DIAGNOSTIKA KVANTITATIVNÍHO A KVALITATIVNÍHO DEFEKTU VON WILLEBRANDOVA FAKTORU PODLE POMĚRU JEHO FUNKČNÍ AKTIVITY KU ANTIGENU

Transkript

1 Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta DIAGNOSTIKA KVANTITATIVNÍHO A KVALITATIVNÍHO DEFEKTU VON WILLEBRANDOVA FAKTORU PODLE POMĚRU JEHO FUNKČNÍ AKTIVITY KU ANTIGENU Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí diplomové práce: MUDr. Petr Smejkal, Ph.D. Autor: Petra BRANDÝSOVÁ Brno, duben

2 Jméno a příjmení autora: Petra Brandýsová Název bakalářské práce: Diagnostika kvantitativního a kvalitativního defektu von Willebrandova faktoru podle poměru jeho funkční aktivity ku antigenu Pracoviště: Oddělení klinické hematologie, FN Brno Vedoucí bakalářské práce: MUDr.Petr Smejkal, Ph.D. Rok obhajoby bakalářské práce: 2010 Souhrn: Příčinou vzniku von Willebrandovy choroby je defekt von Willebrandova faktoru. Tento glykoprotein se uplatňuje jak v procesu primární hemostázy tak také koagulace. Použití specifických testů vyšetřujících jeho antigen a funkční aktivitu (Ristocetin kofaktorová aktivita a Kolagen vazebná kapacita) nám pomáhá lépe určit typ této choroby. Užitečné mohou být také při sledování léčby pacientů s von Willebrandovou chorobou. Klíčová slova: von Willebrandova choroba, von Willebrandův faktor, antigen, ristocetin kofaktorová aktivita, kolagen vazebná kapacita Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem. 2

3 Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Petra Smejkala, Ph.D. a konzultanta RNDr. Jiřiny Zavřelové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne... 3

4 Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce MUDr. Petru Smejkalovi, Ph.D. za čas a rady, které mi věnoval. Ráda bych také poděkovala RNDr. Jiřině Zavřelové a celému kolektivu Úseku rutinní a speciální koagulace ve FN Brno - Bohunice za odpovědi na všechny mé otázky. 4

5 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK A absorbance ADAMTS A Disintegrin And Metallprotease domain with ThromboSpondin ADP adenosindifosfát Ag antigen AK aminokyselina aptt aktivovaný parciální tromboplastinový čas BS krvácivé skóre (bleeding score) CT čas uzavření (closure time) DDAVP 1 deamino 8 D arginin vazopresin EAC ε aminokapronová kyselina EID elektroimunodifuze ELISA enzymová imunoanalýza FVIII faktor VIII FVIII:Ag antigen faktoru VIII FVIII:B vazebná kapacita vwf pro faktor VIII FVIII:C koagulační aktivita faktoru VIII GP glykoprotein HMW multimery o vysoké molekulové hmotnosti LIA latexová imunoanalýza LIS laboratorní informační systém Met metionin OD optická denzita ot/min otáčky za minutu Pl Ag protilátka antigen PPP plazma chudá na destičky PRP plazma bohatá na destičky RIPA ristocetinem indukovaná agregace trombocytů Tyr tyroxin VWF von Willebrandův faktor VWF:Ag vyšetření koncentrace vwf VWF:CBA kolagen vazebná kapacita VWCH von Willebrandova choroba VWF:RCo ristocetinový kofaktor 5

6 OBSAH 1 Úvod Teoretická část Fyziologie hemostázy Systém plazmatických faktorů Koagulační systém Faktor VIII antihemofilický globulin Von Willebrandův faktor Von Willebrandova choroba Klinické projevy, krvácivé skóre Dělení von Willebrandovy choroby Typ Typ Typ 2A Typ 2B Typ 2M Typ 2N Typ Destičkový typ a získaná von Willebrandova choroba Diagnostika Základní koagulační testy Počet krevních destiček Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt) Doba krvácení, PFA Specifické testy Koagulační aktivita faktoru VIII ( FVIII:C) Vyšetření antigenu (VWF:Ag) Vyšetření funkční aktivity VWF (VWF:RCo) Kolagen vazebná kapacita (VWF:CBA) Diskriminační testy Ristocetinem indukovaná agregace trombocytů (RIPA) Multimerní analýza Vazebná kapacita VWF pro faktor VIII (VWF:FVIIIB)

7 2.3.4 Diferenciální diagnostika Léčba Lokální a podpůrná terapie Desmopresin Léčba deriváty krevní plazmy Speciální část Cíl práce Soubor a metodika Stanovení FVIII Princip metody Odběr materiálu Pomůcky, reagencie Kalibrace, kontroly správnosti Pracovní postup Technické údaje Stanovení VWF:Ag Princip metody Odběr materiálu Pomůcky, reagencie Kalibrace, kontroly správnosti Pracovní postup Technické údaje Stanovení VWF:RCo Princip metody Odběr materiálu Pomůcky, reagencie Kalibrace, kontroly správnosti Pracovní postup Technické údaje Přístroj STA R Stanovení VWF:CBA Pracovní postup Popis použitých statistických metod Výsledky

8 3.3.1 Sběr Statistické metody Cut off hodnoty u metody VWF:CBA Cut off hodnoty u metody VWF:RCo Korelace metod Vyhodnocení, dokumentace Poměr VWF:CBA/Ag Poměr VWF:RCo/Ag Korelace mezi metodami Závěr

9 1 Úvod Von Willebrandova choroba se vyskytuje asi u 1% populace a stala se tak nejčastěji se vyskytující vrozenou krvácivou chorobou. Příčinou onemocnění je snížená koncentrace, funkční nebo strukturní defekt von Willebrandova faktoru. Lékař diagnostikuje chorobu na základě krvácivých projevů v osobní i rodinné anamnéze a také použitím různých laboratorních testů (základní, specifické, diskriminační). Pro upřesnění diagnostiky kvantitativních a kvalitativních defektů této choroby využíváme specifické testy zjišťující funkční aktivitu von Willebrandova faktoru, kam řadíme Ristocetin kofaktorovou aktivitu(vwf:rco) a Kolagen vazebnou kapacitu (VWF:CBA). Můžeme také vypočítat poměr mezi funkční aktivitou a antigenem von Willebrandova faktoru, čímž lépe rozlišíme typ 1 od typu 2 této choroby. V teoretické části své práce popisuji především von Willebrandův faktor a von Willebrandovu chorobu její klasifikaci a používané laboratorní testy při jejím určování. V analytické části jsem se zaměřila na výše uvedené funkční testy, vyšetření antigenu von Willebrandova faktoru a F VIII. Data získaná měřením jsem na závěr statisticky zpracovala. 9

10 2 Teoretická část 2.1 Fyziologie hemostázy Zástava krvácení je velmi složitý děj v lidském těle. Při porušení cévní stěny, oddělující krev od ostatních tkání i od vnějšího prostředí, se organismus začne bránit. Tato obranná reakce se nazývá hemostáza a jejím výsledkem je vytvoření krevní sraženiny. Protože se jedná o systém velmi složitý, je třeba jeho důsledná regulace pomocí fibrinolytického systému a systému inhibitorů krevního srážení [12]. Na hemostáze se podílí celá řada složek. Mezi ty nejdůležitější patří: trombocyty, cévní stěna a systém plazmatických faktorů. Prvním krokem při zástavě krvácení je smrštění cévní stěny (vasokonstrikce), kdy se zabrání dalším ztrátám krve a dochází k aktivaci dalších pochodů. Následuje vytvoření primární hemostatické zátky, na které se podílí krevní destičky. Současně dochází k aktivaci plazmatického koagulačního systému, jehož výsledkem je vytvoření pevné fibrinové zátky. 2.2 Systém plazmatických faktorů Tyto látky nacházíme v plazmě, kde se účastní hemostázy. Podílí se jak na vzniku hemostatické zátky, tak také omezují vznikající koagulum na místě poškození. Řadíme mezi ně fibrinolytický systém, koagulační systém a inhibitory krevního srážení [12] Koagulační systém Jedná se o soustavu třinácti koagulačních faktorů, jejichž cílem je vytvoření fibrinového vlákna. Toho je dosaženo postupnou enzymatickou reakcí, kdy neaktivní faktory jsou štěpeny předcházejícím faktorem na aktivní formu. Celá tato reakce je zobrazena na obrázku č. 1 [12]. Pro účely této bakalářské práce se zaměřím pouze na faktor VIII (FVIII) a von Willebrandův faktor (VWF). 10

11 Obr. č. 1: Koagulační kaskáda [ upraveno dle 12] Faktor VIII antihemofilický globulin Plazmatický glykoprotein s velmi složitou molekulou řadíme mezi kofaktory. Tato bílkovina je v plazmě přítomna ve stopovém množství (asi 0,2 μg/ml), v séru aktivitu nenacházíme. V koagulační kaskádě jej nacházíme v komplexu zvaném tenáza, který je tvořen FVIII, faktorem IXa, fosfolipidy a vápenatými ionty. Tento systém zabezpečuje aktivaci faktoru X na faktor Xa, který se stává součástí protrombinázy a štěpí neaktivní protrombin na trombin. Trombin způsobí štěpení fibrinogenu na fibrin, který je na závěr stabilizován faktorem XIII. Inaktivace FVIII probíhá pomocí inhibitoru označovaného jako protein C. Tento faktor je navázaný na VWF, který je v tomto komplexu v převaze, jež činí více než 90 %. Obě bílkoviny (FVIII i VWF) se podařilo v roce 1980 oddělit a můžeme tedy hovořit o koagulační aktivitě FVIII FVIII:C a antigenu FVIII:Ag. Z vazby na VWF se uvolňuje díky kontaktu s fosfolipidy. Poměr jednotek mezi FVIII a VWF je 1:1 se nemění ani při změnách hladin FVIII a VWF [12] Von Willebrandův faktor Tento glykoprotein má rozpětí molekulové hmotnosti kda a patří k největším molekulám v plazmě. Jeho koncentrace je asi 10 μg/ml. Tyto dimery nacházíme v plazmě v různém rozmezí velikostí od těch s nízkou molekulovou hmotností (LMW), přes ty se střední molekulovou hmotností (IMW) až po ty s vysokou molekulovou hmotností 11

12 (HMW). Gen pro VWF nacházíme na krátkém raménku chromozomu 12, obsahuje 52 exonů [4, 12, 15, 16, 22]. Jeho funkce je dvojí: V primární hemostáze se podílí na adhezi a agregaci trombocytů (Obr. č. 2). Váže destičkový GP Ib a zahajuje tak adhezi destiček na subendotel. Tato reakce vede k aktivaci GP IIb/III na povrchu destičky a jeho reakcí s VWF a fibrinogenem dojde k agregaci [6, 15]. V procesu koagulace se uplatňuje jako nosný protein, kdy váže a stabilizuje FVIII, stabilizuje krevní sraženinu a zabraňuje inaktivaci FVIII proteinem C [15]. Obr. č. 2: Funkce von Willebrandova faktoru v primární hemostáze [upraveno dle 21] VWF je syntetizován v megakaryocytech a endoteliálních buňkách. Biosyntéza začíná translací pre-pro-vwf, který kromě polypeptidu VWF (2050 aminokyselin) obsahuje i propetid (741 AK) a signální peptid (22 AK). Následně vznikají dimery pro-vwf v endoplazmatickém retikulu, kdy dochází k vazbě mezi C konci (mezi CK doménami). Pokračuje vznikem multimerů v Golgiho aparátu disulfidickou vazbou mezi doménami D3. Kromě těchto kroků zahrnuje biosyntéza VWF i kroky další včetně polymerizace, glykosylace atd. Tvorbu multimerů ovlivňuje hlavně množství propeptidu a kyselé ph v Golgiho aparátu. K odštěpení propeptidu od vlastní molekuly VWF dochází až po vzniku multimerů VWF. Multimery VWF mohou být vylučovány nepřetržitě, nebo jsou před uvolněním do cirkulace skladovány ve Weibel Paladeho tělíscích v endotelu a α granulích krevních destiček. Nejefektivnější jsou multimery o vysoké molekulové hmotnosti (HMW), protože jejich uvolnění v místě poranění vede k adhezi destiček [12, 15, 16]. Prekurzor VWF má velmi složitou strukturu (Obr. č. 3) a obsahuje řadu specifických domén, např.: 12

13 A1, která váže destičkový glykoprotein Ib a kolagen IV A2, kde dochází ke štěpení Tyr 1605 Met 1606 pomocí ADAMTS - 13 A3, vážící vláknitý kolagen C1, vážící destičkový integrin α IIb β 3 D / D3, vážící FVIII Obr. č. 3: Struktura von Willebrandova faktoru [upraveno dle 24] Odbourání VWF se odehrává pomocí metaloproteázy ADAMTS 13, která působí štěpení mezi Tyr 1605 Met 1606 na doméně A2. Dochází k přeměně velkých multimerů na menší a k tvorbě štěpných produktů. Poločas rozpadu VWF je asi 12 20h [15, 16]. Pro správnou funkci VWF musí být rovnováha mezi syntézou a odbouráváním. Osud VWF po jeho vzniku závisí na mnohých faktorech, mezi ty nejdůležitější patří jeho velikost, náchylnost k proteolýze a interakce s krevními destičkami [16]. K sekundárnímu zvýšení koncentrace FVIII a VWF může dojít v důsledku: infekce, diabetu těhotenství hepatopatie, malignity zvýšeného cvičení zvýšeného stresu užívání antikoncepce Snížená koncentrace (nižší až o 25 30%) se naopak může fyziologicky nacházet u populace s krevní skupinou 0. Jedinci s touto krevní skupinou mají také vyšší zastoupení mezi pacienty s von Willebrandovou chorobou [17, 22]. 13

14 2.3 Von Willebrandova choroba U von Willebrandovy choroby (VWCH) se nesetkáme s primárním poškozením krevních destiček, nejedná se ani o primární koagulopatii a proto ji často řadíme mezi ostatní vrozené krvácivé choroby. Příčinou onemocnění je snížená koncentrace, funkční nebo strukturní defekt VWF. Onemocnění je dědičné, postihuje obě pohlaví (autozomální dědičnost). Asi 1% populace má sníženou hladinu VWF. V současnosti se jedná o nejčastěji se vyskytující vrozenou krvácivou chorobu [10, 11, 13]. Toto onemocnění bylo poprvé popsané v roce 1926 finským lékařem Erikem von Willebrandem na Alandských ostrovech v Baltském moři. Popsal pětiletou holčičku Hjördis, u které se vyskytovalo extrémní krvácení a tvorba modřin. U dalších členů rodiny, převážně žen, se tyto příznaky vyskytly také. Podle nalezených příznaků se Dr. von Willebrand domníval, že se jedná o nový druh hemofilie a označil ji jako pseudohemofílii. Poté objevil určité odlišnosti. Jednalo se především o prodlouženou dobu krvácení a postižení obou pohlaví při normálním počtu krevních destiček. Dal tak příčinu vzniku nové choroby [10, 15] Klinické projevy, krvácivé skóre Charakteristická pro tuto chorobu je přítomnost nadměrného krvácení kůže a sliznic. Klinické projevy jsou velmi různorodé a jejich síla se odvíjí od typu choroby. Můžeme se setkat jak s velmi lehkými projevy, kterým pacient nemusí věnovat zvýšenou pozornost (často jsou tedy diagnostikováni až v dospělosti) nebo i s projevy podobnými těžké hemofílii (krvácení do kloubů). U postižených s VWCH se nejčastěji setkáváme s krvácením z nosu, dásní, po lehkém poranění, tvorbou hematomů a pro ženy je typické silné menstruační krvácení. U dětí postižených touto chorobou se často setkáváme s krvácením dásní po extrakci prvních zubů. Méně často se můžeme setkat s krvácením do dýchacího nebo zažívacího traktu [8, 13, 15]. Pro lepší orientaci v krvácivých projevech byl vytvořen skórovací systém, označovaný BS (Tab. č. 1). Každý symptom vyskytující se u této choroby a jeho četnost má přidělenou číselnou hodnotu. Po součtu jednotlivých bodů získáme celkové krvácivé skóre, které je v rozmezí od -3 do +45. Čím je číslo větší, tím těžší a četnější má pacient krvácivé projevy. Lékař si tedy pomocí výpočtu BS může vytvořit obrázek o krvácivých projevech pacienta, u kterého je podezření na VWCH. 14

15 symptom krvácení z nosu / není nebo nevýznamné (<5x) >5x pouze konzultace kauterizace antifibrinolytika nebo krevní transfuze, substituční terapie, desmopresin kožní krvácení / není nebo nevýznamné (<1cm) >1 cm, bez trauma pouze konzultace krvácení drobných ran z / není nebo nevýznamné (<5x) >5x pouze konzultace chirurgická krvácení zástava krevní transfuze, substituční terapie, desmopresin dutina ústní / žádné alespoň 1x pouze konzultace chirurgická zástava krvácení nebo antifibrinolytika krevní transfuze, substituční terapie, desmopresin krvácení do GIT / žádné spojené s vředy, hemoroidy, portální hypertenzí spontánní chirurgická zástava krvácení,krevní transfuze, substituční terapie, desmopresin, antifibrinolytika extrakce zubů bez krvácení u dvou a více extrakcí extrakce nebyla nebo bez krvácení při jedné extrakci v méně než 25% všech procedur ve více než 25% všech procedur sešití nebo tamponáda krevní transfuze, substituční terapie, desmopresin chirurgické ošetření bez krvácení u dvou a více operací operace nebyla nebo bez krvácení při jedné operaci v méně než 25% všech chirurg.ošetřeních ve více než 25% všech chirurg. ošetřeních chirurgická zástava krvácení nebo antifibrinolytika krevní transfuze, substituční terapie, desmopresin menstruace / bez krvácení pouze konzultace antifibrinolytika, hormonální antikoncepce dilatace a kyretáž, terapie železem krevní transfuze, substituční terapie, desmopresin, hysterektomie poporodní krvácení bez krvácení u dvou a více porodů nerodila nebo bez krvácení u jednoho porodu pouze konzultace dilatace a kyretáž, terapie železem, antifibrinolytika krevní transfuze, substituční terapie, desmopresin hysterektomie krvácení do svalů / nikdy po úrazové, bez terapie spontánní, terapie bez spontánní nebo poúrazové vyžadující desmopresin nebo substituční terapii spontánní nebo poúrazové vyžadující chirurgické ošetření nebo krevní transfuzi krvácení kloubů do / nikdy po úrazové, bez terapie spontánní, terapie bez spontánní nebo poúrazové vyžadující desmopresin nebo substituční terapii spontánní nebo poúrazové vyžadující chirurgické ošetření nebo krevní transfuzi krvácení do CNS / nikdy / / Tab. č. 1: Krvácivé skóre [upraveno dle 19] subdurální, jakýkoliv invazivní zákrok intracerebrální, jakýkoliv invazivní zákrok 15

16 2.3.2 Dělení von Willebrandovy choroby Klasifikace VWCH vychází jak z typu mutace VWF (z patofyziologie defektu), tak také ze stupně defektu VWF (fenotypu) [13]. Toto onemocnění tedy dělíme následovně: Typ 1 Tento typ se vyskytuje nejčastěji a tvoří asi 80% všech případů VWCH. Dědičnost je autozomálně dominantní. Jedná se o kvantitativní defekt VWF, kdy dochází ke snížení jeho hladiny na méně než 15%. Změny ve struktuře multimerů nenacházíme, ani podíl HMW není snížen. Nacházíme normální poměr mezi funkční aktivitou a hladinou antigenu. Klinické projevy jsou různé [13, 16]. Snížená hladina VWF může být vyvolaná mutací, která ovlivňuje genovou expresi a může způsobit následující [16]. Dochází k sekreci funkčně normálního VWF s normálními multimery, jen v menším množství. Narušení intracelulárního transportu podjednotek VWF. Toto je často příčina, kterou nalézáme u pacientů s těžkou dominantně dědičnou formou typu 1 VWCH. Zrychlené odstraňování VWF Typ 2 Nacházíme jej zhruba v 15 30% všech případů. Jedná se o kvalitativní defekt VWF, nedostatek je především HMW. V důsledku toho často dochází ke zhoršení adheze destiček a nebo vazby FVIII. Dědičnost je autozomálně dominantní i recesivní. V plazmě nacházíme sníženou funkční aktivitu i hladinu antigenu. Pacienti s tímto typem mají často pozitivní rodinnou anamnézu, na rozdíl od prvního typu, kde nemusí být tolik zřejmá [7, 15, 16]. Na základě funkčních a strukturních změn rozdělujeme tento typ na další podtypy Typ 2A Tvoří asi 10 % všech případů VWCH. Jedná se o kvalitativní defekt, kdy dochází ke snížení funkcí závislých na trombocytech. Nacházíme nedostatek HMW multimerů, který může být vyvolán buď porušenou tvorbou HMW nebo jejich zvýšenou citlivostí ke štěpení pomocí ADAMTS 13. Laboratorně zjišťujeme sníženou funkční aktivitu ve srovnání s hladinou Ag (poměr je < 0.60), hladina FVIII je buď v normě nebo lehce snížená. U molekulárně genetického vyšetření nalézáme mutace, které působí na organely účastnící se tvorby HMW (ty se pak tvoří defektní). 16

17 Golgiho aparát. Tuto organelu ovlivňuje mutace v propeptidu, kde dochází k narušení multimerizace. Původně se tento fenotyp označoval jako typ IIC VWCH. Endoplazmatické retikulum. Mutace na C konci (CK doméně) brání dimerizaci. Takto poškozené monomery VWF se dostávají do Golgiho aparátu, kde se začlení do vznikajícího multimeru. Ten ukončí své prodlužování a vznikají malé multimery s lichým počtem podjednotek. Původní označení je IID. Golgiho aparát. Mutace poškozuje D3 doménu, která se podílí na tvorbě disulfidických vazeb mezi podjednotkami. Fenotyp označovaný IIE. Poruchou tvorby HMW vznikají malé multimery, které se na krevní destičky váží slabší vazbou, což vede ke zhoršení adhezivních funkcí destiček. Tvorba HMW může být i normální, ale mutace, nejčastěji v doméně A2, může způsobit zvýšenou proteolýzu [15, 16] Typ 2B Kvalitativní defekt vyvolaný zvýšenou afinitou k destičkovému GP Ib. Toto nastává jako důsledek mutace VWF v doméně A1. Nacházíme snížené množství HMW, jejichž tvorba není porušena, ale jsou náchylnější k proteolýze. Tito pacienti často trpí trombocytopenií, která je vyvolaná právě zvýšenou vazbou mezi VWF a krevními destičkami, které vytváří agregáty [15, 16] Typ 2M Varianta kvalitativní vyvolaná mutací v doméně A1, způsobující snížení vazby mezi VWF a krevními destičkami nebo endotelem. Funkce a tvorba HMW není ovlivněna. Poměr mezi funkční aktivitou a Ag je snížen. Původně se tento typ označoval IC [15, 16] Typ 2N U typu Normandy (podle místa prvního nálezu tohoto typu) pozorujeme sníženou afinitou VWF k FVIII. Mutaci nacházíme u VWF v místě vazby FVIII a to na doméně D /D3. Tento typ se může často zaměnit za lehkou formu hemofilie A. Hladina FVIII je v porovnání s Ag snížená [15, 16] Typ 3 Recesivně dědičný kvalitativní typ, u kterého nacházíme těžký deficit VWF. Pacienti trpí těžkými krvácivými projevy podobnými hemofílii A časté a těžké krvácení v dětství, krvácení do kloubů apod. Nízkou hladinu nacházíme u FVIII, antigenu i u koagulační 17

18 aktivity. Často se můžeme setkat s tvorbou aloprotilátek proti VWF. V genu VWF pomocí molekulární genetiky nalézáme pestré genetické mutace delece, malé inserce, nonsense mutace aj., které vedou k předčasné tvorbě stop kodonů [15, 16] Destičkový typ a získaná von Willebrandova choroba Destičkový typ (někdy označovaný také jako pseudo VWCH) je způsoben poruchou GP Ib, který váže HMW a ty poté v plazmě chybí. Postižení jedinci často trpí trombocytopenii. U získané formy VWCH se jako příčina, která stojí za defektním fungováním VWF jeví snížená syntéza, zvýšená proteolýza nebo spotřeba. Byla popsaná např. u nádorových a autoimunitních onemocnění [13] Diagnostika Pro potvrzení VWCH jsou důležitá tři kritéria dědičnost, snížená hladina VWF a krvácivé projevy. Základ pro stanovení diagnózy tvoří především lékařské vyšetření, stanovení osobní a rodinné anamnézy a laboratorní vyšetření [3, 5, 17]. Pro diagnostiku VWCH používáme nejrůznější testy, které se mezi sebou liší silou tuto chorobu diagnostikovat. Laboratorní diagnostika vychází ze základních koagulačních testů, které také označujeme jako screeningové. Slouží jako orientační u pacientů, kde máme podezření na VWCH. Pro potvrzení diagnózy a objasnění typu poruchy používáme specifické a diskriminační testy. Při diagnostikování VWCH by se tedy mělo postupovat od základních testů zaměřených na obecné fungování hemostázy přes ty, které nám diagnózu potvrdí popř. i dourčí její typ Základní koagulační testy Počet krevních destiček Stanovuje se spolu s krevním obrazem na automatických analyzátorech. Jejich snížená hladina může poukazovat na zvýšený sklon ke krvácení. Můžeme také zjistit trombocytopenii, která se často vyskytuje u jedinců s typem 2B VWCH Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aptt) Tímto testem monitorujeme vnitřní koagulační systém, kam patří i FVIII. Právě koncentrace těchto koagulačních faktorů ovlivňuje rychlost tvorby prvního fibrinového vlákna v tomto testu. Normální hodnoty se pohybují v rozmezí sec. Prodloužení značí sníženou koagulační aktivitu FVIII a může svědčit pro diagnózu VWCH [3, 12]. 18

19 Doba krvácení, PFA 100 Doba krvácení (DK) je testem primární hemostázy a je prováděn v různých variantách. Pro diagnózu VWCH je málo citlivý i specifický a slouží spíše jako test orientační pro posouzení funkčnosti primární hemostázy. Normální hodnota je < 270 sec. a můžou ji ovlivňovat některé léky [12]. Z důvodu špatné reprodukovatelnosti a standardizace byl vyvinut automatizovaný systém označovaný jako PFA 100 (odvozené z anglického názvu Platelet Function Analyzer). Tento systém napodobuje normální funkci krevních destiček, kdy dochází k jejich reakci s kolagenem. Trombocyty pacienta se zachytávají na membráně přístroje potažené kolagenem a dochází k jejich aktivaci. Na membráně se nachází i epinefrin s ADP, které se podílí na uvolňování látek z granulí destiček. Nejprve tedy dochází k adhezi destiček a později k tvorbě agregátů, které postupně zmenšují otvor v membráně, až dojde k jejímu uzavření. Tento moment označujeme jako CT (Obr. č. 4). Průtok krve membránou se tedy postupně zmenšuje a rychlost potřebná k jejímu uzavření se odvíjí od počtu trombocytů a hodnoty hematokritu. Obr. č. 4: Znázornění uzavření membrány trombocyty v analyzátoru PFA [upraveno dle 23] Specifické testy Někdy jsou označované také jako testy konfirmační a slouží pro potvrzení a upřesnění diagnózy. Je lepší je mezi sebou kombinovat a diagnózu nestavět jen na jednom z nich, popř. je kombinovat s testy diskriminačními. Postup při diagnostice a kombinování metod je znázorněno na Obr. č

20 Obr. č. 5: Využití specifických a diskriminačních testů při určování typu choroby [18] Koagulační aktivita faktoru VIII ( FVIII:C) Měříme koagulační čas, který závisí na množství FVIII ve vyšetřované plazmě. Všechny ostatní faktory jsou při testu v nadbytku. Test se využívá především k posouzení závažnosti VWCH, protože hladina bývá nižší u těžkých případů VWCH. Využít ho můžeme také k identifikaci typu 2N a hemofilie A. Sám je ale většinou neprůkazný a měl by se využívat v kombinaci s dalšími testy [3] Vyšetření antigenu (VWF:Ag) K vyšetření celkové koncentrace antigenu využíváme imunologické metody. Ty nás ale neinformují o funkci nebo struktuře multimerů. Zvýšení může nastat v důsledku infekce, těhotenství, nádoru, onemocnění ledvin, jater aj. Nízká hladina antigenu může poukazovat na VWCH. Test nám tedy může pomoci detekovat jedince s type 3 i typem 1 VWCH, ale jedince s typem 2 často nezachytí. Měl by se tedy kombinovat i s jinými metodikami [3, 4]. Mezi nejpoužívanější metody stanovení patří: ELISA (sendvičová technika) k vyšetření Ag používáme protilátku značenou enzymem peroxidázou. Na stěny mikrotitrační destičky pokryté protilátkou proti vyšetřovanému antigenu se antigen naváže. Dalším krokem je promytí, kdy se zbavíme všech nenavázaných složek. Poté se na navázaný antigen váže protilátka značená enzymem (konjugát), opět se promyje. Na závěr se přidá chromogenní substrát, který je štěpen konjugátem na barevný produkt. Síla zbarvení odpovídá koncentraci antigenu a měří se na ELISA readeru [12]. 20

21 LIA latexová imunoanalýza, u které využíváme latexové částice, potažené protilátkou proti VWF. Pokud je v testované plazmě přítomen antigen (VWF), dochází jeho vlivem k aglutinaci částic. EID elektroimunodifuze, kdy protilátka obsažená přímo v gelu reaguje při elektroforéze s vyšetřovaným antigenem za vzniku precipitačního píku. Umožňuje tedy kvantitativní stanovení antigenu. Tato metodika je časově i přístrojově náročná a v praxi se od ní upouští [12] Vyšetření funkční aktivity VWF (VWF:RCo) Hodnotíme schopnost VWF reagovat s GP Ib na povrchu destiček, za přítomnosti antibiotika ristocetinu. Tento test je schopen rozpoznat přítomnost HMW forem VWF. Metoda může být založená na dvou principech: Agregační metodika, kdy se k destičkám a ristocetinu přidá bezdestičková plazma pacienta, která slouží jako zdroj VWF. Sledujeme tvorbu agregační křivky [12]. Aglutinační metodika, kdy proti negativní kontrole pozorujeme tvorbu aglutinátů v různě zředěné vyšetřované plazmě s přídavkem destiček a ristocetinu. Určujeme titr, ve kterém ještě k aglutinaci došlo [12]. U jedinců s typem choroby 2A, 2B, 2M jsou v důsledku ztráty HMW naměřené hodnoty nižší než u VWF:Ag. Proto je snaha odstranit tuto limitaci a testují se například ELISA způsoby stanovení např. za použití specifických monoklonálních protilátek. Zatím ale není přítomna žádná alternativa k původnímu, klasickému způsobu stanovení [3] Kolagen vazebná kapacita (VWF:CBA) Kvantitativní a kvalitativní test prováděný ELISA metodikou technicky podobné VWF:Ag, známy jsou i případy stanovení pomocí flow cytometrie. Měří se schopnost domény A3 HMW vázat vláknitý kolagen. Senzitivita tohoto testu je do jisté míry ovlivněna typem použitého kolagenu a na rozdíl od VWF:RCo metodiky je toto stanovení mnohem citlivější na přítomnost HMW. Tento test se využívá především k rozlišení typu 2A a 2B od jiných typů. U typu 2M je VWF:CBA normální a VWF:RCo snížené [3, 4, 10] Diskriminační testy Využívají se především pro určení typu VWCH u pacientů, kde jsme již pomocí specifických testů diagnózu potvrdili. 21

22 Ristocetinem indukovaná agregace trombocytů (RIPA) Vyšetřujeme agregaci trombocytů po ristocetinu, kdy k PRP pacienta přidáme ristocetin a sledujeme tvorbu agregační křivky. Antibiotikum přidáváme v různých koncentracích a celá reakce tedy závisí na koncentraci a správné funkci trombocytů a VWF pacienta. U pacientů s typem 3 VWCH nedochází k agregaci v žádné koncentraci, u typu 2B zjišťujeme agregaci již při nízkých koncentracích ristocetinu. Pokud je reakce na ristocetin snížená, provádíme korekci přídavkem PPP k PRP pacienta. Jde - li o VWCH, dochází ke zvýšení RIPA a pokud zvýšení nenastane, jedná se zřejmě o defekt trombocytů [3, 12, 14] Multimerní analýza Tato analýza zahrnuje elektroforézu vyšetřované plazmy na SDS agarózovém gelu, využívá se jeho nízké a střední rozlišení (1,2% a 1,6%). Separace se děje na základě velikosti separovaných molekul. Rozdělené molekuly se detekují pomocí autoradiografie nebo Western blotu. Výsledkem je zjištění multimerní struktury VWF. Významná je tedy především pro rozlišení typů a podtypů VWCH. Z důvodu přístrojové, časové a finanční zátěže se tento test provádí jen v malém množství laboratoří. Nejčastěji ho tedy používáme v poslední fázi diagnostiky VWCH. (Obr. č. 6) [1, 3, 4, 9]. Obr. č. 6: Struktura multimerů u typu 2 VWCH [25] 22

23 Vazebná kapacita VWF pro faktor VIII (VWF:FVIIIB) Provádí se ELISA metodou, kdy zjišťujeme schopnost VWF vázat se na FVIII. Využití má tento test v diagnostice typu 2N VWCH [3] Diferenciální diagnostika Další postupy, které můžeme uplatnit v diagnostice VWCH je použití poměrů mezi jednotlivými metodami VWF:CBA/VWF:Ag nebo VWF:RCo/VWF:Ag. Těmito poměry se dá odlišit typ 1 od typu 2 VWCH. Cut off hodnota rozlišující tyto typy se v literatuře značně liší. Některé studie uvádí hodnotu pro poměr VWF:RCo/VWF:Ag [5, 22] 0,6 svědčí pro typ 1 < 0,6 svědčí pro typ 2 U jiných se setkáváme s hodnotou [3, 16] 0,7 svědčí pro typ 1 < 0, 7 svědčí pro typ 2 Pro poměr VWF:CBA/VWF:Ag [10] 0,5 svědčí pro typ 1 < 0,5 svědčí pro typ 2 Jiná studie udává [3] 0,7 svědčí pro typ 1 < 0,7 svědčí pro typ 2 Výsledky jednotlivých měření nám svou hodnotou také mohou naznačit, o jaký typ choroby by se mohlo jednat (Obr. č. 7). Obr. č. 7: Porovnání výsledků měření u jednotlivých typů VWCH [18] 23

24 2.3.5 Léčba Pacienti trpící VWCH mají krvácivé projevy různé intenzity a četnosti a tomu se také musí přizpůsobit jejich terapie. Monitorování úspěšnosti léčby je složité a z testů se nejčastěji využívá PFA 100, RCo, aptt Lokální a podpůrná terapie Využívá se u slabšího krvácení vzniklém např. po menším chirurgickém nebo zubařském zásahu. U pacientů s lehkými krvácivými projevy můžeme před podáním léku využít některá opatření jako například [15]: přímý tlak v místě poranění kousání do kousku gázy po extrakci zubu přiložení tlakového obvazu studený zábal pro minimalizování vzniku hematomů Pokud výše zmíněné zásahy nepomohou nebo pacient trpí těžší formou choroby, k zástavě krvácení můžeme využít některá antifibrinolytika, která zpomalí rozpouštění trombu tranexamová kyselina, EAC apod. Z lokálních přípravků se nejčastěji využívá fibrinové lepidlo a u žen pro zmírnění silné menstruace estrogen, který způsobí zvýšení hladiny FVIII a VWF [15] Desmopresin Tato látka (Obr. č. 8) je syntetickým analogem v těle se běžně vyskytujícího hormonu vazopresinu (antidiuretický hormon). Využívá se v léčbě a prevenci krvácivých projevů spojených s VWCH. Běžně se označuje jako DDAVP a jeho podání dvoj až osminásobně zvyšuje hladiny FVIII a VWF zhruba hodinu až dvě od jeho podání. Působí zřejmě na uvolňování těchto látek uskladněných ve Weibel Paladeho tělíscích [15, 22]. Obr. č. 8: Struktura desmopresinu [20] 24

25 Výhodou tohoto přípravku je jeho podání může se do těla aplikovat vpichem do žíly, podkožně nebo intranazálně. Ve formě spreje se využívá k stavění krvácení z nosu, po extrakci zubu, při silné menstruaci apod. Po podání optimální dávky, která je 0,3 μg/kg se maximálního účinku dočkáme zhruba za minut, poločas rozpadu uvolněného FVIII je asi 4 5 hodin. Pokud dochází k opakovanému podání DDAVP, hladina FVIII již tak rapidně nestoupá, patrně proto, že zásoby ve Weibel Paladeho tělíscích se musí doplnit [12, 15]. Tento lék je většinou dobře snášen, ale i přesto se mohou u některých pacientů vyskytnout nežádoucí účinky. Pacientům se srdeční vadou, anginou pectoris a dětem do dvou let věku by se lék neměl podávat. Nežádoucí účinky [12, 15]: bolest hlavy zrychlená srdeční činnost zarudnutí tváře snížený krevní tlak slabost a mdloba během infuze zadržování vody U pacientů s typem 1 a u části pacientů s typem 2 VWCH se většinou setkáváme s dobrou odpovědí na tuto léčbu (dle výsledku terapeutického pokusu). U typu 2B se většinou DDAVP kvůli trombocytopenii nedoporučuje. Vysoké hladiny FVIII po podání DDAVP nacházíme u pacientů s typem 2N, ale jen po dobu 3 hodin. Jedinci s typem 2M a 3 VWCH reagují špatně nebo vůbec [10, 15, 16] Léčba deriváty krevní plazmy Z derivátů krevní plazmy využíváme intravenózní podání koncentrátů VWF a FVIII. Jedná se o čištěné koncentráty FVIII obsahující i VWF nebo koncentráty VWF s i bez obsahu FVIII. V současné době se nejvíce používá preparát Haemate P. [18]. Při podání více infuzí je třeba léčbu pacienta sledovat laboratorně, zejména hladinu FVIII. Vysoké hladiny tohoto faktoru přispívají k vzniku žilní trombózy. K zástavě krvácení můžeme také využít transfuzi krevních destiček, které zřejmě dopraví malé množství VWF na místo poranění. Od používání kryoproteinu se upouští a to hlavně kvůli málo efektivnímu procesu virové inaktivace u tohoto produktu [15]. 25

26 3 Speciální část 3.1 Cíl práce Mým hlavním cílem bylo provést specifické testy u pacientů s von Willebrandovou chorobou. Jednalo se o vyšetření antigenu (VWF:Ag), stanovení faktoru VIII a vyšetření funkční aktivity VWF (VWF:RCo). Při statistickém zpracování jsem se zaměřila na cut off hodnotu poměrů VWF:CBA/VWF:Ag a VWF:RCo/VWF:Ag, které se v literatuře liší. Snažila jsem se zjistit, která je pro stanovení typů choroby vhodnější. Následně jsem také mezi jednotlivými metodami provedla korelaci. 3.2 Soubor a metodika Zkoumaný soubor tvoří pacienti Oddělení klinické hematologie s již dříve nebo i nově diagnostikovanou VWCH. Pacienti museli splňovat všechna kritéria onemocnění snížená hladina VWF, dědičnost a krvácivé projevy. Stanovení FVIII, VWF:Ag, VWF:RCo byla provedena na Oddělení klinické hematologie ve FN Bohunice Brno. Stejné vzorky se také zaslaly do Belgie do Antwerp University Hospital, kde se podrobily testům VWF:CBA a multimerní analýze, které se z finančních důvodů neprovádí zde, ale k určení typu choroby pacienta jsou nezbytné. Vzorky byly skladovány při - 80 C na suchém ledu. Na základě všech těchto testů a poměrů funkční aktivity ku antigenu (VWF:CBA/VWF:Ag a VWF:RCo/VWF:Ag) došlo k rozlišení typu choroby u postižených pacientů. Každý parametr se ze získaného vzorku vyšetří pouze jednou a pro získání další série parametrů je třeba další vzorek, proto množství získaných parametrů závisí na pacientech, kteří se na smluvené vyšetření dostaví Stanovení FVIII Princip metody Měříme koagulační čas, který závisí na funkční aktivitě FVIII ve vyšetřované plazmě. Test se provádí v přítomnosti reagencie APTT a deficitní plazmy obsahující všechny ostatní koagulační faktory v nadbytku. 26

27 Zjednodušeně probíhá reakce následovně: plazma pacienta + Owren veronalový pufr + APTT reagencie + deficitní plazma inkubace 4 min přidání CaCl 2, který reakci startuje, od jeho přidání se měří čas Odběr materiálu Používáme citrátovou plazmu. Tu získáme odběrem venózním krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1:10. Před analýzou je nutné vzorek centrifugovat 15 min při ot/min, získaná stočená plazma se odebere do Eppendorf zkumavky. Vzorek je třeba zpracovat nejpozději do 2 hodin od odběru, pokud se tak nestane, je možné ho zamrazit při -196 C v tekutém dusíku. Poté se uchovává při -20 C po dobu jednoho měsíce. Před použitím se vzorek vloží do vodní lázně s teplotou 37 C, po rozmrazení se nechá 15 min stabilizovat při laboratorní teplotě Pomůcky, reagencie Použité přístroje a pomůcky: koagulometr STA R centrifuga vodní lázeň automatické pipety spotřební materiál rukavice, špičky, zkumavky atd. Reagencie: PTT Automate 10 jedná se o lyofilizát fosfolipidů z mozku, který se rozpustí v 10 ml Aqua pro inj. a necháme vytemperovat 30 min při laboratorní teplotě. DG FVIII lyofilizovaná lidská plazma obsahující všechny koagulační faktory (kromě FVIII) v konstantním nadbytku. Slouží k určení funkční aktivity FVIII. Obsah se rozpustí v 1 ml Aqua pro inj. a 20 min se temperuje při laboratorní teplotě. STA Unicalibrator plazma určená ke kalibraci FVIII s přesně definovanou hodnotou hladiny FVIII. STA Systém Kontrol N + P normální a patologická (abnormální) citrátová plazma, která je lyofilizovaná a slouží k posouzení správnosti metody na stanovení FVIII. Owren veronalový pufr o ph 7,35 ředící roztok potřebný k ředění vyšetřované, kalibrační a kontrolní plazmy. STA CaCl 2 0,025 M roztok chloridu vápenatého. 27

28 Aqua pro injectione slouží jako rozpouštědlo pro lyofilizované reagencie. Čistící roztok A.L.I. promývací roztok přístroje STA R. STA Desorb U promývací roztok pro náběrové jehly přístroje STA R Kalibrace, kontroly správnosti Provádí se s každou sérií vyšetření za použití manuálně předředěné reagencie STA Unicalibrator. Přístroj si plazmu dál automaticky ředí pomocí Owren veronalového pufru ( 1:1, 1:2, 1:4, 1:4, 1:8, 1:15). Pro jednotlivá ředění se změří koagulační časy v sekundách, ze kterých přístroj sám sestrojí lineární kalibrační křivku - závislost sec. na % FVIII (Obr. č. 9). Po provedené kalibraci se ihned zahájí kontrola správnosti provedené kalibrace. Stanovíme hladiny FVIII pomocí reagencie STA Systém Kontrol N + P a porovnáme je s povoleným rozmezím hladin uvedených v přiloženém letáku reagencií. Obr. č. 9: Znázornění kalibrační křivky při stanovení FVIII Pracovní postup Nejprve je nutné si připravit všechny reagencie a rozmrazit vzorky pacientské plazmy. Do zásuvky přístroje určeného pro reagencie vložíme potřebné reagencie spolu s N+P kontrolou. Přístroj si sám provede kalibraci a automaticky, po potvrzení kalibrace se spustí systém kontrol N+P. 28

29 Do počítače zadáme identifikační čísla vzorků pacientské plazmy. Vzorky v Eppendorf zkumavkách jsou umístěné v adaptérech a vkládáme je do zásuvky pro vzorky. Přístroj sám si vzorky naředí a výsledný čas přepočítá na procenta. Pokud je hodnota FVIII nižší než 10% opakuje se vyšetření s nižším ředěním plazmy. Ředění a přepočet provede přístroj sám. Jestliže hodnota FVIII přesáhne 150% a není požadováno přesné stanovení při zvýšené aktivitě, neudává se konkrétní hodnota, ale pouze >150%. Přístroj je napojen na LIS a laborant provádějící vyšetření kontroluje provedené kalibrace, kontroly a získané výsledky. Konečné zhodnocení a přidání komentáře provádí lékař Technické údaje Přesnost metody: 10% Rozsah měření: sec Rozsah měření: 5 200% Kalibrovaná oblast: % Normální hodnoty: % Interference nejsou známy Stanovení VWF:Ag Princip metody Ke stanovení antigenu využíváme metodu LIA (Obr. č. 10). Suspendované latexové částice s kovalentně navázanou specifickou protilátkou proti VWF se specificky vážou na Ag (= VWF), který je přítomný v testované plazmě. Vazba Pl Ag vede k aglutinaci a vzniku agregátů. Pokud roztokem prochází svazek monochromatického světla, latexové částice bez navázaného Ag absorbují světlo pouze slabě. Částice s navázaným Ag absorbují světlo více, protože mají větší rozměr než vlnová délka světla. Zvýšení absorpce světla měřené při 540 nm, závisí na množství Ag přítomného ve vyšetřované plazmě. 29

30 Obr. č. 10: Znázornění LIA reakce Odběr materiálu Citrátovou plazmu získáme odběrem venózním krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1:10. Před analýzou je nutné vzorek centrifugovat 15 min při ot/min, získanou plazmu umístíme do Eppendorf zkumavky. Vzorek musíme zpracovat nejpozději do 8 hodin od odběru, jinak je nutné ho zamrazit při -196 C v tekutém dusíku. Dále se uchovává při -20 C po dobu jednoho měsíce. Před použitím se vzorek vloží do vodní lázně o teplotě 37 C, poté se nechá 15 min stabilizovat při laboratorní teplotě a je připraven k použití Pomůcky, reagencie Použité přístroje a pomůcky: koagulometr STA R centrifuga vodní lázeň automatické pipety spotřební materiál rukavice, špičky, zkumavky atd. 30

31 Reagencie: reagenční set STA LIATEST VWF obsahuje: Reagent 1: Buffer glycinový pufr. Reagent 2: Latex suspenze mikrolatexových částic se specificky navázanou králičí protilátkou proti lidskému VWF, která je stabilizovaná hovězím albuminem. Reagent 3: Latex Diluent roztok s glycinem pro ředění latexové reagencie. STA LIA VWF Calibrator plazma určená ke kalibraci tohoto testu. Hladina VWF je určena přiloženým letákem. STA Liatest Control N + P lyofilizované plazmy, které mají hladinu VWF definovanou výrobcem a slouží ke kontrole správnosti testu. Owren veronalový pufr, ph 7,35 slouží k ředění vyšetřovaných a kontrolních plazem. Aqua pro injectione slouží jako rozpouštědlo pro lyofilizované reagencie. Čistící roztok A.L.I. promývací roztok přístroje STA R Kalibrace, kontroly správnosti Kalibraci provádíme s každou sérií vyšetření s použitím reagencie STA LIA VWF Calibrator a Owren veronalového pufru, který slouží k ředění kalibrátoru. Jsou změřeny absorbance (OD) jednotlivých ředění a přístrojem vytvořená lineární kalibrační křivka (Obr. č. 11) vyjadřuje závislost OD na % VWF. Ihned poté se automaticky provádí kontroly správnosti kalibrace pomocí STA Liatest Control N + P. 31

32 Obr. č. 11: Znázornění kalibrační křivky při stanovení Ag LIA metodou Pracovní postup Připravíme reagencie dle návodu a ve vodní lázni rozpustíme vzorky pacientů. Po vložení reagencií a N+P kontroly do zásuvky přístroje dojde k automatickému spuštění kalibrace a poté i kontroly správnosti měření. Vzorky v Eppendorf zkumavkách umístíme do adaptérů a po načtení jejich identifikačních čísel dojde ke spuštění reakce. Vzorky jsou automaticky ředěny přístrojem. Koncentrace antigenu ve vzorcích se ukáže na obrazovce přístroje v reálném čase v %. Při hladině nižší než 10% se vyšetření automaticky zopakuje s neředěnou plazmou. Pokud je hladina vyšší než 400% výsledek uvádíme jako VWF > 400% Výsledky měření se automaticky přenáší do LIS a laborant je kontroluje. Konečné zhodnocení provádí lékař Technické údaje Přesnost metody: 10% Rozsah měření: 2 420% Kalibrovaná oblast: 0 105% Normální hodnoty: % Interference o chylózní plazma způsobí snížení Ag 32

33 o revmatoidní faktor zapříčiní zvýšení Ag Stanovení VWF:RCo Princip metody Pro stanovení ristocetin kofaktorové aktivity VWF v plazmě využíváme imunoturbidimetrickou metodou. Měřená kyveta obsahuje zdravé promyté destičky, antibiotikum ristocetin a jako zdroj VWF nám slouží plazma pacienta chudá na destičky. Optická část měřícího přístroje zaznamenává intenzitu světla prošlého v přímém směru (Obr. č. 12). Změna turbidity je způsobená shlukováním krevních destiček. Obr. č. 12: Zjednodušené schéma turbidimetru Odběr materiálu Ke stanovení je třeba odebrat citrátovou plazmu. Odbíráme vzorek venózní krve do zkumavky s citrátem sodným v poměru 1:10. Vzorek je nutné centrifugovat 15 min při ot/min, získaná plazma se odebere do Eppendorf zkumavky. Takto připravený vzorek je třeba zanalyzovat nejpozději do 2 hodin od odběru, jinak je možné ho zamrazit při C v tekutém dusíku. Následně jej uchováváme při -20 C po dobu jednoho měsíce. Před použitím jej vložíme do vodní lázně s teplotou 37 C, poté se stabilizuje 15 min při laboratorní teplotě Pomůcky, reagencie Použité přístroje a pomůcky: koagulometr STA R centrifuga vodní lázeň automatické pipety spotřební materiál rukavice, špičky, zkumavky atd. 33

34 Reagencie: BC von willebrand reagens tato reagencie obsahuje antibiotikum ristocetin a promyté krevní destičky. Standard Human Plazma (SHP) lyofilizát kalibrační plazmy s přesně danou hladinou VWF:RiCo. Pro test se využívá čerstvě připravená SHP. Control Plasma N a P lyofilizát normální a patologické citrátové plazmy. Slouží ke kontrole správnosti metody. Imidazol Buffer pufr připravený k okamžitému použití, slouží k ředění vyšetřované plazmy. Fyziologický roztok Aqua pro injectione Čistící roztok (A.L.I.) Promývací roztok pro přístroj STAR STA Desorb U určený k promývání náběrových jehel Kalibrace, kontroly správnosti Kalibraci provádíme za použití reagencie SHP a to vždy při změně šarže této reagencie. Tuto plazmu si přístroj sám naředí na jednotlivá ředění, u kterých naměří absorbanci (OD). Poté si i sestrojí kalibrační křivku jako závislost OD na % VWF:RCo (Obr. č. 13). Po zkontrolování kalibrace se automaticky spustí kontrola správnosti metody, za použití Control Plasma P. Control Plasma N se vyšetřuje a vkládá jako normální vzorek. Obr. č. 13: Znázornění kalibrační křivky při stanovení VWF:RCo 34

35 Pracovní postup Dle návodu si připravíme reagencie a také rozpustíme vzorky pacientů. Do přístroje vložíme potřebné reagencie a P kontrolu. Přístroj sám si provede kalibraci i kontrolu správnosti. Načteme identifikační čísla vzorků a vložíme je do adaptérů. Manuálně dle léčby a archivu pacienta navolíme použité ředění vzorku. Zahájí se popsaná reakce. Získaná absorbance je automaticky pomocí kalibrační křivky přepočítána na %. Hladiny nižší než 20% se znovu měří s plazmou neředěnou. Hladiny vyšší než 60% se přeměřují znovu s plazmou ředěnou. Získané výsledky kontroluje laborant a přenáší se do LIS. Lékař provede konečné zhodnocení Technické údaje Přesnost metody: 10% Rozsah měření: 1 360% Kalibrovaná oblast: 10 75% Normální hodnoty: % Interference o chylózní plazma vyvolá snížení hodnoty VWF:RCo Přístroj STA R Přístroj od firmy DIAGNOSTICA STAGO (Obr. č. 14) byl použit u všech výše uvedených metod. Reagencie na měření FVIII a VWF:Ag byly použity od stejné firmy, pro stanovení VWF:RCo byly použity reagencie firmy SIEMENS. Jedná se o plně automatizovaný přístroj určený k vyšetřování koagulačních poruch a sledování antikoagulační terapie. Obr. č. 14: Přístroj STA R a detail na náběrový systém 35

36 Při měření na něm se uplatňují následující principy: Koagulační přístroj snímá změny rozkyvu kuličky v kyvetě pomocí indukčního senzoru. Konstantního pohybu kuličky je dosaženo pomocí cívek, které vytváří elektromagnetické pole(obr. č. 15) Obr. č. 15: Cívky v přístroji, tvořící elektromagnetické pole kolem kyvety Jakmile viskozita v kyvetě vzroste, pohyb kuličky se zmenší(obr. č. 16). Tohoto se využívá ke stanovení doby vzniku koagula. Obr. č. 16: Zmenšování pohybu kuličky Fotometrické měří se absorbance monochromatického světla, procházejícího kyvetou. Tento princip se uplatňuje u chromogenních a (imuno)turbidimetrických metod. Světlo procházející kyvetou (I0) je zeslabeno a přidává se k němu tzv. parazitní světlo (Ip). Od detekované intenzity (I1) se musí parazitní světlo odečíst a tím získáme konečnou intenzitu I(Obr. č. 17). 36

37 Obr. č. 17: Změny intenzity při průchodu světla kyvetou Výslednou absorbanci získáme pomocí vzorečku: A = -log ( I/I0) Pomocí Lambert Beerova zákona se převede absorbance na koncentraci: A = Ɛ I c Ɛ = molární koeficient I = délka optické dráhy c = koncentrace analytu Vzorky se vkládají bez víček či zátek a jsou uloženy do kovových nosičů tzv. racků. Na začátku přístroje se nachází čtečka čárového kódu, kde se načítají čárové kódy jednotlivých zkumavek. Reagencie se vkládají do reagenční zásuvky, kde mají přesně určené své místo. Oblast přístroje, kde se měří je temperovaná na 36,5 37,5 C. Plastové reakční kyvety již od výrobce obsahují nerezové kuličky a jsou dopravovány na místo určené pro pipetování. Tři pipetovací jehly v přesném množství dávkují pacientskou plazmu, kalibrátory, kontroly, inkubační a startovací reagencie a každá z nich má svou vlastní oplachovací jamku. Součástí přístroje je také monitor, kde kontrolujeme průběh měření a případné chybové hlášky Stanovení VWF:CBA Provádíme ELISA metodikou (Obr. č. 18), při které zjišťujeme schopnost domény A3 HMW vázat kolagen. Tento test využíváme především pro jeho citlivost na přítomnost HMW. U typů 2A a 2B nacházíme tyto multimery snížené a můžeme je tímto testem odlišit 37

38 od dalších typů choroby. U typu 2M bývá většinou VWF:CBA normální. Test můžeme využít i jako ukazatel vnímavosti pacienta na léčbu DDAVP [3, 4, 10]. Obr. č. 18: Zjednodušené schéma ELISA metody Používají se různé kolagenní preparáty, nejčastěji lyofilizáty kolagenů typu I, II, III a IV nebo jejich směsi. Jako zdroj kolagenu nám slouží především koňské šlachy, lidská placenta, hovězí a telecí kůže. Bylo také prováděno testování různých kolagenních preparátů s cílem zjistit, který je pro stanovení nejvhodnější. Z výzkumů Emmanuela Favalora vyplynulo, že pro detekci HMW multimerů je výhodné použít kolagen typu I nebo směs typů I/III více než lidský preparát typu III a hovězí typu I. Zkoumala se také optimální koncentrace preparátů pro tuto metodiku. Ta se u většiny preparátů pohybovala okolo 50 μg/ml [2, 10] Pracovní postup Byl použit komerční kit TECHNOZYM VWF:CBA ELISA využívající koňský kolagen typu III. Test je založený na schopnosti VWF, obsaženého v pacientské plazmě, vázat se na kolagen, kterým je potažena mikrotitrační deska. Test tedy ukazuje fyziologickou aktivitu a koncentraci VWF. Detekce navázaného VWF se následně děje pomocí enzymatické imunoanalýzy (Obr. č 19). Tento test byl prováděn v Antwerp University Hospital v Belgii. Mikrotitrační destičky, které ke stanovení používáme, jsou již potažené koňským kolagenem typu III. Přidáme vzorek pacientské plazmy, který obsahuje VWF. Ten představuje antigen, který se váže na přítomný kolagen. Promyjeme, pro odstranění nenavázaného VWF. Nastává fáze, ve které přidáváme králičí protilátku značenou enzymem křenovou peroxidázou mířenou proti lidskému VWF. Tato značená protilátka se nazývá konjugát a váže se na komplex Pl Ag vzniklý v první fázi. Desku opět promyjeme. 38