří vývodních kanálků varlete, vystupujících z varletní síně a opouštějících varle na jednom jeho pólu. Tyto kanálky se postupně slévají do společného nadvarletního vývodu, který, složen v četné kličky, vytváří tělo a ocas nadvarlete. (KOMÁREK, 1964) Rozvinutý nadvarletní vývod měří u hospodářských zvířat asi 50m. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) Spermie jsou dopravovány do nadvarlete proudem tekutiny ze semenotvorných kanálků. V nadvarleti spermie dozrávají a získávají schopnost pohybu. V hlavě nadvarlete dochází k značné resorpci tekutiny ze semenotvorných kanálků. (REECE, 2011) Celým nadvarletem projdou spermie minimálně za 8-11 dnů. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) Chámovody Chámovod (také vas či ductus deferens) je pokračováním vývodného systému z ocasu nadvarlete do pánevního úseku močové trubice. (REECE, 2011) Je tlustostěnná párová trubice tvořená sliznicí, svalovinou a serózou. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) Sliznice chámovodu je vystlána cylindrickým epitelem a v koncové, ampulovitě rozšířené části obsahuje četné tubulózní žlázy. Podstatnou složkou stěny chámovodu je silná, kruhově a podélně uspořádaná hladká svalovina, jejímiž peristaltickými stahy jsou při ejakulaci vstřikovány spermie do močové roury. (KOMÁREK, 1964) Jakmile chámovod opustí nadvarle a směřuje do dutiny břišní, je spolu s varletní tepnou, žílou, nervem, lymfatickými cévami a svalem vnitřním zdvihačem varlete (musculus cremaster internus) obalen útrobním listem poševního obalu (tunica vaginalis propria). Tento celý útvar se nazývá semenný provazec. Útrobní list poševního obalu obklopuje rovněž varlata a epididymis. Vzniká vchlípením pobřišnice při sestupu varlat do šourku. Po průchodu semenného provazce vnitřním a vnějším prstencem tříselného kanálu se od něho oddělí chámovod a vstoupí do pánevní části uretry. (REECE, 2011) U přežvýkavců se chámovod v konečné části poněkud rozšíří v ampulu chámovodu 14

15 (ampulla ductus deferentis), jejíž žláznatá část vylučuje sekret působící příznivě na spermie, které se sem posunují v době pohlavního vzrušení plemeníků. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) Přídatné pohlavní žlázy Přídatné pohlavní žlázy jsou uloženy v pánevní oblasti u močové trubice. Jejich sekrety tvoří semennou plazmu. Řízení sekrece je vázáno na hormonální aktivitu parenchyrnu varlat a produkci testosteronu, vyměšování pak na dobu ejakulace. (VĚŽNÍK, 2004) Na tvorbě chámu čili ejakulátu se kromě spermií podílejí ještě výměšky zvláštních přídatných pohlavních žláz. Sekrety těchto žláz upravují spermiím optimální prostředí během jejich průchodu močovou rourou, a hlavně pak v pochvě. (KOMÁREK, 1964) Přídatné pohlavní žlázy (glandulae genitales accessoriae) produkují sekrety, které jsou vylučovány do pánevní části močové trubice v blízkosti uložení těchto žláz. K přídatným pohlavním žlázám patří ampule chámovodu, měchýřkovité žlázy, prostata a bulbouretrální žlázy (někdy nazývané Cowperovy žlázy). (REECE, 2011) Ampule chámovodu vzniká rozšířením koncové části chámovodu. Její sekret je vyprazdňován do lumen chámovodu. (REECE, 2011) Předstojná žláza (prostata) leží na krčku močového měchýře, má lalůčkovitou stavbu. Její řídký, mlékovitý výměšek má typický pach po sperminu a svou alkalickou reakcí neutralizuje prostředí v pochvě. (KOMÁREK, 1964) U býka je tato žláza tvořena nepárovým poměrně malým útvarem a disseminovanou žláznatou strukturou podél močové trubice, kam ústí četnými vývody. Na celkovém objemu ejakulátu se sekret prostaty podílí různou velikostí u býka v rozsahu 4-6%. (VĚŽNÍK, 2004) Měchýřkovité žlázy jsou párové žlázy, které ústí do pánevní části močové trubice spolu s chámovody. Četné vývody této žlázy ústí přímo do uretry. (REECE, 2011) Leží na dorzální ploše močového měchýře, laterárně od ampul chámovodu. U přežvýkavců mají kompaktní, lalůčkovitou strukturu a nepravidelný tvar. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) 15

16 Bulbouretrální žlázy (Cowperovy) jsou to dvě žlázy rozdílné velikosti a tvaru podle druhové příslušnosti a ústí obyčejně dvěma vývody do močové roury. Jejich hlenovitý sekret, odcházející na počátku ejakulace, činí močovou rouru vazkou a neutralizuje její kyselou reakci. (KOMÁREK, 1964) Párové bulbouretrální žlázy jsou uloženy nejkaudálněji ze všech přídatných pohlavních žláz. Při ejakulaci se sekrety přídatných pohlavních žláz, označované jako semenná plazma, smísí se spermiemi a tekutinou nadvarlete a vytváří se semeno. (REECE, 2011) Semenná plazma vytváří v samičím pohlavním ústrojí vhodné prostředí pro přežití spermií. Je bohatá na elektrolyty, fruktózu, kyselinu askorbovou a další vitamíny. I když může dojít k oplození spermiemi, které se nesetkaly se semennou plazmou, mají spermie v semenné plazmě větší oplozovací potenciál. (REECE, 2011) V semenné plazmě je přítomno několik prostaglandinů. Má se za to, že pomáhají oplození dvěma způsoby: 1) prostaglandiny reagují s hlenem sliznice děložního krčku a upravují jej pro průchod spermií 2) některé z přítomných prostaglandinů způsobují zpětné kontrakce hladké svaloviny a existuje názor, že tím v děloze a vejcovodech napomáhají transportu spermií směrem k vaječníkům. (REECE, 2011) Dovede vyrovnávat menší výkyvy ph tak, aby chemická reakce vyhovovala požadavkům spermií. Je zároveň prostředím, do něhož spermie vylučují zplodiny přeměny látkové kysličník uhličitý a kyselinu mléčnou. Tvoří přirozenou ochranu spermií a umožňuje jejich pohyb, udržuje napětí a rozptýlenost. Do určité míry chrání spermie i proti náhlým změnám teploty. Chemické složení semenné plazmy je velmi pestré. Pro inseminaci je důležitý zejména obsah fruktózy a jejích štěpných produktů (kyselina mléčná, kysličník uhličitý). (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Pyj Pyj (penis) je samčí kopulační (pářící) orgán. Močovou trubicí, která je v něm uložena, prochází moč a semeno. Kořen penisu odstupuje pomocí dvou ramen od kaudální hrany sedací kosti. Na kořen navazuje tělo penisu, které je zakončeno žaludem. Hlavní vnitřní strukturou je kavernózní tkáň, známější pod pojmem topořivé těleso pyje. Je to soubor krevních sinusů, oddělených listy vazivové tkáně. (REECE, 2011) 16

17 Zvětšení a prodloužení penisu při erekci je založeno buďto na překrvení kavernózních - topořivých těles (hřebec, pes), nebo na vyrovnání esovitého zakřivení penisu bez jeho významného zbytnění (přežvýkavci). Rozmanitost tvaru pyje je též dána různým utvářením žaludu pyje. U býka je žalud pyje málo výrazný, přední část se označuje jako přilba žaludu (galea glandis ). (VĚŽNÍK, 2004) Topořivé těleso je houbovité struktury, obalené tuhou vazivovou blánou. Do štěrbin a dutinek topořivého tělesa vyúsťují tepny, které se při topoření (erekci) pyje silně naplňují krví. (KOMÁREK, 1964) Býk má fibroelastický typ kopulačního orgánu, převažuje fibroelastická tkáň trámců. V době erekce dochází jen k relativně malému zduření pohlavního údu. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) U býka je menší poměr erektilní a pojivové tkáně. Močová trubice je uložena na ventrální části těla penisu. U býka se penis stáčí v esovitém ohbí, což dává neztopořenému penisu esovitý tvar. Při erekci pyje dochází k natažení (vyrovnání) ohybu. (REECE, 2011) U býka je válcovitý a dosahuje při erekci délky přes jeden metr. V klidu vytváří esovitou kličku, která se při ztopoření vyrovnává. Žalud je u býka nevýrazný. (KOMÁREK, 1964) Žalud se označuje jako přilba žaludu (galea glandis), která nasedá na zúžený krček pyje. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) Předkožka (preputium) je vchlípená kožní duplikatura, která obklopuje a chrání volnou část pyje. (REECE, 2011) Předkožka je kožní útvar, který slouží k uložení volné části pyje. Skládá se z vnějšího a vnitřního listu. Ve vnitřním listu jsou uloženy mízní uzlíky a předkožkové žlázy, které produkují předkožkový maz. ( Uvnitř je předkožka tvořena sliznicí, která obsahuje četné mazové žlázy, produkující ostře zapáchající sekret (smegma). Při předkožkovém otvoru přechází sliznice ve vnější kůži břicha. (KOMÁREK, 1964) Sval vnější zdvihač varlete odstupuje z kaudálních částí vnitřního břišního šikmého svalu. Prochází tříselným kanálem a napojuje se na vnější parietální vrstvu vlastního obalu varlete. Tento sval, zvláště za chladného počasí, zatahuje varlata nahoru 17

18 k vnějšímu tříselnému prstenci. (REECE, 2011) Vnitřní zdvihač varlete je složen z hladkosvalových buněk, obklopuje semenný provazec a napomáhá tak udržet jeho integritu. (REECE, 2011) Sval m. urethralis obaluje pánevní část uretry a je pánevním pokračováním hladkosvalové stěny močového měchýře. Peristaltická činnost tohoto svalu pomáhá transportu moči a semene pánevní částí močové trubice. (REECE, 2011) Sval m. bulbospongiosus je příčně pruhovaný sval, který je pokračováním m. urethralis. Vybíhá pouze na krátkou vzdálenost podél močové trubice penisu. Tento sval navazuje svou činností na činnost m. urethralis při vyprazdňování močové trubice. (REECE, 2011) Svaly napřimovače pyje (m. ischiocavernosus) jsou párové příčně pruhované svaly, které odstupují od laterální strany sedacího oblouku a upínají se na tělo penisu. Když se tyto svaly smrští, zatahují penis nahoru ke spodině pánevní. U penisu je většina žil uložených na dorzální straně penisu tlakem uzavřena, což napomáhá ztopoření. (REECE, 2011) Napřimovač pyje obepíná kořen pyje a smrštěním napomáhá uvést ztopořený pyj do polohy, která je vhodná pro páření. ( Zatahovač pyje (m. retractor penis) je párový hladký sval. Jeho dvě části odstupují ze závěsných vazů konečníku, pokračují dopředu a upínají se na tělo penisu. Po jejich spojení na spodní straně penisu pokračují dopředu k žaludu. Tento sval zatahuje ochablý penis do předkožky. (REECE, 2011) Zatahovač pyje slouží k zatažení ochablého pyje do předkožky. Tento sval je složen z hladké svaloviny a odstupuje na ocasních obratlích. ( Šourek Jedná se o kožní vak, ve kterém jsou uložena varlata. (REECE, 2011) 18

19 Šourek (scrotum) u býka leží v krajině stydké. U přežvýkavců je šourek dlouhý, visí hlouběji a je při bázi zaškrcen. Představuje v podstatě vychlípeninu stěny břišní a má tedy podobnou stavbu. Na povrchu šourku je kůže porostlá jemnými chlupy. (KOMÁREK, 1964) Pod kůží šourku je vrstva buněk hladké svaloviny (tunica dartos), která se při poklesu teploty kontrahuje a přidrží varlata blíže k břišní stěně. (REECE, 2011) Pro své kontraktilní schopnosti může vrstva buněk hladké svaloviny (tunica dartos) reagovat na změny teploty prostředí. V chladném počasí se smršťuje, svrašťuje kůži šourku a zmenšuje tím jeho odpařovací plochu. Naopak v teplejším prostředí ochabuje, čímž se odpařovací plocha šourku zvětšuje. Je to mechanismus, který udržuje teplotu šourku o 3 4 C nižší než v konečníku. Tato teplota je totiž optimální pro správný vývoj spermií ve varleti. (KOMÁREK, 1964) Šourek je vystlán blánou, nazvanou vnitřní povázka varlete, k níž zevnitř přirůstá nástěnný list poševního obalu. Je to serózní blanka vznikající vychlípením útrobní pobřišnice. Tato pobřišnice se vchlípí do šourku při sestupu varlat. (REECE, 2011) Pohlavní buňky Spermie Většina spermií v ejakulátu nikdy nedosáhne vejcovodu. Pouze několik desítek spermií se přiblíží k vajíčku a pouze jedna se nakonec účastní oplození. Semeno odebrané pro umělou inseminaci je ředěno, aby byl získán větší počet inseminačních dávek. Počet spermií požadovaných pro umělou inseminaci druhově kolísá, ale blíží se 10 milionům u skotu. (REECE, 2011) Ejakulát Ejakulát (sperma, semeno) je bělavá a viskózní tekutina složená z části buněčné - spermií a části tekuté- semenné plazmy. (LOUDA, 2001) Sperma je směs výměsků žláz a orgánů, které se účastní tvorby samčích pohlavních buněk a ejakulace. Skládá se v podstatě ze dvou hlavních součástí, tj. ze semenné plazmy a ze spermií. Obsahuje % vody. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Chemické složení spermatu je charakterizováno tím, že hlavní součástí je bílkovinný dusík a lipoidy. Z dalších látek je ve spermatu poměrně značné množství cukrů, draslíku, sodíku a chlóru. Obsah kyseliny mléčné kolísá se stářím ejakulátu. 19

20 Koncentrace vodíkových iontů se pohybuje u zdravého spermatu ve fyziologických hranicích od 6,2 do 7,8 ph a je do značné míry závislá na druhové příslušnosti. Zejména ji ovlivňuje množství sekretu přídatných žláz, obsažených v ejakulátu. U plemenných býků je chemická reakce spermatu slabě kyselá v rozmezí od 6,5 ph do 6,9 ph. Zvýšení i snížení ph mimo tyto hranice je třeba vždy pokládat za patologické. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Z formovaných elementů obsahuje ejakulát kromě spermií ještě odloupané epitelie, leukocyty aj. Největší podíl ejakulátu tvoří voda (90 98 % celkové váhy), z anorganických látek obsahuje sodík, draslík, chlór, fosfor, vápník, síru aj., z organických látek bílkoviny, tuky, cukry a některé fermenty. Chemické složení ejakulátu, jeho množství, koncentrace spermií a jejich životnost jsou závislé na mnoha činitelích, jako je stav výživy, stáří, ustájení, pohyb, pohlavní využívání samce aj. (KOMÁREK, 1964) Celkový objem ejakulátu je dán především množstvím semenné plazmy. Toto množství kolísá zejména podle druhů hospodářských zvířat. Určité, i když podstatně menší odchylky v množství ejakulátu lze pozorovat u jednotlivého plemeníka vlivem prostředí, krmení, stáří a kvality sexuálního podráždění. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) U býka trvá ejakulace velmi krátkou dobu. Většina ejakulátu jsou sekrety váčků semenných, sekrety prostaty tvoří jen malou část. Po celou dobu pohlavního vzrušení se vylučují sekrety uretrálních žláz. Spermie jsou ejakulovány současně s ostatními sekrety. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Dobré býčí sperma je barvy mléčné, bělavé, v některých případech šedobílé, mírně nazelenalé a v suchém období často bíložluté. Žlutě je sperma zabarveno karotenem obsaženým v krmivu. Špatné sperma nehodící se k inseminaci bývá zbarveno silně žlutě, žlutozeleně nebo zeleně, což bývá zpravidla způsobeno příměsí hnisu, moče nebo znečištěním množstvím bakteriální flóry. Nežádoucí je i sperma zbarvené narůžověle nebo červeně. Při tomto zabarvení je podezření na pohlavní nákazy nebo oděrky a poranění pyje, způsobné příliš těsnou, drsnou nebo nečistou vložkou v umělé pochvě. Při zastaralých poraněních vývodních cest pohlavních orgánů bývá sperma barvy hnědočervené. Sperma řídké (oligospermie) bývá barvy našedlé nebo s namodralým odstínem. (POLÁK, 1961) 20

21 Hodnoty ejakulátu u býka: Barva mléčně bílá Konzistence smetanově zrnitá Slizová frakce Ne Objem v ml průměrně 4 Koncentrace spermií miliónů/ml 1000 Délka spermie tisícin mm 65 Specifická váha 1,033 ph průměrně 6,8 Fruktóza mg% 500 (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) 3.2 Metody rozmnožování Plodnost skotu je základní biologická a užitková vlastnost, která významným způsobem ovlivňuje ekonomiku chovu, dané farmy. O plodnosti chovaného stáda skotu rozhoduje úroveň chovatelské práce a chovného prostředí, výživy, ustájení a ošetřování. (LOUDA, BEZDÍČEK, 2015) Přirozená plemenitba V chovu bez tržní produkce mléka je převládající metodou plemenitby přirozená plemenitba kombinovaná s inseminací v chovech, kde se provádí intenzivní šlechtitelská práce s cílem produkovat plemenné býky a jalovice. (LOUDA, 2001) Výhody přirozené plemenitby jsou především v menší organizační náročnosti, nižších nákladech a v tom, že plemeník sám vyhledává a zapouští říjící se plemenice. Nevýhody jsou pak v nutné obměně býka ve stádě z důvodu zabránění příbuzenské plemenitby, nutné sledování a vyšetřování zdravotního stavu býka (především reprodukčních orgánů a pohlavních chorob), nutný výběr plemenného býka, nákup a péče o něj, využití býků s nižší plemennou hodnotou u býků v inseminaci a pomalejší genetický pokrok. ( 21

22 Obr. 1 Přirozená plemenitba ( Inseminace Historický vývoj umělé inseminace formovali možnosti poznávání vlastností spermií, co v značné míře záviselo na rozvoji mikroskopické techniky. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) Nejpokrokovější metodou reprodukce hospodářských zvířat se stala ve druhé polovině 20. století inseminace. Umělá inseminace hospodářských zvířat je dokladem schopnosti člověka odhalovat přírodní tajemství a zákony ve prospěch rozvoje materiálních hodnot. (KOPECKÝ, 1981) Zavádět se začala koncem roku Začátkem roku 1947 přednášel prof. dr. SÖRENSEN z Kodaně na Porodnické klinice VŠV v Brně o svých zkušenostech s umělou inseminací krav a kobyl v Dánsku. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) Inseminace skotu představuje jednu z nejprogresivnějších metod šlechtění skotu a řízení reprodukčního procesu. Inseminace přispěla k rozvoji metod kontroly dědičnosti mléčné a masné užitkovosti a zdraví i biotechnických metod. V současné době je inseminace převládající metodou plemenitby v dojených stádech skotu. (LOUDA, 2001) Inseminace skotu je jedna z metod, která při zvyšování koncentrace zvířat a při uplatňování velkovýrobní technologie umožňuje zvýšit úroveň reprodukce, plemenářské práce, zoohygieny a úroveň organizace práce. Význam inseminace 22

23 jako plemenářského opatření nesmírně vzrostl zavedením novým technologickým postupů při konverzaci a uchovávání býčího spermatu. (KOPECKÝ, 1981) Inseminace má i své nevýhody, které jsou ve vyšší organizační náročnosti a vyšších nákladech na inseminační dávku. ( Vlastní inseminace záleží ve vpravení dávky semena, potřebné k zabřeznutí plemenice, do jejich pohlavních orgánů. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) 3.3 Inseminační dávky Obr. 2 Inseminační potřeby ( Metody odběru ejakulátu Plodnost býka je ovlivněna celou řadou faktorů, které mohou ovlivnit kvalitu čerstvého ejakulátu i vyrobené inseminační dávky. (STÁDNÍK, DOLEŽALOVÁ, 2015) Správný odběr spermatu je důležitou podmínkou úspěchů inseminace. Jeho správné provádění má národohospodářský a chovatelský význam. (POLÁK, 1961) Pro dobré výsledky inseminace má odběr spermatu zásadní význam. Při odběru semena je nutno mít neustále na mysli, že pracujeme s živým materiálem, který má velkou chovatelskou hodnotu. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Ejakulát, který se má použít k inseminaci, je třeba získat tak, aby při jeho odběru proběhly všechny pohlavní reflexy beze zbytku a bez narušení. Musí být pokud možno čistý, bez nežádoucích příměsí a je třeba učinit všechna opatření, aby nedošlo k jeho 23

24 narušení kontaminací různými mikroorganismy, tepelným nebo světelným šokem. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Účelem technického odběru spermatu je: 1. Zachytit celý a čistý ejakulát beze ztrát s maximálním a ekonomickým využitím plemeníků a plánováním odběru podle nejnovějších poznatků vědy. 2. Umožnit prověřování spermatu četnými laboratorními prověrkami a zachovat živost a plodnost spermií. 3. Podle výsledků prověrek spermatu posoudit vhodnost plemeníka před jeho zařazením do plemenitby. 4. Zabránit poranění samice plemeníkem. 5. Přerušit přímý pohlavní styk umožňující rozvlékání pohlavních nákaz z plemenic na plemeníky a naopak. (POLÁK, 1961) V minulosti se k získávání spermatu používalo mnoho metod, které se postupně zdokonalovaly. Sperma se původně zachycovalo do mořské houby, vložené do pochvy plemenice, nebo se vyhrnovalo rukou z pochvy nebo se zachycovalo do sběrače vloženého do pochvy (kolektor), do kondomů, navlečených na penis, masáží (frikcí) pyje, pomocí elektrického proudu a metodami chirurgickými. Pro inseminaci však byla vypracována dokonalá metoda odběru pomocí umělé pochvy. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Pochvy pro býky mají plášť z tuhé gumy a jejich rozměry se pohybují od 30 do 50 cm. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Při vlastním odběru semena se postupuje přípravou pochvy. Připravená umělá pochva má válcovité tělo s ventilkem, zadní (horní) otvor, ke kterému je připevněn sběrač semena, a přední (dolní) otvor (ústí). Správně upravená vložka má mít po celé délce stejnou světlost a nemá vytvářet žádné záhyby. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Sběrač semena, který se vyjme z předehřívací komory, naplní se vodou teplou asi 40 C, aby sběrací prostor v okamžiku ejakulace byl zahřát na teplotu C. Teplota by neměla příliš poklesnout, aby nenastal chladový šok spermií, který snadno vznikne, klesne-li teplota stěn sběrného prostoru pod 30 C. Příliš vysoké teploty při odběru ohrožují totiž životnost spermií a kromě toho mohou vzbudit u býka nežádoucí zábranné reflexy nebo návyk na vyšší teplotu pochvy. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Umělé fantomy, kterých se používá jako atrap k odběru spermatu býků, se zhotovují zpravidla ze železných trubek nebo pevných dřevěných tyčí. Povrch fantomu se 24

25 pokrývá měkkými vycpávkami, které se potáhnou kůži vydělanou i se srstí nebo pogumovaným pevným plátnem. (POLÁK, 1961) Atrapa je objekt, který má vyvolat u přivedeného plemeníka, určeného k odběru semena, reflex pohlavního sblížení a celý řetěz následujících reflexů. Protože tyto reflexy nejsou u býků specificky vázány na druhé pohlaví, používáme k tomuto účelu nejraději jiného býka stanice. Vyhneme se tak nebezpečí přímého pohlavního styku a eventuálnímu zavlečení některé z pohlavních nákaz. Přivedenému plemeníku ponecháme dostatek času, aby u něho mohlo nastat dokonalé rozdráždění. Nedovolíme mu se vzepnout ke skoku, dokud nenastala kvalitní erekce. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Po prvním odběru může během několika minut následovat odběr druhý. Druhý ejakulát bývá u nevyčerpaných zdravých plemeníků kvalitnější než první. U pohlavně dospělých zdravých býků je nejvhodnější frekvence odběrů dvakrát týdně. Mladé, nově zařazené býky je třeba na tuto frekvenci zvolna navykat. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Metody vyšetření ejakulátu Ejakulát lze hodnotit mnoha laboratorními, více či méně objektivními metodami. Laboratorní prověrka má pokud možno objektivně zhodnotit vlastnosti získaného semena a na základě toho určit, zda je vhodné k inseminaci či nikoliv. Podle jejího výsledku se určuje i stupeň ředění. Druhým úkolem laboratorní prověrky je zachytit včas případné onemocnění pohlavního aparátu, která se projeví změnami v kvalitě spermatu a morfologickými změnami spermií. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Sperma se prověřuje ihned po jeho získání. Laboratoř k tomu určená má mít teplotu C, má být hygienicky zařízena a okna mají být opatřena tak, aby na pracovní stůl nedopadalo přímé sluneční světlo. Prověrka spermatu v provozních podmínkách má být skončena nejdéle 15 minut po jeho získání. Laboratorních zkoušek je několik. V běžném provozu se však používají jen nejdůležitější z nich. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Sperma se prověřuje: 1. makroskopicky podle zevních vlastností patrných již pouhým okem, 2. mikroskopicky, 3. laboratorními zkouškami, 4. zkouškou na živém zvířeti (biologické zkoušky a biologické prověrky) (POLÁK, 1961) 25

26 Makroskopické posouzení ejakulátu Základní prověrkou semena je jeho makroskopické posouzení. Posuzuje se bezprostředně po odběru, bez pomoci složitějších přístrojů. Stanoví se při ní objem ejakulátu, jeho hustota a zrnitost, pach a obsah nežádoucích přimíšenin. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Objem ejakulátu je variabilní a značně kolísá, Zjišťuje se měřením v kalibrovaném válci nebo vážením na laboratorní automatické váze (v gramech). (LOUDA, 2001) Objem ejakulátu se určuje s přesností nejméně 0,5 ccm. (POLÁK, 1961) Objem ejakulátu bývá 3 až 12 ccm, průměrně 6 ccm. Toto množství může značně kolísat i u téhož býka na obě strany. Při pravidelném pohlavním využívání zdravého plemeníka bývá získávané množství ejakulátu přibližně konstantní. Z vlivů, které se uplatňují na objemu ejakulátu, jsou nejdůležitější plemenná příslušnost, individuální založení, stáří, způsob a kvalita krmení, ošetřování, intenzita pohlavního využití, zdravotní stav aj. Plemenná příslušnost bývá vyjádřená tím, že býci dojných plemen mívají větší objem ejakulátu než býci žírných. (POLÁK, 1961) U býků onanistů", pohlavně vyčerpaných, špatně živených, nepravidelně odebíraných nebo nemocných, kolísá objem ejakulátu dosti značně. V záznamech se pak býk hodnotí jako nevyrovnaný, špatný dárce spermatu. Starší býci, kteří mají za normálních podmínek trvale malý objem ejakulátu (2 až 3 ccm), se z hlediska ekonomiky, dědičnosti a dalších důvodů pro inseminaci nehodí. (POLÁK, 1961) Objem ejakulátu je pouze pomocným evidenčním zjištěním. Stupeň ředění určíme z dalších zjištění hustoty a pohybu. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Objem a mnohdy současně i koncentraci ejakulátu snižují: nedostatečné vydráždění a příprava před odběrem, porušení pohlavních reflexů, špatně připravená a málo vymazaná umělá pochva, nesprávný sklon umělé pochvy v okamžiku ejakulace a ostatní rušivé zevní i vnitřní příčiny. Objem ejakulátu se může zvýšit prodloužením přípravy býka před odběrem. (POLÁK, 1961) Kvalitní býčí ejakulát je hustý jako smetana. Ve skleněné nádobce lze při stěnách pozorovat určitou zrnitost, kterou tvoří shluky obrovského množství spermií. Tyto shluky se zvolna pohybují a mění svoje seskupení. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Konzistence, zrnitost se posuzuje u každého ejakulátu ve sběrači v dopadajícím nebo procházejícím světle. (LOUDA, 2001) Husté sperma dobré jakosti je neprůhledná, vazká tekutina, zpravidla 26

27 smetanovitého, mírně zrnitého vzhledu, v níž se zrníčka stále pomalu pohybují. V tomto případě se mluví o tzv. masové aktivitě ejakulátu. Řídké sperma špatné jakosti je vodnaté, průsvitné, bez zrnitosti a bez zřetelného makroskopického pohybu zrnek. Obsahuje málo spermií a nehodí se k inseminaci. Bývá u býků onanistů, u býků přetížených častým odběrem, špatně krmených, prováděných, ošetřovaných, nemocných nebo u býků s poruchami v pohlavních orgánech. (POLÁK, 1961) Barva se posuzuje proti světlu. Dobré sperma je barvy bělavé, v některých případech šedobílé, nebo mírně nažloutlé. Špatné sperma nehodící se k inseminaci bývá zbarveno silně žlutozeleně nebo zeleně s přímísením hnisu, moče nebo nežádoucími mikroorganismy. Špatné je i sperma příměsí krve. Žlutavé zbarvení může být způsobeno flavinovými barvivy obsaženými v krmivu. (LOUDA, 2001) Barva semena se podobá smetaně. Může se poněkud měnit vlivem krmné dávky, a to nejčastěji do žluta nebo do zelena. Je to ovšem pouhý nádech. Je-li k ejakulátu přimísena krev, moč nebo hnis, mění se jeho barva v růžově červenou, žlutozelenou nebo šedou. Takto znečištěné semeno je nežádoucí a nehodí se k ředění. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Pach se posuzuje čichem ve sběrači. Dobré sperma má slabý specifický pach. (LOUDA, 2001) Pach ejakulátu připomíná poněkud vůni čerstvě nadojeného mléka. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Pach je ovlivňován jakostí a druhem krmiva. (POLÁK, 1961) Odchylný pach zjistíme, je-li k ejakulátu přimíšena moč nebo hnis. Tyto příměsi mění současně i hustotu a barvu semena, které se nehodí k dalšímu zpracování. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Špatné sperma ztrácí příměsí cizích látek charakteristický zápach. Nazelenalé sperma páchne močí. Hnilobný zápach svědčí o příměsi hnisu a o chronických procesech ve varlatech nebo přídatných žlázách. (POLÁK, 1961) Nadměrné zpěnění spermatu je nežádoucí a nesnadno se odstraňuje. Bývá při špatné technice odběru, při ejakulaci do středu umělé pochvy a při delším stékání spermatu po stěně umělé pochvy. (POLÁK, 1961) 27

28 3.3.3 Metody uchování ejakulátu Stěžejní otázkou rozvoje umělé inseminace všech druhů hospodářských zvířat je problém uchování oplozovací schopnosti a životnosti spermií mimo organismus po co nejdelší dobu. Na vitalitu a fertilitu spermií má rozhodný vliv jak způsob ředění, tak metoda konverzace ředěného ejakulátu. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) Účelem ředění a konzervace spermatu je zajistit podle potřeby maximální jeho využití a prodloužení pokud možno nejdéle oplozovací schopnosti spermií. (ŠMERHA, 1980) Sperma se musí zpracovat do 15 minut po odběru. Je však nutno s ním zacházet velmi opatrně a hygienicky, neboť jde o živou látku, která podléhá snadno poškození. Za všech okolností je třeba postupovat tak, aby nebylo kontaminováno mikroorganismy a aby semeno neutrpělo šok náhlým poklesem teploty. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) V průběhu uplynulých let byla vyzkoušena různá složení ředících roztoků, které podle účinnosti lez rozdělit do tří skupin: Extendory- slouží pouze k zvětšení objemu semene, které se používá bezprostředně, tj. v čerstvém stavu Protektory- kromě zvětšení objemu semene zajišťují zdroj výživy a ochranu spermií v prostředí mimo organismus po delší dobu. Implementory- jsou v podstatě protektory, ke kterým byly přidány látky působící na pohlavní orgány samic a ovlivňující příznivě pasáž spermií a proces oplození. (GAMČÍK, KOZUMPLÍK, 1984) K ředění používáme obvykle standardně vyráběná ředidla. Jako jsou: žloutkocitronanové, žloutko-glukózo-citronanové, žloutko-glykokol-citronanové, žloutkomléčné, žloutko-glycerín-mléčné a ředidlo nasycené kysličníkem uhličitým. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Ředidlo se připraví před počátkem odběru. Nesmí však být starší než dvě hodiny. Po posouzení získaného spermatu stanovíme stupeň ředění. Ten závisí zejména na kvalitě ejakulátu, množství a koncentraci spermií a na tom, kolik inseminačních dávek potřebujeme. Zásadou je, že v jedné inseminační dávce nemá být méně než spermií. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Další nezbytnou součástí technologického procesu výroby inseminačních dávek je jejich chlazení a ekvilibrace, tedy adaptace spermií na zpomalení metabolismu, která musí být provedena za optimálních podmínek, protože savčí spermie jsou citliví 28

29 na rychlost zchlazování. Naředěný ejakulát je chlazen pomalu, aby se předešlo chladovému šoku. (STÁDNÍK, DOLEŽALOVÁ, 2015) Náhlým poklesům teploty se zabraňujeme především tím, že se pracujeme s nádobami ponořenými do vodní lázně, a to jak při odběru, tak i při ředění. Chlazení semena musí probíhat rovnoměrně tak, aby naředěné semeno dosáhlo konzervační tepoty 1 3 C za 2,5 až 3 hodiny po odběru. Naředěné semeno je již lépe chráněno proti vlivům prostředí i proti chladovému šoku. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Optimální teplota pro uchovávání spermatu vně organismu byla dlouho studována a dodnes se názory jednotlivých autorů různí. V současné době je pokládána optimální teplota pro uchovávání spermatu vně organismu 0 až 3 C. (POLÁK, 1961) V poslední době se sperma rychle zmrazuje velmi nízkými teplotami na 78 C, C, 196 C bez krystalizace na amorfní hmotu. V tomto zmrazeném stavu si spermie uchovají plodnost i několik měsíců a v budoucnu se počítá s uchováváním zmrazeného spermatu i několik roků. Po rozmrazení, při kterém se musí rychle překlenout bod krystalizace vody, obnovuje většina spermií pohyb i plodnost. Zmrazení spermatu je účinný způsob jeho dlouhodobé konzervace účinkem nízkých teplot, hluboko pod bodem mrazu. (POLÁK, 1961) Kryokonzervace spermií je jednou z nejdůležitějších a nejpoužívanějších metod, které se využívají při konzervaci živočišných genetických zdrojů tak i v chově a šlechtění hospodářských zvířat. Zmražování biologického materiálu nám umožňuje prakticky časově neomezené uchování genofondu vysoce hodnotných plemenných jedinců, kteří příspívají k udržení specifické genetické diverzity druhů a plemen hospodářských zvířat. (ŠPALEKOVÁ, CHRENEK, 2015) 3.4 Hodnocení inseminačních dávek Hodnocení kvality dlouhodobě uchovávaných inseminačních dávek Zavedení dlouhodobé konzervace býčího spermatu do praxe významným způsobem přispělo zjednodušení a zlepšení inseminačního provozu. Snížil se počet býků potřebných pro zajištění inseminace. Významně se zvýšila hodnota býků daná jejich plemennou hodnotou. Použití této metody umožnilo mezinárodní výměnu a zušlechťování celých populací skotu. (LOUDA, 2001) 29

30 U každého ejakulátu se zjišťuje aktivita spermií po rozmrazení, na tom pracovišti, kde bylo sperma zmraženo a dále pak vždy před expedicí na středisko inseminačních techniků. (ŠMERHA, 1980) Uchovat spermie při životě umožňují speciální ředidla s přídavkem glycerínu a speciální chladící postup. Význam této metody pro zootechnické účely je veliký. Umožňuje vytvořit zásobu semena, která se v plném rozsahu použije po prověření dědičných vlastností plemeníka. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) V průběhu zmrazování a rozmrazování spermií dochází ke složitým procesům přeměny skupenství vody a koncentrace roztoků v buňce (spermii) i mimo ni, a tím i k zatížení buněčné membrány. Důsledkem těchto procesů je přežívání jenom určitého počtu spermií (30-50%). (LOUDA, 2001) Nejrozšířenější metodou dlouhodobé konverzace spermatu ve světě je metoda francouzská, při které se semeno mrazí a uchovává v pejetách s objemem 0,25-0,50 cm 3 spermatu. (LOUDA, 2001) Hodnocení kvality inseminačních dávek běžnými metodami mikroskopického vyšetření Mikroskopické posouzení následuje ihned po makroskopickém posouzení semena. Mikroskopicky stanovíme hustotu semena v běžném provozu pouze přibližně, neboť velmi záleží na rychlém ukončení prověrky. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Mikroskopicky se posuzuje zásadně v předehřívacích skříních nebo mikroskopem s vlastním vyhřívacím stolkem, a to hustota, pohyb a příměsi spermatu. (POLÁK, 1961) Mikroskopická kontrola spermatu je vedle záznamů o plodnosti i biochemických zkoušek jednou z nejspolehlivějších pomůcek pro posouzení býků z hlediska produkce jejich spermatu. Sperma je nutno zkoušet soustavně a delší dobu, aby byl vyloučen eventuální vliv vnějších (nedědičných) činitelů. (ŠMERHA, 1958) Stanovení hustoty spermatu Stanovení koncentrace spermií v ejakulátu je jednou ze základních informací o jeho kvalitě a úrovni funkce spermiogenetického epitelu. Faktory ovlivňující koncentraci spermií v ejakulátu se všeobecně uplatňují prostřednictvím vnitřního prostředí organismu a negativním působením na řídící mechanismy, po případě přímo na cílové tkáně pohlavního systému. Geneticky podmíněné oligospermie jsou nežádoucím 30

31 znakem samčí subfertility. Koncentrace spermií se zjišťuje fotometricky (nefelometricky), hemocytometricky a počítačem částic. (VĚŽNÍK, 2004) Hustota- koncentrace spermií v ejakulátu je dána funkční aktivitou semenoplodného epitelu varlat, věkem, zdravotním stavem plemeníka, připraveností a technikou odběru ejakulátu daného plemeníka. (LOUDA, 2001) Podle této přibližné metody označujeme hustotu ejakulátu takto: Velmi husté sperma (označované VH) je takové sperma, které obsahuje v 1 mm³ více než spermií. Husté sperma, které obsahuje více než v 1 mm³ spermií, označujeme písmenem D (densum) nebo H (husté). Středně husté sperma obsahuje až spermií v 1 mm³. Označujeme je písmenem SD (semidensum) nebo S (středně husté). Řídké sperma obsahuje méně než spermií v 1 mm³. Označujeme je písmenem R (rarum) nebo Ř (řídké). Ejakulát, ve kterém jsou jenom ojedinělé spermie, nejvýše však v 1 mm³, označujeme písmenem O (oligospermie). Takové semeno není vhodné k dalšímu zpracování a bývá příznakem různých poruch a onemocnění pohlavního aparátu nebo chyb v technice odběru semena. Ejakulát, ve kterém nejsou žádné spermie, označujeme písmenem A (aspermie). Takový ejakulát je rovněž příznakem různých onemocnění pohlavního aparátu i onemocnění celkových. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Ke stanovení hustoty spermatu fotometricky se v dnešní době používá fotometr digitální. Přístroj zajišťuje objektivní přesnost, rychlost měření a malá spotřeba spermatu. Stanovení hustoty spermatu hemocytometricky se stanoví počítáním spermií v Bürkerově komůrce. (LOUDA, 2001) Hustotu semena posuzujeme na speciálně upraveném podložním sklíčku, do něhož je vybroušen důlek. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Stanovení hustoty spermatu býků odhadem. Odhadem se ověřuje hustota spermatu na inseminačních stanicích pouze ve výjimečných případech. Tento způsob hodnocení je vhodný v polních podmínkách u býků využívaných v přirozené plemenitbě. Vyšetření ejakulátu se provádí před začátkem připouštěcího období. Stanovení hustoty spermatu mikroskopickým odhadem podle Götze u býků se používá k odhadu hustoty neředěné nebo ředěné sperma citrátem sodným v poměru 1:50. Hustota se stanoví na základě 31

32 vzdálenosti mezi hlavičkami spermií u neředěného spermatu, nebo na základě počtu spermií v zorném poli. Pro stanovení hustoty spermatu spermiodenzimetrem podle Karrase se využívá Karrasův klín. (LOUDA, 2001) Hodnocení pohybu spermií Současně s prověrkou hustoty posuzujeme také pohyb spermií. Čím více spermií se v ejakulátu pohybuje rovnoměrně a progresívně vpřed za hlavičkou, tím je ejakulát hodnotnější a předpokládáme u něho vyšší plodnost. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Motilita (pohyblivost) spermií je jednou z nejvýznamnějších charakteristických asociovaných s fertilizační schopností spermií. (KUBOVIČOVÁ, MAKAREVIČ, ŠPALEKOVÁ, CHRENEK, 2015) Základní způsobem kvantitativního stanovení motility je mikroskopický nápočet pohybujících se spermii v zorném poli. Výpočet se vyjadřuje buďto v procentu pohyblivých spermií nebo metodou bodového odhadu, kdy jeden bod reprezentuje 20 % pohyblivých spermií. Hodnocení pohyblivosti se provádí většinou v ejakulátu naředěném fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým pufrem na ph 6,8 u býků. (VĚŽNÍK, 2004) Pohyb posuzujeme na okraji důlku v tenké vrstvě spermatu. Klasifikujeme ho pětibodovou stupnicí. Hustota a pohyb jsou hlavními ukazateli, podle kterých se rozhodne o dalším zpracování semena. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) U hodnocení aktivity se hodnotí charakter pohybu, určuje se směr a rozsah kmitů hlavičky spermie. Přímý progresivní pohyb spermií je znakem jejich plnohodnotnosti a vyjadřuje se v procentech. U ejakulátů určených k přímé inseminaci nebo určených ke konzervaci se považuje minimální aktivita 70%. Aktivita spermatu se posuzuje u každého ejakulátu. Hodnotí se minimálně 3 zorná pole a odhadem se stanoví procentické zastoupení spermií pohybujících se vpřed za hlavičkou. Vedle pohybu přímočarého vpřed za hlavičkou je třeba sledovat i ostatní druhy pohybu, které se hodnotí jako závadné. Nežádoucí je i shlukování spermií, tzv. aglutinace. (LOUDA, 2001) Hodnocení vířivosti pohybu vyjadřuje společné hodnocení hustoty a pohyblivosti spermií. Hodnotí se neředěný, čerstvý, tzv. nativní vzorek ejakulátu. (LOUDA, 2001) Při mikroskopické prověrce se posoudí i znečištění spermatu případnými nečistotami. K mikroskopické prověrce semena patří i přesné stanovení počtu spermií. 32

33 (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Má-li se sperma prověřovat mikroskopicky přesně a spolehlivě, musí se při prověrkách používat téhož mikroskopu se stále stejným zvětšením a osvětlením, stejných krycích sklíček a stále stejně velkých kapek spermatu. (POLÁK, 1961) Hodnocení kvality inseminačních dávek běžnými metodami mikrobiologického vyšetření V biologických testech se sleduje odolnost spermií vůči různým vnějším vlivům. Provádí se dlouhodobý chladový test, krátkodobý tepelný test, zjišťuje se odolnost spermií vůči chladovému šoku a odolnost spermií vůči působení 1% roztoku NaCl. (LOUDA, 2001) Prověrka rezistence spermií Při biologickém hodnocení spermatu se kromě procenta živých a mrtvých spermií provádějí testy přežitelnosti a zjišťuje se odolnost spermií vůči působení jednoprocentního roztoku NaCl zkouškou rezistence. (ŠMERHA, 1980) Zkouška rezistence je biologická zkouška, založená na posuzování odolnosti lipoproteidního obalu spermií proti účinkům 1% roztoku chloridu sodného. Čím déle odolává koloidní ochranný obal spermií působením většího množství roztoku NaCl, tím jsou spermie odolnější i proti jiným nepříznivým vlivům prostředí. Z toho se odvozuje, že mají i větší plodnost. Na rezistenci spermatu má vliv mnoho činitelů vnitřního i zevního prostředí, hlavně pak krmení a ošetřování. Rezistence může silně kolísat jak u býků různých plemen, tak i u býků téhož plemena, popřípadě i u jednotlivých ejakulátů. Rezistence, kterou spermie získávají při průchodu ocasem nadvarlete, je však jen jedním článkem v celém řetězu činitelů a vlastností, které podmiňují plodnost ejakulátu. (POLÁK, 1961) Při prověrce rezistence se zjišťuje, kolik kubických centimetrů 1% roztoku NaCl je zapotřebí přidat k objemu 0,02 ml spermatu, aby byl rozrušen obal spermií a tím zastaven jejich progresívní pohyb. (POLÁK, 1961) Rezistence má být u ejakulátu dobré jakosti alespoň (ŠMERHA, 1980) Testy přežitelnosti spermatu Testy přežitelnosti spermatu jsou důležité pro posouzení biologické hodnoty a oplozovací schopnosti spermií. Mezi výsledky těchto testů a skutečnou plodností byla 33

34 zjištěna vysoká korelace. Jedná se o testy: Krátkodobý tepelný test přežitelnosti, dlouhodobý tepelný test přežitelnosti. (LOUDA, 2001) Metoda funkčního vyšetření spermií (FVS) vychází ze skutečností, že kvalita ejakulátů je především prezentována úrovní funkčních ukazatelů spermií. Proto při každém vyšetření semene s cílem posouzení jeho funkční úrovně a zvýšeni možnosti předpovědi jeho přežitelnosti a oplozovací schopnosti přistupuje se k metodě FVS. FVS spočívá v rozšíření základního vyšetření ORS o ukazatele, které při krátkodobém testu přežitelnosti vykazuji změny dokládající funkční a morfologickou rezistenci spermií. Kromě základního vyšetření ejakulátu se provede: -zjištění aktivity spermií ve výchozím čase a za 12O minut testu přežitelnosti; - zjištění procenta živých spermií ve výchozím čase a za l2o minut testu přežitelnosti; -stanovení rychlosti pohybu spermií testem propulsivity v obou časových termínech; - hodnocení aktivity endogenních reduktáz taktéž v obou časových termínech; -morfologické posouzení a morfologická rezistence spermií barvených nátěru ve výchozím čase a za 120 minut testu přežitelnosti.(věžník, 2004) Odolnost živých spermií vůči chladovému šoku Touto zkouškou se posuzuje reakce spermií na rychlé zchlazení. (LOUDA, 2001) Chladový šok je velkým nebezpečím pro spermie. Je působen náhlým poklesem teploty, a to zejména v hranicích od 25 do 5 C. (KOVÁŘ, SOBEK, 1965) Chladový šok je reakce spermií na rychlé ochlazení. Spermie ztrácejí životnost, plodnost, hynou a po novém zahřátí na tělesnou teplotu neobnoví jíž pohyb. Stupeň účinnosti chladového šoku je závislý na odolnosti spermií. (POLÁK, 1961) Chladový šok (otřes, mrtvice) spermií nastává: 1. rychlým ochlazením, přeskokem z tělesné teploty na teploty pod 17 C, 2. zachycením ejakulátu do studených, nezahřátých sběračů spermatu, hlavně pak v chladném ročním období při teplotách pod 18 C, 3. ředěním spermatu studeným ředidlem, přičemž vzniká tím větší chladový šok, čím větší je stupeň ředění, 4. změnou slabé kyselé reakce spermatu v zásaditou, 5. při malém objemu spermatu: čím menší objem, tím rychleji sperma chladne a znehodnocuje se, 34

35 6. při malé odolnosti spermií a nedostatečném lipoidním obalu, 7. u nezralých nebo přestárlých spermií, 8. při prověrkách a ředění v laboratořích s teplotou pod 18 C, 9. při nedodržování zásad ředění, chlazení a přepravy, 10. při inseminaci neředěným spermatem, použije-li se chladných inseminačních pipet nebo při inseminaci na mrazu. (POLÁK, 1961) Prověrka respirace spermatu Biologickou hodnotu, pohyblivost, počet a životnost spermií lze stanovit také určením respiračního kvocientu. Respirace se stanoví cytorespirometrem, jímž se měří množství spotřebovaného kyslíku za určitou dobu. Biologicky plnohodnotné sperma spotřebuje mnohem více kyslíku než sperma méněhodnotné, u něhož je spotřeba kyslíku mnohem nižší. Této prověrky se používá při určování testu vyčerpanosti, který se zjišťuje odebráním 10 ejakulátů za 2 hodiny u téhož býka. Jakost každého ejakulátu se stanoví cytorespirometrem. (POLÁK, 1961) Stanovení procenta živých a mrtvých spermií barvením Touto biologickou zkouškou se získává obraz o kvalitě ejakulátu. Je založena na rozdílné afinitě živých a mrtvých spermií k barvivům. Mrtvé nebo oslabené spermie přijímají barvivo, živé spermie nepropouštějí semipermeabilní membránou barvivo a zůstávají bílé. Málo životaschopné spermie se značně sníženým metabolismem se barví bledě růžově až červeně. Např.: barvením eosínem, barvení podle Bloma I., Lasleye, Bloma II. (LOUDA, 2001) Test fruktózy a fruktolýzy Existují vztahy mezi indexem fruktolýzy a plodnosti ejakulátu. Metoda stanovení fruktózy a fruktolýzy je založena na principu metody, kterou se prokazuje cukr v krvi. Je poměrně složitá, nehodí se pro běžný inseminační provoz, a proto ji nerozvádíme. (POLÁK, 1961) Prověrka koncentrace hyaluronidázy Jako biologického testu pro posouzení kvality spermatu se může použít i zjištění koncentrace hyaluronidázy, která vzrůstá s intenzitou poškození spermií, přičemž klesá rezistence, pohyblivost a plodnost. (POLÁK, 1961) 35

36 Prověrka pohybu spermií přídavkem glukózy Zjišťují-li se v ejakulátech některých býků zdánlivě mrtvé, málo pohyblivé spermie nebo zpomalený hromadný pohyb, doporučuje se přidat ke spermatu roztok glukózy. Zvýší-li se pohyb spermií, je to průkazem anabiózy z hladu", která vzniká při nesprávném krmení, zvláště při nedostatku cukru v krmné dávce. Po zjištění se potřebně upraví složení krmné dávky a sleduje se její vliv na změnu kvality ejakulátu. (POLÁK, 1961) Zjišťování hodnoty katalázy Určení hodnoty katalázy pomáhá k rychlejší orientaci o počtu spermií a jiných buněk v ejakulátu. Normální a čistě získaný ejakulát má jen malé množství štěpného fermentu H 2 O 2. V patologických ejakulátech s leukocyty, erytrocyty, bakteriemi apod. se rychle zvyšuje obsah katalázy. Sperma s malým počtem spermií a živých buněk vykazuje číslo katalázy do 300. Ukazatelé převyšující tuto hranici poukazují na změny v ejakulátu, který se musí podrobněji a pečlivěji prověřit dalšími zkouškami. (POLÁK, 1961) Speciální vyšetření dávek Hypoosmotic swelling (HOS) test Hypoosmotic swelling (HoS) test patří mezi jednoduché průkazy membránové úrovně spermií stanovením jejich semipermeability. U intaktních buněk vlivem hypoosmotických podmínek dochází průnikem vody a zvětšováním buněčného objemu ke stáčení bičíků. HOS test je doplňkem metod hodnotících vitalitu spermií. Použití této metody umožňuje především hodnotit integritu membrán bičíku spermií. (VĚŽNÍK, 2004) Automatické systémy hodnocení kvality inseminačních dávek CASA (Computer assisted semen analysis) CASA je velmi přesná metoda určující celou škálu pohybových charakteristik spermií, vyžaduje však správné nastavení parametru měření, vhodnou přípravu vyšetřovaného vzorku a správnou interpretaci získaných výsledků. (VĚŽNÍK, 2004) Klasické hodnocení motility je ovlivněno řadou subjektivních faktoru. Dlouhou dobu proto existuje snaha zavést objektivní metodu. CASA (Computer asisted semen analysis) přinesla v tomto směru značný pokrok a prokázala, že exaktní vyhodnocení motility spermií má skutečně predikační hodnotu při odhadu fertility, a to zejména 36

37 v rámci asistované reprodukce. CASA je poloautomatická počítačová metoda pro hodnocení morfologie a motility spermií využívaná především pro vyšetření motility. Optický systém zařízení snímá obraz, který je digitalizován a přenášen na monitor ve formě pixelů. Pomocí speciálních algoritmů využívajících počty a jasnost pixelů jsou rozlišovány pohyblivé a nepohyblivé spermie a je analyzována dráha každé spermie Dráha jednotlivých spermií je determinována funkcí jejich bičíků a s charakteristikou pohybu odráží fyziologický stav spermie. (VĚŽNÍK, 2004) U pohyblivých spermií jsou pomocí CASA stanoveny následující parametry: VCL curvilinear velocity- rychlost hlavičky na skutečné dráze, průměrná rychlost mezi body měření VAP average-path velocity - rychlost hlavičky na napřímené dráze (odvozena matematickou úpravou VCL), slouží k plynulejšímu vyjádření pohybu VSL straight-line velocity - rychlost hlavičky na přímé dráze, mezi výchozím a konečným bodem měření ALH amplitude of lateral head displacemant - maximální šířka oscilace hlavičky, odvozeno z VCL a VAP, odráží pohyb bičíku LIN linearity- linearita skutečné dráhy (VSL/VCLx100) [%] WOB wobble - stupeň oscilace skutečné dráhy kolem její napřímené dráhy (VAP/VCLx100) [%] STR straightness - přímost napřímené dráhy (VSL/VAPx100) [%] BCF beat cross frequency- počet, kolikrát je skutečná dráha překřížena napřímenou dráhou[hz] Podle změřených a vypočítaných parametrů jsou spermie rozděleny do následujících kategorií: nepohybliví (VAP< než limit pro lokálně pohyblivé) lokálně pohyblivé (VAP než limit pro nepohyblivé a menší než limit pro lokálně pohyblivé), pohyblivé (VAP než limit pro lokálně pohyblivé), které se dále dělí nelineárně pohyblivé (motilní, ale ne hyperaktivní s STR 90), nelineárně pohyblivé (motilní, ale ne hyperaktivní s STR < 90), hyperaktivní spermie (motilní s VCL > 80, lin < 65 a LHD > 6,5) cirkulárně pohyblivé (maximální rádius 30 µm). 37

38 V současné době je snaha o větší využití tohoto systému i ve veterinární medicíně, kde je však nutné zohlednit mezidruhové rozdíly ejakulátů, respektive pohybových charakteristik spermií. To vyžaduje správné nastavení parametru pro vyšetření na různých typech přístrojů (mezi nejpoužívanější patří CellSoft a HTM/IVOS). Systém CASA byl použit u několika druhů zvířat (býk, kanec, beran, hřebec, králík, pes). Nejvíce publikací se týká využití u býků. Za zmínku stojí i poznatek o rozdílné charakteristice pohybu býčích spermií s chromosomem X a Y (PENFOLD a spol., 1998). (VĚŽNÍK, 2004) Obr. 3 CASA ( 38