Rekombinantní protilátky, bakteriofágy, aptamery a peptidové scaffoldy pro analytické a terapeutické účely Luděk Eyer

Transkript

1 Rekombinantní protilátky, bakteriofágy, aptamery a peptidové scaffoldy pro analytické a terapeutické účely Luděk Eyer Virologie a diagnostika Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno

2 Alternativní biologické rozpoznávací elementy rekombinantní protilátky nanoprotilátky modifikované bakteriofágy aptamery peptidové scaffoldy

3 I. Rekombinantní protilátky Protilátkové fragmenty připravené rekombinantními technologiemi

4 Formáty rekombinantních protilátek VH VL CH1 CL CH2 VH VL CH3 CH1 CL VH VL VH VL VH VL IgG Fab scfv dsfv

5 Technologie přípravy rekombinantních protilátek B-lymfocyty / hybridomy izolace genetického materiálu fágová knihovna selekce a izolace protilátky vázající antigen expresní systém produkce protilátky

6 Izolace genetického materiálu B-lymfocyty/hybridomy mrna cdna VL VH primer linker VL VH restrikční místo VL VH

7 Konstrukce fágové knihovny elektroporace fágemid bakteriální buňka amplifikace fága fágová knihovna

8 Fágová knihovna Heterogenní směs fágových částic obsahujících různé protilátkové geny exprimující různé fágové protilátky Fág M13

9 Fágová knihovna Naivní knihovna Knihovna získaná z imunizovaných zvířat Syntetická knihovna

10 Biopanning selekce fágové protilátky s nejvyšší afinitou k antigenu analogie klonální selekce in vivo

11 Biopanning Inkubace knihovny s imobilizovaným antigenem Odmytí Odmytí Eluce Eluce Reamplifikace fága

12 Izolace pozitivního fágového klonu

13 Produkce rekombinantní protilátky v expresním systému Přenos genu pro rekombinantní protilátku do expresního systému Bakterie (E. coli, B. brevis) Kvasinky (Saccharomyces, Pichia) Savčí buňky Hmyzí buňky Geneticky modifikované rostliny

14 Produkce rekombinantní protilátky v expresním systému VL VH Signální sekvence His-tag Transport do periplazmatického prostoru nebo ven z buňky Purifikace protilátky afinitní chromatografií

15 Afinitní maturace in vitro: zvýšení afinity rekombinantní protilátky Mutageneze a rekombinace Analogie afinitní maturace in vivo

16 Metody afinitní maturace in vitro Náhodná mutageneze error prone PCR bakteriální mutátorové kmeny Místně řízená mutageneze PCR s degenerovanými primery Přeskupování přeskupování řetězců přeskupování DNA

17 I. Náhodná mutageneze error prone PCR bakteriální mutátorové kmeny

18 II. Místně řízená mutageneze PCR s degenerovanými primery

19 III. Rekombinační technologie přeskupování řetězců přeskupování DNA

20 Přeskupování řetězců VL VL VL VL VL VL vyštěpení endonukleázami smíchání a opětovné spojení ligázou VH VH VH VH VH VH VL VL VL VH VH VH klonování do fágemidu + selekce

21 Přeskupování DNA naštěpení na krátké fragmenty PCR klonování do fágemidu + selekce

22 Výhody rekombinantních protilátek tvorba protilátky bez imunizace zvířat neomezená produkce genetická manipulace - změna afinity a specifity Nevýhody rekombinantních protilátek nižší affinita a specifita oproti klasickým protilátkám

23 Nanoprotilátky Protilátky tvořeny těžkým řetězcem Výskyt u čeledi Camelidae a některých paryb Nanoprotilátka Konvenčí protilátka Protilátka tvořená těžkým řetězcem

24 Nanoprotilátka versus scfv fragment VH nanoprotilátka

25 Výhody nanoprotilátek Malá velikost penetrace do buněk a tkání Neobvyklé paratopy Vysoká rozpustnost a stabilita Genetické manipulace změna afinity a specifity Nízká imunogenicita diagnostický a TERAPEUTICKÝ potenciál

26 Aplikační možnosti nanoprotilátek diagnostika a inaktivace patogenů identifikace toxinů a detoxifikace diagnostika malých molekul haptenů diagnostika a terapie nádorových onemocnění imunoafinitní chromatografie biosenzory

27 II. Bakteriofágy Fágy exprimující na povrchu krátké peptidy rozpoznávající antigen

28 Bakteriofágy Technologie fágového displeje Využití bakteriofága pro vývoj vysoce citlivých imunoanalytických metod

29 Fágová peptidová knihovna velikost: jednotlivých fágových klonů -GG-C(X) 6-8 C(GGGGS) 3 -

30 Phage anti-immunocomplex real-time PCR Nekompetitivní imunoanalytická metoda pro detekci malých molekul Rozpoznání imunokomplexu protilátka-analyt Kvantifikace pomocí RT-PCR bakteriofág eluce fágová DNA analyt protilátka fágový peptid RT-PCR

31 Výhody PHAIA-PCR oproti klasické ELISA Rychlá selekce pozitivního fágového kmene Vyšší citlivost metody - PCR amplifikace Nekompetitivní metoda pro detekci malých molekul

32 III. Aptamery syntetické oligonukleotidy vázající cílové molekuly

33 Aptamery ssrna nebo ssdna délka: bazí interakce s ligandem založena na vodíkových vazbách

34 Sekundární a terciární struktury aptamerů

35 Technologie SELEX Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment selekce aptameru s nejvyšší afinitou k antigenu oligonukleotidová knihovna screening cílová molekula regenerace vazba amplifikace cyklů odmytí eluce

36 Aplikační možnosti aptamerů flow cytometrie kapilární elektroféza elektrochromatografie afinitní chromatografie biosenzory terapie

37 Výhody aptamerů vysoká stabilita a životnost netřeba imunizovat zvířata rychlá selekce funkčního aptameru

38 IV. Peptidové/proteinové scaffoldy peptidy nebo proteiny vázající se s vysokou afinitou k cílovým molekulám

39 Proteinový scaffold hypervariabilní smyčky interakce s ligandem scaffold tvořený α-helixy nebo β-listy hypervariabilní smyčky

40 Výhody scaffoldů vysoká strukturní stabilita vysoká rozpustnost snadná exprese široký aplikační potenciál

41 University of California, Davis, USA Department of Entomology Nanoprotilátky Bakteriofágy

42 Děkuji Vám za pozornost. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno