prof. RNDr. Ladislav Havel, CSc.

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin Vliv růstových regulátorů na programovanou buněčnou smrt Bakalářská práce Vedoucí práce: prof. RNDr. Ladislav Havel, CSc. Vypracovala: Zuzana Prudká Brno 2008

2 zadání

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Vliv růstových regulátorů na programovanou buněčnou smrt vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. V Brně dne. podpis diplomanta.

4 Poděkování Tímto bych chtěla poděkovat prof. RNDr. Ladislavu Havlovi, CSc., vedoucímu mé bakalářské práce, za odborné vedení a cenné rady a laborantce Martině Jůzové za pomoc při práci v laboratoři. Dále bych chtěla poděkovat mým rodičům za to, že mi umožnili studovat.

5 ABSTRAKT Programovaná buněčná smrt je nezanedbatelný proces v růstu a vývoji rostlin. Cílem této práce bylo experimentálně ověřit vliv nedostatku auxinů, konkrétně 2,4-D, na programovanou buněčnou smrt. Pokus byl proveden na suspenzní kultuře tabáku BY-2, která byla kultivována v médiu s přidaným 2,4-D a bez 2,4-D po dobu pěti dnů. Životnost byla stanovena pomocí dvojitého barvení fluorescein diacetátem (FDA) a propidium jodidem (PI). Životnost buněk v médiu bez 2,4-D se v průběhu kultivace snižovala rychleji než životnost buněk v médiu s 2,4-D. Buňky se více seskupovaly a měnily svůj tvar. Klíčová slova: 2,4 D, auxiny, BY-2, cytokininy, programovaná buněčná smrt, životnost

6 ABSTRACT Programmed cell death is an indispensable process in plant growth and development. The main object of this work was to verify the influence of 2,4-D to programmed cell death. Cell suspension culture of tobacco BY-2 was cultivated in meidum with 2,4-D and in medium without 2,4-D. The viability of cells was determined using double staining with fluorescein diacetate and propidium iodide. The viability of cells in medium without 2,4-D declined more rapidly than in medium with 2,4-D. Cells made up larger groups and changed their form. Keywords: 2,4-D, auxins, BY-2, cytokinins, programmed cell death, viability

7 OBSAH 1. SEZNAM ZKRATEK ÚVOD CÍL PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST Růstové regulátory Podstata účinku rostlinných hormonů Auxiny Charakteristika auxinů, jejich chemické a fyzikálně chemické vlastnosti Syntetické látky s účinkem auxinu Principy metod stanovení auxinu Biosyntéza IAA Transport IAA v rostlinách Antiauxiny a inhibitory transportu auxinu Hlavní fyziologické účinky auxinů v rostlinách Mechanismus účinků auxinů na molekulární úrovni Auxiny v explantátových kulturách Cytokininy Charakteristika cytokininů Anticytokininy Chemické a fyzikální vlastnosti cytokininů Metody stanovení cytokininů Biosyntéza cytokininů Metabolismus cytokininů Transport a translokace cytokininů v rostlinách Úloha cytokininů v rostlinách a jejich praktické využití Cytokininy v explantátových kulturách Programovaná buněčná smrt Fáze buněčné smrti Výhody buněčných kultur při studiu PCD Změny buňky a organel v průběhu PCD Protoplast... 23

8 Buněčné jádro Golgiho aparát (GA) Endoplazmatické retikulum (ER) Mitochondrie Vakuoly Plazmatická membrána Role PCD ve vegetativním vývoji rostlin Aleuronová vrstva a endosperm Tracheální elementy MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDKY DISKUZE ZÁVĚR SEZNAM LITERATURY... 33

9 1. SEZNAM ZKRATEK 2,4-D BAP DAPI DNA FDA HPLC HR IAA PI PCD RIA trna kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová benzylaminopurin 4,6-diamidino-2-fenylindol deoxyribonukleová kyselina fluorescein diacetát vysokoúčinná kapalinová chromatografie hypersenzitivní reakce kyselina indolyloctová propidium jodid programovaná buněčná smrt radioimunoanalýza transferová ribonukleová kyselina

10 2. ÚVOD V mnohobuněčném organismu je za normálních podmínek udržována rovnováha v produkci nových buněk a zániku buněk starých. Dobré fungování orgán i celého organismu (rostliny) souvisí se schopností odstranit buňky nepotřebné, nebezpečné nebo napadené infekcí. To zajišťuje proces zvaný programovaná buněčná smrt (apoptóza). Tento termín použili poprvé v roce 1972 Kerr, Wyllie a Currie. Pochází z řečtiny a lze ho přeložit jako opadávání. V roce 2002 získali Sydney Brenner, H. Robert Horvitz a John E. Sulston Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství za výzkum v oblasti genetická regulace vývoje orgánů a programovaná buněčná smrt. Programovaná buněčná smrt je fyziologický proces aktivní po celou dobu růstu a vývoje. Na rozdíl od nekrózy, což je akutní patologický proces vyvolávající zánětlivou reakci, je programovaná buněčná smrt vysoce geneticky řízená a dává organismu během jeho životního cyklu různé výhody. Může být spuštěna nedostatkem signálů z okolí, signálem pro zahájení apoptózy, dále poškozením buňky např. virem či fyzikálními podmínkami. Pro studium programované buněčné smrti u rostlin jsou ideálním modelem buněčné suspenzní kultury. Používají se kultury odvozené od Arabidopsis thaliana, tabáku, mrkve, okurky a rodu Zinnia. Tyto kultury se vyznačují hlavně uniformitou, dostupností a sníženou komplexitou.

11 3. CÍL PRÁCE Cílem práce bylo zvládnou kultivaci rostlinných buněk a pletiv in vitro. Dále se seznámit se základními informacemi týkajícími se programované buněčné smrti u rostlin, detekce životnosti buněk a vlivu cytokininů a auxinů na programovanou buněčnou smrt a získané informace literárně zpracovat. Praktická část zahrnovala experimentální ověření vlivu nedostatku vybraných cytokininů a auxinů na programovanou buněčnou smrt.

12 4. TEORETICKÁ ČÁST 4.1 Růstové regulátory Pro rostlinné hormony je přijímána stejná definice jako pro hormony živočišné: rostlinný hormon je organická sloučenina syntetizovaná v jedné části rostliny a translokovaná do části jiné, kde fyziologickou reakci vyvolávají velmi malé dávky. Rostlinné hormony jsou přirozené regulátory růstu, tj. jsou syntetizovány rostlinou samotnou. Za hormony nelze považovat organické regulátory růstu, které byly syntetizovány organickými chemiky nebo v jiných organismech než jsou rostliny. Jak fytohormony, tj. přirozené růstové regulátory, tak i syntetické regulátory rozlišujeme na regulátory povahy stimulační a povahy inhibiční. Rozlišení je však málo přesné, neboť i stimulátor může ve vyšší koncentraci růst inhibovat a naopak inhibitor ve velmi nízké koncentraci může působit stimulačně Podstata účinku rostlinných hormonů V procesech růstu a vývoje hrají významnou roli fytohormony a jejich interakce. Neexistuje růstový proces, který by byl ovlivňován pouze jedním fytohormonem, a na druhé straně neexistuje fytohormon, který by ovlivňoval pouze jediný růstový proces. Tento pleiotropní účinek fytohormonů lze uvažovat jako následek interakcí dvou, resp. tří složek. Hlavní složkou je počet aktivních molekul fytohormonu spojených s místem jejich účinku v buňce. Tato hodnota závisí na biosyntéze a metabolismu fytohormonů i na regulaci jejich importu a exportu. Druhou složkou je senzitivita buněk k endogenním fytohormonům. Může být přesněji definována jako počet receptorů pro hormony a jejich afinita k fytohormonům. (Procházka, Šebánek a kol., 1997) Auxiny Charakteristika auxinů, jejich chemické a fyzikálně chemické vlastnosti Nejdéle známým auxinem je kyselina indolyl-3-octová (IAA), později byly v rostlinách nalezeny kyseliny indolyl-3-máselná (IBA), 4-chlor-IAA a kyselina fenyloctová (PAA). Kyseliny indolyl-3-octová i fenyloctová jsou krystalické látky, špatně rozpustné ve vodě v kyselé a neutrální oblasti. Dobře se rozpouštějí v organických rozpouštědlech a ve vodném alkalickém prostředí. Jsou to slabé organické kyseliny. Kyselina indolyloctová

13 je dosti nestálá, snadno dekarboxyluje. Je velmi citlivá ke světlu a zejména UV záření, které vyvolává její rozklad. Kyseliny fenyloctová je stálá látka. Obr. 1 Struktura IAA, IBA, 4-chlor-IAA Obr. 2 Struktura PAA Syntetické látky s účinkem auxinu Společným znakem těchto látek je aromatický kruhový systém, v jehož postranním řetězci v určité vzdálenosti od něj je umístěna karboxylová skupina (nebo skupina na karboxylovou snadno převeditelná). Všechny dosud známé syntetické auxiny jsou slabé organické kyseliny. Mezi aromatickým kruhem a karboxylovou skupinou musí být alespoň jeden uhlíkový (nebo kyslíkový) atom. Syntetické auxiny lze rozdělit do pěti skupin: 1. indolové kyseliny: kyselina indolyl-3-propionová (IPA) 2. naftalenové kyseliny: α-naftyloctová kyselina (NAA), β-naftoxyoctová kyselina (NOA) 3. chlorfenoxykyseliny: 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D), 2,4,5- trichlorfenoxyoctová (2,4,5-T), 2-metyl-4-chlorfenoxyoctová (MCPA) 4. benzoové kyseliny: 2,3,6- a 2,4,5-trichlorbenzoová, dicamba 5. deriváty kyseliny pikolinové: picloram Chemické a fyzikálně-chemické vlastnosti těchto látek jsou obdobné IAA a PAA; jde většinou o látky stálé. Obr. 3 Struktura NAA

14 Obr. 4 Struktura chlorfenoxykyselin Principy metod stanovení auxinu Auxiny extrahujeme z rostlinných pletiv organickými rozpouštědly, vždy v přítomnosti antioxidantů. Při čištění extraktu vytřepáváním se využívá kyselého charakteru IAA: při nízkém ph přechází nedisociovaná kyselina do organických rozpouštědel (éteru), při vysokém ph zůstává její anion ve vodné fázi. K dalšímu čištění lze použít různé chromatografické postupy. Vlastní stanovení množství IAA v extraktu lze provést biotesty nebo fyzikálně-chemickými metodami Biosyntéza IAA Biosyntéza IAA vychází z aminokyseliny L-tryptofanu a může probíhat několika drahami: indolylpyruvátovou, tryptaminovou a indolylacetaldoximovou. Nejčastěji se u vyšších rostlin setkáváme s dráhou indolylpyruvátovou, ve které je tryptofan převáděn na kyselinu indolylpyrohroznovou transaminační reakcí. Kyselina indolylpyrohroznová dekarboxyluje za vzniku indolylacetaldehydu, který je oxidován na IAA Transport IAA v rostlinách Auxin vzniká ve špičce koleoptile a je transportován bazipetálně. V kořenech je IAA transportována převážně akropetálně. Polární je i pohyb syntetických auxinů. Transport IAA je velmi specifický aktivní proces, vyžadující pro svou funkci energii. Je zajištěn specifickými přenašeči, umístěnými v plazmalemě bazálních pólů buňky. Aktivní polární transport auxinu můžeme pozorovat v parenchymatickém i vaskulárním pletivu. Ve vaskulárním pletivu je však auxin transportován v parenchymatických buňkách obklopujících cévy spíše než v cévách samých. Hladina IAA v xylémové šťávě

15 je velmi nízká. IAA však může být transportována floémem ze starších listů do ostatních částí rostliny. Mechanismus transportu IAA vysvětluje nejlépe chemiosmotický model. Podle něj je energie dodávána protonovou pumpou, která přenáší protony z cytoplazmy do buněčné stěny, kterou tak okyseluje. Tím je IAA udržována vně buňky v méně disociovaném stavu, než je v cytosolu, a vstupuje do buňky jako nedisociovaná molekula či jako anion elektrogenním symportem s 2 protony. Přenašeč odpovědný za výdej IAA z buňky je umístěn v plazmalemě bazální části buňky a vynáší anion IAA spolu s protonem. Transport IAA je závislý na transportu iontů vápníku v opačném směru; vápník se pravděpodobně účastní mechanismu výdeje IAA na bázi buněk Antiauxiny a inhibitory transportu auxinu Antiauxiny jsou látky, které samy o sobě nemají auxinovou aktivitu a účinek auxinů inhibují, pravděpodobně na vazebném místě. Známe pět takových sloučenin. Jsou to kyseliny 2,4,6-trichlorfenoxyoctová, 2,4-dichlorfenoxyizomáselná, 2,4,6- trichlorbenzoová, trans-skořicová a p-chlorfenoxyizomáselná tato má dosti výrazné antiauxinové účinky, ale inhibuje i polární transport IAA, což znesnadňuje interpretaci jejích účinků. Transport auxinu je specificky bržděn kyselinou 2,3,5-trijodbenzoovou (TIBA), N-(1- naftyl)ftalamovou (NPA) a fluorenolem. Obr. 5 Struktura kyseliny 2,4,6-trichlorfenoxyoctové Obr.6 Fluorenol

16 Hlavní fyziologické účinky auxinů v rostlinách Nejlépe prostudovaným účinkem auxinů je stimulace dlouživého růstu. S růstovou stimulací souvisí i úloha auxinu v regulaci tropismů. Stimulace růstu je vyvolána auxinem obvykle v rozmezí koncentrací mol.l -1. Vyšší koncentrace auxinu naopak v řadě případů růst inhibující, často v důsledku zvýšené tvorby ethylenu. Další z výrazných růstových účinků auxinů je stimulace tvorby kořenů. Auxiny stimulují nejen dlouživý růst buněk, ale i jejich dělení. Stimulaci buněčného dělení a tvorby cévních svazků můžeme pozorovat v mnoha in vitro systémech. Auxin hraje důležitou roli v diferenciaci buněk, zejména proto, že ovlivňuje jejich polaritu, např. indukuje embryogenní schopnosti v procesu somatické embryogeneze Mechanismus účinků auxinů na molekulární úrovni Receptory auxinů jsou bílkoviny, které specificky vážou daný hormon a komplex hormon-receptor pak zprostředkovává další přenos signálu. Protože v rostlinách dosud nebyla dostatečně prokázána funkční úloha vazby hormonů, bývají vazebné bílkoviny častěji označovány jako vazebná místa. Dosud nejlépe byla charakterizována na membránách vázaná vazebná místa pro auxin v koleptilích kukuřice. Byla popsána i vazebná místa rozpustná, cytoplazmatická a jaderná. Po navázání auxinu na membránový receptor musí být signál dále přenesen do nitra buněk. To se děje prostřednictvím druhých poslů, cyklického adenosinmonofosfátu (camp) či inozitoltrifosfátu (IP 3 ). Stejně jako u ostatních hormonů můžeme i u auxinů rozlišit účinky brzké, rychlé, a pozdní, pomalé. Pro brzké i pozdní účinky je nutná stálá přítomnost auxinu. Pro většinu z nich je nutná funkční syntéza RNA a proteinů. (Macháčková, 1997) Auxiny v explantátových kulturách Auxiny bývají do kultivačních médií přidávány většinou v kombinaci s cytokininy. Vzájemná kombinace podporuje jak dediferenciaci, tak opětnou diferenciaci. Přítomnost auxinů v kultivačním médiu je nutná i pro indukci kalusu. V tomto směru působí téměř univerzálně 2,4-D, která vyvolává tvorbu kalusu i u těch druhů či explantátů, u kterých jsou ostatní růstové regulátory neúčinné.

17 Různé kombinace auxinů a cytokininů se využívají velmi často pro vyvolání organogeneze v orgánových i kalusových kulturách, velmi často se uplatňují v prašníkových kulturách. Poněkud zvláštní postavení mají při indukci somatické embryogeneze a zakořeňování in vitro. (Havel, 1997) Cytokininy Charakteristika cytokininů První přirozený cytokinin byl identifikován v nezralém endospermu kukuřice a nazván zeatin. V současné době známe přes 30 přirozených cytokininů. Strukturálně všechny vycházejí z adeninu substituovaného na exocyklické aminoskupině v poloze N-6. Tato konfigurace je základní podmínkou biologické aktivity. Všechny přirozené cytokininy jsou odvozeny od čtyř základních substitucí adeninu v poloze N-6: 1. N 6 -( 2 -izopentenyl)adeninu 2. cis- a trans-zeatinu 3. dihydrozeatinu 4. N6-benzyladeninu Obr. 7 N 6 -( 2 -izopentenyl)adenin Obr. 8 trans-zeatin Obr. 9 N 6 -benzyladenin

18 Anticytokininy Anticytokininy působí jako antagonisté jak vůči přirozeným endogenním cytokininům, tak vůči cytokininům aplikovaným exogenně. Představují účinný nástroj pro studium mechanismu a způsobu působení cytokininů. Modifikací purinového skeletu cytokininů záměnou atomu N-7 za uhlík a atomu C-8 za dusík byly získány pyrolové, respektive pyrazolové deriváty s vysokou antagonistickou aktivitou vůči cytokininům adeninového i močovinového typu. Anticytokininy byly získány též strukturální modifikací cytokininů močovinového typu Chemické a fyzikální vlastnosti cytokininů Chemickou povahou jsou cytokininy báze. Při nízkých hodnotách ph (pod 2) nesou celkově kladný náboj, při hodnotách ph nad 12 náboj záporný a v rozmezí ph 6 až 8 se chovají jako neutrální sloučeniny. Cytokininové báze jsou hydrofobní sloučeniny. Navázáním hydrofilních cukrů vznikají amfifatické konjugáty. Tyto vlastnosti jsou využívány při čištění a frakcionaci cytokininů Metody stanovení cytokininů Vlastnímu stanovení cytokinů musí předcházet čištění a obohacení vzorku z důvodu nepatrného obsahu cytokininů v buňkách a přítomnosti mnohonásobně vyššího množství interferujících strukturálně příbuzných látek. Jednotlivé cytokininy oddělené pomocí HPLC lze stanovit na základě absorpce UV záření pomocí vhodného detektoru. Ve většině případů je však nutné použít jiných citlivých selektivních metod. Velmi se osvědčily metody imunoanalytické, jako ELISA a RIA. Vyznačují se vysokou citlivostí a při použití vhodných protilátek i vysokou specifitou. Dále je velmi přesná plynová chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií Biosyntéza cytokininů Cytokininy se vyskytují v rostlinách jako volné sloučeniny a jako součásti molekul některých trna. Pokud je v trna přítomen, nachází se cytokinin vždy vedle 3 -konce antikodonu. Vzniká na úrovni polynukleotidu přenesením izopentenylového řetězce

19 odvozeného od mevalonátu na adenylový zbytek. Reakce je katalyzována 2 - izopentenyl:trna transferázou. Izopentenyladenosin je většinou dále modifikován hydroxylací terminální metylové skupiny za vzniku cis-zeatinu. Takto modifikovaná trna je potenciálním zdrojem cytokininu, který se může uvolnit při její metabolické degradaci. Jde o nepřímou biosyntézu. Přímá cesta biosyntézy volných cytokininů je dosud známa pouze u rostlin transformovaných fytopatogenem Agrobacterium tumefaciens, indukujícím nádorový růst v důsledku nadprodukce auxinu a cytokininů. Volné cytokininy v transformovaných buňkách vznikají připojením izopentenylového řetězce z 2 - izopentenylpyrofosfátu na exocyklickou (N-6)-aminoskupinu 5 -AMP za vzniku výchozího cytokininu N 6 -( 2 -izopentenyl)adenosin-5 -fosfátu. Konverze je katalyzována enzymem cytokininsyntetázou ( 2 -izopentenylpyrofosfát:5 -AMPizopentenyltransferázou). Virulence A. tumefaciens je vázána na přítomnost Tiplazmidu, který nese strukturální geny kódující enzymy pro biosyntézu auxinu a cytokininu. Tyto geny jsou součástí segmentu Ti-plazmidu (T-DNA), který je přenášen z bakterie do genomu hostitele Metabolismus cytokininů I když se v rostlinách vyskytuje více než 30 přirozených cytokininů, jejich metabolismus je relativně jednoduchý. Probíhá v následujících fázích: 1. vzájemná přeměna bází, nukleosidů a nukleotidů 2. N-glukosylace purinu a konjugace alaninu v poloze N-9 3. O-glykosilace a acetylace postranního řetězce 4. redukce dvojné vazby postranního řetězce 5. odštěpení postranního řetězce Různé produkty metabolismu se vyznačují velmi odlišnými vlastnostmi z nichž zejména polarita je rozhodující pro jejich příjem a translokaci v pletivech a buňkách i pro jejich finální biologický účinek. Existují nepřímé důkazy, že cytokininy ve formě bází představují vlastní biologicky aktivní formy cytokininů při stimulaci buněčného dělení. Proto konverze ribotidů a ribosidů na báze může mít zásadní význam pro regulaci obsahu fyziologicky aktivních cytokininů v buňce.

20 Transport a translokace cytokininů v rostlinách Vzhledem k tomu, že cytokininy se vyskytují jako integrální složka některých trna, je zřejmé, že mohou být, byť v omezeném množství, syntetizovány v každé buňce. Přesto biosyntéza volných cytokininů je v rostlinách lokalizována. Nejvyšší obsah cytokininů i jejich tvorba de novo byly zjištěny v kořenových vrcholech. Tato skutečnost podporuje představy o interakci auxinu syntetizovaném ve vzrostných vrcholech a cytokininů vytvářených v oblasti kořenových meristémů při determinaci polarity rostlin. Tento koncept předpokládá existenci polárního transportu auxinu i cytokininů. I když polarita transportu auxinu ve stoncích i kořenech je obecně známa, transport cytokininů jak v kořenech, tak ve stoncích není výrazně polární. Cytokininy jsou translokovány symplasticky lýkem i xylémem z kořenů do lodyh. Podle některých prací polarita i rychlost jejich translokace může být ovlivněna auxinem. Pro příjem cytokininů rostlinnými buňkami je rozhodující jejich molekulární forma. Velmi dobře jsou přijímány lipofilní cytokininové báze, zatímco pro polární glykosidy a zejména ribotidy nejsou rostlinné membrány permeabilní Úloha cytokininů v rostlinách a jejich praktické využití Endogenní i exogenně aplikované cytokininy vykazují shodné účinky na řadu biologických procesů, jako je stimulace buněčného dělení, iniciace růstu adventivních pupenů, stimulace větvení a odnožování rostlin, redukce dlouživého růstu stonků, inhibice diferenciace a růstu kořenů a oddálení stárnutí pletiv. Z praktických aplikací cytokininů je nejvýznamnější jejich využití v rostlinných biotechnologiích jako složek kultivačních médií při odvozování a udržování rostlinných tkáňových kultur a dále při regeneraci rostlin in vitro. (Kamínek, 1997) Cytokininy v explantátových kulturách Cytokininy bývají do kultivačních médií většinou přidávány v kombinaci s auxiny. Mohou však působit i samy. Samy o sobě cytokininy mohou nacházet uplatnění při indukci tvorby prýtů. Při přímé regeneraci se jedná v principu o potlačení apikální dominance cytokininem. Na prorůstajících větvích jsou stejným mechanismem opět stimulovány k růstu nově vyvinuté axilární meristémy. Stejně tak mohou samy cytokininy indukovat tvorbu adventivních meristémů na kultivovaných segmentech

21 stonků, listů a děloh. V obou uvedených případech se však většinou do kultivačního média přidávají zároveň auxiny, které pozitivně ovlivňují růst indukovaných základů. Při indukci somatické embryogeneze cytokininy bývají obvykle pouze doplňující složkou média. Více se uplatňují při kultivaci vyvíjejících se somatických embryí. (Havel, 1997) 4.2 Programovaná buněčná smrt Smrt buněk při abiotickém stresu může být nekrotická nebo programovaná. Nekrotická buněčná smrt je neřízená událost po nevratné poruše buněčných membrán, zatímco programovaná buněčná smrt je dobře organizovaná, v sériích charakteristických morfologických změn a degradaci nukleární DNA endonukleázami. Štěpení DNA ve specifických místech endonukleázami je jedním z hlavních znaků PCD. Programovaná buněčná smrt (PCD) je nezanedbatelná stránka rostlinného vývoje, obranných reakcí rostlin a jejich stavby, je to vysoce organizovaný, regulovaný proces. Studium PCD v celých rostlinách může být obtížné, protože často nastává v malé skupině nedostupných buněk, skrytých v množství okolních buněk zdravých. Uniformita, přístupnost a snížená komplexnost dělá buněčné kultury ideálním výzkumným objektem ke zkoumání regulace PCD v rostlinách. PCD může být aktivována jako následek abiotického nebo biotického stresu, napadení patogenem nebo mezibuněčné signalizace. Způsob smrti buněk indukované chemikáliemi závisí na dávce dané chemikálie. Nízké dávky nejsou pro buňku smrtelné, vyšší spouštějí PCD a vysoké dávky působí nekontrolovanou nekrotickou buněčnou smrt. PCD může také být indukována extrémy mnoha environmentálních podnětů, např. teplotou, vodním stresem a UV ozářením. Důležitým kritériem pro spuštění PCD je hustota buněk. Buňky nerostou a následně umírají, pokud jsou kultivovány při hustotě pod kritickou hranicí. Ale buňky mohou přečkat v nízkých hustotách, jestliže jsou kultivovány v upraveném médiu. Upravené médium je médium, ve kterém byly buňky dříve aktivně pěstovány a které obsahuje složky udržující buňky v nízkých hustotách. (McCabe, Leaver, 2000) Během buněčné smrti je nutný přísun energie, která je potřebná pro průběh apoptotických procesů a zpracování jejich produktu pro další využití v organismu. To se může projevit např. zvýšením respirace. Zde hrají významnou roli mitochondrie. Bylo

22 to pozorováno u živočichů. U rostlinných dvoujaderných embryogenních buněk se mitochondrie nacházejí ve zvýšeném počtu okolo apoptotického jádra. (Havel, 1996) Fáze buněčné smrti In vivo a in vitro procesy PCD se skládají ze tří zřetelně identifikovatelných fází indukční fáze, kde buňka přijímá signál a zahajuje buněčnou smrt, uskutečňovací fáze, kde je aktivován mechanismus buněčné smrti a degradační fáze, kde má činnost mechanismu buněčné smrti za následek morfologické a biochemické změny, které jsou známkou procesů buněčné smrti. Tyto znaky mohou být použity k identifikaci aktivní buněčné smrti a patří mezi ně smrštění (kondenzace) protoplastu a jádra a aktivace endonukleáz, které štěpí DNA. (McCabe, Leaver, 2000) Výhody buněčných kultur při studiu PCD Mezi důvody, které dělají buněčné kultury atraktivním systémem pro studium PCD patří: 1. Uniformita: Buněčné kultury mohou být využity jako rychle se dělící a poměrně homogenní soubor buněk. Může být jednoduše udržováno velké množství buněčného materiálu nebo může být větší množství vytvořeno ze zásob. 2. Přístupnost: Zkoušení kvantitativního růstu nebo smrti je relativně jednoduché za použití životnostního barvení. Sloučeniny mohou být lehce přidány nebo odstraněny z kultur a buňky jsou poměrně dostupné což usnadňuje hodnocení role hormonů nebo signálních drah podílejících se na regulaci PCD. Jednoduchý přístup ke kultivovaným buňkám také znamená možnost sledovat probíhající morfologické změny spojené se smrtí buňky pod mikroskopem (odebíráním vzorků v časových intervalech nebo sledováním jednotlivých buněk v reálném čase). 3. Snížená komplexita: Suspenzní kultury jsou většinou považovány za soubor nediferenciovaných buněk. Absence buněčné diferenciace může být jistou výhodou pro studium PCD. Nicméně, suspenzní kultury nejsou vždy nediferenciované a je také možné použít buněčné kultury ke studiu PCD ve vývoji, spojené např. s embryogenezí, fylogenezí nebo senescencí. (McCabe, Leaver, 2000)

23 4.2.3 Změny buňky a organel v průběhu PCD Změny organel budou popsány u živočišných buněk, jelikož literatura týkající se PCD u rostlin je v tomto směru omezená Protoplast Nejvíce viditelná morfologická změna související s PCD je kondenzace protoplastu. Ta zanechává mezeru mezi stěnou a plazmatickou membránou, která je viditelná pod světelným mikroskopem Buněčné jádro Buněčné jádro je na povrchu kryto jaderným obalem (karyotékou), kterou tvoří dvě membrány. Uvnitř jádra se nachází nukleoplazma a chromatin. Ten je tvořen DNA, histony a kyselými chromozomovými bílkovinami. (Procházka, 2003) Při PCD dochází ke kondenzaci jádra (McCabe, Leaver, 2000) a vznikají větší shluky chromatinu uvnitř jádra, chromatin často kondenzuje do malých shlukujících se balónků (Kerr et al., 1972). To platí i u rostlinných buněk. U rostlin byly také objeveny různé typy interfázních jader procházející PCD, např. prodloužená jádra u tabáku BY-2 (Houot et al. 2001). Danon a Gallois (1998) pozorovali tři typy jaderných změn při UV ozáření protoplastů: normální kulatá jádra, podlouhlá, měsíčkovitá jádra a fragmentovaná jádra. Navrhli, že tyto tři typy jader mohou tvořit časový postup změn jádra během PCD. Podle McCabe a Leavera (2000) by ale kondenzace jádra neměla být považována za tak spolehlivý charakteristický znak apoptotických buněk. Pro sledování změn v jaderné morfologii se používá 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Dále se používá propidium jodid (PI) pro rozlišení raných a pozdních fází PCD. Barvení svědčí o míře kondenzace chromatinu. Buňky potom mohou být podle fáze PCD rozděleny průtokovou cytometrií. Tato technika byla vyvinuta O Brienem, který ji použil pro důkaz, že PCD u rostlin je reverzibilní. (McCabe, Leaver, 2000) Golgiho aparát (GA) Během buněčné smrti dochází ke štěpení proteinů GA zodpovědných za udržení struktury GA kaspázami (Mancini et al., 2000)

24 Endoplazmatické retikulum (ER) V endoplazmatickém retikulu jsou proteiny sbaleny do nativní konformace. Špatně sbalené proteiny jsou zadržovány, buď dokončují tento proces nebo jsou degradovány (Hussain a Ramaiah, 2007). Existují tři signální dráhy, které regulují množství proteinů obsažených v ER a degradaci proteinů špatně sbalených (Malhorta a Kaufman, 2007). Pokud tyto systémy selžou, dochází k apoptóze a autofagii (Rao et al., 2004). U rostlin byla apoptóza v souvislosti s GA a ER popsána u druhu Zinnia elegans, kdy došlo k degradaci těchto organel hned po vakuolárním kolapsu při přeměně mezofylových buněk na tracheární elementy (Obara a Fukuda, 2004) Mitochondrie Mitochondrie se u živočichů účastní aktivace apoptotické dráhy. Koordinují kaspázovou aktivitu přes vyplavení cytochromu c do cytozolu (Green a Reed, 1998). U rostlinných buněk dochází k vyplavení cytochromu c také. Balk et al. (1999) popsal translokaci cytochromu c do cytozolu po ovlivnění kotyledonů okurky vysokou teplotou. K vyplavení cytochromu c došlo i při hypersenzitivní reakci (Saviani et al ) Vakuoly Při apoptotické a autofagické smrti živočišných buněk dochází k vakuolizaci cytoplazmy, u autofagie i k degradaci cytozolu a organel. U rostlin se vakuoly transformují ve velké kompartmenty, v nichž jsou uloženy hydrolytické enzymy. Tyto enzymy po prasknutí tonoplastu způsobují destrukci buněčného aparátu (Kuriyama, 1999). Kolaps vakuoly je řízen buňkou, hned po kolapsu dochází k fragmentaci DNA a degradaci organel (Inada et al., 1998) Plazmatická membrána Plazmatická membrána při PCD ztrácí symetrii. U rostlin i u živočichů bylo potvrzeno, že dochází k přesunu fosfatidylserinu z vnější strany plazmatické membrány na vnitřní.

25 4.2.4 Role PCD ve vegetativním vývoji rostlin Aleuronová vrstva a endosperm Aleuronová vrstva je sekretorické pletivo produkující hydrolytické enzymy používané pro mobilizaci zásobních produktů v endospermu během klíčení semen. Model odumírání těchto buněk byl vytvořen u ječmene a má tři fáze. V první fázi dochází k degeneraci buněk škrobového endospermu škrobový endosperm zralých zrn je složen z mrtvých buněk, ale buňky si udržují svoji strukturu obsahující zbytky jader, ribozómů a endoplazmatického retikula. Druhá fáze zahrnuje odstranění těchto zbytků z aleuronové vrstvy pomocí degradačních enzymů. Třetí fází je programované umírání buněk aleuronové vrstvy (Fath et al., 2000). PCD těchto buněk lze regulovat i pomocí fytohormonů. V protoplastech buněk aleuronové vrstvy ošetřených gibereliny docházelo ke zvýšené vakuolizaci, snížení ph a hromadění hydrolytických enzymů. Po ošetření ABA se PCD oddaluje a ph se nemění (Young a Gallie, 2000) Tracheální elementy Tracheální elementy (TE) jsou cévy a cévice tvořené mrtvými buňkami zajišťující v rostlině transport vody, iontů a živin. Proces PCD zahrnuje pouze terminální diferenciace xylému. Na konci nově vzniklých TE dochází k perforacím buněčných stěn (Shinohara et al., 2000). Modelovým organizmem pro studium této oblasti PCD je Zinnia elegans, z níž lze jednoduše izolovat mezofylové buňky (Fukuda a Komamine, 1980 a, b). Tyto buňky jsou za přítomnosti auxinů a cytokininů schopné rediferenciace v tracheální elementy (Fukuda, 1997; Obara a Fukuda, 2004). Dochází ke ztrátě fotosyntetického aparátu, dediferenciaci, diferenciaci prokambia v TE, vytvoření sekundární buněčné stěny a její následné lignifikaci. Po lignifikaci dochází k úplné autolýze celého protoplastu a řadě cytologických změn degradaci buněčných organel a vakuolárnímu kolapsu (Groover et al., 1997; Groover a Jones, 1999; Kuriyama, 1999). Buněčné jádro je díky rozpínání vakuoly tlačeno k buněčné stěně a mění svůj tvar, poté dochází k degradaci jaderné DNA (Obara et al., 2001).

26 5. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ Pro experimenty byla použita suspenzní kultura buněčné linie tabáku BY-2 (Nicotiana tabacum L., cv. Bright Yellow 2). Ta byla v sedmdesátých letech vyselektována z průmyslově využívané suspenzní kultury tabáku, která byla ještě několik let předtím odvozena z kalusu na in vitro pěstovaných semenáčcích tabáku (Nagata et al., 1992; Nagata, 2004). Pasážování kultury probíhá pravidelně dvakrát týdně. Suspenze byla kultivovaná ve 100 ml Erlenmeyerových baňkách na MS (Mourashige & Skoog) médiu (složení viz. tabulka 1.). Médium bylo sterilizováno v autoklávu TUTTNAUER 3870 EA 15 minut při 120 C. K založení experimentů byly použity jednorázové serologické pipety, práce probíhala ve výhradně sterilních podmínkách ve flowboxu, Erlenmeyerovy baňky byly sterilizovány v autoklávu a uzavřeny alobalem. Kultivace probíhala na třepačce KÜHNER SHAKER při teplotě 27 C, 135 otáčkách/min. a rozptýleném světle po dobu pěti dnů. Byly použity dvě varianty média s 2,4-D a bez 2,4-D, u obou byla stanovována životnost. Stanovení životnosti suspenze Životnost byla stanovována 2., 3., 4. a 5. den po založení experimentu fluorescenčním barvením v mikrozkumavkách eppendorf. Do mikrozkumavek bylo pipetováno 25 µl buněčné suspenze, 10 µl PI (propidium jodid) červená fluorescence mrtvých buněk, a 3 µl FDA (fluorescein diacetát) zelená fluorescence buněk živých. Preparáty byly vyhodnocovány na fluorescenčním mikroskopu OLYMPUS IX 70 a fotografovány fotoaparátem OLYMPUS SP-350. Tab. 1 Složení média mikroelementy koncentrace na 1 l sacharóza 30 g KH 2 PO 4 0,2 g thiamin 1 ml mg/l CoCl 2. 6 H 2 O 0,025 CuSO 4. 5 H 2 O 0,025 FeNaEDTA 36,70 H 3 BO 3 6,20

27 makroelementy vitamíny KI 0,83 MnSO 4. H 2 O 16,90 Na 2 MoO 4. 2 H 2 O 0,25 ZnSO 4. 7 H 2 O 8,60 mg/l CaCl 2 332,02 KH 2 PO 4 170,00 KNO ,00 MgSO 4 180,54 NH 4 NO ,00 mg/l glycin 2,00 myo-inositol 100,00 kys. nikotinová 0,50 pyridoxin HCl 0,50 thiamin HCl 0,10 Do média pro variantu 1 bylo přidáno 2,4-D v koncentraci 0,2 ml/l. Thiamin byl připraven jako zásobní roztok 90 mg/100 ml vody, 2,4-D taktéž jako zásobní roztok 1mg/1 ml vody.

28 6. VÝSLEDKY V experimentu byla sledována životnost buněk tabáku v médiu s přidanou 2,4-D (varianta 1) a v médiu bez 2,4-D (varianta 2). Jak je patrné z grafu 1, životnost buněk při založení kultury se blíží 100%, v dalších dnech klesá. U varianty 1 je pokles mírnější než u varianty 2. U varianty 1 ve 2. den kultivace životnost klesla o 1%, ve 3. den o 4%, ve 4. den o 5% a v 5. den kultivace o 6%. U varianty 2 můžeme pozorovat už ve 2. den kultivace pokles životnosti o 6%, ve 3.den o 7%, ve 4. den o 9% a v 5. den o 10%. Tab. 2 Životnost buněk v jednotlivých opakováních pokusu 2. den 3. den 4. den 5. den kontrola - 2,4-D kontrola - 2,4-D kontrola - 2,4-D kontrola - 2,4-D 1. 98,47 88,73 93,71 90,31 94,57 89,72 93,68 89,00 týden 2. 98,14 94,21 96,49 93,10 94,81 91,07 93,70 89,30 týden 3. 97,96 96,17 94,28 92,43 93,70 90,56 92,89 91,03 týden Ø 98,19 ± 0, ,04 ± 3, ,83 ± 1, ,95 ± 1, ,36 ± 0, ,45 ± 0, ,42 ± 0, ,78 ± 0, Tab. 3 Životnost buněk kontrola životnost [%] bez 2,4-D životnost [%] 2. den 98,19 93,04 3. den 94,83 91,95 4. den 94,36 90,45 5. den 93,42 89,78 Graf 1 Životnost buněk životnost (%) den 3. den 4. den 5. den kultivace (dny) kontrola bez 2,4-D

29 Obrázek 1 4 ukazuje průběh pokusu u varianty 1, obrázek 5 8 průběh u varianty 2. U varianty 1 jednak není tolik mrtvých buněk a buňky si také zachovávají stejný tvar jako na počátku. U varianty 2 se buňky v průběhu pokusu víc seskupují a, jak je vidět na obrázku 8, mění svůj tvar nafukují se. Dále jsem pozorovala i změny barvy suspenze v Erlenmeyerových baňkách, varianta 2 byla tmavě žlutá, kdežto varianta 1 jen lehce nažloutlá. Obr. 10 Varianta 1, 2. den Obr. 11 Varianta 1, 3. den Obr. 12 Varianta 1, 4. den Obr. 13 Varianta 1, 5. den

30 Obr. 14 Varianta 2, 2. den Obr. 15 Varianta 2, 3. den Obr. 16 Varianta 2, 4. den Obr. 17 Varianta 2, 5. den

31 7. DISKUZE Programovanou buněčnou smrt (PCD) lze indukovat různými způsoby a lze také sledovat různé známky poškození buněk. Já jsem se v této práci zaměřila na ovlivnění PCD růstovými regulátory, konkrétně syntetickým auxinem 2,4-D. Náplní mé práce bylo zjistit, jaká je životnost u buněk s přidanou 2,4-D v médiu (kontrolní vzorek) a bez 2,4-D v médiu. Výsledky jednoznačně prokázaly, že suspenzní kultura tabáku BY-2 je závislá na přítomnosti 2,4-D v médiu, což souhlasí s výsledky Richterové (2005), která uvedla, že suspenze téměř vyčerpá 2,4-D po pětidenní kultivaci. Proto se obvykle tato suspenze subkultivuje po čtyřech dnech. Richterová dále uvádí, že při přidání 1 µm BAP do média lze pozorovat odlišnou morfologii buněk buňky jsou protáhlé, ale nejde o indukci PCD. K té je zapotřebí BAP v koncentraci asi 27 µm (Carimi et al., 2003). PCD lze indukovat i navozením hypersenzitivní reakce (HR), po které následuje PCD. HR může být v buněčných kulturách indukována přidáním patogenů do média. Naton et al. (1996) přidali do suspenzní kultury petržele fytopatogenní houbu Phytophtora infestans a studovali aktivaci rostlinných obranných reakcí a indukovali PCD u 60% buněk. PCD lze indukovat i teplotním stresem. McCabe a Leaver (2000) spustili u kultur mrkve a okurky PCD působením teploty 55 C. Šlo o navození synchronním způsobem, PCD spustili u 90% buněk. Koukalová et al. (1997) spouštěla PCD chladovým stresem buněčná kultura tabáku byla pěstována při 5 6 C. U obou těchto experimentů autoři pozorovali znaky PCD, jako např. kondenzaci protoplastu a jádra a štěpení DNA. V mé práci se nepodařilo indukovat PCD u tak velkého množství buněk, proto se domnívám, že při použití růstových regulátorů nelze indukovat PCD synchronním způsobem.

32 8. ZÁVĚR Rostliny, resp. rostlinné buňky jsou na růstových regulátorech závislé. Závěrem lze tedy říci, že růstové regulátory významně ovlivňují programovanou buněčnou smrt. Výsledky mé práce to jednoznačně potvrzují. Při normální kultivaci se životnost kultivovaných buněk jen mírně snižuje, což je normální jev. Při kultivaci v médiu bez růstových regulátorů životnost klesá mnohem rychleji buňky programovaně umírají. V další práci bych se ráda zaměřila na detailnější zkoumání umírajících buněk, na kondenzaci protoplastu a jádra.

33 9. SEZNAM LITERATURY BALK, J., LEAVER, C. J., McCABE, P. F. Translocation of cytochrome c from the mitochondria to the cytosol occurs during heat-induced programmed cell death in cucumber plants. FEBS Letters, 1999, roč. 463, s * CARIMI, F., ZOTTINI, M., TERZI, M., FORMENTIN, E., LO SCHIAVO, F. Cytokinins: new apoptotic inducers in plants. Planta, 2003, roč. 216, s *** DANON, A., GALLOIS, P. UV-C radiation induces apoptotic like changes in Arabidopsis thaliana. FEBS LETT., 1998, roč. 437, č. 1, s FATH, A., BETHKE, P., LONSDALE, J., MEZA-ROMERO, R., JONES, R. Programmed cell death in cereal aleurone. Plant Molecular Biology, 2000, roč. 44, s * FUKUDA, H., KOMAMINE, A. Establishment of an experimental systém for the study of tracheary element differentiation from single cells isolated from the mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiology, 1980a, roč. 65, s * FUKUDA, H., KOMAMINE, A. Direct evidence for cytodifferentiation to tracheary elements without intervening mitosis in a culture of single cells isolated from the mesophyll of Zinnia elegans. Plant Physiology, 1980b, roč. 65, s * FUKUDA, H. Tracheary element differentiation. Plant Cell, 1997, roč. 9, s * GREEN, D. R., REED, J. C. Mitochondria and apoptosis. Science, 1998, roč. 281, s * GROOVER, A., JONES, A. M. Tracheary element differentiation uses a novel mechanism coordinating programmed cell death and secondary cell wall synthesis. Plant Physiology, 1999, roč. 119, s * GROOVER, A., DeWITT, N., HEIDEL, A., JONES, A. Programmed cell death of plant tracheary elements: Differentiating in vitro. Protoplasma, 1997, roč. 196, s * HAVEL, L. Apoptóze u rostlin. Disertační práce. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, s HAVEL, L. Růstové regulátory a explantáty. In PROCHÁZKA, ŠEBÁNEK A KOL. Regulátory rostlinného růstu. Praha: Academia, s HOUOT, V., ETIENNE, P., PETITOT, A. S., BARBIER, S., BLEIN, J. P., SUTY, L. Hydrogen peroxide induces programmed cell death features in cultured tobacco BY-2 cells, in a dose-dependent manner. Journal of Experimental Botany, 2001, roč. 52, s * INADA, N., SAKAI, A., KUROIWA, H., KUROIWA, T. Three-dimensional analysisof the senescence program in rice (Oryza sativa L.) coleoptiles Investigations by fluorescence microscopy and electron microscopy. Planta, 1998, roč. 206, s * KAMÍNEK, M. Cytokininy. In PROCHÁZKA, ŠEBÁNEK A KOL. Regulátory rostlinného růstu. Praha: Academia, s KERR, J. F. R., WYLLIE, A. H., CURRIE, A. R. Apoptosis basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer, 1972, roč. 26, s. 239-&. * KOUKALOVÁ, B., KOVARÍK, A., FAJKUS, J., ŠIROKÝ, J. Chromatin fragmentation associated with apoptotic changes in tobacco cells exposed to cold stress. FEBS Lett., 1997, roč. 414, s **

34 KURIYAMA, H. Loss of tonoplast integrity programmed in tracheary element differentiation. Plant Physiology, 1999, roč. 121, s * MACHÁČKOVÁ, I. Auxiny. In PROCHÁZKA, ŠEBÁNEK A KOL. Regulátory rostlinného růstu. Praha: Academia, s MANCINI, M., MACHAMER, C. E., ROY, S., NICHOLSON, D. W., THORNBERRY, N. A., CASCIOLA-ROSEN L. A., ROSEN, A. Caspase-2 is localized at the Golgi complex and cleaves golgin-160 during apoptosis. Journal of Cell Biology, 2000, roč. 149, s * McCABE, P. F., LEAVER C. J. Programmed cell death in cell cultures. Plant Molecular Biology. 2000, roč. 44, č. 3, s NATON, B., HAHLBROCK, K., SCHMELZER, E. Correlation of rapid cell death with metabolic changes in fungus-infected, cultured parsley cells. Plant Physiology, 1996, vol. 112, s ** NAGATA, T. When I encountered tobacco BY-2 cells!, Tobacco BY-2 cells. Edited by Nagata T., S. Hasezawa, D. Inzé. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. 2004, s. 1-6 * NAGATA, T., NEMOTO, Y., HASEZAWA, S. TobaccoBY-2 Cell-line as the HeLa cell in the cell biology of Higher-Plants. International Review of Cytology-A Survey of Cell Biology, 1992, vol. 132, s * OBARA, K., FUKUDA, H. Programmed cell death in xylem differentiation. Programmed Cell Death in Plants, 2004, s * OBARA, K., KURIYAMA, H., FUKUDA, H. Direct evidence of active and rapid nuclear degradation triggered by vacuole rupture during programmed cell death in Zinnia. Plant Physiology, 2001, roč. 125, s * PROCHÁZKA, S. a kol. Botanika: morfologie a fyziologie rostlin. dotisk Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, s PROCHÁZKA, ŠEBÁNEK A KOL. Regulátory rostlinného růstu. Praha: Academia, s RICHTEROVÁ, L. Dynamika obsahu 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny v procesu růstu buněčné suspenze tabáku BY-2. Diplomová práce. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, s SAVIANI, E. E., ORSI, C. H., OLIVEIRA, J. F. P., PINTO-MAGLIO, C. A. F., SALGADO, I. Participation of the mitochondrial permeability transition pore in nitric oxide-induced plant cell death. FEBS Letters, 2002, roč. 510., s * SHINOHARA, N., DEMURA, T., FUKUDA, H. Isolation of a vascular cell wallspecific monoclonal antibody recognizing a cell polarity by using a phage display subraction method. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, roč. 97, s * YOUNG, T. E., GALLIE, D. R. Regulation of programmed cell death in maize endosperm by abscisic acid. Plant Molecular Biology, 2000, roč. 42, s * * citováno z: KUTHANOVÁ, A. Indukce a detekce programované buněčné smrti (PCD) v buněčných liniích tabáku. Dizertační práce. Praha: Univerzita Karlova, ** citováno z: McCABE, P. F., LEAVER C. J. Programmed cell death in cell cultures. Plant Molecular Biology. 2000, roč. 44, č. 3, s

35 *** citováno z: RICHTEROVÁ, L. Dynamika obsahu 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny v procesu růstu buněčné suspenze tabáku BY-2. Diplomová práce. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, s