Transport a sekrece bakterií a kvasinek

Transkript

1 Transport a sekrece bakterií a kvasinek Proteiny prokaryotních mikroorganismů určené k transportu obsahují na N- terminálním konci sekvence nazývané signální peptidy.

2 Základní fosfolipidová molekula

3 Základní moduly cytoplasmatické membrány

4

5 FL fosfolipid, LPS lipopolysacharid, Po porin, LP - lipoprotein

6 Typy porinů

7 Schema sekrečního kanálu

8 Syntéza Zanoření do membrány Translokace Sekrece proteinů Rozpoznání signálního peptidu Odštěpení signálního peptidu speciální peptidasou Konečné umístění zralého peptidu Signální sekvence : AK Počátek: 5-6 AK, pozitivní náboj Střední část: průměrně 12 AK, hydrofobní bez náboje, α-helix Koncová část:c-terminální, 6 AK, neutrální AK v pozici -1 a -3, často prolin nebo glycin

9 Signální peptidy - funkce

10 Proteiny vnější membrány (VM) G - bakterií Protein funkce OmpA stabilizace VM a konjugace F, receptor Tu II fága Murein lipoprotein nejhojnějšní protein u E.coli, S,typhimurium OmpB (porin) difuzní kanál pro metabolity včetně maltosy LamB (maltoporin) specifický porin pro maltosu, maltodextrin, receptor bakterofága λ OmpC (porin) difuzní kanál malých molekul, receptor fága TuIb a T4 OmpF (porin) difuzní kanál malých molekul, receptor fága TuIa a T2 OmpT proteasa PhoE (protein E) anion-selektivní difuzní kanál indukovaný limitací fosfátu Protein P anion-selektivní difuzní kanál Ps. aeruginosa, TolA udržení integrity VM, skupina A kolicinů TonA vstup sideroforu (Fe), receptor T1, T5, 80, kolicin M TonB vstup sideroforu (Fe), transport B 12 Tsx kanál pro nukleosidy, receptor sudých fágů, kolicin K

11 Proteiny určené k transportu signální sekvence

12 Typy asociace proteinů s membránou

13 Typy membránových proteinů

14 Transport oligopeptidů Oligopermeasový systém opp mutanty špatně sporulují fenotypicky se zastavují ve stadiu 0 Sporulační defekt je výsledkem zablokování transportu oligopeptidů Vazebný protein pro peptid OppA je u B. subtilis zakotven v membráně jako lipoprotein

15 Většina bakteriálních proteinů určených k odchodu z cytoplasmy jsou exportovány via vysoce konzervovanou SecA-YEG (Sec) dráhu.

16 Průchod sekretovaného proteinu

17 Sekrece typu III Vyskytuje se u G - bakterií patogenních pro lidi, zvířata i rostliny Tento typ sekrece podmiňuje jejich virulenci Systém se aktivuje kontaktem s eukaryotní cytoplasmatickou membránou a umožňuje bakteriím injikovat své proteiny do napadené buňky. Yersinia je vybavena virulonem Yop, který umožňuje obranu proti primární imunitní obraně napadených buněk Sekreční aparát 25 proteinů a soubor dalších 12 Yop YopE, YopH, YopP, YopM, YopT, YopJ, YpkA/YopO, YopP/ YopJ Ničí cytoskeleton a blokují fagocytosu (E, H, T) zabraňují uvolnění cytokinů(yopp/ YopJ) a indukují apoptosu

18 Translokace přes membránu Vyžaduje účast dalších proteinů porační aktivita Významná je účast malého 11 kda proteinu LcrG, úloha při translokaci.

19 Jednoduchá sekrece

20 Typy sekrece

21 Sekrece typu III

22 Sekrece typu III

23 Sekrece typu IV tvorba bičíků

24 Typy sekrece u Gram-negativních bakterií Typ I. je energizovaná hydrolýzou ATP, jedná se o jednokrokový přesun z cytoplasmy do periplasmatického prostoru ( α-hemolysin u E. coli ABC přenašeč) Typ II. obecná sekreční dráha vyžaduje energii z ATP a pmf, někdy GTP. První fáze přesunu přes cytoplasmatickou membránu je řízena geny anaolgními k sec genům. Proteiny mají N-terminální signální sekvenci, účast signal recognition particles SRP. Typ III. Sekrece používá systému kanálů (pórů) vycházejících z cytoplasmy na povrch buňky. Je funkční u patogenů. Proteiny obsahují N-terminální signální sekvenci, ale ta není odštepovaná. Proteiny bazálního tělíska bičíku. Typ IV. Proteiny obsahují N-terminální signální sekvenci, α-doménu, C-terminální β-doménu, bičíky, proteásy patogenů. Typ V. Přenos T-DNA z Agrobacter tumefaciens do hostitele a sekrece toxinu Bordetella pertussis

25 Bakteriální neklasicky sekretované proteiny Modelové vyhledávací metody byly použity k vyhledávání sekvencí pro identifikaci údajné signální sekvence nebo motivu odpovědného za sekreci. Žádný signál ani charakteristický motiv nebyly nalezeny pro velký počet neklasicky sekretovaných proteinů. Je zřejmé, že tyto proteiny jsou sekretovány novým způsobem. Nicméně bylo nalezeno, že zjevně neklasicky sekretované proteiny jsou rozlišitelné od buněčných proteinů svým složením aminokyselin, sekundární strukturou a neuspořádanými oblastmi (regiony). Je zřetelné, že předpověď neuspořádanosti odhaluje, že bakteriální sekretované proteiny jsou více strukturně neuspořádané než jejich cytoplasmatické analogy.

26 Bakteriální neklasicky sekretované proteiny Sekrece proteinů přes biologické membrány je většinou zprostředkovaná translokačními mechanismy rozpoznávajícími specifické sekvenční značky (tag) nebo motivy označujícími proteiny k sekreci. U bakterií, the klasický tripartitně strukturovaný Sec signální peptid řídí cíle sekrečních drah. Kromě Sec-závislé sekrece, různé další sekreční dráhy byly objeveny,pracují způsobem nezávislým na Sec. Převládajícím typem je twin-arginine translokace (Tat) tato sekreční dráha využívá twin-arginine konsensus motivu a je uložena uvnitř vlastního signálního peptidu. Zatímco Sec- a Tat-závislá seckreční dráha translokuje proteiny pouze přes vnitřní membránu u Gram-negativních bakterií, přídavné translokační mechanismy byly nalezeny ve vnější membráně těchto bakterií. N-terminální signální peptid má centrální roli v těchto sekrečních systémech jako tag-signální sekrece.

27 Transportní váčky vnější membrány outer membrane vesicles -OMV OMV zřejmě vznikají z periplasmatických výčnělků a propojují tak CM s OM. Zatím popsány u gramnegativních bakterií, obsahují DNA, RNA, proteiny, endotoxiny a podobné virulenční molekuly. OMV vynášejí endotoxické lipopolysacharidy na povrch a iniciují vznik onemocnění u hostitele. Mohou rovněž obsahovat signální molekuly pro quorum sensing a tvorbu biofilmu.

28 Tvorba OMV

29 Transportované látky

30 Transmisní el. mikroskopie negativně barvených OMV u C.jejuni OMV u divokého kmene C. jejuni 11168H (A) a kmene (B) s intaktní dvojvrstevnou membranou. OMV mají nepravidelný kulovitý tvar a nemají jednotnou velikost. Šipky ukazují rozdíly v densitě izolovaných OMV. Průměr váčků kolísá od 10 do 250 nm (měřítko- úsečka, 500 nm).

31 Proteomická analýza C. jejuni 11168H Bylo identifikováno 151 proteinů, včetně periplasmatických a s vnější membránou asociovaných proteinů, ale také proteiny důležité pro přežití a patogenezi, včetně CDT (cytoletální distendní toxin). OMV obsahovaly 16 N-vázané glykoproteiny, což naznačuje, jak periplasmaticky lokalizované imunogenní proteiny mohou interagovat s buňkami hostitele. Váčky C.jejuni mají cytotoxickou aktivitu a indukují imunitní odpověď hostitele na T84 intestinálních epiteliálních buňkách. Tato odpověď nebyla zeslabena působením proteinázy K nebo polymyxinem B před jejich inkubací s intestinálními epiteliálními buňkámi..

32 Modelový systém (artificial neural networks) byl použit ke konstrukci znaků proteinů k identifikaci neklasicky sekretovaných proteinů u Gram-pozitivních a Gram-negativních bakterií

33 Artificial neural networks were used to construct protein feature based methods for identification of non-classically secreted proteins in both Gram-positive and Gram-negative bacteria

34 Účast Golgi aparátu na transportu

35 Účast dalších vesikulů na transportu

36 Syntéza a transport proteinů

37 ER u kvasinek

38 Transport u kvasinek Endoplasmatické retikulum (ER) - cytoplasmatická organela - počátek sekreční dráhy. Sekrece proteinů začíná spolu s kotranslační inzercí polypeptidového řetězce do ER. Proteiny jsou glykosylované a skládají se v lumen ER a přepravují se v obalených váčcích (COPII coated vesicles), které pučí ER a dopravují svúj náklad do Golgi aparátu. Proteiny po projití Golgi aparátem jsou směrovány buď do vakuol nebo do cytoplasmatické membrány. Ačkoli se ER a jádro liší strukturou, jejich membrány a lumen jsou are spojité a oba systémy jsou místy přenosu proteinů.

39 Kvasinkový feromon Kvasinkový kopulační feromon alfa faktor inhibuje adenylát cyklasu in vitro, alfa faktor inhibuje membránově vázanou adenylát cyklasu buněk v závislosti na koncentraci.

40 a buňky produkují a-faktor, sexuální feromon, který signalizuje přítomnost a buňky sousední α buňce. a buňky odpovídají na α-faktor, růstem směrem k zdroji (shmoo) α-faktoru. Podobně, α buňky tvoří α-faktor, a odpovídají na a- faktor růstem ke zdroji feromonu. Odpověď haploidních buněk se týká pouze sexuálního feromonu opačného párovacího typu.

41

42 Kvasinkový feromon α faktor

43 Signální dráha kvasinkového sexuálního faktoru Extracelulární mating factor se váže na G-protein vázaný receptor v cytoplasmatické membráně. Aktivace receptoru spouští disociaci podjednoty Ga, která váže GTP z heterotrimerického G-proteinu. Ten obratem aktivuje GTP-vazebný protein z Rho family, Cdc42, který je kvasinkovým homologem malé savčí GTPase, která aktivuje spouštění za tvorby filopodie. Tak jako v savčích buňkách Cdc42 aktivuje protein (Bee1, homolog WASp) který aktivuje ARP komplex, vedoucí k místní nukleaci aktinu, v místě vazby mating Faktoru. Místní nukleace aktinu a růst vláken vede k polarizovanému růstu a získání tvaru shmoo. Nadto aktivace receptoru spouští další odpovědi přes MAP kinasovou Kaskádu a připravuje tak haploidní buňku na spájení ( mating).