VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ. Diplomová práce. magisterský navazující studijní obor Biomedicínské a ekologické inženýrství

Transkript

1 VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií Ústav biomedicínského inženýrství Diplomová práce magisterský navazující studijní obor Biomedicínské a ekologické inženýrství Student: Bc. Radek Rúbal ID: Ročník: 2 Akademický rok: 2014/2015 NÁZEV TÉMATU: Hodnocení doby života a změn konfokální mikroskopií POKYNY PRO VYPRACOVÁNÍ: 1) Proveďte literární rešerši v oblasti konfokální mikroskopie a využití měření doby života fluorescence v buněčné biologii. 2) Seznamte se s možnosti využití pulsního laditelného laseru (WLL) a funkce řízení doby otevření detektoru (TimeGate). 3) S aplikací WLL, funkce TimeGate a detekce hybridními detektory pořiďte sadu fluorescenčních intenzitních snímků a současně spektrálních snímků živočišné buňky. 4) Navrhněte schéma algoritmu pro zpracování exportovaných dat do výsledné podoby znázorňující spektrální změny současně se změnami v době života fluorescence. Algoritmus bude zahrnovat vytvoření grafické reprezentace a 3D rekonstrukci posunutých spektrálních dat. 5) Realizujte navržený algoritmus v prostředí Matlab. Ve výsledku získejte snímky v různých spektrálních oblastech s vyobrazením doby života fluorescence. K vytvořenému algoritmu vyhotovte grafické uživatelské prostředí. 6) K porovnání využijte výstupy z klasického FLIM systému. Proveďte diskusi. DOPORUČENÁ LITERATURA: [1] LAKOWICZ, Joseph R. Principles in Fluorescence Spectroscopy. 3rd ed. New York: Plenum Press, ISBN-13: [2] GOLDMAN, Robert D., SPECTOR, David L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-13: Termín zadání: Termín odevzdání: Vedoucí práce: Ing. Vratislav Čmiel Konzultanti diplomové práce: prof. Ing. Ivo Provazník, Ph.D. Předseda oborové rady

2 UPOZORNĚNÍ: Autor diplomové práce nesmí při vytváření diplomové práce porušit autorská práva třetích osob, zejména nesmí zasahovat nedovoleným způsobem do cizích autorských práv osobnostních a musí si být plně vědom následků porušení ustanovení 11 a následujících autorského zákona č. 121/2000 Sb., včetně možných trestněprávních důsledků vyplývajících z ustanovení části druhé, hlavy VI. díl 4 Trestního zákoníku č.40/2009 Sb.

3 Abstrakt Práce se zabývá technikami pro zobrazení doby života fluorescence. Doba života fluorescence je počítána z dat získaných pomocí sekvenčního snímání konfokálním mikroskopem Leica-TCS-SP8X. V práci jsou uvedeny algoritmy výpočtu a software pro zobrazení a analýzu doby života fluorescence jak ve 2D tak ve 3D. Na konci jsou postupy použity pro zobrazení doby života fluorescence mezenchymálních buňek a fibroblastů obarvených komplexem SPIO-Rhodamine. Klíčová slova Konfokální mikroskopie, fluorescence, doba života fluorescence, FLIM, SPIO, nanočástice, Leica-TCS-SP8X, bílý laser, pulsní laser, WLL. Abstract Content is focused on fluorescence lifetime imaging techniques. Fluorescence lifetime is computed from data acquired with using of Leica-TCS-SP8X confocal microscope sequential scanning. Algorithms and software for the computation, imaging and analysis of fluorescence lifetime is presented. Software is allowing both 2D and 3D imaging of fluorescence lifetime. Techniques are used for fluorescence lifetime imaging of mesenchymal cells and fibroblasts tainted with SPIO-Rhodamin complex. Keywords Confocal microscopy, fluorescence, fluorescence lifetime, FLIM, SPIO, nanoparticles, Leica-TCS-SP8X, white light laser, pulsed laser, WLL.

4 Bibliografická citace RÚBAL, R. Hodnocení doby života a změn konfokální mikroskopií. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií, s. Vedoucí diplomové práce Ing. Vratislav Čmiel

5 Prohlášení Prohlašuji, že svou semestrální práci na téma Měření Hodnocení doby života a změn konfokální mikroskopií jsem vypracoval samostatně pod vedením vedoucího semestrální práce a s použitím odborné literatury a dalších informačních zdrojů, které jsou všechny citovány v práci a uvedeny v seznamu literatury na konci práce. Jako autor uvedené semestrální práce dále prohlašuji, že v souvislosti s vytvořením této semestrální práce jsem neporušil autorská práva třetích osob, zejména jsem nezasáhl nedovoleným způsobem do cizích autorských práv osobnostních a jsem si plně vědom následků porušení ustanovení 11 a následujících autorského zákona č. 121/2000 Sb., včetně možných trestněprávních důsledků vyplývajících z ustanovení části druhé, hlavy VI. díl 4 Trestního zákoníku č. 40/2009 Sb. V Brně dne: 22. května 2015 podpis autora

6 Poděkování Děkuji vedoucím semestrální práce Ing. Vratislavu Čmielovi za účinnou metodickou, pedagogickou a odbornou pomoc a další cenné rady při zpracování mé diplomové práce. V Brně dne: 22. května 2015 podpis autora

7 Obsah Obsah Úvod Principy konfokální mikroskopie Lasery pro konfokální mikroskopii Dělení světelného paprsku Optický systém, zaměření na souřadnice Detektory Fotonásobič, lavinová fotodioda Hybridní detektory Fluorescence Nanočástice Možnosti snímání a zobrazení dat Zpracování dat pro zobrazení spektrálních změn Zpracování dat pro zobrazení doby života fluorescence Porovnání s prahovou hodnotou Výpočet směrnice Programové řešení Načtení a zobrazení vstupních dat Základní funkce pro práci se snímky Výpočet pro zobrazení doby života fluorescence Zobrazení doby života fluorescence ve 2D Funkce pro analýzu snímků ve 2D Zobrazení doby života fluorescence ve 3D Uložení výsledků a export snímků Výsledky praktického měření Diskuze Závěr... 71

8 13. Literatura... 72

9 1. Úvod Fluorescenční mikroskopie je velmi dobrý nástroj pro zobrazování specificky značených struktur v komplexním prostředí a podává informaci o jejich uspořádání v trojrozměrném prostoru. Použitím konfokálního mikroskopu je získán obraz s podstatně lepším prostorovým rozlišením díky potlačení světla ze struktur mimo optické ohnisko. Nanotechnologie, i přes svá rizika, jsou v dnešní době velmi populární. K fluorescenčním barvivům jsou stále častěji používány nanomateriály. Mimo selektivní zobrazení struktur je možné pozorovat jejich schopnost do struktur pronikat a kumulovat se v různých oblastech. Železité nanočástice SPIO jsou využívány jako kontrastní látka pro MRI. Pomocí těchto částic je možné selektivně značit transplantované buňky. K železitým nanočásticím lze připojit fluorofor, například GFP nebo rhodamin a částice zobrazit také konfokálním mikroskopem. Tímto způsobem je možné hodnotit kde a kolik se v buňce částic nachází a zdali jsou bezpečně lokalizované. Nanočástice v buňce jsou však často atakovány enzymy a jinými metabolickými sítěmi buňky a ty mohou způsobit změny intenzity fluorescence rhodaminu za dělší časové období. Doba života fluorescence a její změny podávají dodatečné informace o vnitřním prostředí. Vhodným zobrazením nám mohou podat komplexnější a přesnější informace o složení, chemických vlastnostech a vnitřním uspořádání zkoumaného vzorku. Příčiny a přesná charakteristika změn doby života fluorescene ke kterým dochází, nejsou vždy zcela popsány. Nástroje umožňující zobrazení doby života fluorescence tak otevírají další možnosti v analýze vzorků. 9

10 2. Principy konfokální mikroskopie Optický systém konfokálního mikroskopu je navržen tak, aby eliminoval, nebo alespoň podstatně potlačil světlo přicházející z míst mimo optické ohnisko. Umožňuje snímání jednotlivých oblastí zkoumaného vzorku. Vhodnou úpravou získaných dat pomocí softwaru je pak možné zrekonstruovat 3D model celého vzorku a zobrazit řez libovolnou rovinou. Výsledné snímky dosahují podstatně lepšího kontrastu i rozlišení v porovnání s klasickým optickým mikroskopem. Vzorky je navíc možné pozorovat do hloubky i několika mm. Jednoduché schéma skenovacího konfokálního mikroskopu je znázorněno na Obr. 1. Zdrojem intenzivního bodového světla je zpravidla laser. Úzký laserový paprsek Obr. 1 Schéma konfokálního mikroskopu je veden odrazem od dichromatického a skenovacího zrcadla k objektivu, který jej zaměřuje na určitý bod vzorku. U reálného objektivu se paralelní laserové paprsky nikdy neprotnou v jednom bodě. Minimální velikost oblasti, ve které se paprsky protínají, záleží na kvalitě objektivu a šířce laserového svazku. Minimální velikost této oblasti společně s vlnovou délkou laseru určují limitní prostorovou rozlišovací schopnost mikroskopu. Souřadnice x, y jsou vybírány pomocí skenovacího zrcadla, jednotlivé řezy v ose z jsou zaměřovány systémem čoček objektivu. V zaměřeném bodě je excitován fluorofor, který následně fluoreskuje a emituje světlo o jiné vlnové délce. Emitované světlo je vedeno zpět přes objektiv a systém zrcadel, prochází skrz dichromatické zrcadlo směrem k detektoru. Před detektorem je clonka, úzká štěrbina, která filtruje světlo přicházející z míst mimo optické ohnisko. Detekovaný signál dává informaci jednoho pixelu, respektive voxelu. Výsledný obraz je snímán bod po bodu. Takové skenování je 10

11 značně zdlouhavé. V následujících kapitolách budou podrobněji popsány jednotlivé části a dokonalejší způsoby snímání Lasery pro konfokální mikroskopii Zdroj světla pro konfokální mikroskop musí splňovat řadu parametrů. Důležitý je především jeho jas, stabilita, přesnost zaměření a vlnová délka. Jak přesně je možné zdroj světla zaměřit je nejdůležitější parametr. Snahou je zaměřit světlo do co nejmenší oblasti tak, aby bylo rozlišení snímku omezeno pouze difrakčním limitem. Plošné všesměrové zdroje světla v tomto případě nelze použít, protože je bodově zaměřit nelze. Případné použití clonky, malé štěrbiny, která by imitovala bodový zdroj, vede k velkým ztrátám s ohledem na všesměrovost tohoto zdroje a omezenou velikost čočky objektivu. Kvalitní lasery generují paralelní paprsky s minimální rozbíhavostí. Takový zdroj světla lze snadno zaměřit do jednoho bodu, protože všechny paprsky se protnou v ohnisku. Vhodný profil laserového paprsku, TEM 00 (Transversal electromagnetic mode) je na Obr. 2. Obr. 2 Některé příčné módy, profily emitovaného svazku laseru. Zdroj [1] U zdroje světla je důležitá především intenzita záření, která nám dává představu o zářivém toku na jednotku plochy. Celkový zářivý tok u laserů může být řádově v mw, a přesto dosahují vysoké intenzity záření, protože je veškerá energie soustředěna pouze z malé plochy. Intenzita záření musí být stabilní po dlouhou dobu, abychom mohli při daném nastavení laseru opakovaně realizovat danou intenzitu a tak zajistit opakovatelné podmínky pro snímky vytvořené v různých dnech. Stejně tak musí být stabilní tvar a směr paprsku. 11

12 Klasické lasery, ať už to jsou plynné lasery, lasery pevné fáze, nebo diodové lasery, emitují pouze jednu vlnovou délku a pro různá barviva je tak potřeba více jejich druhů kombinovat. Nejnovějším typem laserů, které stále více pronikají do konfokální mikroskopie, jsou vláknové lasery. Barvu laseru je nutné volit s ohledem na fluorofor. Snahou je používat delší vlnové délky, protože pronikají hlouběji do tkání. Většina používaných laserů jsou pulzní lasery, které jsou vhodné také pro FLIM. Krátké pulzy trvají řádově femtosekundy a dosahují výkonu až 10W. Díky vyššímu výkonu laseru je možné dosáhnout lepšího kontrastu ve snímcích. Krátké impulzy zajišťují, že průměrná použitá energie je malá a laser nezpůsobí poškození snímaného vzorku. Ideálně by měla být vlnová délka laseru pro konfokální mikroskopii libovolně laditelná. Toho je možné dosáhnout pomocí WLL (white light laser), neboli bílého laseru a akusto-optického děliče, který je popsán v kapitole 2.2 WLL je zdroj světla složeného ze široké škály vlnových délek, které je možné zaměřit jako laser. Základem WLL je vláknový IR laser, jehož výstup je veden přes vláknový zesilovač a následně fotonické krystalové vlákno, jak je znázorněno na Obr. 3. Ve fotonickém krystalovém vláknu nastávají procesy, při kterých se monochromatické světlo rozprostře do široké škály vlnových délek. Obr. 3 Schéma bílého laseru. Řez fotonickým krystalovým vláknem vlevo. Zdroj[6] Pomocí akusto-optického děliče je možné z výstupního paprsku oddělit požadované vlnové délky k excitaci, standardně 8 vlnových délek současně, v závislosti na použitém barvivu Dělení světelného paprsku Světlo excitující vzorek je přivedeno ve směru optické osy a stejnou cestou se vrací emitované světlo směrem k detektoru. Nezbytností je zařízení, které umožní osvětlovat vzorek a zároveň propouštět světlo k detektoru. Nejjednodušším řešením by bylo polopropustné zrcadlo, které 50% světla propustí a odrazí. Ztráta poloviny signálu je ale nepřijatelná. Existují však i polopropustná zrcadla 12

13 s jiným poměrem odraženého a propuštěného světla, která umožňují získat obvykle 80% emitovaného světla. Mnohem propracovanější metodou je použití dichromatického zrcadla, které je v podstatě speciálním interferenčním filtrem. Zrcadlo je složeno z velmi tenkých (vlnová délka nebo polovina vlnové délky), průhledných vrstev o různém indexu lomu, které se pravidelně střídají. V závislosti na síle vrstev a materiálu dochází ke konstruktivní interferenci světla vybrané vlnové délky a k jeho průchodu zrcadlem. V případě destruktivní interference je světlo odraženo. Podle konstrukce, excitačního a emisního spektra, jsou interferenční filtry schopné odrazit více než 90% a propustit zpravidla více než 85% světla. Na Obr. 4 je pro lepší představu uvedena spektrální charakteristika dichromatického zrcadla. Filtry jsou popsány svou spektrální charakteristikou. Udává se také hraniční vlnová délka, při které je 50% světla odraženo a propuštěno. Dnes jsou na trhu zcela běžně dostupné a lze si vybrat odpovídající filtr nejen pro jeden daný fluorofor, ale existují i vícepásmové filtry pro až 4 různá pásma. I přes tyto vlastnosti mají dichromatická zrcadla svá omezení, protože jsou vždy navržena pouze pro neměnná pásma. Pro víceparametrické zobrazení a použití v kombinaci s WLL nejsou dostatečná. V kombinaci s WLL se používá akusticko optický dělič paprsku. Jedná se o optický krystal. V jeho krystalické mřížce dochází ke konstruktivní interferenci a odrazu vlnové délky, pokud je srovnatelná se vzdáleností atomů v krystalické mřížce v souladu s Braggovým zákonem (1) do difrakčního maxima 1. řádu [7]. n celé kladné číslo λ vlnové délka světla d vzdálenost rovin v krystalické mřížce φ úhel dopadu světla na rovinu krystalu Buzením krystalu ultrazvukem, mechanickou vlnou řádově ve stovkách MHz, dochází v krystalu ke vzniku míst s vyšší a nižší hustotou a perioda mechanické vlny tak určuje vzdálenost d. Změnou budící frekvence je tak možné měnit vlnovou délku odraženého světla. Superpozicí různých frekvencí ultrazvuku navíc můžeme vybírat i více vlnových délek světla najednou. Naopak světlo dopadající na krystal ze směru interferenčního maxima 1. řádu vyhovující rovnici (1) je odraženo ve směru optické osy. Na Obr. 5 je tato funkce znázorněna. Pomocí akusto optického filtru je ze svazku WLL vybráno světlo požadovaného spektra pro excitaci vzorku. Následně je přes akusticko optický dělič paprsku vedeno ke vzorku, přičemž emitované světlo rozdílných vlnových délek je propuštěno k detektoru. Oba dva krystaly jsou řízeny mechanickým vlněním. 13

14 Obr. 4 Příklad spektrální charakteristiky dichromatického zrcadla 50% při 490nm. Zdroj[2] Obr. 5 Výběr vlnových délek a dělení paprsku pomocí optického krystalu buzeného ultrazvukem. Zdroj [6] Optický systém, zaměření na souřadnice Celkový obraz je získán skenováním jednotlivých pixelů. Každý pixel je třeba zvlášť zaměřit a to v dostatečně krátkém čase. Excitační světlo o vybrané vlnové délce je přiváděno k objektivu, který jej soustřeďuje do ohniska. Naklápěním zrcadel je nastavován úhel, pod kterým světlo dopadá na objektiv. Tím je nastavována souřadnice 14

15 v rovině x,y. Posunem objektivu, případně vzorku, je možné snímat jednotlivé řezy v ose y. Světlo je stejnou cestou přiváděno zpět k detektorům. Emitované světlo může obsahovat různé vlnové délky a je vhodné provést spektrální detekci. Jedním z výhodných přístupů jak toho dosáhnout, je použití hranolu k rozkladu světla a následně systému štěrbin a zrcadel, jak je zobrazeno na Obr. 6. Systém minimálně zeslabuje přicházející signál a umožňuje oddělenou detekci požadovaných částí spektra. Obr. 6 Spektrální detekce. Rozdělení paprsku hranolem, systémem zrcadel a štěrbin k detektorům. Zdroj [8] Jednotlivé detektory mohou mít různá zesílení. Detektory mohou být fotonásobiče, případě hybridní detektory, které jsou popsány v kapitole Detektory V konfokální mikroskopii lze pro záznam světla použít různé druhy fotodetektorů. Mohou to být fotonásobiče, fotodiody, CCD detektory nebo hybridní detektory. Při výběru detektoru je důležité brát v úvahu jeho parametry, kterými jsou především spektrální citlivost, kvantová účinnost, prostorové rozlišení, uniformita, poměr signál/šum, dynamický rozsah a také odezva. Spektrální citlivost je důležitý parametr, který vyjadřuje velikost signálu v závislosti na vlnové délce dopadajícího světla. Obvykle je vyjádřena v podobě kvantové účinnosti, procentem detekovaných fotonů z jejich dopadeného množství. Uniformita bývá vyjádřena několika různými parametry včetně změn zesílení a velikosti šumu v závislosti na místě a směru dopadu. Limitní prostorové rozlišení je dáno minimální vzdáleností dvou bodů s vysokým kontrastem, ve které jsme je schopni ještě rozlišit. Rozlišení bodů s menším kontrastem je obtížnější. Lepší přehled o prostorovém rozlišení detektoru nám může dát modulační přenosová funkce (MTF) a kontrastní přenosová funkce (CTF). 15

16 Poměr signál/šum nám dává informaci o proměnlivosti signálu a tím o přesnosti, s jakou jsme schopni určit velikost signálu. Existuje řada zdrojů šumu. Světlo má svůj vlastní šum způsobený svou částicovou povahou. Fotony dopadající náhodně v různých intervalech způsobují kvantový šum. V elektronických zařízeních je vždy přítomen tepelný šum, který lze částečně omezit snížením teploty. Zesílení detektoru, např. fotonásobiče, by proto mělo být dostatečně velké, aby vstupní signál do zesilovače byl vyšší než jeho vstupní šum. Dynamický rozsah je odvozen od maximálního a minimálního jasu, který je detektor schopen zaznamenat v daném zorném poli. Odezva detektoru je definována jako čas, za který jeho výstup dosáhne 90% ustálené hodnoty. Obecně se někdy u detektorů udává časová konstanta Fotonásobič, lavinová fotodioda Schéma konstrukce fotonásobiče je znázorněno na Obr. 7. Je tvořen vakuovou trubicí s okénkem ze skla, případně křemenného skla pokrývajícího fotokatodu. Následuje řetězec elektronových násobičů nazývaných dynody. Elektrický obvod je uzavřen anodou. Proud tekoucí mezi anodou a zemí je přímo úměrný proudu fotoelektronů generovaných fotokatodou v důsledku dopadu fotonů. Obr. 7 Schéma fotonásobiče. Zdroj [4] Spektrální citlivost je dána především materiálem fotokatody, kterým bývají alkalické kovy nebo polovodiče. Fotokatody jsou dobře citlivé na ultrafialové záření od 200nm a také na viditelné spektrum. Jejich citlivost na delší vlnové délky v infračervené oblasti značně klesá. Zesílení fotonásobičů se může kus od kusu lišit. V případě vystavení vysokým intenzitám záření se velmi pomalu zotavují a mohou být i nevratně poškozeny. Zesílení fotonásobičů může být velmi vysoké a já závislé na aplikovaném napětí a počtu 16

17 dynod. Při použití dynod může být kolem 10 milionů. Jejich kvantová účinnost je však velmi nízká. Detekují většinou méně než 30% dopadů fotonů vlnových délek, na které jsou nejcitlivější. To znamená, že více než 70% fotonů dopadených na fotokatodu nezpůsobí vznik fotoelektronu a není tedy zaznamenáno. Pracovní šířka pásma fotonásobiče může být až 1,5GHz, běžnější je však hodnota kolem 100MHz. Šum fotonásobiče je primárně součtem kvantového šumu a šumu způsobeného tepelným šumem, který náhodně generuje elektrony na dynodách. Částečně přispívá také unikající proud mezi dynodami a zemí. Sekundárními zdroji může být kosmické záření a jakékoliv vysokoenergetické záření z vnějších zdrojů. Jediný elektron dopadený na dynodu, bez ohledu na zdroj, může způsobit generaci elektronů z dalších dynod, což vede k multiplikativní chybě. I přesto dosahuje šum fotonásobičů velmi nízkých hodnot. Jejich dynamický rozsah je obvykle 8 bitů, 256 odstínů šedi. Fotonásobiče jsou použitelné především pro nízké hodnoty osvětlení se slabě emitujícími fluorofory. Lavinové fotodiody využívají vnitřního fotoelektrického jevu. Jejich zesílení v závislosti na přiloženém reverzním napětí dosahuje obvykle 50 až 200, některé druhy více než 1000, ve speciálních případech při použití v takzvaném Geigerově režimu až Spektrální citlivost dosahuje vysokých hodnot i u dlouhých vlnových délek infračerveného záření a mají podstatně vyšší kvantovou účinnost, typicky 60-80%. Obvykle mají delší odezvu než fotonásobiče a vyšší šum Hybridní detektory Hybridní detektory jsou kombinací fotonásobiče a lavinové fotodiody. Schéma hybridního detektoru je na Obr. 8. Dopadající foton je na fotokatodě přeměněn na elektron a urychlován vysokým napětím směrem k lavinové fotodiodě. Celý detektor má vyšší kvantovou účinnost a kratší dobu odezvy než samotný fotonásobič. Dosahuje také lepšího poměru signál/šum, především díky absenci dynod. Lavinová fotodioda zajišťuje dostatečné zesílení. Především díky rychlosti odezvy jsou hybridní detektory vhodné k detekci jednotlivých fotonů i u vyšších intenzit. Další nespornou výhodou těchto detektorů je možné použití funkce TimaGate. U konvenční mikroskopie je běžné blokovat excitační světlo pomocí filtrů. V případě excitace pulzním laserem v kombinaci s hybridními 17

18 Obr. 8 Hybridní detektor Leica microsystems. Zdroj [9] detektory je možné odstranit excitační světlo a také světlo z pozadí použitím vhodného časového okna, ve kterém budeme snímat. Tento způsob detekce je vidět z grafu na Obr. 9. Umožňuje používat barviva, kde je rozdíl excitačního spektra od emisního minimální a přitom nedochází ke zkreslení signálu. Obr. 9 Volba časového okna detekce 18

19 3. Fluorescence Většina dnešní mikroskopie využívá fluorescenci a to především kvůli zvýšení kontrastu oproti klasickému zobrazení v průchozím světle a zvýraznění specifických částí. Umožňuje také kvantitativní měření. Mimo jiné je vhodná pro zobrazení živých buněk. Fluorescence patří do skupiny luminiscenčních jevů. Jejich společnou vlastností je emise světla při přechodu elektronů z excitovaných energetických stavů do stavů základních. Do excitovaného stavu se může elektron dostat například absorpcí světla, mechanickým třením nebo chemickou reakcí. Luminiscence způsobená excitací molekul světlem nebo ultrafialovým zářením se nazývá fotoluminiscence, která je formálně rozdělena do dvou kategorií, fluorescence a fosforescence. Fluorescence je děj, při kterém část atomů a molekul látky absorbuje světlo určité vlnové délky a v důsledku toho emituje světlo o delší vlnové délce za krátký časový interval, kterému se říká doba života fluorescence. Fosforescence je velmi podobně vznikající děj, avšak jeho doba života je podstatně delší. V procesu fluorescence jsou tři důležité děje, které mají řádově rozdílné doby trvání. Excitace molekuly, přesun elektronu do vyššího orbitalu a absorpce fotonu trvá řádově femtosekundy (10-15 s). Pro představu světlo za tento čas urazí asi 0,3µm. Přechod na nejnižší energetickou hladin excitovaného stavu trvá řádově pikosekundy (10-12 s). V této fázi je rozptýleno určité množství tepla, takže dochází ke ztrátě energie. Konečný proces emise fotonu o delší vlnové délce a návrat do základní energetické hladiny trvá řádově nanosekundy (10-9 s). Celý proces je možné znázornit pomocí Jablonskiho energetického diagramu na Obr. 15. Energetické hladiny elektronů S 0, S 1, S 2 jsou znázorněny silnějšími čarami a jsou rozděleny ještě na několik vibračních stavů. 19

20 Obr. 10 Jablonskiho energetický diagram. Zdroj [3] Obvykle měříme excitační spektrum, které bývá shodné s absorpčním spektrem, a emisní spektrum. Rozdíl maxim jejich vlnových délek se nazývá Stokesův posuv. Intenzita záření fluorescence je přímo úměrná množství absorbovaného záření a kvantové účinnosti fluoroforu, leze ji vyjádřit rovnicí (3). Množství absorbovaného záření vychází z Lambert-Beerova zákona. Kvantová účinnost fluoroforu je definována jako poměr emitovaných fotonů k absorbovaným (2). Kvantová účinnost je vždy menší než jedna a pro nefluorescenční látky je rovna nule. F intenzita fluorescence I 0 ε λ c l Intenzita excitačního záření molární absorpční koeficient (koeficient extinkce) molární koncentrace fluorescenčního barviva délka absorpční vrstvy (tloušťka snímané vrstvy) Pokud je absorbováno méně než 2% excitační energie, lze rovnici (3) aproximovat rovnicí (4). k konstanta úměrnosti Kvantová účinnost a molární absorpční koeficient, který je závislý na vlnové délce, jsou čistě materiálové konstanty a záleží na použitém fluoroforu. Intenzita záření daného 20

21 fluorescenčního barviva je přímo úměrná jeho koncentraci v místě, pokud je intenzita excitačního záření konstantní. Různé procesy mohou vést ke snížení intenzity fluorescence. Jedním jsou interakce fluoroforu s molekulami okolního prostředí, takzvaný quenching. Interakce mohou nastávat také mezi vlastními molekulami fluoroforu, takzvaný self-quenching. Při vysokých koncentracích fluorescenčního barviva proto dochází naopak ke snížení intenzity fluorescence. Tento děj není destruktivní, dochází pouze k přeměnám energie jiným, než k emisi fotonu. Dalším procesem je fotobleaching. Bylo popsáno mnoho fotochemických reakcí, které fotobleaching způsobují. Například vznikající reaktivní formy kyslíku a částečně také atomární kyslík, způsobují destrukci fluorescenčních barviv. S časem dochází k nevratnému snížení intenzity fluorescence. Velikost těchto změn podstatně záleží na době expozice a intenzitě excitačního světla. 21

22 4. Nanočástice Nanočástice mají velikost, jak napovídá název, od několika nanometrů až po stovky nanometrů. Velikost je srovnatelná například s velikostí molekul proteinů, DNA, tuků a s velikostí virů. Jejich velikost jim umožňuje pronikat také do intracelulárního prostředí a právě tento druh nanočástic se používá v mikroskopii. Nanočástice mají mnohem větší povrch ve srovnání s většími částicemi a podstatně se mění jejich fyzikální a chemické vlastnosti. V konfokální mikroskopii jsou používány především pro zvýšení přesnosti zobrazení struktur a zvýšení kontrastu. Nanočástice jsou vystavěny z jednotlivých atomů či molekul podle předem daných pravidel. V současné době jsou používány především kovové nanočástice zlaté, stříbrné, železité, zinkové a nekovové uhlíkové. Povrch nanočástic se upravuje různými způsoby, například aby pronikaly selektivně do určitého typu buněk. Železité nanočástice SPIO (superparamagnetic iron oxide) vykazují superparamagnetizmus a jednodoménovost, proto jsou využívány jako kontrastní látka pro MRI. Pomocí těchto částic je možné selektivně značit transplantované buňky. K železitým nanočásticím lze připojit fluorofor, například GFP nebo rhodamin a částice zobrazit také konfokálním mikroskopem. Tímto způsobem je možné hodnotit kde a kolik se v buňce částic nachází a zdali jsou bezpečně lokalizované. Nanočástice v buňce jsou však často atakovány enzymy a jinými metabolickými sítěmi buňky a ty mohou způsobit spektrální změny a změny intenzity fluorescence rhodaminu za dělší časové období. 22

23 5. Možnosti snímání a zobrazení dat Základním zobrazením je intenzitní snímek v určité části spektra. Aplikací různých algoritmů lze naměřená data zobrazit rozličnými způsoby. Možnost excitace vybranou vlnovou délkou světla pomocí laditelného WLL a zároveň možnost detekce a kvantifikace intenzity fluorescence vzorku ve velmi úzkých intervalech vlnových délek umožňuje konturovat dvourozměrné nebo jednorozměrné excitačně emisní spektrogramy. Tyto automatizované analýzy se v konfokálních mikroskopech Leica nazývají jako lambda sken. Výsledkem je 2D graf (tj. histogram emisní křivky při zvolené pevné excitaci) případně 3D graf (sada histogramů pro několik excitačních vlnových délek), kde vrstevnicová nebo prostorová vizualizace umožňuje identifikaci maxim jednotlivých barviv. Na Obr. 10 je zobrazeno excitační spektrum (modře) a emisní spektrum s vyznačenými spektrálními okny pro jednotlivé detektory tvořící společně λ sken. Na Obr. 11 jsou potom zobrazeny čtyři intenzitní snímky pro čtyři různé spektrální oblasti v jednom časovém okně. Obr. 11 Graf λ skenu. Intenzita[libovolné jednotky], vlnová délka[nm]. Zdroj[11]. Obr. 12 Intenzitní snímky v jednom časovém okně pro různé λ 23

24 Příklad 3D zobrazení λ skenu je na Obr. 13. Intenzita na dané vlnové délce je vyjádřena barevně a také výškou v ose y. Obr. 13 3D λ sken. Emise, Excitace. Zdroj [6] Po excitaci intenzita emitovaného záření fluorescenčního barviva, která je přímo úměrná počtu excitovaných atomů či molekul, exponenciálně klesá s časem. Na rozdíl od intenzity samotné, rychlost jejího poklesu nezávisí na počtu excitovaných částic, ale především na typu fluorescenčního barviva a parametrech prostředí. Doba života fluorescence dává dodatečné informace o snímaném vzorku. Podobně jako mnoho dalších přírodních procesů lze modelovat vývoj intenzity rovnicí (5). Konstantu β lze rozepsat podle rovnice (6) a časová konstanta je námi hledaná doba života fluorescence, která značí čas poklesu na přibližně 36,79% I 0. Časová konstanta τ, doba života fluorescence, je znázorněna na Obr. 14. t I(t) I 0 β čas Intenzita v čase t Intenzita těsně po odeznění excitace záporná konstanta reprezentující rychlost poklesu intenzity τ časová konstanta, doba života fluorescence 24

25 Obr. 14 Vyjádření doby života fluorescence. Snímáním vývoje intenzity fluorescence v čase v jednom určitém intervalu vlnových délek získáme vývoj intenzity přibližující se exponenciální funkci (5). Na Obr. 15 je vybrána oblast intenzitního snímku buněk po excitačním impulzu. Na Obr. 16 je poté vyobrazen vývoj intenzity v čase vybrané oblasti. Obr. 15 Intenzitní snímek fluorescence těsně po excitačním impulzu 25

26 Obr. 16 Vývoj intenzity vybrané oblasti v čase. Doba života fluorescence je charakteristická pro daný fluorofor. Dobu života však může výrazně ovlivnit okolí floroforu, například kontakt s polární kapalinou, nebo ph prostředí a jiné chemické faktory. Mimo to lze hodnotit změnu doby života fluorescence v čase případně je možné vytvořit 3D model sledovaného objektu. 26

27 6. Zpracování dat pro zobrazení spektrálních změn Obecný charakter dat pro zpracování a následné zobrazení spektrálních změn je popsaný v kapitole 6 a příklad snímků je na Obr. 16. Podrobný popis dat je uveden v kapitole 9.5. K získání dat je použito skenovacího módu xyλ mikroskopu Leica-TCS-SP8X. Výstupem je sada spektrálních snímků určité oblasti vlnových délek. Oblast vlnových délek je rovnoměrně rozdělena na dílčí oblasti o stejné šířce. Každý snímek vyjadřuje intenzitu na vlnových délkách jedné dílčí oblasti. Sada snímků charakterizuje jednu rovinu xy. Za účelem hodnocení spektrálních změn je v programu funkce, která počítá histogram emisní křivky vybrané oblasti xy a umožňuje jeho zobrazení. Blokové schéma funkce je na Obr. 17. Příklad použití funkce v GUI je blíže popsán v kapitole 9.5 Obr. 17 Blokové schéma funkce pro výpočet emisního spektra oblasti V prvním části jsou načteny všechny spektrální snímky zvoleného řezu. Následně je spočtena suma vybrané oblasti xy zvlášť pro každý spektrální snímek. Výsledky sumací jsou průběžně ukládány a nakonec zobrazeny do grafu. Vykreslený graf je v podstatě histogram a vyjadřuje sumu intenzity vybrané oblasti v závislosti na snímku respektive na intervalu vlnových délek. Histogram je vyjádřen křivkou. V průběhu práce bylo zjištěno, že ke spektrálním změnám ve snímcích nedochází a po dohodě s vedoucím byla práce zaměřena na dobu života fluorescence. Zpracování spektrálních změn je tak možné pouze pomocí tohoto základního nástroje prezentovaného dále v kapitole

28 7. Zpracování dat pro zobrazení doby života fluorescence Snímky pro zpracování jsou získávány pomocí konfokálního mikroskopu Leica-TCS-SP8X. Software k tomuto mikroskopu neumožňuje zobrazení doby života fluorescence. Existují moduly, které takovéto zobrazení umožňují, jejich cena je však poměrně vysoká. Použitý typ mikroskopu neumožňuje přímé měření jedné exponenciály, protože není dostatečně rychlý. Pro získání vzorků exponenciály se proto používá sekvenční snímání ve skenovacím módu xyz. Sekvenční snímání je znázorněno na Obr. 18. Obr. 18 Sekvenční snímání jednoho pixelu Po excitaci laserovým pulsem je emise detekována v časovém okně, kterému lze nastavit minimální šířku 3,5ns. Toto okno se posouvá v čase např. s krokem 1ns vzhledem k excitačnímu impulsu laseru. Na Obr. 19. je vidět následné seřazení hodnot získaných pro jeden pixel. Výška sloupce odpovídá změřené hodnotě a je ovlivněna hodnotami v celé šířce detekčního okna. Ve výsledku by takto seřazené hodnoty měly dostatečně přesně sledovat exponenciální pokles intenzity po jednom excitačním impulzu. Obr. 19 Seřazení hodnot získaných sekvenční snímáním 28

29 Obvykle se nejdříve nasnímá celá rovina a až následně dojde k posunu časového okna a opětovnému nasnímání celé roviny. Výstupní snímky, které byly popsány v kapitole 5, tak ve skutečnosti nenásledují po sobě, ale jsou takto pouze seřazeny. Snímání tímto způsobem je poměrně zdlouhavé. Pokud je potřeba nasnímat vzorek ve více rovinách, může měření probíhat i desítky minut s ohledem na požadované rozlišení. Z tohoto důvodu a také kvůli sekvenčnímu snímání měření není metoda příliš vhodná pro pohyblivé vzorky. Výstupní snímky jsou charakterizovány, jak již bylo zmíněno, především dobou otevření detektoru, respektive šířkou časového detekčního okna a krokem, se kterým se toto okno posunuje vzhledem k excitačnímu impulzu. Důležitým parametrem je také rozlišení v rovině xy a ve směru osy z. Pro zpracování dat k zobrazení doby života fluorescence byly navrženy dvě různé metody. Metody se liší především dobou výpočtu a přesností výsledných dat Porovnání s prahovou hodnotou Metoda vychází ze skutečnosti, že časová konstanta exponenciální funkce je čas, za který intenzita poklesne na počáteční hodnoty, jak je znázorněno na Obr. 16. Funkci, která využívá této vlastnosti exponenciální funkce, lze najít v přiloženém souboru mygui.m pod názvem ctauc. S touto funkcí pracuje GUI, které je popsánov kapitole 6. Blokové schéma funkce je vidět na Obr. 20. Obr. 20 Blokové schéma funkce Vstupem do funkce je vývoj jedné roviny v čase, jak je znázorněno na Obr. 14. Jedná se tedy o sadu šedotónových snímků, trojrozměrnou matici. Dalšími dvěma vstupy jsou numerické hodnoty vyjadřující šířku detekčního okna a časový krok. Hodnoty šedotónových snímků se předpokládají v rozsahu Každý pixel s hodnotou dva a menší je v prvním kroku vynulován. Tyto hodnoty jsou považovány za šum a dále se s nimi nepracuje. Pro výpočet je vytvořena 2D logická maska z prvního snímku. Tato maska říká, které pixely ve snímku nejsou nulové. 29

30 Následně je vytvořena prahová 2D matice jako 1/e násobek prvního snímku. Tato matice určuje prahovou hodnotu pro jednotlivé pixely. Snímky se prochází tak, jak jsou řazeny v čase, tedy od nejsvětlejšího po nejtmavší. Za použití logického indexování je každý snímek porovnán s prahovou maticí. Na pozicích, které jsou zjištěny jako podprahové a které zároveň nebyly zjištěny jako podprahové v předchozím kroku, je ve výsledné matici doby života fluorescence zapsán index snímku aktuálně porovnávaného snímku. Výsledná matice doby života fluorescence je na konci upravena pomocí šířky detekčního okna a kroku tak, aby hodnoty odpovídaly době života fluorescence, nikoliv indexům snímků. Upravená matice je poté funkcí vrácena. Velkou výhodou metody je nenáročnost výpočtu díky logickému indexování. Výsledná data je však potřeba dobře interpretovat. V měřených vzorcích se doba života fluorescence pohybuje řádově v jednotkách nanosekund, maximálně kolem 10 nanosekund. Jelikož lze zvolit minimální šířku časového okna 3.5ns, s ohledem na tvar exponenciální funkce nelze považovat první snímek za vhodně zvolenou počáteční hodnotu. Vypočítaná doba života fluorescence bude vycházet delší, než je její skutečná hodnota. Touto metodou proto nelze určit skutečnou dobu života fluorescence, je však možné zjistit, jestli ve vzorku existují místa s hodnotami odlišnými. Další nepřesností, která souvisí se šířkou časového okna, je interval, ve kterém se hodnota pravděpodobně nachází. Pokud hodnota pixelu klesne pod prahovou hodnotu ve druhém snímku, v případě šířky detekčního okna 3.5ns a kroku 1ns lze pravděpodobnou hodnotu doby života fluorescence tohoto pixelu považovat za celý interval 1ns až 4.5ns. 30

31 7.2. Výpočet směrnice Druhým přístupem pro zjištění doby života fluorescence je co nejpřesnější odhad záporné konstanty β reprezentující rychlost poklesu exponenciály z rovnice (5). Převrácená hodnota konstanty β je dle rovnice (6) dobou života fluorescence. Výpočet vychází ze skutečnosti, že přirozený logaritmus exponenciální funkce je přímkou. Výsledkem přirozeného logaritmu rovnice (5) je tedy rovnice (7). Z rovnice (7) je patrné, že závislost logaritmu intenzity pixelu na čase je lineární, jak je znázorněno na Obr. 21. Obr. 21 Funkce e x a její přirozený logaritmus Problém způsobuje skutečnost, že hodnoty na ose y jsou integrálem celého časového okna a nevyjadřují tedy hodnotu na dané souřadnici x. Za účelem řešení tohoto problému a co nejpřesnějšího se přiblížení skutečné hodnotě doby života fluorescence byla odvozena rovnice 10 následujícím způsobem. Zařízení vzorkuje signál. Předpokládá se exponenciální průběh signálu podle rovnice (8) Na Obr. 22 je znázorněna situace kdy zařízení integruje v detekčním okně, vyjádřeno intervalem(a,b), a výsledek integrace je zapsán. Na Obr. 22 je výsledek vyjádřen výškou sloupce. Toto se děje s krokem k. Krok je obvykle kratší než časové 31

32 okno a vzorky se překrývají, záleží však především na nastavení mikroskopu. Můžeme tedy dle Obr. 22 obecně napsat rovnici (9), která bude vyjadřovat směrnici přímky. Obr. 22 Náčrt snímání a parametrů pro rovnici (9) Následnými úpravami získáme rovnici (10), ze které je patrné, že směrnice přímky je závislá na kroku a pro získání směrnice β musíme směrnice s krokem vydělit. Funkci, která časovou konstantu počítá s využitím popsaných vlastností, lze najít v přiloženém souboru mygui.m pod názvem ctaup. S touto funkcí taktéž pracuje GUI, které je popsáno následně v kapitole 9. Blokové schéma funkce je vidět na Obr. 23. Vstupem do funkce je stejně jako v předchozí funkci vývoj jedné roviny v čase, trojrozměrná matice šedotónových snímků, a dvě numerické hodnoty vyjadřující šířku časového detekčního okna a časový krok. Hodnoty šedotónových snímků se předpokládají v rozsahu

33 Obr. 23 Blokové schéma funkce Každý pixel s hodnotou dva a menší je v prvním kroku rovněž vynulován. Pro výpočet je vytvořena cell array obsahující lineární vektory, které znázorňují exponenciální vývoj hodnot pixelů v čase I e (t). Vektory jsou vytvořeny pouze pro pixely, které mají v prvním snímku nenulovou hodnotu. Jednotlivé buňky jsou následně procházeny a předávány k dalšímu výpočtu. Z důvodu následného výpočtu přirozeného logaritmu, jsou z lineárního vektoru I e (t) vybrány pouze nenulové hodnoty a je k nim přiřazen čas. Následuje výpočet přirozeného logaritmu ln(i e ) a je tak získána přímka. Směrnice S přímky ln(i e ) je spočtena pomocí vnitřní funkce Matlabu polyfit, která přímku aproximuje metodou nejmenších čtverců. Ze směrnice S je vypočtena časová konstanta s ohledem na (6) a (10) podle (11). Přesnost výpočtu časové konstanty touto metodou závisí především na kvalitě, s jakou směrnice S odpovídá přímce. 33

34 8. Programové řešení 8.1. Načtení a zobrazení vstupních dat Snímky je možné načíst standardním způsobem pomocí dialogového okna. Pro tento účel je využita vnitřní funkce Matlabu uigetfile. Funkce je volána pomocí hlavním menu, pod záložkou Soubor snímků výběrem možnosti Nový. Je možné vybrat libovolný počet souborů. Pomocí možnosti Přidat snímky je možné přidávat soubory z různých složek. Původní návrh řešení předpokládal velké množství vstupních dat. Program si proto vytváří pouze seznam snímků, které jsou načteny, a neukládá snímky do paměti. Načítá do paměti pouze snímky, se kterými aktuálně pracuje. Seznam obsahuje cesty ke snímkům, názvy snímků, pro snadný přístup jejich pozici v prostoru a čase a přiřazuje k nim klíč, který určuje příslušnou cestu ke snímkům. Rozeznává se také, jestli se jedná o snímky pro výpočet doby života fluorescence, nebo o snímky pro výpočet spektrálních změn. Pozice jsou zjišťovány z názvu snímku, který se předpokládá ve tvaru X_zN_tN_chN.tif pro dobu života fluorescence, případně X_zN_tN_laN.tif pro spektrální změny. Názvy v tomto tvaru jsou standardním výstupem z mikroskopu. Místo N se předpokládá libovolné číslo, které vyjadřuje odpovídající umístění snímku a místo X se předpokládá libovolný počet znaků. Všechny parametry z t a ch názvy nemusí nutně obsahovat. Program intuitivně vyhodnotí, jaký typ snímků je načtený a nabídne okno s parametry snímků, které po uživateli požaduje vyplnit, viz Obr. 24. Obr. 24 Okno pro vyplnění parametrů snímků 34

35 Pro vyplnění parametrů byly vytvořeny ikony, které uživateli usnadňují orientaci v parametrech. Na Obr. 24 je zobrazeno okno pro vyplnění parametrů v případě, když byly načteny snímky pro výpočet spektrálních změn pouze v jedné rovině. Z okna na Obr. 25 je vidět, že byly načteny pouze snímky pro výpočet změn doby života fluorescence. Šířku detekčního okna t 1 a krok t 2 je možné libovolně zvolit vepsáním do příslušeného pole. V okně je také vidět, pokud bylo provedeno pouze jedno měření, jelikož čas opakování měření t r vyplnit možné není a pole neobsahuje žádnou hodnotu. Hodnoty rozměrů říkají, že snímky obsahují 3D data, jelikož je možné vyplnit parametr z 1. Rozměr y je automaticky přepočten ze zadaného rozměru x přes rozlišení snímků. Parametr z 2 v programu nakonec řešen nebyl a předpokládá se, že snímky na sebe navazují. Vyplnění rozměrů je důležité především pro reálné rozměry ve 3D zobrazení. Obr. 25 Okno pro vyplnění parametrů snímků Podle dostupných dat jsou automaticky zpřístupněny příslušené nabídky v hlavním menu. Okno s parametry snímků je možné kdykoliv vyvolat pomocí tlačítka vlevo dole s příznačným názvem. Uživatelské rozhraní umožňuje pohodlné prohlížení vstupních dat a dává jasnou představu o prostorovém umístění příslušených řezů a jejich vývoji v čase. Vstupní data je možné zobrazit ve 2D. Na Obr. 26. Je zobrazení vstupních dat znázorněno. V tomto 35

36 případě se jedná o snímek konvalinky. Sada snímků konvalinky byla pořízena pomocí skenovacího módu xyz za použití objektivu HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM. Snímání bylo provedeno v režimu photon counting s frekvencí 100Hz. Snímky byly pořízeny v rozlišení 512x512x60 pixelů a jejich rozměry xyz jsou 775x775x61.89µm. Vzorek byl excitován světlem o vlnové délce 490nm. Detekovaná intenzita je na vlnových délkách 499nm - 551nm. Byla použita šířka detekčního okna 3.5ns a krok 1ns. Celkem bylo použito 9 sekvencí a detekční okna odpovídají časům 0-3.5ns 1-4.5ns 2-5.5ns 3-6.5ns 4 7.5ns 5 8.5ns 6-9.5ns ns a ns. Celkový čas snímání byl 2000s. Tato sada snímků je použita pro názorné zobrazení velké části funkcí programu. Obr. 26 Zobrazení vstupních dat ve 2D Vpravo vedle snímku je vždy zobrazena škála hodnot pomocí colorbaru. Pokud sada snímků obsahuje řezy ve směru osy z, je zobrazen vertikální slider vpravo, pomocí kterého je možné procházet snímky ve směru osy z. Procházení snímků ve směru osy z je znázorněno na Obr. 27. Aktuální pozice z je zobrazena v pravém horním rohu v µm. Požadovanou pozici je možné vepsat ručně do tohoto pole. 36

37 Obr. 27 Procházení snímků ve směru osy z Pomocí horizontálního slideru je možné procházet snímky v čase a sledovat tak exponenciální pokles intenzity, což znázorňuje Obr. 28. Aktuální čas je zobrazen vlevo vedle slideru. Požadovaný čas je také možné ručně vepsat do příslušného pole. Zobrazovaný čas je vždy počátkem detekčního okna. Obr. 28 Procházení snímku v čase V případě načtení spektrálních snímků umožňuje horizontální slider procházet dílčí oblasti vlnových délek. Vlevo vedle příslušného slideru se potom zobrazuje střed dílčí oblasti vlnových délek, kterou snímek znázorňuje. Obr. 29 znázorňuje tuto funkci. 37

38 Obr. 29 Procházení spektrálních snímků Pokud bylo měření opakováno, je zobrazen druhý horizontální slider, kterým je možné procházet jednotlivá měření. Konkrétní příklad procházení jednotlivých měření je v kapitole Základní funkce pro práci se snímky Pro práci se snímky jsou nad zobrazovací plochou čtyři menu tlačítka, která spouští běžně užívané funkce pro práci s obrázky. První tlačítko zleva označené znaky +- umožňuje přiblížit vybranou oblast, takzvaný zoom. Jeho funkce je prezentována na Obr. 30. Vybraná oblast zůstává přiblížená i v případě posunu sliderů a je tak možné pohodlně sledovat vývoj oblasti jak v čase, případně ve spektru, tak ve směru osy z a porovnávat také jednotlivá měření. Obr. 30 Funkce zoom. Výběr oblasti vlevo, vybraná oblast vpravo Druhé tlačítko, označené znaky pan umožňuje posun ve snímku. Třetí tlačítko označené znaky rot. je pro 3D zobrazení a umožňuje rotaci modelu a jeho funkce je znázorněna v kapitole

39 Tlačítko označené Display Range umožňuje změnit zobrazovaný rozsah hodnot. Použití tlačítka vyvolá dialogové okno, které po uživateli požaduje zadání rozsahu hodnot, jak je znázorněno na Obr. 31. Obr. 31 Výběr rozsahu hodnot Dialogové okno obsahuje informaci o doporučeném nastavené rozsahu. Doporučené nastavení nemusí být ideální, protože udává rozsah mezi minimální a maximální hodnotou v aktuálním snímku. V kapitole 9.5 je uvedena funkce pro analýzu snímků, která uživateli může usnadnit vhodnou volbu rozsahu. Vybrané hodnoty se zapisují do poles pomlčkou, např Rozsah je změněn pomocí vnitřní funkce Matlabu caxis. Hodnoty menší než minimum jsou zobrazeny černě, hodnoty vyšší než maximum se zobrazí v případě vstupních dat bíle. Změna rozsahu v případě zobrazení doby života fluorescence, které používá odlišnou barevnou škálu, je popsána v kapitole 9.4. Hodnoty v rozsahu jsou lineárně namapovány na celou škálu šedi 1-254, případně na škálu použitou pro zobrazení doby života fluorescence. Obr. 32 Zvolený rozsah 0-10 vlevo a vpravo 39

40 Poslední tlačítko, nebo spíš menu s volbami, umožňuje filtrovat zobrazovaný snímek. Jeho funkce bude znázorněna na snímcích doby života fluorescence, pro které bylo menu vytvořeno Výpočet pro zobrazení doby života fluorescence Po načtení vstupních snímků pro výpočet doby života fluorescence je v hlavním menu zpřístupněna možnost výpočtu. Možnost zobrazení doby života fluorescence je zpřístupněna až po provedení výpočtu. Je tedy nutné nejdříve zavolat příslušné funkce. V hlavním menu pod záložkou Výpočet je možné spustit výpočet s využitím jedné z funkcí popsaných v kapitolách 5.1 a 5.2. Možnosti v nabídce jsou příznačně pojmenovány Porovnávat dle funkce popsané v 5.1 a Počítat směrnici dle funkce popsané v 5.2. Zvolením způsobu výpočtu je spuštěna sekvence znázorněná blokovým schématem na Obr. 33. Obr. 33 Blokové schéma výpočtu doby života fluorescence V prvním kroku je alokována matice, do které se budou ukládat vypočtené hodnoty. Matice má rozměry podle rozlišení snímků a počtu měření. Pokud je ze vstupních dat zjištěno, že měření je opakované, zobrazí se dialogové okno, ve kterém může uživatel vybrat rozsah měření, která chce spočítat. Defaultně je nastaven výpočet všech měření. Pokud je ze vstupních dat zjištěno, že vstupní data obsahují více řezů v ose z, zobrazí se dialogové okno, ve kterém může uživatel vybrat rozsah výpočtu v ose z. Výběr oblasti z je znázorněn na Obr. 34. Předpokládá se vstup např přičemž hodnoty jsou vyjádřeny v µm. Možnost výběru oblasti výpočtu byla přidána především kvůli výpočtu pomocí směrnice, který může být zdlouhavý a někdy by mohlo být užitečné spočítat jen část načtených dat. Po zvolení oblastí se prochází všechny zvolené řezy. Vývoj intenzity aktuálního řezu je načten do 3D matice a předán vybrané funkci, která vrátí 2D snímek doby života fluorescence. Řez je následně uložen na příslušnou pozici matice alokované v prvním kroku. 40

41 Obr. 34 Výběr oblasti z Protože výpočet může probíhat delší dobu, je nad zobrazovací plochou při výpočtu vypisována informace o jeho průběhu. Konkrétně je zde napsáno, který řez je aktuálně počítán. Uživatel je tak neustále ujišťován, že program nezamrznul, ale výpočet v pořádku probíhá Zobrazení doby života fluorescence ve 2D Po provedení výpočtu zvolenou metodou je v menu nabídce Zobrazit umožněna volba Dobu života fluorescence. Zobrazení doby života fluorescence je znázorněno pomocí pseudobarevné škály jet. Hodnoty doby života fluorescence příslušené barvy jsou zobrazeny vedle snímku pomocí colorbaru, jako na Obr. 35. Stejně jako u vstupních dat je možné procházet jednotlivé řezy v ose z a jednotlivá měření pomocí sliderů, které jsou automaticky zobrazeny. Možné je taktéž používat všechny základní funkce uvedené v kapitole 9.2. Velmi užitečná je v tomto případě změna rozsahu hodnot. Na Obr. 35 vlevo je vidět nepříliš vhodně zvolený rozsah hodnot nm programem. Snímek po vhodnější volbě rozsahu 3.5-8nm je vidět na Obr. 35 vpravo. 41

42 Obr. 35 Metoda porovnání s prahem. Změna rozsahu hodnot Metoda výpočtu použitá na Obr. 35 vytváří obrázky se značným šumem, je to však dáno také rozlišením snímků. V menu nad zobrazovací plochou je možné vybrat různé typy filtrů s velikostí matice 3x3. Vzhledem k povaze dat může být u metody porovnání s prahem efektivní použití mediánového filtru, jak je znázorněno na Obr. 36. Použitím tohoto filtru se ztratí některé detaily, hranice oblastí však zůstávají ostré a jsou lépe viditelné. Na Obr. 36 vpravo je pak zřetelně vidět rozdíly v době života fluorescence konvalinky po aplikaci mediánového filtru. Obr. 36 Výpočet pomocí prahu. Nefiltrovaný snímek vlevo. Po aplikaci mediánového filtru vpravo Příklad snímku doby života fluorescence vypočteného pomocí směrnice je na Obr. 37 vlevo. 42

43 Obr. 37 Vypočet směrnice. Nefiltrovaný snímek vlevo. Po použití Gaussova filtru vpravo. Metoda lépe vykresluje přechody mezi oblastmi a zvýrazňuje detaily. Je to dáno především typem výstupních dat, která jsou spojitá na rozdíl od dat získaným výpočtem pomocí prahu, která jsou diskrétní a znázorňují interval hodnot. Přesto výsledné snímky obsahují značné množství šumu. Na data získaná pomocí výpočtu směrnice je možné s úspěchem aplikovat Gaussův flitr, který zachovává většinu detailů, jak je vidět na Obr. 37 vpravo. Přiblížený detail je následně na Obr. 38. Na detailu je vidět, že v podstatě nedochází ke zkreslení hran a hodnoty zůstávají zachovány. Dle předpokladu vychází doba života fluorescence pomocí výpočtu směrnice kratší, než u výpočtu pomocí prahu. V oblastech s krátkou dobou život fluorescence jsou hodnoty nižší o více než 3ns. Předpokladem je, že doba života fluorescence získaná pomocí výpočtu směrnice více odpovídá skutečné hodnotě. Obr. 38 Detail snímku. Nefiltrovaný vlevo. Použití Gaussova filtru vpravo 43

44 8.5. Funkce pro analýzu snímků ve 2D Menu pro analýzu se zobrazují vždy vlevo vedle zobrazovací plochy nad tlačítkem Parametry Snímků. K příslušenému zobrazení se zobrazí pouze menu, které je možné v dané situaci použit. V případě spektrálních snímků je možné interaktivně zobrazit emisní spektrum vybrané oblasti. Funkce popsaná v kapitole 4 je zavolána aktivací políčka Vymezit oblast v panelu Analýza spektra. Pomocí myši je následně možné označit oblast, měnit její tvar a pozici. Kontinuálně se změnou oblasti se vlevo vedle zobrazeného snímku vykresluje histogram emisního spektra oblasti, jak je vidět na Obr. 39 a 40. Snímky na těchto obrázcích zobrazují mezenchymální buňky. Obr. 39 Analýza emisního spektra mezenchymální buňky Snímky na Obr. 39 a 40 byly získány pomocí skenovacího módu xyλ. Rozlišení snímků je 512x512 pixelů. Rozměry xy jsou x144.71µm. Vlnové délky byly skenovány v rozsahu nm. Spektrum je rozděleno celkem do 16 snímků. Každý snímek tak vyjadřuje spektrální okno o šířce 5,9375nm. 44

45 Obr. 40 Analýza emisního spektra změna vybrané oblasti V případě opakování měření je možné pomocí druhého horizontálního slideru procházet jednotlivá měření. Z grafu emisního spektra je možné následně posoudit, zda dochází ke spektrálním změnám ve vybrané oblasti v čase. Toto použití je znázorněno na Obr. 41 a 42. Jedná se o snímky ( ) pořízené ve skenovacím módu xyλt. Rozlišení snímků 1024x1024 pixelů odpovídá fyzické velikosti 496,2x496,2µm. Vlnové délky byly skenovány v rozsahu nm. Spektrum je rozděleno celkem do 11 snímků. Každý snímek tak vyjadřuje spektrální okno o šířce ~7.7273nm. V průběhu 10 hodin bylo provedeno celkem 21 měření. Na začátku tedy proběhlo první měření a následně další každou půl hodinu. Obr. 41 Porovnání opakovaného měření v čase 420min 45

46 Obr. 42 Porovnání opakovaného měření v čase 600minut V případě 2D zobrazení doby života fluorescence je možné interaktivně zobrazit histogram hodnot ve vybrané oblasti. Histogram je znázorněno křivkou v grafu na Obr. 43 vlevo. Funkci zobrazující histogram je možné zavolat aktivací políčka Vymezit oblast v panelu Analýza d.ž.f. Pomocí myši je následně možné označit oblast, měnit její tvar a pozici. Kontinuálně se změnou oblasti se histogram aktualizuje. Obr. 43 Zobrazení histogramu vybrané oblasti Blokové schéma funkce pro zobrazení histogramu je znázorněno na Obr. 44. V prvním kroku jsou načtena data aktuálně zobrazeného snímku. Ze snímku jsou následně vybrána pouze data vyznačené oblasti. 46

47 Obr. 44 Blokové schéma funkce pro analýzu doby života fluorescence Zvolený rozsah zobrazovaných hodnot Display Range je rozdělen na deset shodných intervalů. Ke každému intervalu je následně přiřazen počet pixelů, jejichž hodnoty spadají do tohoto intervalu. Krajní intervaly obsahují také počet hodnot menších než minimum případně větší než maximum rozsahu. Pixely s nulovou hodnotou doby života fluorescence nejsou započítávány, jelikož se pravděpodobně nejedná o zkoumaný vzorek. Počty pixelů jsou následně poděleny jejich celkovým počtem, aby hodnoty vyjadřovaly relativní četnost. Relativní četnost se vztahuje pouze k nenulovým hodnotám. Hodnoty jsou následně zobrazeny do grafu, přičemž relativní četnost je přiřazena vždy středu intervalu. Body jsou nakonec spojeny křivkou. Funkce může být velmi užitečná pro vhodný výběr zobrazovaného rozsahu hodnot. Z grafu na Obr. 43 vlevo je možné zjistit intervaly, jejichž zastoupení je nižší než 10%. Výsledek po provedení změny rozsahu na 1.5 až 4.5ns je na Obr. 45. Obr. 45 Změna rozsahu s pomocí analýzy V porovnání se snímkem na Obr. 43 jsou oblasti na Obr. 45 mnohem lépe zřetelné. Podle změněného rozsahu je také aktualizován histogram, jak je vidět na Obr. 45 vlevo. Hodnoty nespadající do zvoleného intervalu jsou přičteny ke krajním intervalům. Z grafu 47

48 na Obr. 45 vlevo můžeme následně vyčíst, že hodnoty doby života fluorescence 4.2ns a vyšší mají ve vybrané oblasti zastoupení asi 20%. Na Obr. 46 je znázorněno, že funkce zohledňuje také případné použití filtrace. Obr. 46 Zastoupení hodnot po použití mediánové filtrace Zobrazení doby života fluorescence ve 3D Vstupní snímky pro 3D rekonstrukci musí obsahovat řezy v ose z a doba života fluorescence těchto řezů musí být před zobrazením spočtena. Na ukázku jsou použity snímky konvalinky, jejichž parametry jsou popsány v části 9.1. Jak provést výpočet doby života fluorescence všech řezů bylo popsáno v kapitole 9.3. Funkce provádějící 3D rekonstrukci využívá vnitřních funkcí Matlabu patch,isosurface a isocaps. Jedná se tedy o zobrazení povrchů. Zobrazení dat ve 3D je možné po výběru nabídky Zobrazit 3D v hlavním menu. Veškerá nastavení pro 3D zobrazení se zobrazují a nastavují vlevo v programovém okně, jak je vidět na Obr. 48. Funkci pro zobrazení, jejíž bokové schéma je znázorněno na Obr. 47, je možné spustit tlačítkem Použít změny po vyplnění potřebných parametrů. V první části funkce jsou načteny všechny snímky doby života fluorescence. Ze snímků jsou následně vybrána data podle zvolené oblasti. 48

49 Obr. 47 Blokové schéma funkce pro 3D zobrazení Zaškrtnutím políčka Vymezit oblast je spuštěn interaktivní výběr oblasti v rovině xy, jak je znázorněno na Obr. 48. Tažením myši je možné vybrat libovolnou oblast ve tvaru obdélníku. Rozsah hodnot x a y se v okně Nastavení 3D kontinuálně aktualizuje při změně vybrané oblasti. Výšku modelu, tedy rozsah osy z, je nutné vepsat ručně do příslušného pole s pomlčkou mezi minimem a maximem. Hodnoty vybrané oblasti jsou souřadnicemi, nikoliv skutečnými rozměry. Obr. 48 Výběr oblasti a nastavení parametrů pro 3D zobrazení Při aktivaci výběru oblasti je maximalizován 2D snímek, ze kterého je oblast vybírána. V případě deaktivaci výběru je maximalizována naopak oblast, ve které se zobrazuje 3D model. Po odškrtnutí políčka Vymezit oblast dojde k zobrazení pouze 3D modelu, jak je znázorněno na Obr. 49. Poměry na obrazovce se tak interaktivně mění v závislosti na aktuálně používané funkci. Tato funkce programu je výhodná především při použití malé zobrazovací plochy. 3D model na Obr. 49 je podrobněji popsán později. 49

50 Obr. 49 Úprava zobrazované plochy dle používané funkce Jak již bylo zmíněno, model na Obr. 49 je vytvořen z povrchů. Použitá funkce isosurface vytváří povrch, který kopíruje shodné hodnoty. Podobě jako vrstevnice na mapách spojuje body se stejnou nadmořskou výškou, vyjadřuje povrch hodnoty se stejnou dobou života fluorescence. Povrch na Obr. 50 je tvořen místy s dobou života fluorescence 1ns. Obr. 50 Zobrazení povrchu pomocí funkce Isosurface 50

51 Plochy mezi jednotlivými místy jsou vyplněny pomocí funkce Matlabu patch, aby byl povrch souvislý. Celý povrch je následně vyhlazen pomocí vnitřní funkce Matlabu Isonormals. Barva povrchu na Obr. 50 je pro názornost modrá, aby odpovídala hodnotě 1ns podle colorbaru. Povrch uzavírá oblasti s vyššími hodnotami doby života fluorescence, než je hodnota povrchu. Řez uzavřenými oblastmi je možné vyplnit hodnotami, které příslušnému řezu náleží. Toto umožňuje zaškrtnutí políčka Vyplnit řez. Funkce používá vnitřní funkci Matlabu isocaps. Výsledek použití funkce společně s povrchem použitým na Obr. 50 je znázorněn na Obr. 51. Obr. 51 Vyplnění řezu pomocí funkce isocaps Po vyplnění řezu dává model mnohem lepší představu o prostorovém uspořádání objektu. Je možné také měnit průhlednost řezu pro lepší představu o vnitřní struktuře. Použití modré barvy povrchu je vhodné pro názornost, nicméně v případě použití průhlednosti řezu není modrá barva vhodná, jak je znázorněno na Obr. 52. Pro představu o tvaru a vnitřním uspořádání objektu je mnohem vhodnější použít neutrální barvu povrchu, například bílou, nebo šedou, jak je znázorněno na Obr. 53. Použitím neutrální barvy se také výrazně sníží zkreslení hodnot doby života fluorescence v řezu, ke kterému dochází kvůli průhlednosti. 51

52 Obr. 52 Změna průhlednosti povrchu. Nevhodně zvolená barva povrchu. Obr. 53 Zobrazení vnitřní struktury pomocí průhlednosti řezu a vhodně zvolené barvy povrchu. Kromě průhlednosti řezu je možné měnit taktéž průhlednost povrchu. Vhodnou volbou barev a průhledností je možné vyznačit vnitřní struktury objektu, jako na Obr. 54. Volba povrchů a barev záleží na fantazii a potřebách uživatele. Přestože barvy povrchů na Obr. 54 vlevo neodpovídají době života fluorescence, může být toto zobrazení výhodné pro zobrazení místa kumulace částic s určitou hodnotou doby života fluorescence. Na Obr. 54 vpravo bylo snahou použít barvu povrchu dle doby života fluorescence, kterou povrch kopíruje. Hodnoty doby života fluorescence v řezu jsou však značně zkresleny průhledností a barvou povrchů. 52

53 Obr. 54 Značení vnitřních struktur za použití dvou povrchů Pro vytvoření povrchu je potřeba, aby na sebe oblasti se shodnou dobou života fluorescence navazovaly. Vybraná oblast ze snímků je proto před výpočtem povrchů vyhlazena. Vyhlazení je prováděno pomocí vnitřní funkce Matlabu smooth3. Tato funkce umožňuje použít k vyhlazení Gaussův 3D filtr, nebo průměrování. K vyhlazování se používá stejný filtr, který je aktuálně zvolený pro 2D zobrazení. V případě výběru možnosti Nefiltrovat není vyhlazování provedeno. V případě použití mediánové filtrace je použito průměrování. Vyhlazení pomocí mediánové filtrace ve 3D program neumožňuje. Porovnání různých typů vyhlazení a výsledného modelu je vidět na obrázcích 55 a 56. Použitím průměrování je na Obr. 55 dosaženo velmi hladkého povrchu. Oblast s vybraným rozsahem hodnot je potom dobře zřetelná. Vznik plynulého přechodu mezi oblastmi je pro výpočet povrchu výhodný. Je však zároveň nevýhodou, že na okrajích oblastí vznikají přechody, které nejsou skutečné, jak je vidět na Obr. 55 vpravo. Detail snímku na Obr. 55 vpravo je možné porovnat s detaily na Obr. 38, ve kterých není filtrace použita, případně je použito Gaussova filtru. Obr. 55 Vyhlazení pomocí průměrování. Vznik neexistujících oblastí vpravo. 53

54 Použití Gaussova filtru k vyhlazení je znázorněno na Obr. 56 vlevo a zobrazení bez použití vyhlazování je vidět vpravo. Bez použití vyhlazení obsahuje model množství ne zcela zřetelných oblastí. Gaussův filtr model podstatně zlepší a přitom zachová okrajové oblasti a minimálně zkreslí hodnoty, jak je znázorněno na detailech Obr. 38. Tyto vlastnosti filtrace je třeba brát v úvahu při interpretaci 3D zobrazení. Obr. 56 Vyhlazení pomocí Gaussova filtru vlevo. Zobrazení bez vyhlazení vpravo. Pod parametry vyjadřujícími rozsah vybrané oblasti je seznam povrchů, které budou použity. Je možné přidat libovolné množství povrchů pomocí tlačítka Přidat povrch. Každý povrch je možné libovolně pojmenovat při jeho vytvoření. Po vytvoření je povrch připsán do seznamu. Libovolný povrch je možné ze seznamu odebrat stiskem klávesy DELETE. Každému z povrchů je možné přiřadit jeho parametry, které se zobrazují níže po výběru příslušného povrchu v seznamu, vyznačeno na Obr. 57. Obr. 57 Seznam povrchů a jejich parametrů Hranice povrchu vyjadřuje izolinii, hodnotu doby života fluorescence, kterou bude daný povrch kopírovat. Hodnotu lze odhadnout z colorbaru, případně pomocí analýzy popsané v kapitole 8.5 Hodnotu je však třeba ručně vepsat do příslušného pole. V poli průhlednost povrchu je možné zadáním hodnot v rozsahu 0-1 povrch zprůhlednit přičemž hodnota 0 značí zcela průhledný povrch (nebude zobrazen) a hodnota 1 značí neprůsvitný povrch. 54

55 Barvu povrchu je možné vybrat kliknutím na příslušné políčko. Po kliknutí se otevře standardní paleta barev, jak je zvykem u většiny programů. Políčko se obarví vybranou barvou. Defaultně je nastavena barva povrchu na neutrální šedou, která minimálně zkresluje barevnou škálu řezů. Každý povrch však může být vybarven vlastní zvolenou barvou. Vyplnění řezu je vhodné používat pouze u jednoho z povrchů a to převážně u povrchu s nejnižší hodnotou doby života fluorescence, jelikož se řezy následně překrývají a každý řez má svou vlastní barevnou škálu. V poli průhlednost řezu je možné zadáním hodnot v rozsahu 0-1 řez zprůhlednit. Zprůhlednění řezu umožňuje nahlédnout dovnitř objektu a vidět lépe jeho strukturu, jak bylo znázorněno na Obr. 53. Neprůhledný řez na Obr. 51 naproti tomu lépe znázorňuje hodnoty doby života fluorescence v řezu. Průhlednosti povrchů, jejich barvy a průhlednosti řezů se v modelu aktualizují ihned po jejich změně. V případě změny oblasti xyz, přidání nového povrchu nebo změny jeho hranice je z důvodu náročnosti výpočtu potřeba stisknout tlačítko Použít změny, aby se změněné parametry v modelu projevily. Po zobrazení modelu se v panelu Nastavení 3D aktivuje tlačítko Posvítit. Tlačítko volá vnitřní funkci Matlabu camlight. Stisknutím tlačítka je přidáno světlo ze směru, ze kterého uživatel model aktuálně pozoruje. Tímto způsobem je model nasvícen a stínován. Natočením modelu je možné přidat světlo z kteréhokoliv směru. Tlačítkem Odstranit světla je možné odstranit veškerá světla přidaná k modelu. Na Obr. 58 vlevo je vidět model bez osvícení, vpravo po nasvícení z aktuálního pohledu. Obr. 58 Neosvícený model vlevo. Osvětlený vpravo. 55

56 8.7. Uložení výsledků a export snímků V hlavním menu pod záložkou Soubor snímků je možné volbou Uložit uložit aktuální soubor snímků. Soubor snímků je uložen do souboru.mat. Název souboru a jeho umístění je možné volit libovolně. Konkrétně jsou takto uloženy vypočítané snímky doby života fluorescence, cesta ke vstupním snímkům a jejich parametry. Uložený soubor snímků je možné opět kdykoliv načíst volbou Načíst v tomto menu a začít s ním pracovat. Ve stejném menu je volbou Export možné provést export všech snímků doby života fluorescence. V adresáři programu je vytvořena složka s názvem, který odpovídá souboru snímků. Snímky jsou do této složky ukládány ve formátu export_zn_tn.tif kde za N je dosazen index řezu a měření. Příklad exportovaného snímku je na Obr. 59. Vedle vlastního snímku je zobrazen colorbar a název snímku popisuje jeho umístění. Obr. 59 Exportovaný snímek konvalinky. Řez v ose z=45. První měření. 56

57 9. Výsledky praktického měření Kromě snímků konvalinky a byly vytvořeny snímky fibroblastů a mezenchymálních buněk. Sada snímků fibroblastů byla pořízena pomocí skenovacího módu xyz za použití objektivu HC PL APO CS2 63x/1.40 OIL. Snímání bylo provedeno se skenovací frekvencí 100Hz. Snímky byly pořízeny v rozlišení 512x512x22 pixelů a jejich rozměry xyz jsou x246.03x6.17µm. Vzorek byl excitován světlem o vlnové délce 540nm. Detekovaná intenzita je na vlnových délkách 550nm - 620nm. Byla použita šířka časového detekčního okna 3.5ns a krok 1ns. Celkem bylo použito 9 sekvencí a detekční okna odpovídají časům 0-3.5ns 1-4.5ns 2-5.5ns 3-6.5ns 4 7.5ns 5 8.5ns 6-9.5ns ns a ns. Celkový čas snímání byl sekund. Snímky byly obarveny komplexem SPIO-Rhodamin. Obr. 60 Fibroblasty. Doba života fluorescence[ns]. z=0 z=1 Obr. 61 Fibroblasty. Doba života fluorescence[ns]. z=2 z=3 57

58 Obr. 62 Fibroblasty. Doba života fluorescence.[ns] z=4 z=5 Obr. 63 Fibroblasty. Doba života fluorescence. [ns] z=6 z=7 Obr. 64 Fibroblasty. Doba života fluorescence. [ns] z=8 z=9 58

59 Obr. 65 Fibroblasty. Doba života fluorescence. [ns] z=10 z=11 Obr. 66 Fibroblasty. Doba života fluorescence. [ns] z=12 z=13 Obr. 67 Fibroblasty. Doba života fluorescence. [ns] z=14 z=15 59

60 Obr. 68 Fibroblasty. Doba života fluorescence. [ns] z=16 z=17 Obr. 69 Fibroblasty. Doba života fluorescence. [ns] z=18 z=19 Obr. 70 Fibroblasty. Doba života fluorescence. [ns] z=20 z=21 60

61 Na Obr. 71 je porovnání intenzitního snímku získaného v prvním detekčním okně a zpracovaného snímku znázorňujícího dobu života fluorescence tohoto řezu. Snímek může působit dojmem, že doba života fluorescence souvisí s intenzitou snímku na Obr. 71 vlevo. Na Obr. 72 je zobrazen detail snímku, kde je vidět, že vyšší intenzita neznamená nutně kratší dobu života fluorescence. Obr. 71 Intenzitní snímek vytvořený v prvním časovém detekčním okně. Snímek znázorňující dobu života fluorescence [ns] vpravo Obr. 72 Detail snímku. Intenzita vlevo přímo nesouvisí s dobou života fluorescence [ns] Na Obr. 73 je znázorněn výběr oblasti pro 3D zobrazení doby života fluorescence fibroblastů. Na Obr. 74 je potom zobrazen 3D model vybrané oblasti. Model je zobrazen ze dvou různých pohledů, aby bylo jasně vidět jeho prostorové uspořádání. 61

62 Obr. 73 Fibroblasty. Výběr oblasti a 3D zobrazení doby života fluorescence [ns] Obr. 74 Fibroblasty 3D. Doba života fluorescence v pseudobarevné škále jet. [ns] Sada snímků mezenchymálních buněk byla pořízena pomocí skenovacího módu xyz za použití objektivu HC PL APO CS2 63x/1.40 OIL. Snímání bylo provedeno se skenovací frekvencí 200Hz. Snímky byly pořízeny v rozlišení 512x512x20 pixelů a jejich rozměry xyz jsou x179.68x8.77µm. Vzorek byl excitován světlem o vlnové délce 540nm. Detekovaná intenzita je na vlnových délkách 550nm - 620nm. Byla použita šířka časového detekčního okna 3.5ns a krok 1ns. Celkem bylo použito 9 sekvencí a detekční okna odpovídají časům 0-3.5ns 1-4.5ns 2-5.5ns 3-6.5ns 4 7.5ns 5 8.5ns 6-9.5ns ns a ns. Celkový čas snímání byl sekund. Snímky byly obarveny komplexem SPIO-Rhodamin. 62

63 Obr. 75 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence[ns]. z=0 z=1 Obr. 76 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence[ns]. z=2 z=3 Obr. 77 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence.[ns] z=4 z=5 63

64 Obr. 78 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence. [ns] z=6 z=7 Obr. 79 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence. [ns] z=8 z=9 Obr. 80 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence. [ns] z=10 z=11 64

65 Obr. 81 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence. [ns] z=12 z=13 Obr. 82 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence. [ns] z=14 z=15 Obr. 83 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence. [ns] z=16 z=17 65

66 Obr. 84 Mezenchymální buňky. Doba života fluorescence. [ns] z=18 z=19 66

67 10. Diskuze Použitý mikroskop Leica-TCS-SP8X umožňuje snímání v režimu single photon counting. Výsledný signál je tak digitalizován a díky tomu je dosaženo vyššího poměru signálu k šumu. Minimální šířka časového detekčního okna je 3.5ns.Díky posunu tohoto časového okna s určitým krokem je možné aproximovat intenzitu v časovém okně o délce kroku. Moderní konfokální mikroskopy určené pro snímání dat k analýze doby života fluorescence využívají režimu snímání TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting). [13] [14] Pro snímání v režimu TCSPC je nutností speciální hardware přiřazující mnohem přesnější čas detekce jednotlivým fotonům relativně k času excitace. Časové rozlišení těchto systémů je v řádu pikosekund. Jelikož čas dopadu fotonu má charakter pravděpodobnosti, je měření pro každý pixel opakováno, dokud není získán dostatečný počet fotonů pro zobrazení histogramu s požadovaným krokem. Z histogramu se následně aproximuje křivka znázorňující exponenciální pokles a vyjádří doba života fluorescence. Na Obr. 75 je příklad takového histogramu. Obr. 85 Příklad histogramu času dopadu fotonů.[12] Výpočet popsaný v kapitole 7.2 nezávisí na velikosti časového okna, ve kterém jsou fotony detekovány. Přesný čas dopadu fotonů v detekčním okně proto není nutné znát. 67

68 Nejkratší doba života fluorescence, kterou je možné tímto způsobem analyzovat, záleží především na časovém kroku. Čím jemnější je krok, tím kratší dobu života fluorescence je možné analyzovat. Se zkracujícím se krokem roste i náročnost na přesnou synchronizaci kroku. Pro analýzu a zobrazení FLIM snímků jsou k moderním konfokálním mikroskopům dodávány software umožňující mimo jiné nastavení prahové hodnoty histogramů času dopadu fotonů, která už jsou považovány za šum. Některé softwary také obsahují výpočet multiexponenciálního poklesu. Program v této práci obsahuje pouze pevně danou hodnotu pixelu, která už je považována za šum. Multiexponenciální pokles tímto softwarem není možné analyzovat. Podle zdroje [12], ve kterém jsou zkoumány změny doby života fluorescence Rhodaminu 6G vázaného na zlaté nanočástice, uvádí dobu života fluorescence vodního roztoku s koncentrací barviva 1µM (bez zlatých nanočástic) 3.87ns. Exponenciální pokles intenzity fluorescence tohoto roztoku je znázorněn histogramem na Obr. 75 (a). Hodnoty doby života fluorescence jsou popisovány nižší v případě přítomnosti nanočástic Au v roztoku. Konkrétně 2.7ns pro roztok 1µM R6G a 16.67mM Au, znázorněno histogramem (b) a 1.75ns pro roztok 1µM R6G a 33.33mM Au. Jak zdroj uvádí, za přítomnosti zlatých nanočástic dochází k předávání energie mezi částicemi a barvivem a k poklesu doby života fluorescence. Na Obr. 76 je uveden snímek fibroblastů vyjadřující dobu života fluorescence vypočtenou pomocí metody 7.2. Detailní parametry snímání dat pro výpočet jsou uvedeny v 9. Vzorky buňek byly obarveny komplexem SPIO-Rhodamin. Obr. 86 Doba života fluorescence Fibroblastů. Barveno komplexem SPIO-Rhodamin Vlevo: Histogram doby života fluorescence s krokem 0.6ns. 68

69 Ze snímku na Obr. 76 byly vybrány prakticky všechny pixely a pomocí analýzy popsané v kapitole 8.5 zobrazen histogram. Z histogramu na Obr. 76 vlevo lze vyčíst, že nejčastější doba života fluorescence ve snímku je v rozsahu 2.4ns až 3.0ns a doba života fluorescence přibližně 64% snímané vrstvy (bez pozadí) je v rozmezí 1.5ns až 4.5ns. Hodnoty vychází velmi podobně pro všechny řezy v ose z. Na Obr. 77 je uveden snímek mezenchymálních buněk vyjadřující dobu života fluorescence vypočtenou pomocí metody 7.2. Detailní parametry snímání dat pro výpočet jsou uvedeny v 9. Vzorky buňek byly obarveny komplexem SPIO-Rhodamin. Histogram tohoto snímku ukazuje velmi podobné hodnoty jako v případě fibroblastů. Více než 75% hodnot je v rozmezí 1.5ns až 4.5ns. Obr. 87 Doba života fluorescence mezenchymálních buňěk. Barveno komplexem SPIO-Rhodamin Vlevo: Histogram doby života fluorescence s krokem 0.6ns. Snímky v pseudobarevné škále vyjadřují dobu života fluorescence. Pro hodnocení změn v době života fluorescence se předpokládá, že si uživatel zobrazí snímky, případně histogramy vedle sebe a porovnáním mezi sebou jejich parametry bude sám hodnotit. Tento způsob byl zvolen proto, že nasnímání buněk po delším časovém období v řádu několika hodin i dní těžko zaručí, že se objekty pod mikroskopem neposunou. V takovém případě nelze jednoduše porovnat snímky mezi sebou programově. Řešením by mohlo být vyhledání objektů a jejich zpětné poskládání na sebe. Je však otázkou, jak dobře by vyhledání a lícování objektů pracovalo, pokud by docházelo k výrazným změnám intenzity po delším časovém období a tím by se podstatně změnil tvar oblastí. Pohledem na snímky doby života fluorescence mezenchymálních buněk lze říct, že zhruba na okrajích buněk je vyšší doba života fluorescence a uvnitř nižší. Oblasti vyšší 69