Hladina mykotoxinů v průběhu skladování obilovin

Transkript

1 MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA Ústav technologie potravin Hladina mykotoxinů v průběhu skladování obilovin Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Ing. Viera Šottníková, Ph.D. Vypracoval: Bc. Zdeněk Slonek Brno, 2008

2 2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Hladina mikotoxinů v průběhu skladování obilovin vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne. podpis diplomanta. 3

4 Poděkování Chtěl bych poděkovat Ing. Viere Šottníkové, Ph. D. za odborné vedení při zpracování zadaného tématu diplomové práce a za poskytnutí množství informací k vypracování diplomové práce. Panu Mgr. Vlastimilovi Dohnalovi, Ph.D. děkuji za pomoc s analyzováním a vyhodnocováním vzorků. Firmě ZENZA Znojmo, a.s a jejím pracovníkům za odbornou a profesionální pomoc při získávání vzorků a poskytnutí zázemí. 4

5 ABSTRAKT Diplomová práce obsahuje historii mykotoxinů, přehled nejběžněji se vyskyttujících mykotoxinů, jejich producentů a optimální podmínky pro jejich tvorbu. Přináší přehled maximálních limitů tak, jak se postupně v Evropském společenství vyvíjely. Nejdůležitější limity pro obsah mykotoxinů byly novolizovány Nařízením komise ES č. 1881/2006, a doplněny ES č. 1126/2007. Experimentální část je zaměřena na sledování vzrůstajícího obsahu deoxynivalenolu ve vzorcích ozimé pšenice, která byla naskladněna do obilného sila ZENZA Hodonice ze sklizně Celkem byl vyšetřen soubor 38 vzorků ozimé pšenice. Tyto vzorky byly vhodně upraveny pro mykotoxikologické stanovení. U mykotoxikologického rozboru byly zjištěny všechny vzrorky jako pozitivní, obsahovaly deoxynivalenol, ale žádný vzorek nepřekročil maximální povolený zákonný limit. Klíčová slova: producenti, mykotoxiny, HPLC, deoxynivalenol The diploma work contents a history of mycotoxins, a review of most commonly incidented mycotoxins, their producers and optimal conditions for their production. It brings a summary of maximal limits just as it was gradually progressed in the EU. The most important limits for mycotoxinal content was amended by EU-committee order No. 1881/2006 and it was supplemented by ES No. 1126/2007. Experimental part is focused on content monitoring of deoxynivalenol in samples of wheat, which was stored into the silo of ZENZA Hodonice during the harvest There was inspected a 38 samples sat of wheat at all. These samples were suitable modified for mycotoxicological analysis. By a mycotoxicological analysis was ascertained all samples as positive, they contained deoxynivalenol, but any sample didn t get over maximal permitted lawful limit. Key words: producers, mycotoxins, HPLC, deoxynivalenol 5

6 OBSAH 1 ÚVOD Cíl práce LITERÁRNÍ PŘEHLED Definice Historie mykotoxinů v potravinách Rozdělení mykotoxinů Aflatoxiny Sterigmatocystin Ochratoxiny Patulin Cyklopiazonová kyselina (CPA) Rokvefortin C Citrinin Citreoviridin Fusariové toxiny trichotheceny Fusarin C Zearalenon Deoxynivalenol T-2 toxin Výskyt mykotoxinů v surovinách, produktech a krmivech rostlinného původu Faktory ovlivňující produkci mykotoxinů v pracovním a životním prostředí Infekce zrnin a dalších krmných plodin Stanovení mykotoxinů Test pro měření potenciálu tvorby mykotoxinů v obilí Vývoj legislativy související s hodnotami mykotoxinů Limity Prevence růstu hub a dekontaminace mykotoxinů v polních plodinách Biologická likvidace toxinů Prevence a snižování fusariových toxinů v obilovinách a výrobcích z obilovin58 3 MATERIÁL A METODIKA Charakteristika regionu Znojmo Charakteristika teplotních poměrů Znojma Charakteristika srážkových poměrů Znojma Charakteristika trvání slunečního svitu Znojma Výkup obilovin silem Pšenice potravinářská Pšenice ostatní Ječmen sladovnický Ječmen ostatní

7 3.3 Získání vzorku Přístroje Chemikálie Stanovení DON HPLC stanovení obsahu DON Kalibrace VÝSLEDKY A DISKUSE Obsahy deoxynivalenolu ve sledovaných vzorcích Obsah deoxynivalenolu ve vzorcích ve srovnání s legislativou a dostupnými literárními údaji Obsah deoxynivalenolu ve vzorcích ve srovnání s legislativou Obsah deoxynivalenolu ve srovnání s dostupnými literárními údaji ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam zkratek

8 1 ÚVOD Mykotoxiny jsou látky přírodní povahy, proto lze očekávat jejich výskyt v potravinových surovinách v hodnotách, které se budou od sebe v jednotlivých letech odlišovat. Skladování a uchování potravinových surovin má významný vliv na sekundární kontaminaci mykotoxiny. Důležitým atributem, souvisejícím se zdravotní bezpečnosti potravin našeho života jsou plísně a jimi produkované toxiny. Záruka jejich úplné eliminace neexistuje. Kontrola nezávadnosti konzumovaných potravin a krmiv z pohledu vznikajících toxinů je naprosto nezbytnou součástí. Ke sledovaným látkám, zejména pokud jde o hygienicko-toxikologickou nezávadnost potravin, patří různé průmyslové kontaminanty, těžké kovy, pesticidy, ale i některé přírodní toxiny včetně mykotoxinů. Mykotoxiny zvyšují virulenci plísní a snižují odolnost hostitelského substrátu. Tím dochází k poklesu nutriční hodnoty rostlin, nebo skladovaných surovin a klesá využitelnost zpracování pro potravinářský a krmivářský průmysl. Každoročně dochází k obrovským ztrátám surovin, potravin a krmiv, vlivem jejich znehodnocení toxiny. Mikroorganismy nacházející se v potravinách mohou způsobovat mnohá onemocnění lidí i jiných živočichů. Zajistit zdravotní bezpečnost je v současnosti hlavní prioritou z pohledu ochrany zdraví spotřebitele. Plísně a mykotoxiny jsou velmi závažným rizikem pro bezpečnost potravin a zdraví lidí. 8

9 1.1 Cíl práce Cílem diplomové práce bylo vypracování literární rešerše na téma Hladina mikotoxinů v průběhu skladování obilovin Zpracovat historii mykotoxinů Zjistit výskyt jednotlivých toxinů s přehledem jejich producentů a optimálních podmínek pro rozvoj producentů - Možnost detekce mykotoxinů v laboratořích - Limity jednotlivých toxinů přípustných v potravinách Provedení laboratorních analýz dostupnými metodami Vyhodnocení výsledků, jejich vyhodnocení a diskuze Získané výsledky porovnat s dostupnými informacemi o výskytu a legislativou 9

10 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Definice Mykotoxiny jsou účinné látky mikroskopických hub, nebílkovinné povahy, toxické vůči člověku a hospodářským zvířatům a k expozici jimi dochází proti vůli a zájmům člověka. Uvedená definice se vypořádává zejména s historickými okolnostmi, za jakých pojem,,mykotoxiny vznikl a s tím, že tatáž látka může být v jednom případě mykotoxinem a v jiném antibiotikem (griseofulvin). Na této definici se shodli českoslovenští odborníci na problematiku plísní a mykotoxinů během konference,,mykotoxiny, pořádané Československou vědeckou společností pro mykologii při ČSAV v Praze roku

11 2.2 Historie mykotoxinů v potravinách První doložené zprávy o toxicitě plesnivých potravin pocházejí z konce minulého století z Japonska. Některé z nich navazují na lidové zkušenosti, tradované ve východní Asii po staletí. Zejména je popsána mnohaletá lidová zkušenost, že žlutou rýži je třeba vystavit na několik hodin v tenké vrstvě prudkému slunci, aby pozbyla svoji toxicitu (fotolýza mykotoxinu citreoviridinu). V první polovině tohoto století bylo známo o toxickém účinku plesnivých potravin již více. Ve 30. a 40. letech byly na území tehdejšího SSSR zkoumány vzorky obilí, napadené plísněmi rodu Fusarium. Ty, i jejich extrakty, vykazovaly toxicitu pro pokusná zvířata a v praxi byly spojeny s onemocněním, které je nyní nazýváno alimentární toxická aleukie (ATA); v té době bylo známo pod mnoha synonymy (např.,,septická angína ). Exaktní modelový pokus, prokazující původ ATA z otravy fusáriovými mykotoxiny provedl až Ueno v 70. letech. Ve 40. letech se objevil na trhu "zázrak z plísní", penicilín, zachraňující životy u dříve naprosto beznadějných pacientů s infekcemi. Jeho rozšíření přispěla i 2. světová válka. Nadšení nad penicilínem a záhy plejádou dalších antibiotik zcela přehlušilo starší poznatky o toxicitě plísní, navíc často publikované pouze v národních jazycích a v periodicích a sbornících lokálního významu. Přírodní penicilín se rozkládá v žaludku a nelze jej podávat ústy jako lék (V-penicilín v tabletách je produktem farmaceutického průmyslu), takto podaný penicilín může naopak vyvolávat závažné alergické potíže. Může také nepříznivě ovlivňovat mikroflóru trávicího ústrojí. Sir Alexander Flemming měl mimořádné štěstí v tom, že nalezl kmen, produkující penicilin, který současně neprodukoval žádný mykotoxin. Kmeny s produkcí penicilínu a neprodukující zároveň žádnou toxickou látku jsou značně vzácné. Sir Alexander Flemming nalezl jeden, jeho pozdější američtí spolupracovníci druhý. Originální produkční kmen nalezli i českoslovenští vědci, vyvíjející na konci 2. světové války v poloilegálních podmínkách preparát Mykoin B, což byl originální československý penicilín. Většina výrobců však nakonec přešla na kmen US provenience, který měl nejvýhodnější produkční vlastnosti. Obnovení zájmu o toxické látky z plísní přišlo náhle. V roce 1960 uhynulo na farmách Nové Anglie několik desítek tisíc krůťat na chorobu, tehdy pojmenovanou Turkey-X disease. V té době již byla pokročilejší analytická chemie. Již po krátké době bylo objeveno několik 11

12 toxických látek. Byl také podán průkaz jejich původu z arašídů, které tvořily součást krmné směsi pro krůťata, a rovněž byla zjištěna produkce těchto látek plísněmi, které se v arašídech masově vyskytovaly. Protože se produkující plíseň nazývá Aspergillus flavus, byly nalezené jedy nazvány aflatoxiny. Poměrně rychle byla zavedena práce s mykotoxiny i do tehdejší ČSSR. K zahájení výzkumu mykotoxinů na lékařské fakultě v Brně došlo v souvislosti s následující kasuistikou. V jednom ze závodů tehdejší Fruty došlo k zaplísnění rajčat. To vedlo k výraznému senzorickému znehodnocení výrobků silně hořkou chutí. Navíc, pracovníci hygienické služby, provádějící tehdy senzorické zkoušky, onemocněli s příznaky poškození jater. Řešením problému byl tehdy pověřen doc. RNDr. Miroslav Polster, CSc., který se spojil s řadou zahraničních pracovišť a postupně přešel ze sledování jiných xenobiotik a výzkumu bakteriálního metabolismu na problematiku mykotoxinů. Vystudoval chemii, ale dlouhá léta pracoval jako mikrobiolog. V jeho osobě se tedy ideálně spojily požadavky na pracovníka v této oblasti: důkladná znalost chemie a mikrobiologická erudice. Posléze začal obnovený výzkum veterinárních toxikóz na tehdejší VŠV Brno (nyní VFU Brno), v Hradci Králové (Dvořáčková) a ve výzkumném ústavu ČSAV v Olešnici v Orlických horách. Referenční laboratoř pro analýzu mykotoxinů byla zřízena při KHS Plzeň. Na Slovensku byl výzkum mykotoxinů a plísní soustředěn na Výzkumném ústavu preventivného lekárstva v Bratislavě. V 70. letech se výzkum i rutinní testování nejdůležitějších mykotoxinů rozšířil na mnoho dalších pracovišť. V současné době představuje vrcholové pracoviště pro mykotoxiny v potravinách a potravinových surovinách Centrum hygieny potravinových řetězců na Státním zdravotním ústavu v Brně. Každé z pracovišť, která se u nás zabývají mykotoxiny, má svá specifika. Pracoviště na LF MU Brno v sobě díky tradicím, založeným doc. Polsterem, spojuje přístup chemický a mikrobiologický. Zde se systematicky zkoumají vztahy vlastností plísňových kultur a produkce mykotoxinů ( ). 12

13 2.3 Rozdělení mykotoxinů Mykotoxiny lze rozdělit podle velkého množství kritérií. Žádné z dosud používaných však nelze považovat za univerzálně použitelné. Nejjednodušší je rozdělení podle chemické struktury. Jeho výhodou je poměrně snadné a jednoznačné zařazení jakékoli látky o známé chemické struktuře. Tab. č. 1 Chemické dělení mykotoxinů Furanofurany Substituované pyreny a hydroxypyreny Substituované chinony Nenasycené laktony Griseofulviny Epoxytrichotheceny Polycyklické substituované indolové deriváty Cyklické dipeptidy Mykotoxiny jiné struktury aflatoxiny, sterigmatocystin, versicolorin, aj. kyselina koji, sekalonové kyseliny aj. luteoskyrin, rubratoxin, xanthomegnin, viridicatumtoxin aj. patulin, kyselina penicillová, kyselina mykofenolová, alternariol, citreoviridin, ochratoxiny, rubratoxin B, 4,5,8- trimetylpsoralen aj. griseofulvin T-2 toxin, diacetoxyscirpenol, vomitoxin (=deoxynivalenol), nivalenol, fusarenony, verrucariny, roridiny, satratoxiny aj kyselina cyklopiazonová, paspaliny, penitremy aj. gliotoxin, sporidesminy, roquefortin, fumitremorgen, verruculogeny, brevianamidy aj. zearalenon, curvularin, citrinin, PR-toxin, canthecellin, moniliformin, kyselina betanitropropionová aj. 13

14 Tab. č. 2 Dělení mykotoxinů podle způsobu biosyntézy Biosyntéza moniliforminu - moniliformin (z kyseliny octové) Biosyntéza z polyketidů -patulin, ochratoxin, emodin, kyselina sekalonová, aflatoxiny aj. Biosyntéza z isoprenoidů - trichotheceny, roquefortiny aj. Biosyntéza z aminokyselin - kyselina cyklopiazonová, cyklické dipeptidy aj. Tab. č. 3 Dělení mykotoxinů podle toxicity - kvantitativní Silně toxické aflatoxiny, patulin, luteoskyrin, sporidesminy, ochratoxin A, cyklochlorotin (= islandotoxin), zearalenon (F-2 toxin), T-2 toxin, DAS (diacetoxyscirpenol), citreoviridin, rubratoxiny, penitrem A (nejnižší LD50 ze známých mykotoxinů) Středně toxické citrinin, kyselina penicillová, sterigmatocystin, kyselina cyklopiazonová Slabě toxické griseofulvin, kyselina koji, trichothecin, kyselina mykofenolová, chaetomin Tab. č. 4 Dělení mykotoxinů podle toxicity kvalitativní Hepatotoxiny aflatoxiny, sporidesminy, luteoskyrin, sterigmatocystin aj. Nefrotoxiny ochratoxin A, citrinin aj. Toxiny zažívacího traktu T-2 toxin další trichotheceny Neurotoxiny a myotoxiny tremorgeny (např. penitrem A), citreoviridin Dermotoxiny verrucariny, psoraleny, sporidesminy, trichotheceny aj. Toxiny dýchacího traktu patulin Genitotoxiny zearalenony Imunotoxiny aflatoxiny, ochratoxin A, trichotheceny aj. Toxiny nezařaditelné nebo málo prozkoumané 14

15 Tab. č. 5 Rozdělení podle účinku na buňku Inhibitory tvorby energie Inhibitory proteosyntézy Modifikátory cytoskeletu Estrogenní mykotoxiny Tremorgeny citreoviridin, luteoskyrin, xanthomegnin, kyselina sekalonová D, moniliformin trichotheceny, ochratoxin A griseofulvin, cytochalasiny, cyclochlorotin zearalenon penitremy (A, B, C), fumitremorginy (A a B), verruculogeny Karcinogenní mykotoxiny aflatoxin B 1 ( Aflatoxiny Obr. č. 1 Aflatoxin B 2 Aflatoxiny patří s ohledem na svoji extrémně vysokou toxicitu mezi nejvíce sledované mykotoxiny. Nejvýznamnějšími producenty aflatoxinů jsou dvě blízce příbuzné plísně rodu Aspergillus, a to A. flavus a A. parasiticus. K jejich rozvoji může za příznivých podmínek docházet prakticky v každém substrátu, nicméně nejvyšší nálezy aflatoxinů (v ojedinělých případech až stovky mg.kg -1 ) byly zaznamenány u kukuřice, podzemnice olejné, pistácií, paraořechů, bavlníkových semen a kopry. Nižší hladiny aflatoxinů lze nalézt i v mandlích, pekanových a vlašských ořechách, hrozinkách, fících a různých druzích koření (VELÍŠEK, 1999). 15

16 Podmínky produkce mykotoxinů: teplota C, optimum 28 C, ph 2,5 6,0, vlhkost nad 14 %, (pod 12 % vlhkosti substrátu se produkce mykotoxinu zastavuje), doba růstu 3 15 dní (SUCHÝ A HERZIG, 2005). Jsou známy čtyři základní aflatoxiny B 1, B 2, G 1 a G 2. Od nich jsou odvozeny aflatoxiny M 1 a M 2, které vznikají až v organismu zvířat a přecházejí do masa, ledvin, mléka a vajec. Aflatoxiny se v těle hromadí a jejich vylučování je pomalé. Nejnebezpečnější je aflatoxin B 1, po něm následují s klesající toxicitou aflatoxiny G 1, B 2 a G 2. Na rozdíl od většiny ostatních mykotoxinů je aflatoxin B 1 účinný až po jeho biotransformaci v organismu zvířete. Aflatoxin B 1 je nejsilnějším dosud známým přírodním karcinogenem. Karcinogenní účinek je důsledkem dlouhodobého příjmu nízkých dávek aflatoxinů ( Aflatoxiny jsou poměrně hydrofilní sloučeniny a proto není jejich afinita k tukové složce potravinářských surovin vysoká a při výrobě rostlinných olejů se koncentrují ve šrotech. Při zpracování mléka, při kterém dochází k oddělení mléčného tuku, je nutné počítat s relativním nárůstem afaltoxinu M 1 např. v odtučněném tvarohu, syrovátce, podmáslí apod. Při tepelném zpracování kotaminovaných surovin je možné zaznamenat vesměs pokles většiny aflatoxinů, jehož rozsah pochopitelně závisí na obsahu vlhkosti, množství tuku a dalších složkách, přítomných v dané potravině. Příklad experimentálních údajů pro aflatoxin B 1 jsou shrnuty v tabulce č. 6. V některých případech se pokles nálezů tohoto toxinu přičítá jeho vazbě na přítomné organické makromolekuly, zvláště tvorbě komlexů s proteiny (VELÍŠEK, 1999). 16

17 Tab. č. 6 Změny obsahu aflatoxinu B 1 a M 1 při zpracování kontaminovaných surovin Produkt Podmínky zpracování Ztráty (%) arašídy Pražené,150 C, 30 min 20 Suché pražení 31 Pražení v oleji 35 Výrobky z arašídů Pražení, 204 C Podzemnicový olej Záhřev, 120 C, 10 min 0 (nerafinovaný) Rýže Napařovaní 0 Vaření za tlaku, 120 C 27 Normální vaření 51 Mléko Pasterace 72 C, 45 s 35 Sterilace 115 C 19 I když mykotoxiny jsou jedovaté pouze ve velkém množství, vystavení se velmi malým dávkám alfatoxinů po dlouhou dobu může být také zdraví nebezpečné. Určité aflatoxiny mohou také způsobovat genetické mutace v lidských i zvířecích buňkách. Jako výsledek kontrol potravinářské produkce v rozvinutých zemích světa je těžká otrava aflatoxiny velmi nepravděpodobná. Množství aflatoxinů v nezpracovaných potravinách bylo redukováno důslednými kontrolními mechanismy, používanými ještě před jejich prodejem. Nad to ve většině zemí existují pravidelné a systematické kontroly množství aflatoxinů v základních prvotních surovinách (obiloviny, dehydrované ovoce, atd.). Pečlivě se také kontroluje maso a mléko. Na druhou stranu, obyvatelé méně rozvinutých oblastí světa, hlavně Afriky a Asie, jsou více vystaveni riziku otravy aflatoxinem. Nicméně tato rizika se týkají i ostatních států, a to v důsledku mezinárodního obchodu. Nebezpečí, spojená s přítomností aflatoxinů a ostatních mykotoxinů, se dotýkají dovážejících zemí stejně jako pěstitelských. Z tohoto důvodu se kontroly vysoce rizikových produktů provádějí, jakmile dorazí do třetí země. Celá řada zemí reguluje hladinu aflatoxinů v produktech určených pro potraviny a zvířecí krmivo. Evropská unie také určila maximální limity schválené pro značné množství potravin, včetně sušeného a 17

18 dehydrovaného ovoce, obilniny a také mléko a mléčné výrobky. V podmínkách České republiky jsou tyto mykotoxiny zjišťovány v surovinách z dovozu a dále při kontaminaci skladovaných produktů (Nedělník, 2003). Detoxikační opatření Odstranění nebo inaktivace aflatoxinů (dále AF) z kontaminovaných zemědělských produktů je dlouhodobý problém. AF jsou látky velmi termostabilní, že např. pasterizace ani var v neutrálním prostředí je nerozloží. Při chemické dekontaminaci se spíše využívá reakcí založených na citlivosti AF vůči oxidaci, nestabilnosti při nízkých a vysokých hodnotách ph. Celosvětově doporučovaná metoda pro snížení obsahu aflatoxinů je amoniakalizace působení NH 4 OH za teploty 118 C a zvýšeného tlaku. Určité výsledky přináší i použití alkalických oxidačních činidel, popř. adiční reakce s alkoholem v kyselém prostředí. Avšak tyto chemické metody mají pouze omezené uplatnění, nehodí se např. pro ošetření potravin, a to pro nebezpečí toxických reziduí z použitých chemikálií. Z mnoha hledisek (včetně ekonomického) se zdá výhodnější se zaměřit především na prevenci kontaminace potravin, tj. na přísné dodržování technologií výroby a skladování zemědělských produktů nebo na výběr rostlin, resistentních vůči houbovým chorobám. Aflatoxiny nejsou obvykle konzumovány izolovaně, ale v kombinaci s dalšími mykotoxiny, kde se může uplatňovat synergismus. Rovněž další xenobiotika mohou modifikovat toxicitu aflatoxinů, popř. dalších mykotoxinů (VIŠŇOVSKÝ, 1997) Abychom mohli plísně dále pozorovat a zkoumat, musíme mít k dispozici a využití moderní metody, které nám pomohou odpovědět na řadu zatím nezodpovězených otázek a posunout tak hranice našeho poznání. K těmto metodám patří i chemotaxonomie. Chemotaxonomie je významná metoda ke stanovení metabolického profilu toxinogenních plísní se zaměřením na vybrané sekundární metabolity. V uvedeném případě se jedná o mykotoxiny. Získané výsledky metabolického profilu toxinogenních plísní umožní provést jejich druhovou identifikaci. Jestliže byla u některého kmene určitého druhu plísní dříve zjištěna produkce určitého mykotoxinu, je možné považovat všechny kmeny tohoto druhu za potenciálně toxinogenní, tj. schopné produkovat určitý mykotoxin. Stanovení reálné toxinogenity kmenů se provádí na specifických živných půdách (např. YES médium) 18

19 s následným analytickým stanovením příslušných mykotoxinů (OSTRÝ, ŠKARKOVÁ a RUPICH, 2001) Sterigmatocystin Obr. č. 2 Sterigmatocystin Sterigmatocystin je kometabolit plísní příbuzných aflatoxinům. Bývá považován za jejich prekurzor při biosyntéze. Jedním z jeho nejvýznačnějších producentů je plíseň A. versicolor. Přítomnost sterigmatocystinu byla prokázána spolu s aflatoxiny v plesnivých cereáliích, kávových zrnech, z živočišných produktů pak v šunce, salámech i sýrech (VELÍŠEK, 1999). Producenti: Aspergillus flavus, A. multicolor, A. nomius, A. parasiticus, A. versicolor, Bipolaris nodulosa, Chaetomium thielavioideum, Chaetomium udagawae, řada zástupců Emericella spp., Farrowia malaysiensis, Monocillium nordinii ( Zdá se, že část biochemických pochodů, vedoucích ke tvorbě mykotoxinů, mají sterigmatocystin a aflatoxiny společnou. Při uměle zavedených metabolických blocích končí biosyntéza u versicolorinů ( Patří mezi kyselé mykotoxiny, za alkalické reakce přechází do vodného roztoku, ale silně alkalické prostředí vede k jeho rozkladu. Je dobře stanovitelný vzhledem ke zbarvení ve viditelném světle a intenzívní žluté fluorescenci pod ultrafialovým světlem (365 nm). K jeho 19

20 mikrobiologickému stanovení lze využít i jeho antibakteriální účinky ( Toxikologické údaje: akutní toxicita je nízká je meziprodukt biosyntézy aflatoxinů vykazuje hepatotoxické účinky má mutagenní účinky (Ames test - zejména po metabolické aktivaci mikrozomálními enzymy) a u Bacillus subtilis vytváří addukty v DNA jeho karcinogenní aktivita se rovná 1/10 karcinogenity aflatoxinu B 1. ( Sterigmatocystin je pro lidi i zvířata aktutně silně toxický a obdobně jako aflatoxiny vykazuje pokazatelnou hepatokarcinogenitu. Z tohoto důvodu je jeho obsah v potravinách limitován. V ČR se přípustné maximální obsahy v poživatinách pohybují v rozmezí 5-20 µg/kg (VELÍŠEK, 1999) Ochratoxiny Obr. č. 3 Ochratoxin A 20

21 Tato skupina mykotoxinů zahrnuje sedm izokumarinových derivátů, vždy spojených s fenylalaninem. Primárním cílovým orgánem ochratoxinu A je vyvíjející se centrální nervový systém ( K objevu ochratoxinů došlo v Jihoafrické republice při laboratorním vyšetřování toxinogenních hub, izolovaných ze zemědělských plodin. Nejvýznamnějšími producenty těchto toxinů byly plísně Aspergillus ochraceus. V chladnějších klimatických pásmech Evropy (zejména ve Skandinávii) jsou nejvýznamnějšími producenty nejtoxičtějšího mykotoxinu této skupiny, ochratoxinu A (zkratka OTA), penicillia, především Penicillium viridicatum (VELÍŠEK, 1999). Producenti: Aspergillus ochraceus, A. verrucosum, A. sulphureum, A. mellus, Penicillium viridicatum, P. palitans, P. commune, P. aurantiogriseum, P. freii, P. tricolor, P. verrucosum, P. polonicum. Podmínky produkce mykotoxinu: teplota 12 až 37 C, optimální 25 až 37 C, vlhkost 18 až 25 %, ph minimálně 2,2. Růst plísní a produkce mykotoxinů ustává při vlhkosti substrátu pod 13 % a teploty v rozmezí 4 až 9 C (SUCHÝ a HERZIG, 2005). Mechanismus jeho toxicity spočívá v tom, že fenylalaninová část jeho molekuly je t-rna zaměněna za fenylalanin. Ten je však v ochratoxinu A navázán na kumarinovou část, která brání jeho navázání do proteinového řetězce. Tím dojde k zastavení proteosyntézy. Fenylalanin může do určité míry posloužit jako antidotum, protože mezi ním a ochratoxinem A probíhá při vazbě na t-rna kompetitivní inhibice. V rámci základního výzkumu ochratoxinu A byly připraveny analogy, ve kterých je fenylalanin nahrazen jinou aminokyselinou, jejich toxicita byla srovnatelná ( Ve své molekule obsahuje fenylalanin se substituovaným (3R)-3,4- dihydromethylisokumarinem. Toxické účinky jsou přičítány atomu chlóru, kterým je aromatický kruh substituován. Ochratoxin B se liší od ochratoxinu A pouze absencí atomu chlóru, ale stejně jako ochratoxiny α a β, vznikající z mateřských sloučenin ztrátou fenylalaninu (hydrolýze peptidové vazby), je prakticky netoxický. Na inkorporaci atomu chloru do skeletu ochratoxinu A se podílí chlorperoxidasa, donorem je anorganický chlorid (VELÍŠEK, 1999). 21

22 Hlavním účinkem ochratoxinu A na úrovni organismu je útlum imunity a postižení ledvin. Novější práce, zabývající se karcinogenitou ochratoxinu A, prokazují silný efekt promotoru karcinogenního procesu, ale nebyla prokázána schopnost iniciace. Z hlediska praktického přístupu ke kontaminaci potravin ochratoxinem A se tím nic nemění, protože potravu i prostředí atakují karcinogeny se schopností iniciace z mnoha dalších zdrojů ( Ochratoxin A se nejčastěji nachází v cereálicích (ječmeni, pšenici, kukučici, rýži) a také v zelených kávových bobech. Vedle rostlinných produktů lze nalézt tento mykotoxin též v orgánech hospodářských zvířat, zejména ledvinách vepřů. Koncetrace zde často dosahují až stovek µg.kg -1, přechodový faktor se pohybuje v rozmezí (u drůbeže jsou jeho hodnoty několikanásobně vyšší, ), pro játra s pohybuje v rozmezi Stopové koncentrace ochratoxinu A byly prokázány i v mase, příležitostně v sýrech, popsána byla produkce tohoto mykotoxinu i v uzenářských výrobcích, k jejichž finalizaci se používají kulturní plísně, jako např. uherský salám (VELÍŠEK, 1999). Jeho výskyt v obilninách byl zjištěn už dva týdny před sklizní i po ní při skladování při vyšší vlhkosti kolem 20 % a teplotě 3 5 C. Obsah v kukuřici, ječmenu a ovsu činil až 0,2 mg/kg. Vysoké obsahy vykazuje poměrně často i sója a surová sójová moučka (KALÁČ a MÍKA, 1997). Hlavním zdrojem ochratoxinu A je obilí. I naše obilí zpravidla obsahuje detekovatelné, ale podlimitní koncentrace. Významným zdrojem ochratoxinu též může být káva. Toto zjištění souvisí s nálezy toxikologicky významných koncentrací ochratoxinu A v lidské krvi v krevních konzervách (Německo, Rakousko, Švýcarsko). Při cíleném pátrání po zdroji byl prokázán právě původ z kávy. U nás je surová káva rozdělena do tří jakostních skupin, I. - III. I. ochratoxin A zpravidla neobsahuje, II. výjimečně a podlimitní koncentrace, III. pravidelně a často se vyskytují i nadlimitní koncentrace. V praxi se suroviny míchají na jakostní stupně a - d. První je prakticky jen s jakosti I, poslední stupeň obsahuje převážně jakost III. Písmeno, označující jakost, nalezneme na balení kávy (pokud je balena na našem území) za číslem státní normy. Dalším význačným zdrojem ochratoxinu je vepřová krev, v níž je ochratoxin vázán na albumin - domácí zabijačky, krevní speciality ( Ochratoxiny se ukládají v tkáních (ledviny) a přechází do potravin. Jde o termostabilní toxin, tudíž není destruován při tepelné úpravě krmiv a potravin. Určitou výhodou z hlediska 22

23 bezpečnosti potravin je, že se jen nepatrně kumuluje v živočišných tkáních, takže potraviny živočišného původu nepředstavují pro člověka vážné riziko. Přesto byla prokázána jeho rezidua v masných výrobcích. K jeho vzniku dochází i při použití kulturních plísní, např. v uherském salámu. Z živočišných potravin může být významným zdrojem ochratoxinů vepřová krev (výrobky z krve), ve které se ochratoxin váže na sérový albumin (SUCHÝ a HERZIG, 2005) Patulin Obr. č. 4 Patulin Nejvýznamnějšímí producenty patulinu jsou plísně Penicillium patulinum a P. expansum, které patří mezi běžné patogeny mnoha druhů ovoce a a zelenin. Patulin se nalézá především v jablkách, ale prokázán byl i v hroznech, pomerančích apod. Jde o relativně velmi běžný kontaminant koncentrátů a džusů připravených z těchto surovin, zejména bylo-li k jejich výrobě použito ovoce ve vysokém stupni zralosti, přezrálé nebo poškozené (hladiny patulinu však běžně nepřevyšují 0,1 mg.kg-1. Chemickou sturkturou se patulin řadí mezi mykotoxiny laktonového typu, jedná se o opticky inaktivní 4-hydroxy-4H-furo(3,2-c)pyran-2(6H)-on (Velíšek, 1999). Producenti: Penicillium urticae, P. expansum, P. claviforme, ale produkují jej i plísně rodu Aspergillus (A. clavatus, A.giganteus, A. tereus). Živný substrát: rýže, nahnilé ovoce, ovocné šťávy (jablečné), rajčatové výrobky, může být produkován i v plesnivých silážích. 23

24 Podmínky produkce mykotoxinu: teplota 2 do 35 C, optimum 25 C, ph 3,0 až 6,5, doba růstu 6 až 8 dní (Suchý a Herzig, 2005). Toxický účinek patulinu je objasňován jeho schopností vázat se na sulfhydrilové skupiny bílkovin. To ve svém důsledku vede k narušení permeability buněčných membrán, narušení aktivity enzymů, narušení procesu dýchání. Patulin má teratogenní vlastnosti. Není přímý mutagen. Je podezříván z poškození DNK, inhibuje RNK, ale karcinogenita pro člověka dosud nebyla prokázána ( V gastrointestinálním traktu (GIT) vyvolává degeneraci epitelových buněk, záněty, ulcerace a hemoragie. Jde o neurotoxický mykotoxin, poškozuje CNS, slezinu, játra, žaludek, ledviny a respirační aparát. Nejčastěji vyvolává intoxikace u drůbeže. Při dlouhodobém podávání je karcinogenní. U skotu jsou popisovány i akutní otravy patulinem, manifestující se jako plicní edém. Při krmení kontaminovanou siláží může vyvolat vnitřní krvácení. Za charakteristické klinické projevy intoxikace lze pokládat ztrátu koordinace, paralýzu a degeneraci neuronů mozkové kůry. Pro člověka jsou hlavním zdrojem patulinu nejrůznější potraviny vyrobené ze zkaženého ovoce. Proti jeho tepelnému rozkladu působí vitamín C, který toxin tepelně stabilizuje i při sterilizačních teplotách (Suchý a Herzig, 2005). S ohledem na prokázanou toxicitu patulinu se požaduje, stejně jako u aflatoxinů, aby jeho obsah v potravinách byl snížen na technicky dosažitelné minimum. Akční limit navržený pro patulin WHO je 0,005 mg.kg-1, česká legislativa udává obecně limitní hodnoty pro potraviny v rozmezí 0,05 až 0,1 mg.kg-1, pro kojenecké výrobky 0,001 mg.kg-1 (Velíšek, 1999). 24

25 2.3.5 Cyklopiazonová kyselina (CPA) Obr. č. 5 Cyklopiazonová kyselina Byla objevena v roce Paralelně bývají v substrátu přítomny i další příbuzné sloučeniny, amidy a iminy kyseliny cyklopiazonové a její chelát s Fe 3+, popsaný samostatně na začátku 70. let jako flavutoxin. Jde o indolovou sloučeninu, barevně reagující s Ehrlichovým činidlem, což lze použít i pro její stanovení ( Cyklopiazonová kyselina příležitostně doprovází v kontaminovaných materiálech aflatoxiny. Jejími významnými producenty jsou některé kmeny Aspergillus flavus, produkována je i některými penicilii, zvláště druhem Penicillium commune a P. griseofulvum. Přítomnost tohoto mykotoxinu byla prokázána např. v kukuřici, slunečnicových semenech, různých krmivech, arašídech i v sýrech, zrajících s bílou plísní na povrchu. Informace o ukládání tohoto mykotoxinu v živočišných tkáních nejsou k dispozici. Obecně jsou údaje o výskytu cyklopiazonové kyseliny velmi omezené (VELÍŠEK, 1999). Z toxikologických vlastností byly popsány změny v transportu iontů vápníku vedoucí k osmotické smrti buněk. Působí inhibičně na adenosintrifosfatázu v sarkoplazmatickém retikulu svalových buněk. Klinicky jde o projevy slabosti, letargie a narušené koordinace. Citlivá k intoxikaci CPA je především drůbež. CPA může vytvářet rezidua v živočišných produktech. Nízké koncentrace CPA, doložené v živočišných potravinách naznačují, že CPA nepředstavuje vážné riziko pro spotřebitele. Určitá rezidua byla prokázána v drůbežím mase. V menší míře se vyskytuje toxin v plísňových 25

26 sýrech (Penicillium camemberti) a plísňových salámech. Při nedodržení technologických postupů pří výrobě těchto potravin se může jeho koncentrace výrazně zvýšit (SUCHÝ a HERZIG, 2005) Rokvefortin C Obr. č. 6 Rokvefortin C Rokvefortin C mohou produkovat některé kmeny plísní Penicillium roqueforti používané k výrobě sýrů s modrou plísní v těstě. Hladiny rokvefotinu C v sýrech dosahovaly v době jeho objevení řádově až jednotek mg.kg -1. Za současných podmínek však selektované kmeny tento toxin produkují jen ve stopovém množství. Rokvefortin C je bazická sloučenina, kterou lze řadit mezi alkaloidy. Základem skeletu je dihydroindolový cyklus. Toxicita rokvefortinu je obecně nízká, podrobnější údaje o působení na lidský organismus však nejsou k dispozici (VELÍŠEK, 1999). 26

27 2.3.7 Citrinin Obr. č. 7 Citrinin Citrinin, jenž byl objeven na počátku 30. let 20. století, je produkován především plísněmi Penicillium citrinum a P. verrucosum. Představuje hlavní kontaminant tzv. žluté rýže. V mírném klimatickém pásmu se nachází především v obilninách, údaje o jeho výskytu jsou však omezené (VELÍŠEK, 1999). Producenti: plísně rodu Penicillium (P. citrinum, P. expansum, P. verrucosum) a rodu Aspergillus (A. tereus, A. candidus). Podmínky produkce mykotoxinu: mykotoxin je produkován při teplotě 15 až 37 C, optimum je 30 C. Jde o nefrotoxin, způsobuje lymfopenii. U citrininu byly prokázány kancerogenní, mutagenní a teratogenní vlastnosti. U krav mléčného typu vyvolává onemocnění označované jako syndrom pyrexie-pruritus-hemoragie. Toxin má antifungální, antibakteriální, antiprotozoární, insekticidní a fytotoxické účinky. U obilovin je zaznamenána jeho přítomnost často již před sklizní (SUCHÝ a HERZIG, 2005). Může se vyskytovat společně s ochratoxinem a snad jde i o jeho prekursor. Po vyvolání metabolických bloků lze u kmenů produkujících ochratoxin zaznamenat pokles této produkce a objevení produkce citrininu ( ). 27

28 2.3.8 Citreoviridin Obr. č. 8 Citreoviridin Typickým producentem je Peniciliium citreoverdi, byl identifikován v tzv. Žluté rýži, nálezy byly hlášeny i u pekanových ořechů a kukuřice, která nebyla sklizena v době zralosti. Podrobnější informace o výskytu této látky nejsou k dispozici (VELÍŠEK, 1999) Fusariové toxiny trichotheceny Mykotoxiny fusariového typu zearalenon, moniliformin, fusarin C a řada trichothecenů (12,13-epoxy-trichothec-9-ény) jsou na obilí syntetizovány plísněmi rodu Trichothecium, některými kmeny rodů Cephalosporium, Stachybotrys a Trichoderma. Důležité trichotheceny jsou deoxynivalenol (DON), diacetoxyscirpenol, nivalenol, HT-2 toxin a T-2 toxin. Plísně rodu Fusarium rostou v teplotním rozmezí 1 až 39 C, optimum 25 až 30 C. Optimum tvorby mykotoxinů je zpravidla podstatně nižší, v rozmezí 8 až 12 C. Zearalenon, má například u prasat estrogenní účinky. Trichotheceny inhibují proteosyntézu a způsobují u zvířat zvracení, průjmová onemocnění a nechutenství. Fuzáriovým toxinům se připisuje neobjasněné, epidemicky se vyskytující onemocnění. T-2 toxin se dává do souvislostí s výskytem onemocnění alimentární toxická aleukie (ATA), která se vyznačuje oslabením krvetvorby (GÖRNER a VALÍK, 2004) Fusarin C Fusarin C je kometabolitem plísně Fusarium moniliformis, parazitující především na kukuřici. Nalezen byl spolu s moniliforminem i v dalších obilovinách. Z devíti dnes známých 28

29 producentů fusarinu C (fusarií) jich sedm bylo izolováno z evropských plodin či půd. Fusarin C je silný mutagen. Z tohoto pohledu se blíží aflatoxinu B 1 a sterigmatocystinu, jedná se o potenciální lidský karcinogen (VELÍŠEK, 1999). V Číně a Africe je podezřelý, že se podílí na tvorbě nitrosaminů (jsou produkty reakce sekundárních aminů s kyselinou dusitou) v kukuřičné mouce na rakovině jícnu. Karcinogenita nebyla bezpečně prokázána, zato mutagenní účinky na baktérie i vyšší organismy, jakož i potlačování imunitního systému živočichů (KALÁČ a MÍKA, 1997) Zearalenon Obr. č. 9 Zearalenon Zearalenon je produkován některými plísněmi rodu Fusarium, v některých případech i stejnými druhy, které jsou schopny produkovat trichotheceny. Přestože nemá steroidní strukturu, má účinky steroidních hormonů estrogenů. Rozeznáváme účinky estrogenní, antiestrogenní, antiandrogenní a anabolický, které jsou u jeho derivátů různým způsobem zastoupeny. V organismu se metabolicky aktivuje, asi 5 % se vylučuje močí, zbytek stolicí, během laktace asi 40 % mlékem. Zearalenon může u lidí i hospodářských zvířat způsobovat hyperestrogenismus ( ). 29

30 Hlavním druhem v produkci zearalenonů je Fusarium graminearum (= F. roseum, nepohlavní forma Gibberella zeae), protože široce infikuje krmivářské a potravinářské obilí a je schopna produkovat až 1900 µg/kg toxinu v suché váze obilí. V současné době je izolováno 15 derivátů základní struktury zearalenonu (dříve označovaný jako F-2 toxin) ( Živný substrát: obilniny, kukuřice, čirok, seno, siláž, velmi často se vyskytuje v krmivech živočišného původu. Podmínky produkce mykotoxinu: teplota 3 až 8 C (při 25 C se netvoří) (SUCHÝ a HERZIG, 2005). Obsahy zearalenonu při technologickém zpracování obilovin často významně klesají. Např. v bílé mouce, připravené z kontaminované pšenice, bylo obsaženo jen % výchozího obsahu tohoto mykotoxinu; v chlebu se jeho obsah proti mouce snížil na %. Při výrobě těstovin v přítomnosti 1 % uhličitanu draselného činily ztráty mykotoxinu %. Omývání kukuřice, které se v případě DON a dalších trichothecenů ukázalo být účinné, k významnému poklesu obsahu zearalenonu nevedlo (VELÍŠEK, 1999). Trichotheceny tvoří skupinu velice podobných látek, charakterizovaných přítomností tzv. trichothecenového jádra. V tomto jádře se nalézá epoxidová skupina, která je použitelná pro jejich stanovení. Byly známy už před "mykotoxinovým boomem". Připisují se jim rovněž některé starověké a středověké morové rány, Jobovo onemocnění z Bible aj. Z lidských onemocnění vyvolávají alimentární toxické aleukie (ATA) a snad se podílejí na kardiomyopatii kobaltového piva a pelagře. Zvláštní skupinu tvoří tzv. makrocyklické trichotheceny, které mají část základní molekuly překlenutou můstkem s vazbou na obou koncích. Tím dochází k překrytí některých funkčních skupin a k potenciaci skupin jiných. Toxicita může vzrůst i o více než jeden řád. Typickými zástupci této skupiny jsou satratoxiny, účinné látky Stachybotrys atra, a toxiny Dendrodochium toxicum. Systematičtěji byly tyto látky studovány v USA a Maďarsku. Další zvláštní skupinou trichothecenů jsou baccharinoidy, které vznikají přeměnou trichothecenových mykotoxinů z půdních mikroskopických hub v organismu cévnatých rostlin z rodu Baccharis (jejich habitus se poněkud podobá rodu Solidago). Rostou v povodí Orinoka, hlavní problém s nimi je ten, že je dobytek nerozeznává jako jedovaté. Podobným způsobem vznikají také toxiny naší hasivky orličí. 30

31 Globální účinky trichothecenů byly popsány u ATA, některé navíc způsobují centrální zvracení. Satratoxiny působí na kůži už ve zlomcích mikrogramu těžké dráždění. Řadou trichothecenů se vedle lékařů a veterinářů zabývají též fytopatologové, protože některé trichotheceny slouží jako faktory patogenity druhů rodu Fusarium, napadajících kulturní plodiny ( ). Podle charakteristických chemických vlastností se rozlišují 4 podskupiny trichothecenů, a to trichotheceny A, B, C a D. typ A, který nemá na C-8 oxoskupinu (např. T-2 toxin, HAT-2 toxin, monoacetoxyscirpenol, diacetoxyscirpenol, tzv. DAS diacetoxyscirpenol, trichodermin) typ B, kde je na C-8 oxoskupina, k typu B se řadí nivalenol (NIV), deoxynivalenol (DON, někdy zvaný vomitoxin), 3-acetyldeoxynivalenol (3AcDON), jeho isomer 15- acetyldeoxynivalenol (15AcDON) a fusarenon-x typ C obsahující další epoxyskupinu v poloze C-7 a C-8 nebo C-8 a C-9 typ D, který obsahuje makrocyklický kruh mezi C-4 a C-15 (např.verrukariny, roridiny a satratoxiny). Přestože je dnes známo téměř 150 trichothecenů, jen asi 10 z nich lze běžně v zemědělských plodinách detegovat. Plísně rodu Fusarium produkují pouze toxiny skupiny A a B. Fyzikálně-chemické vlastnosti trichothecenů jsou velice rozmanité a souvisejí především s přítomností polárních substituentů v jejich molekule. Při studiu chemické reaktivity trichothecenů byla věnována zvýšená pozornost toxinu DON s ohledem na velmi častý výskyt v obilninách představujících často základní položku potravního koše. Tak např. bylo zjištěno, že ve vodných roztocích dochází k adici siřičitanu na dvojnou vazbu mezi uhlíky C-9 a C-10 za vzniku hydroxysulfonátů. Obdobný produkt vzniká z 3AcDON, u NIV je reakce asi čtyřikrát rychlejší. Ve vroucí vodě se otevírá epoxidový kruh DON, což z hlediska biologické aktivity přináší detoxikaci. K otevření epoxidového kruhu a hydrolýze vázané octové kyseliny u DAS dochází působením enzymů intestinální mikroflóry u mnoha zvířat, včetně skotu a prasat. Řada studií byla věnována změnám, ke kterým dochází při zpracování trichotheceny 31

32 kontaminovaných cereálií. Tak např. při mletí pšenice s obsahem 0,51 mg.kg -1 DON bylo v mouce přítomno 0,35 mg.kg -1 toxinu, ale koncentrace v otrubách vzrostla na dvojnásobek (1,12 mg.kg -1 ). Obdobně činil obsah NIV v pšeničné mouce % (v závislosti na stupni vymletí) množství nacházejícího se ve výchozí surovině. Při pečení různých pšeničných výrobků se ztráty DON - pohybovaly v rozmezí % (vztaženo na výchozí hladiny v mouce). Při mletí kukuřice poklesl obsah T-2 a DON o % (suché zrno) a dokonce až o 60 % při mletí vlhkých zrn. K výraznému snížení hladiny DON dochází při mytí kontaminovaného obilí. Např. při výchozím (extrémně vysokém) obsahu toxinu v ječmeni 16,1 mg.kg -1 činil pokles obsahu toxinu v zrnech po 24 hodinách máčení ve vodě 92 %. DON je však stabilní v procesu vaření piva, jeho obsah se prakticky nezměnil ani po 90 minutách varu. Trichotheceny vykazují široké spektrum biologických účinků jako jsou antibakteriální, antivirální, fungistatické a cytostatické účinky, některé z nich jsou i fytotoxické. U lidí je s expozicí T-2 toxinu spojováno onemocnění alimentární toxická aleukie (ATA). DAS, další ze zástupců trichothecenů typu A, je na rozdíl od T-2 toxinu podstatně méně akutně toxický, vyznačuje se však významným teratogenním potenciálem. DON, reprezentující typ B trichothecenů, je sice z běžně se vyskytujících mykotoxinů této skupiny nejméně toxický, nicméně bývá v kontaminovaných potravinách často hlavním trichothecenem. Příznakem akutní intoxikace DON je zvracení, bolesti břicha, průjmy, bolesti hlavy spojené se závratěmi apod. Mimořádně vysokou toxicitou se vyznačují makrocyklické trichotheceny typu D. Např. akutní toxicita verrukarinu je asi desetkrát vyšší než T-2 toxinu. Hygienické limity pro trichotheceny se ve státech EU poněkud liší, pro DON se pohybují v rozmezí 1-2 mg.kg -1. V ČR je limitní hodonota pro DON u obilovin (včetně rýže a kukuřice) 2 mg.kg -1, pro mouku 1 mg.kg -1 (VELÍŠEK, 1999) Deoxynivalenol Fyzikální vlastnosti a spektrální charakteristiky: a) Popis: krystalická látka bez zápachu b) Bod tání: o C c) Je dobře rozpustný v acetonitrilu, chloroformu, směsi octan etylnatý: acetonitril (4:1), ve směsi chloroform : metanol (9:1) a nerozpustný v hexanu a petroléteru. 32

33 Toxikologické údaje: deoxynivalenol (DON) vykazuje nejnižší akutní toxicitu mezi významnými trichotheceny v pořadí: T-2 toxin diacetoxyscirpenol (DAS) nivalenol (NIV) deoxynivalenol (DON), akutní intoxikace je charakterizována iritací kůže, nechutenstvím, zvracením průjmy, haemorhagiemi, nervovými poruchami a smrtí, není mutagenní v Amesově testu, vysoký příjem vede k abortům, teratogenním změnám, je imunotoxický - potlačuje humorální a celulární imunitní funkce, snižuje se hmotnost thymu a objevují se leze na srdečním svalu, nebyl zatím pozorován žádný karcinogenní efekt v chronických studiích na myších (dvouleté studie). Zdrojem jsou zejména obiloviny a výrobky z obilnin. K producentům lze zařadit Fusarium culmorum, Fusarium graminearum (chemotyp I, II, IA, IB), Fusarium poae ( T-2 toxin Fyzikální vlastnosti a spektrální charakteristiky: a) Popis: bílé krystalické jehličky z benzenu-skellysolve B b) Bod tání: o C c) Rozpustnost: je dobře rozpustný v acetonitrilu, chloroformu, směsi octan etylnatý: acetonitril (4:1), ve směsi chloroform : metanol (9:1) a nerozpustný v hexanu a petroléteru. K producentům náleží Fusarium acuminatum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichides Toxikologické údaje: Způsobuje onemocnění známé jako,,alimentární toxická aleukie. 33

34 Z hlediska akutní toxicity je T-2 toxin nejúčinnější ze skupiny trichothecenových mykotoxinů V experimentech se zvířaty T-2 toxin vyvolává toxický efekt s nekrotickými změnami epiteliální tkáně a supresivní účinek v hematopoese. Vykazuje hepatotoxické účinky, postihuje buňky myokardu, projevuje se nekrotickými změnami trávicího traktu a haemorhagickou diatézou. T-2 toxin po dlouhodobém podávání nevykázal u pokusných zvířat tumorogenní účinek, ten se nepředpokládá ani u lidí. Zdrojem toxinu jsou obiloviny a výrobky z obilovin. Tab. č. 7 Hygienické údaje Israel obilí 100 mg/kg Rusko výrobky z obilovin 100 mg/kg Tab. č. 8 Česká republika Potravina PM SM [mg/kg] [mg/kg] obilí rýže kukuřice 20 1 ( Jeho výskyt v obilném zrnu je omezen v případě včasné sklizně. Celosvětově byl výskyt T- 2 toxinu prokázán v obilovinách v Kanadě, USA, Argentině, Evropě (v bývalé ČSSR, Finsku, Německu, Maďarsku, Itálii, Norsku, Velké Británii), v Indii a na Novém Zélandu. 34

35 Tab. č. 9 Odhad dietární expozice T-2 toxinu pro populaci v ČR v roce 1996 Mykotoxin Potravina Odhad dietární Čerpání PTDI [%] expozice [ng/kg t.hm./d] T-2 toxin Obiloviny a výrobky z nich PTDI provizorní tolerovatelný denní přívod pro T-2 toxin byl stanoven až v roce 2001 na 60 ng/kg t.hm./d - ng/kg tělesné hmotnosti na den (MALÍŘ a OSTRÝ, 2003). 2.4 Výskyt mykotoxinů v surovinách, produktech a krmivech rostlinného původu V letech bylo na přítomnost fumonisinů (dále FUM) analyzováno 210 vzorků kukuřičných produktů (mouka, corn flakes, pop corn aj.) koupených v běžné obchodní síti. Positivních bylo 89 % vzorků s průměrným záchytem 180 ng/g a maximem 4594 ng/g- ve 4 % vzorků byl obsah FUM vyšší než 1000 ng/g. Maximální koncentrace FUM byly v kukuřičném chlebu a extrudovaných kukuřičných produktech, relativně nejméně FUM bylo zachyceno v pop cornu a corn flakes. V letech bylo shromážděno celkem 84 vzorků kukuřice především z lokalit jižní a střední Moravy. Vzorky byly odebírány jednak přímo z porostů (celé palice ve sklizňové zralosti), jednak byla získáno zrno z výkupních závodů. Cílem experimentu bylo na základě výsledků mykologických a toxikologických analýz určit základní spektrum houbových kontaminantů kukuřice v podmínkách ČR se zvláštním zřetelem na zástupce rodu Fusarium a pokusit se ve vzorcích zrna imunoezymatickou cestou detekovat přítomnost základních toxických metabolitů: DON (deoxynivalenol), T-2, ZEA (zearalenon) a FUM. Z přirozeně infikovaných kukuřičných zrn byli v obou sledovaných sklizňových letech v in vitro podmínkách izolováni zástupci celkem 7 houbových rodů. S nejvyšší intenzitou se vyskytovaly druhy rodu Fusarium (průměrná kontaminace 44,8 %), druhým nejčastějším se vyskytujícím byl rod Stemphylium (29,3 %). Spektrum izolovaných druhů rodu Fusarium bylo tvořeno 8 druhy. V obou sledovaných sklizňových ročnících byl druhem s nejvyšší frekvencí Fusarium graminearum ( ,75 %, resp ,7 %), druhým nejčastějším se vyskytujícím druhem bylo F. culmorum. Na obsah deoxynivalenolu bylo positivně 35

36 analyzováno 95,2 % vzorků. Koncentrace DON se pohybovaly v rozpětí od 25 do 285 µg/kg. Koncentrace T-2 byly zaznamenány v širším rozpětí, než u předešlého toxinu a pohybovaly se v rozpětí od 12 do 875 µg/kg. Koncentrace ZEA byly variabilnější než v případě sloučenin trichothecénového typu. V některých vzorcích byly zaznamenány nulové koncentrace (17 % vzorků), maximální koncetrace nepřesáhla 110 µg/kg. Nulová koncentrace FUM byla u 7 vzorků z celkového počtu 42 (tj. 17 %), u ostatních vzorků se detekované rozpětí pohybovalo od 12 do téměř 1000 µg/kg. Ve srovnání s ostatními třemi zkoumanými sloučeninami bylo u této látky dosaženo v průměru nejvyšších hodnot. Sledování kontaminace krmných surovin po sklizni v roce 1996 prokázalo 54 % pozitivních nálezů především DON a ZEA (nad 0,2 mg/kg, průměrná koncentrace 0,605 mg/kg) ve vzorcích čerstvě sklizené pšenice a ječmene. U vzorků odebíraných v roce 1998, kdy bylo vyšetřeno 189 vzorků obilnin, byla kontaminace toxiny podstatně nižší. To opět potvrzuje předpoklad, že klimatické podmínky během vegetačního období jsou vedle faktorů rezistence a technologických pěstitelských postupů pro úroveň kontaminace toxiny rozhodujícím faktorem (NEDĚLNÍK, 2003) Faktory ovlivňující produkci mykotoxinů v pracovním a životním prostředí Tvorba mykotoxinů v pracovním a životním prostředí člověka je podmíněna celou řadou biologických, fyzikálních a chemických faktorů. Růst vláknitých mikromycetů a následné produkce mykotoxinů pak závisí na následujících faktorech: vlhkosti, teplotě, složení substrátu, přítomnosti kyslíku, mykologickému profilu toxinogenních mikromycetů, sporulaci a mikrobiálních interakcích. Za nepříznivé situace dochází ke kontaminaci pracovního a životního prostředí člověka spórami a následně osídlení prostředí, k růstu vláknitých mikromycetů, a produkci mykotoxinů. Tato situace je umožněna zejména: a) existencí zdrojů kontaminace Spóry vláknitých mikromycetů jsou přítomny ve velkém množství v ovzduší, v půdě, ve vodě, na povrchu živých i odumřelých organismů. Jsou velmi adaptabilní při kontaminaci jakéhokoliv substrátu. To jim umožňuje osídlit řadu rozdílných biotopů, tedy i pracovní a životní prostředí člověka 36

37 b) existencí vhodného substrátu Pracovní a životní prostředí člověka v případě přítomnosti vhodného substrátu (vzhledem k jeho složení a obsahu živin) se tak stávají vhodným pro osídlení, růst a rozmnožování vláknitých mikromycetů a následně produkci mykotoxinů. c) existencí vhodných podmínek pro osídlení pracovního a životního prostředí spórami vláknitých mikromycetů - při nedostatečně zabezpečeném větrání a vhodné klimatizaci - při nesprávné regulaci vytápění a vlhkosti - při nadměrné vlhkosti v budovách d) nedodržování vhodných hygienických podmínek a nedůsledného provádění čištění a dekontaminace pracovního a životního prostředí člověka (VELÍŠEK, 1999). 37

38 Obr. č. 10 Faktory ovlivňující výskyt mykotoxinů v potravinách a krmivech (VELÍŠEK,1999) 38

39 Tab. č. 10 Výskyt významných mykotoxinů a stanovené koncentrace mykotoxinů v potravinách Mykotoxiny Potravina Stanovené koncentrace Aflatoxiny (zejména B 1 ) arašídová omáčka, arašídová pasta, arašídová směs, arašídy kandované, broskvová jádra, batáty, cereální snídaně, česnek nakládaný, česnekový prášek, chili koření, chili papričky, čirok, čokoláda, fíky, fíková pasta, hrášek, jádra melounu, kakaová drť, kakaové keksy, kari pasta, kari, kávová zrna, kokosová zmrzlina, jednotky až stovky µg/kg kokosové ořechy, kayenský pepř, kmín, kokosový olej, kukuřice sušená, kukuřice vařená, kukuřičné otruby, kukuřičné slupky, kukuřičné výrobky, kukuřičný slad, kukuřičný stonek, kukuřičný škrob, maniok (cassava), mandle, marcipán, maso, müsli, nudle, muškátový oříšek, olej, ořechy brazilské, ořechy pistáciové, ořechy pekanové, ořechy vlašské, paprika, pepř, pekařské výrobky, pistácie kandované, pivo, proso (čirok, millet), rozinky, ryby, sezamové semeno, sojová mouka, špagety, tykvová jádra, vaječné výrobky, víno, zázvor, zrno ječmene Aflatoxin G 1 stejný jako u AFB 1, navíc v semenech celeru Jednotky až desítky µg/kg Aflatoxin G 2 stejný jako u AFB 1, navíc citrony, indická kassia (skořice)mango, olivový olej, pomeranče, jednotky až desítky µg/kg slunečnicová semínka, sezamová semínka, kurkuma, soja (shoyu), římský kmín Aflatoxin M 1 jogurt, kukuřice bílá a žlutá, kukuřice žlutá čerstvě sklizená, máslo, mléko pasterizované a sterilizované, mléko sušené, mléko velbloudí, pistáciové ořechy zaplísněné, syrovátka sušená, jednotky až desítky µg/kg 39

40 sýry (blue, Blue Haverti, Brie, Camembert, Cheddar, Cheshire, Chester, Cottage, Coplte, Cream, Double Gloucester, Eidam, Emental, Fresh, Gouda, Grana Padano, Lancashire, Leicester, Maribo, Mozarella, Parmezán, Romadur, Samsoe, Stilton, Wensleydale) Alternáriové mykotoxiny: Alternariol Alternariol metyleter Kyselina tenuazonová rajčata a rajčatový protlak, rajčatová pasta, jablka, mandarinky, melouny, olivy, pekanové ořechy, pepř, ječmen, oves, žito, pšenice, čirok, slunečnicová semena Deoxynivalenol obiloviny a výrobky z nich, dětská výživa z obilovin, ječmene a hotové výrobky na bázi ječmene, různé druhy kukuřice, pšenice a výrobky z ní, triticale, rýže, proso, čirok, otruby, žitná mouka a otruby, chleba špagety, müsli, nudle, pivo, chilli prášek, koriandr, zázvor, sojové boby, česnek, brambory Fumosin B 1 kukuřice a kukuřičné výrobky (např. kukuřičný křehký chléb, extrudované kukuřičné výrobky (křupky, tyčinky) a polenta Kyselina cyklopiazonová kukuřice, arašídy, kodo proso, semena slunečnice, rýže, kroupy, sýry camembertského typu, měkké plísňové sýry francouzského typu, gouda, čedar, mléko ovcí (pouze experimentálně) Patulin jablka a výrobky z jablek, banány, grepy, broskve, meruňky, ananas, borůvky, plesnivé kompoty, hruškové džusy jednotky až stovky µg/kg setiny, jednotky až desítky mg/kg jednotky až tisíce µg/kg jednotky až stovky µg/kg desítky až stovky µg/kg Sterigmatocystin obiloviny a výrobky z nich (cereálie určené ke snídani, cornflakes), pšenice, ječmen, kukuřice, rýže, sojové boby, zelená káva, marihuana, tvrdé sýry (např. gouda, moravský blok, eidam), jednotky až stovky µg/kg 40

41 pepř, fenykl, lisovaná semena olejnin, hroznový a grepový mošt T-2 toxin obiloviny a výrobky z nich, ječmen, kukuřice, oves, žito, pšenice, fazole, koření (např. v kari, zázvor) a pivo Zearalenon obiloviny a výrobky z nich, ječmen, slad, pivo, kukuřice, cornflakes, popcorn, žito, oves, pšenice, rýže, čirok, proso, boby, ořechy, banány, chilli koření, chilli omáčka, koriandr, kari, kari-pasta, fenykl, pepř, olej (MALÍŘ a, OSTRÝ, 2003) jednotky, desítky až stovky µg/kg jednotky až desítky µg/kg 2.5 Infekce zrnin a dalších krmných plodin Plísně (houby) jsou pravidelnou součástí půdní biocenózy a plní nezbytnou úlohu v recyklaci živin z rozkládajícího se biologického materiálu. Nepříznivé počasí a nevhodné podmínky ošetřování umožní životaschopným sporám plísní klíčení, růst a pomnožení v krmivech přímo na poli. Rozmnožující se spory, které se v prostředí šíří větrem a hmyzem, mohou napadat rostliny během jejich růstu. Plísně kontaminují zrniny a krmné plodiny v průběhu celého výrobního procesu, tj. pěstování, sklizně, transportu a zejména pak při skladování a konzervaci (SUCHÝ a HERZIG, 2005). Producenti toxinů se dělí dle výskytu plísně: polní: napadají plodiny již před sklizní Fusarium skladištní: napadají uskladněné plodiny, např. obilí při vlhkosti % v rozmezí teplot 10 až 50 C; nebezpečné jsou především tzv. vlhkostní kapsy, místa, kde dochází ke kondenzaci vlhkosti na styku uskladněné plodiny se stěnami nebo podlahou skladiště; patří sem především rod Aspergillus 41

42 polní i skladištní: rod Penicillium (KOMPRDA, 2004). Jakmile plísně kolonizují krmiva, začnou využívat jejich živiny pro svůj metabolismus a rozmnožování a snižují jejich obsah. Výrazně kontaminovaná kukuřice může po zaplísnění ztratit až 10 % metabolizovatelné energie a 5 % bílkovin. Zhoršení nutriční hodnoty krmiv je dáno i poklesem esenciálních aminokyselin v zaplísněných krmivech (lysinu, cysteinu a argininu). Metabolická činnost hub je v krmivech spojena s aerobním dýcháním, při kterém se spotřebovávají významné živiny, především tuky a sacharidy. Bartov (1985) uvádí, že po 50 - ti dnech skladování se snížil obsah tuku u kontaminované kukuřice o 52 až 57 %. Tím dochází i k výraznému snížení energické složky krmiva. Na přítomnost plísní a mykotoxinů v krmivech nás mohou upozornit již některé senzorické změny jako charakteristický zápach, barva nebo morfologické změny na semenech a plodech. Plísňové metabolity výrazně snižují i chutnost krmiva (SUCHÝ a HERZIG, 2005). 2.6 Stanovení mykotoxinů Zrna, napadená fuzárií, vykazují nestejnou velikost, tvar i barvu. Typickým příznakem napadení je zbělení a svraskání zrna; matný, šedý až šedožlutý povrch; načervenalá barva. Symptomy však mohou být každý rok jiné. Časné napadení fuzárií se většinou projevuje nedostatečnou tvorbou zrna, při pozdním napadení jsou rozdíly ve tvaru a velikosti zrna velmi málo patrné. Kromě toho může klasy napadat podobným způsobem také Microdochium nivale (Plíseň sněžná). Kontaminace zrna se však nemusí projevit ve vzhledu, takže se často stává, že i na pohled nezávadné zrno může být kontaminováno. Na základě vizuálního hodnocení proto nelze na obsah mykotoxinů usuzovat (KOUBOVÁ, 2005) Mykotoxiny se stanovují různými metodami. Zřejmě nejpřesnější metodou, která je považována za standardní, je kapalinová chromatografie, v běžném screeningu se většinou využívá imunoenzymatických analýz (ELISA) nebo chromatografie na tenké vrstvě. Serologické testy ELISA použili pro stanovení fusariových mykotoxinů v zrně obilovin v poslední době např. v USA ABUZEID et al. (1991) pro DON a ZON a BEBBET et al. (1994) pro ZON a na Novém Zélandu LAUREN a ANGNEW (1991) pro NIV, DON. scirpentriol a T-2-tetraol. PESTKA et al. (1995) přinesli obsáhlý přehled (70 liter. citací) o imunologických 42

43 postupech detekce mykotoxinů v obilovinách a cereálních potravinách. Všechny tyto metody jsou dostatečně přesné a citlivé a při srovnání výsledků dosažených HPLC a ELISA metodou je dosahováno vysokých korelací. Přesto existují rizikové faktory, které je třeba při analytice mykotoxinů minimalizovat. Prvním z nich je odběr vzorků. Vzhledem k závažnosti tohoto experimentálního kroku byl dokonce vzorkovací postup upraven v roce 1994 direktivou EU č. 98/53/EC. Tato direktiva určuje postup především při odběru vzorků krmiv pro stanovení obsahu mykotoxinů. Druhým rizikovým faktorem je purifikace a extrakce vzorků. Při nedokonalé purifikaci mohou zůstat mykotoxiny maskovány jinými látkami a tak může být získán falešně negativní výsledek. V souvislosti s analýzou mykotoxinů je třeba také uvést, že obsah mykotoxinů nekoreluje s výskytem nativních původců těchto látek či s obsahem jejich spor. Indikací možného hygienického problému může být sice viditelný výskyt povlaku mycelia (u Fusarium spp. většinou bělavý nebo růžový), ale přesto musí následovat analytické stanovení toxických látek. Vzhledem k tomu, že většina problémů s obsahem mykotoxinů souvisí s krmivy pro hospodářská zvířata, bude v následujícím textu uvedeno několik poznámek k této problematice. Při podezření na mykotoxikózu u zvířat je třeba ihned po projevení příznaků (odmítání krmiva, zvracení aj.) odebrat vzorek krmiva pro následnou analýzu. Krmiva v tomto případě by měla být vyšetřena na přítomnost dvou až čtyř toxických látek: l. deoxynivalenol, 2. T-2 toxin, 3. zearalenon, 4. dle složení krmiva fumonisiny nebo ochratoxin. Je samozřejmé, že v krmivu se mohou vyskytovat desítky dalších mykotoxinů, které mohou také negativně ovlivnit zdravotní stav zvířete. Přesto pro odpověď, zda zdravotní potíže jsou vyvolány mykotoxiny by mělo postačovat stanovení výše uvedených čtyř sloučenin. V této souvislosti je třeba opět poznamenat, že dosud opomíjeným toxinem produkovaným Fusarium spp. byla kyselina fusarová. Toxicita této látky pro teplokrevné živočichy je ve srovnání s trichothecény a fumonisiny podstatně nižší, ale nejnovější experimenty prokázaly, že tato látka zesiluje toxické účinky ostatních fusariotoxinů. Tento toxikologický synergizmus může být do určité míry vysvětlením skutečnosti, že zkrmování přirozeně kontaminovaného krmiva má mnohdy výrazně vyšší negativní účinky na konzumenta, než zkrmování krmiva uměle kontaminovaného shodným toxinem (NEDĚLNÍK, 2003). 43

44 2.6.1 Test pro měření potenciálu tvorby mykotoxinů v obilí Mezi mykotoxiny s významným zdravotnickým dopadem (příčina alimentárních otrav) patří trichotheceny, produkované zejména houbami rodu Fusarium. Problematika sanitární kontroly obilí před sklizní je složitá, protože: Produkce trichothecenů je připisována určitým druhům hub i určitým kmenům uvnitř téhož druhu houby; tentýž trichothecen může být vytvářen různými druhy i různými rody hub; tentýž druh houby může produkovat více rozdílných mykotoxinů, často několik desítek s různou toxicitou; mykotoxiny nejsou produkovány systematicky, jejich produkce závisí na mnoha biotických a abiotických faktorech. Francouzští výzkumníci se touto problematikou zabývali a vyvinuli test, který zjišťuje druhy hub, potenciálně produkující trichotheceny, produkované zejména houbami rodu Fusarium. Jako model použili pšenici napadenou toxinogenními houbami rodu Fusarium v předsklizňovém období. Nový test, určený k hodnocení toxinogenního potenciálu vzorku pšenice je nazván Tri 5, jménem genu, který je identifikován podle genové amplifikace. Tento gen kóduje enzym, který se účastní biosyntézy trichothecénů. Nový test rychleji a přesněji než mikrobiologické testy zjišťuje pouze druhy hub, které mají potenciál produkovat trichothecény. Hodnotí riziko tvorby trichothecénů a ne přítomnost mykotoxinů. Tri 5 - metoda hodnocení rizika trichothecénů v předsklizňovém období tedy nekonkuruje ostatním metodám zjišťování mykotoxinů, ale doplňuje je, protože měří potenciál (test prognostický), zatímco jiné techniky měří vyjádření tohoto potenciálu (VONDRÁŠKOVÁ, 2005). 44

45 Tab. č. 11 Přehled nebezpečných mykotoxinů a možností jejich stanovení testy VICAM AFLATOXIN (B 1, B 2, G 1, G 2, M 1 ) plíseň produkující toxin Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus DEOXYNIVALENOL Fusarium graminearum FUMONISIN (B 1, B 2, B 3 ) OCHRATOXIN A ZEARALENON TRICHOTHECEN T- 2 ( Fusarium moniliforme Aspergillus ochraceus Penicillium verrucosum Fusarium graminearum plísně rodu Fusarium napadané potraviny obilniny, mouka, ořechy, kopra, koření, mléko podzemnice olejná ječmen a ječmenný slad, oves, kukuřice, pšenice kukuřice a ostatní obilniny obilniny, káva, pivo, čirok zdravotní efekty rozsah testů VICAM karcinom a ppb poškození jater (Afla Test snížená imunita mléko FL) snížená ppb produkce (FL) mléka ppb (HPLC) ppb (Afla M 1 HPLC) poškozuje: ppm - trávicí trakt a (FL) slezinu ppm - kostní dřeň (HPLC) - reprodukční ppm orgány (Don FQ FL) ztráta váhy a nechutenství rakovina (krysy) otok plic (prasata) poškození mozku (koně) karcinom ledvin poškození ledvin snížená imunita obilniny, čirok negativní vliv na: - ovulaci a oplodnění - usazení plodu - vývoj plodu - zdraví novorozenců obilniny a krmiva poškozuje: - trávicí trakt - kostní dřeň - pokožku ppm (Dontest TAG FL) ppm (Dontest HPLC) ppb (OchraTest FL) ppb (OchraTest HPLC) ppm (FL) ppm (HPLC) ppm (FL) testy VICAM AflaTest AflaTest WB Afla M1 Afla B AflaOchra HPLC DonTest TAG DonTest HPLC Don FQ FumoniTest OchraTest AflaOchra HPLC ZearalaTest ZearalaTest WB T-2 TAG 45

46 2.7 Vývoj legislativy související s hodnotami mykotoxinů Maximální mezní hodnoty aflatoxinů aplikované na produkty, tak jak jsou stanoveny v bodech a Přílohy I, Nařízení komise ES č. 466/2001, budou rovněž aplikovatelné na produkty z nich zpracované, pokud pro takové zpracované produkty nejsou stanoveny žádné specifické maximální limity. S ohledem na aflatoxiny v produktech zmiňovaných v bodu 2.1 Přílohy I, je zakázáno: a) mísit produkty odpovídajícím maximálním hladinám stanoveným v Příloze I s produkty přesahujícími tyto maximální hladiny, anebo mísit produkty, jež se mají podrobit třídící technice nebo fyzické úpravě, s produkty určenými k přímé lidské spotřebě anebo jako potravinářské přísady, b) používat produkty, které nesplňují maximální hladiny stanovené v bodech , a Přílohy I jako přísady pro výrobu ostatních potravin. Plody podzemnice olejné, ořechová jádra a sušené ovoce, nesplňující maximální hladiny aflatoxinů stanoveného v bodu Přílohy I, a obiloviny neodpovídající maximálním hladinám stanoveným v bodě , lze umístit na trh za předpokladu, že tyto produkty: a) jsou určeny k přímé lidské spotřebě anebo jsou použity jako potravinářská přísada, b) vyhovují maximálním hladinám stanoveným v bodě Přílohy I pokud jde o plody podzemnice olejné, a v bodě Přílohy I, pokud jde o ořechová jádra a sušené ovoce c) jsou podrobeny sekundárnímu ošetření zahrnujícímu třídění nebo jiné fyzické ošetření, a po tomto ošetření nejsou překročeny maximální limity stanovené v bodech a Přílohy I, a toto ošetření nemá za následek škodlivá rezidua, d) jsou jasně označeny s uvedením destinace a je na nich upozornění, produkt se musí podrobit třídění nebo jiné fyzické úpravě ke snížení kontaminace aflatoxinem ještě před lidskou spotřebou anebo použitím jako potravinářské přísady. 46

47 Tab. č. 12 Maximální hladiny určitých škodlivin v potravinách, odstavec 2: Mykotoxiny Maximální hladina [µg/kg] Produkt B 1 B 1 + B 2 + G 1 +G 2 M Aflatoxiny Burské oříšky, ořechová jádra a sušené ovoce Burské oříšky, ořechová jádra s sušené ovoce, a produkty z nich zpracované, určené k přímé lidské spotřebě nebo jako potravinářská přísada Burské oříšky, jež se mají třídit anebo jinak fyzicky ošetřit ještě před lidskou konzumací anebo jako potravinářská přísada Ořechová jádra sušené ovoce, které se má podrobit třídění anebo jinému fyzickému ošetření před lidskou spotřebou nebo použitím jako potravinářská přísada Obiloviny (včetně pohanky, Fagopyrum sp.) Obiloviny (včetně pohanky, Fagopyrum sp.) a produktů z nich zpracovaných, určené k přímé lidské spotřebě anebo jako potravinářská přísada Obiloviny (včetně pohanky, Fagopyrum sp.) jež se mají podrobit třídění nebo jiné fyzikální úpravě, ještě před lidskou konzumací nebo použitím jako potravinářská přísada (ES Č. 466/2001)

48 Tab. č. 13 Změna nařízení ES č. 466/2001, pokud jde o fusariové toxiny Produkt Maximální limit [µg/kg] 2.4 Deoxynivalenol (DON) Nezpracované obiloviny, jiné 1250 než pšenice tvrdá, oves a kukuřice Nezpracovaná pšenice tvrdá a 1750 oves Nezpracovaná kukuřice Pokud není do stanoven žádný limit, platí od zmíněného data limit 1750 µg/kg Obilná mouka, včetně 750 kukuřičné mouky, kukuřičné krupice a kukuřičné křupky Pečivo, cukrářské výrobky, 500 sušenky, svačinky z obilovin a snídaňové cereálie Těstoviny (v suchém stavu) Obilné a ostatní příkrmy pro 200 kojence a malé děti 2.5 Zearalenon Nezpracované obiloviny jiné 100 než kukuřice Nezpracovaná kukuřice Pokud není do stanoven žádný zvláštní limit, platí od zmíněného data 200 µg/kg Obilná mouka kromě 75 kukuřičné mouky Kukuřičná mouka, kukuřičná krupička, kukuřičná krupice Pokud není do stanoven žádný zvláštní limit, platí od zmíněného data 200 µg/kg a rafinovaný kukuřičný olej Pečivo, cukrářské výrobky, sušenky 50 Svačinky z kukuřice a kukuřičné snídaňové cereálie Pokud není do stanoven žádný zvláštní limit, platí od zmíněného data 50 µg/kg 48

49 Ostatní svačinky z obilovin a snídaňové cereálie Zpracované kukuřičné potraviny pro kojence a malé děti 50 Pokud není do stanoven žádný zvláštní limit, platí od zmíněného data 20µg/kg Jiné obilné a ostatní příkrmy 20 pro kojence a malé děti 2.6 Fumonisiny (vztahuje se na sumu B 1 a B 2 ) Nezpracovaná kukuřice Pokud není do stanoven žádný zvláštní limit, platí od zmíněného data 2000 µg/kg Kukuřičná krupice, Pokud není do stanoven žádný zvláštní limit, kukuřičná krupička a platí od zmíněného data 1000 µg/kg kukuřičná mouka Kukuřičné potraviny k přímé Pokud není do stanoven žádný zvláštní limit, spotřebě kromě a platí od zmíněného data 400 µg/kg Kukuřičné a ostatní příkrmy Pokud není do stanoven žádný zvláštní limit, pro kojence a malé děti platí od zmíněného data 200 µg/kg 2.7 T-2 a HT-2 toxin (vztahuje se na sumu T-2 a HT-2 toxinu) Nezpracované obiloviny a Bude případně stanoveno před výrobky z obilovin (ES Č. 856/2005) Nařízením komise č. 1881/2006 došlo k některým dílčím změnám v stanovených maximálních limitech mykotoxinů v zájmu ochrany veřejného zdraví. Evropský úřad pro bezpečnost potravin (EFSA) přijal dne 4. dubna 2006 na žádost Komise aktualizované vědecké stanovisko týkající se ochratoxinu A v potravinách, v němž zohlednil nové vědecké poznatky a došel k závěru, že tolerovatelný týdenní příjem (WTA) je 120 ng/kg tělesné hmotnosti 49

50 Pokud jde o patulin, Vědecký výbor pro potraviny na svém zasedání ze dne 8. března 2008 schválil prozatímní maximální tolerovatelný denní příjem (PMTDI) patulinu 0,4 µg/kg tělesné hmotnosti Na obsah fusariového toxinu mají značný vliv klimatické podmínky během růstu, a zejména v období květu. Dodržování zásad správné zemědělské praxe, která sníží rizikové faktory na minimum, může kontaminaci houbami rodu Fusarium do určité míry předejít. Doporučení Komise 2006/583/ES ze dne 17. srpna 2006 k prevenci a snižování fusariových toxinů v obilovinách a výrobcích z obilovin obsahují obecné zásady prevence a snižování kontaminace fusariovými toxiny (zearalenon, fumonisiny a trichotheceny) v obilovinách, které mají být provedeny vnitrostátními zásadami správné praxe založenými na těchto zásadách S ohledem na vývoj vědeckých a technologických poznatků o těchto toxinech v potravinách by do 1. července 2008 měl být zvážen přezkum maximálních limitů pro deoxynivalenol, zearalenon, fumonisiny B 1 a B 2 a rovněž by mělo být zváženo, zda je vhodné stanovit maximální úroveň pro T-2 a HT-2 toxinu v obilovinách a výrobcích z obilovin 50

51 Tab. č. 14 Změna nařízení ES č. 466/2001 Nařízením komise č. 1881/2006 pokud jde o mykotoxiny Maximální hladina [µg/kg] Potraviny B 1 Suma B 1, B 2, G 1 a G 2 M Aflatoxiny Všechny druhy obiloviny a všechny výrobky pocházející z obilovin včetně zpracovaných výrobků z obilovin, kromě potravin uvedených v 2.1.7, a Kukuřice, jež má být před použitím k lidské spotřebě či jako potravinová složka tříděna nebo jinak fyzikálně ošetřena Obilné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti 2.2 Ochratoxin A 2,0 4,0-5,0 10,0-0, Nezpracované obiloviny 5, Všechny produkty pocházející z nezpracovaných obilovin, včetně zpracovaných výrobků z obilovin a obilovin určených k přímé lidské spotřebě kromě potravin uvedených v a Obilné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti ( 2.4 Deoxynivalenol 3,0 0, Nezpracovaná kukuřice 1250* 2.5 Zearalenon Nezpracovaná kukuřice 200* Kukuřice určená k přímé lidské spotřebě, kukuřičná mouka, 200* 51

52 kukuřičná krupička, kukuřičná krupice, kukuřičné klíčky a rafinovaný kukuřičný olej Pečivo (včetně malého běžného pečiva), jemné a trvanlivé pečivo, sušenky, svačinky z obilovin a snídaňové cereálie kromě svačinek z kukuřice a kukuřičných snídaňových cereálií Svačinky z kukuřice a kukuřičné snídaňové cereálie 2.6 Fumonissiny Suma B1 a B Nezpracovaná kukuřice 2000** Kukuřičná mouka, kukuřičná krupička, kukuřičná krupice, kukuřičné klíčky a rafinovaný kukuřičný olej Kukuřičné potraviny k přímé spotřebě kromě potravin uvedených v a Kukuřičné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti ( 50 50* 1000** 400** 200** 2.7 T-2 a HT-2 toxin Suma T-2 a HT-2 toxinu Nezpracované obiloviny a výrobky z obilovin * maximální limit je platný od 1. července 2007 ** maximální limit je platný od 1. října 2007 (ES Č. 1881/2006) - Nařízení komise č. 1126/2007 ze dne 28. září 2007, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách, pokud jde o fusariové toxiny v kukuřici a ve výrobcích z kukuřice. 52

53 Tab. č. 15 Změny limitů ES č. 1126/2007, kterým se mění 1881/2006 Fusariový toxin Položka č. Surovina/potravina Nejvyšší přípustné množství (µg/kg) dříve Nejvyšší přípustné množství (µg/kg) nyní Deoxynivalenol Nezpracovaná kukuřice Doplněno Mleté frakce kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů kódu KN nebo a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu KN Doplněno Mleté frakce kukuřice s velikostí částic 500 mikronů kódu KN a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu KN Zearalenon Nezpracovaná kukuřice kromě nezpracované kukuřice určené ke zpracování mokrým mletím Rafinovaný kukuřičný olej Kukuřice určená k přímé lidské spotřebě, svačinky z kukuřice a kukuřičné snídaňové cereálie Doplněno Doplněno Mleté frakce kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů kódu KN nebo a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu KN Mleté frakce kukuřice s velikostí částic 500 mikronů kódu KN a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu KN Fumonisiny Nezpracovaná kukuřice kromě

54 nezpracované kukuřice určené ke zpracování mokrým mletím Kukuřice určená k přímé lidské spotřebě, kukuřičné potraviny k přímé lidské spotřebě kromě potravin uvedených v bodech a Kukuřičné snídaňové cereálie a svačinky z kukuřice Kukuřičné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti Doplněno Mleté frakce kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů kódu KN nebo a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic > 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu KN Doplněno Mleté frakce kukuřice s velikostí částic 500 mikronů kódu KN a ostatní výrobky z mleté kukuřice s velikostí částic 500 mikronů nepoužívané k přímé lidské spotřebě kódu (ES Č. 1126/2007) Limity Monitoring výskytu mykotoxinů se provádí v mnoha evropských zemích a začíná se realizovat i v České republice. Jsou k dispozici údaje o kontaminaci kukuřice především mykotoxiny DON, FUM a ZEA z Rakouska, Itálie i jiných zemí. Publikované údaje z ČR např. uvádějí, že po sklizni v roce 1996 bylo v souboru vzorků pšenice a ječmene nalezeno 54 % vzorků pozitivně kontaminovaných především DON a ZEA s průměrnou koncentrací 605 µg/kg. Vzhledem k tomu, že legislativa určující maximální povolené hladiny fusariotoxinů v surovinách a krmivech se teprve vytváří, je velmi obtížné podobné výsledky interpretovat. Prvním koplexnějším materiálem, stanovujícím limity obsahů mykotoxinů, je směrnice EU 1525/98 s účinností od Pouze v některých zemích jsou určeny národní hodnoty 54

55 mykotoxikóz. V Rakousku jsou uváděny hodnoty pro DON (pšenice, rýže 500 µg/kg) a ZEA (pšenice, rýže 60 µg/kg), Francie má limity pro ZEA v potravinách na úrovni 200 µg/kg, pro FUM je limit ve Švýcarsku na úrovni 1000 µg/kg. Limity na severoamerickém kontinentu se u DON u pšenice pohybují od 1000 µg/kg (USA) do 2000 µg/kg (Kanada). Obecně lze tedy uvést, že limitní koncentrace u většiny fusariotoxinů v případě potravin se budou pohybovat na úrovni 1 mg/kg samozřejmě také v závislosti na akutní toxicitě. V naší republice je problém mykotoxikóz omezen především na fusariotoxiny, které jsou významnými kontaminanty potravinářských a krmivářských surovin. Především při průběhu vegetačního období s nadměrnými srážkami a relativně chladnějším počasí je předpoklad zvýšené kontaminace těmito látkami. Na základě dosavadních výsledků se jeví jako hygienicky i ekonomicky nejzávažnější mykotoxiny DON a ZEA. Zvláště DON by bylo možné považovat za jakýsi indikátor celkové kontaminace mykotoxiny. První českou zákonnou normou, stanovující hladinu mykotoxinů, je Zákon 110/97 Sb. o potravinách a vyhláška 298/97 Sb. s limity pro aflatoxiny, patulin, ochratoxin A a deoxynivalenol (NEDĚLNÍK, 2003). 2.8 Prevence růstu hub a dekontaminace mykotoxinů v polních plodinách Polní plodiny, zejména obiloviny a olejnatá semena, jsou hlavním zdrojem mykotoxinů v potravním řetězci zvířat a lidí. Růst hub a produkce mykotoxinů se může uskutečnit na plodinách ještě na poli a nebo po dobu uskladnění, anebo v obou případech. Uskladněné produkty potom mohou obsahovat toxiny, které se do nich dostaly ještě na poli anebo byly syntetizovány po dobu uskladnění. Produkci mykotoxinů v těchto produktech se dá zabránit prevencí růstu producentů. Prevence nebo inhibice růstu po dobu uskladnění se obyčejně zabezpečuje úpravou vnitřního prostředí v skladovacích prostorech (vlhkost, teplota a plynná atmosféra ). Hladina vlhkosti se dá znížit sušením ještě před uskladněním. Plynná atmosféra se dá změnit hermetickým uskladněním s vysokou hladinou oxidu uhličitého a nízkou hladinou kyslíku. 55

56 Používá se i chemická inhibice růstu hub po dobu uskladnění. Organické kyseliny, zejména kyselina propionová nebo v kombinaci s kyselinou octovou nebo kyselinou mravenčí, jsou zde velmi úspěšné. Aflatoxiny se dají částečně anebo úplně degradovat zářením, teplem nebo silnými kyselinami a zásadami, oxidačními látkami anebo bisulfidem. Hydrogenperoxid a riboflavin denaturují aflatoxin v mléku. Mycelium Aspergillus parasiticus může degradovat aflatoxiny. Adsorbenty jako bentonit a aktivní uhlí může fyzikálně odstranit aflatoxiny a patulin z kapalných potravin. Patulin je stálý při nízkých hodnotách ph, ale ne v přítomnosti většího množství vitamínu C nebo bisulfitu. Patulin mohou degradovat aktivně fermentující kvasinky. Mycelium Penicillium rubrum degraduje rubratoxin (BETINA, 1990) Biologická likvidace toxinů Biologické odbourání toxinů má nesporné výhody před odbouráním fyzikálními nebo chemickými metodami. Biologické odbourání toxinů produkovaných houbami pracuje hlavně na dvou nejvýznamějších principech, sorpce a enzymatické degradaci, oba způsoby jsou dosažitelné biologickými systémy. Živé mikroorganismy mohou pohlcovat toxin produkovaný houbami, a tato vlastnost může být použita při vytvoření biofiltru pro tekuté odmoření nebo vytvoření probiotik navázání a odstranění toxinu ze střev. Enzymatické hodnocení degradace může být v podání buď vně vnitrobuněčných enzymů nebo může být degradace kompletní, konečný produkt je CO 2 a voda. Alternativou je enzymatické přizpůsobení, které může změnit, redukovat nebo kompletně odstranit jedovatost. Mikroorganismy může detoxikaci provést mnoha způsoby : celý organismus může být použit jako startovací kultura v kvašení piva, vína a moštu, nebo v mléčně kysaném zelí, nebo mléce a mase, rafinovaný enzym může být použit v rozpuštěném nebo imobilizovaném (biofiltru) stavu, kde enzymatická aktivita může být přenesena do heterogenního systému kvasinky, probiotika a rostliny (MAGAN a OLSEN, 2004). 56

57 Četné studie ukázaly, že různé adsorpční materiály mají vysokou afinitu pro mykotoxiny vznikají stabilní vazby. Jde např. o aktivní uhlí, hydratované sodnovápenaté aluminosilikáty (HSCAS) a speciální polymery. Tyto vazby mohou existovat v různých kapalných systémech, např. ve vodě, pivu, vínu, plnotučném a odstředěném mléku a podzemnicovém oleji. Prokázalo se, že HSCAS dávají poměrně uspokojivé výsledky pokud jde o aflatoxiny, nejsou však účinné v prevenci toxických účinků mykotoxinů plísně Fusarium, např. fumonisinů, trichothecenu nebo zearalenonu. Kladné účinky aktivního uhlí a bentonitu sodného se zjistily u krys intoxikovaných toxinem T-2. Došlo k vázání mykotoxinů a tím se zamezilo jeho absorpci. Bentonit však nebyl účinný vůči zearalenonu (ZEA) a nivalenolu (NIV) u prasat. V literatuře je popsána účinnost řady adsorpčních činidel vůči různým mykotoxinům u různých zvířat. Při provádění ekonomické rozvahy před aplikací adsorpčních materiálů pro prevenci intoxikace mykotoxiny je nezbytné stanovit odpovídající spolehlivost a bezpečnost. Použitý absorpční materiál by neměl způsobovat snižování nutričních hodnot. Rozšířené používání adsorbentů při produkci hospodářských zvířat vedlo k tomu, že se na trhu objevila řada nových výrobků. Většina z nich má vysokou schopnost vázat mykotoxiny,,in vitro. Uvedené výrobky se používají jako přísada do krmiv. Účinnost,,in vivo a bezpečnost pro dobytek nebyla však u většiny komerčních výrobků dostatečně prověřována. Ačkoliv testy,,in vitro jsou klíčovým krokem ve vyhodnocování a kontrole kvality adsorbentů, experimenty,,in vivo jsou nejlepším postupem pro vyhodnocování účinnosti jakékoliv protilátky. U fumonisinů se ukázalo, že zvýšení poměru sfinganinu k sfingosinu (SA/SO) je užitečný biomarker pro odhad expozice zvířat kontaminovanému krmivu. Uvedený biomarker ukazuje jak na expozici fumonisinům, tak na toxické účinky z biochemické změny (narušení metabolismu sfingolipidů), vyvolané přímo fumonisiny na příslušné jedince. V Itálii (Institute of Science of Food Production National Research Council, ISFPA NRC) prověřovali možné kladné účinky různých adsorpčních materiálů (např. aktivního uhlí a cholestyraminu) přidávaných do kontaminované stravy stanovením poměru SA/SO (KVASNIČKOVÁ, 2005). 57

58 2.8.2 Prevence a snižování fusariových toxinů v obilovinách a výrobcích z obilovin Jednotlivé články řetězce zpracování obilí by měly být vedeny k přijetí správné praxe s cílem předcházet a snižovat kontaminaci fusariovými toxiny a mělo by se toho dosáhnout prostřednictvím zásad jednotně uplatňovaných v rámci Společenství. Plné zavedení zásad podle doporučení do praxe by mělo vést k dalšímu snížení úrovně kontaminace. Zásady správné praxe pro prevenci a snižování kontaminace obilovin mykotoxiny, včetně příloh týkajících se ochratoxinu A, zearalenonu, fumosinů a tichothecenů přijaté Komisí pro Kodex Alimentarius v roce 2003 zohledňuje: a) střídání plodin je všeobecně účinný způsob snižování rizika kontaminace v závislosti na kmenu houby a odrůdě plodiny. Byl zjištěn úzký vztah mezi předplodinou a způsobem zpracování půdy, které poukazují na význam posklizňových zbytků hostitelské plodiny v životním cyklu patogenu Fusarium spp. Pěstovali se pšenice po plodinách, jako je například kukuřice nebo obiloviny, které jsou hostiteli druhů rodu Fusarium, byl obsah DON vyšší. b) volba odrůdy/hybridu v dané oblasti by se měly pěstovat jen odrůdy doporučené pro použití v členském státě nebo v konkrétní oblasti členského státu. Sníží se tím stres rostlin a plodina bude méně citlivá na houbové infekce. c) osevní plán pěstování plodin by mělo být naplánováno tak, aby se vyhnulo klimatickým podmínkám, které prodlužují dozrávání na poli před sklizní. d) zpracování půdy a způsob pěstování plodin při kultivaci je třeba věnovat náležitou pozornost riziku eroze a zpracování půdy. e) sklizeň f) sušení g) skladování h) přeprava ze skladu (DOPORUČENÍ KOMISE) 58

59 3 MATERIÁL A METODIKA 3.1 Charakteristika regionu Znojmo Podnebí okresu je teplé a suché. Průměrná roční teplota se dlouhodobém časovém normálu pohybuje v závislosti na nadmořské výšce mezi 7 až 8,5 C. Roční úhrn srážek kolísá mezi mm a je ovlivněn srážkovým stínem Českomoravské vrchoviny. Nejvýše položeným místem okresu je Suchá hora u Zblovic, jejíž vrchol je 521 metrů nad mořem. Nejnižší místo okresu je 175 metrů nad mořem a nachází se na soutoku Dyje a Jevišovky. Znojmo leží v nadmořské výšce 289 metrů nad mořem. Na výměře hektrarů (stav k ) byla zemědělská půda, tvořila 68,3 % výměry okresu. Z této plochy připadalo hektarů na ornou půdu, hektrarů na trvalé travní porosty a hektarů na zahrady a ovocné sady ( 59

60 3.1.1 Charakteristika teplotních poměrů Znojma Nejchladnějším měsícem je zde obvykle leden, naopak nejteplejším je červenec. V lednu bývá průměrná teplota v okolí Znojma - 1,9 C Nejvyšší teplota byla naměřena ve Znojmě 37,2 C. Letní období začíná 25. května a trvá 109 dnů ( 25 Průměrná teplota Dlouhodobý normál C měsíc Obr. č. 11 Průměná teplota vzduchu 60

61 3.1.2 Charakteristika srážkových poměrů Znojma Celý okres Znojmo patří mezi extrémně suché oblasti naší republiky. V chladném půlroce zde spadne mm srážek, což je 33,9 35,5 % ročního úhrnu, v létě je pak srážkový úhrn mm (66,1 64,5 %). Nejvíce srážek obvykle spadne v letním období (v červnu), minimum připadá na březen ( 120 Srážky v roce 2007 Dlouhodobý normál mm měsíc Obr. č. 12 Úhrn srážek Charakteristika trvání slunečního svitu Znojma Počet jasných dnů se zvyšuje s nadmořskou výškou. Jejich průměrný počet je v okolí Znojma 39,5 ročně. Průměrné trvání slunečního svitu je v červenci kolem 270 hodin a v prosinci 36 hodin ( 61

62 3.2 Výkup obilovin silem Výkup se řídil Všeobecnými podmínkami nákupu rostlinných produktů ze sklizně Pšenice potravinářská Dodavatel musí deklarovat odrůdy na dodacím listě. Za pšenici potravinářskou se považují registrované odrůdy pšenice, které jsou zapsány ve Státní odrůdové knize České republiky. Tab. č. 16 Parametry výkupu potravinářské pšenice dle Všeobecných podmínek nákupu základní minimální maximální Vlhkost 14,0 0,0 18,0 Objemová hmotnost - 75,0 - v kg/hl Příměsi v % 4,0 0,0 8,0 Nečistoty v % 0,0 0,0 2,0 Obsah mokrého - 24,0 - lepku v sušině v % Číslo poklesu v s Sedimentační index (Zelenyho test) Obsah N-l v sušině - 11,6 - (N x 5,7) v % Pšenice potravinářská dále musí vyhovovat požadavkům uvedených v ČSN v článku 4.1, 4.2, 5.2 a

63 3.2.2 Pšenice ostatní Dodavatel musí deklarovat odrůdu na dodacím listě. Příměsi celkem a nečistoty celkem se posuzují podle definic uvedených v ČSN v článku 3.1 až článku 3.13, s výjimkou článku 3.2 a Tab. č. 17 Parametry výkupu pšenice základní minimální maximální Vlhkost v % 14,0 0,0 18,0 Příměsi v % 6,0 0,0 12,0 Z toho porostlá zrna 2,0 0,0 4,0 v % Nečistoty v % 0,0 0,0 5,0 Z toho svízel v % 0,3 0,0 0,3 Obsah N-l v sušině 11,0 9,0 - (N x 5,7) v % 63

64 3.2.3 Ječmen sladovnický Příměsi a nečistoty se posuzují podle definic uvedených v ČSN Barva zrna světle žlutá, plucha zrna jemná, jemně vrásčitá. Tab. č. 18 Parametry výkupu sladovnického ječmene základní minimální maximální Vlhkost v % 14,0 0,0 16,0 Podíl zrna nad sítem 2,5 x 22 mm v % 90,0 80,0 - Zrnové příměsi 2,0 0,0 4,0 sladařsky nevyužitelné v % Zrnové příměsi 2,0 0,0 5,0 sladařsky částečně využitelné v % Zrna porostlá v % 0,0 0,0 0,2 Zrna zelená v % 1,0 0,0 1,0 Neodstranitelná 1,0 0,0 1,0 příměs Klíčivost v % 98,0 95,0 - Dusikaté látky 11,0 10,0 12,0 v sušině v % 64

65 3.2.4 Ječmen ostatní Příměsi celkem a nečistoty celkem se posuzují podle definic uvedených v ČSN v článku 3.1 až 3.12, s výjimkou článku 3.2. a 3.12 a Tab. č.19 Parametry výkupu ječmene základní minimální maximální Vlhkost v % 14,0 0,0 25,0 Příměsi v % 3,0 0,0 10,0 Z toho porostlá zrna 2,0 0,0 4,0 v % Nečistoty v % 0,0 0,0 5,0 Z toho svízel v % 0,3 0,0 0,3 Ječmen dále musí odpovídat požadavkům uvedených v ČSN článku 4.2 a

66 3.3 Získání vzorku Odběr vzorku představuje samostatnou kapitolu. Získaný vzorek musí být poměrný a průměrný. Vzorek nebylo možné získat již při samotných dodávkách do sila. Jelikož každá dovezená partie vykazovala různorodé jakostní parametry, tak nebylo možné předvídat do které buňky bude vykoupené zboží uloženo. Proto byl zvolen způsob získání vzorku při manipulaci s celou buňkou, tedy při jejím přetahování. Při této operaci bylo možné zaručit poměrnost a průměrnost. Během operace přetahování byly odebírány dílčí vzorky, které byly smíchány ve vzorek směsný, pomocí labolatorní děličky byl získán laboratorní vzorek o přibližné váze 1 kg. Odebraný laboratorní vzorek byl zabalen do igelitových sáčků, neprodyšně uzavřen a označen. Sáčky byly uloženy v uzamčené skříni v laboratoři, aby bylo zamezeno případné náhodné manipulaci. Odběry byly naplánovány v cca 2.měsíčních odstupech tedy v měsíci říjen 2007, leden 2008 a konec března Jelikož provoz sila nebylo možné omezit, byly vytipovány buňky, u kterých jsme předpokládali, že po danou dobu budou v sile zachovány. U některých buněk došlo ke sloučení, případně prodání, proto z plánovaných cca 50 vzorků bylo odebráno 38 vzorků. Vzniklou situaci, tedy není u některých buněk podchyceno září, a u jiných měsíc březen. 3.4 Přístroje Vzorek byl homogenizován na Laboratory Mill 120, mixování bylo uskutečněno pomocí Ultra Turraxem (Německo) a využito centrifugy Universal 32R (Německo). Analýza byla provedena na kapalinovém chromatografu HP110 (Agilent Technologies, Palo Alto, USA) s hmotnostním detektorem Agilent MSD 1465 VL. Chromatograf se skládá z odplyňovací jednotky mobilní fáze (G1322A), kvartérního čerpadla mobilní fáze (G1311A), automatického dávkovače vzorku (G1321A) o kapacitě až 100 vzorků a hmotnostního detektoru (G1946VL). 66

67 3.5 Chemikálie Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a., rozpouštědla pak čistoty gradient grade. Acetonitril, methanol, kyselina mravenčí a standard deoxynivalenolu byly zakoupeny u firmy Sigma-Aldrich, s.r.o. (Praha, Česká republika). 3.6 Stanovení DON Po rozbalení laboratorního vzorku, bylo odebráno cca 100 g a homogenizováno na mlýnku Laboratory Mill 120. Do patron bylo naváženo 12,5 g vzorku a přidáno 50 ml roztoku acetonitrilu s vodou (poměr 84 : 16). Směs byla poté 3 minuty mixován Ultra Turraxem a po dobu 5 minut centrifugován při 4000 ot./min.. Ze supernatanu bylo odebráno 5 ml a přečištění předčištění proběhlo na MycoSep 225 Trich Push. Z takto předčištěného vzorku byly odebrány 2 ml extraktu k odpaření při 40 C mírným proudem dusíku do sucha. Odpařený vzorek byl znovu rozpuštěn 100 µl mobilní fáze (1mM kyselina mravenčí/acetonitril, 90/10, v/v).takto připravený vzorek byl použit k vlastnímu stanovení na HPLC/MS. Obr. č. 13 Předčištění na MycoSep 225 Trich Push 67