Intracelulární Ca 2+ signalizace

Transkript

1 Intracelulární Ca 2+ signalizace Vytášek 2009

2 Ca 2+ je universální intracelulární signalizační molekula (secondary messenger), která kontroluje řadu buměčných metabolických a vývojových cest intracelulární koncentrace klidových buněk je nM, aktivované buňky mají Ca 2+ koncentraci nad 1μM koncentrační změny Ca 2+ mohou aktivovat velmi rozličné signalizační kaskády nejen v rozličných typech hbuněk, ale i v rozličných ýhkompartmentech dané buňky (např. zvýšení Ca 2+ v jádře neuronu vede k aktivaci genové transkripce a zvýšení Ca 2+ v synapsi způsobí uvolnění neurotransmiteru)

3 Procesy ovlivněné změnami koncentrace Ca 2+ Učení a paměť Kontrakce a relaxace Membránová excitabilita Buněčná motilita Cytoplasmatický a mitochondriální metabolism Syntéza bílkovin a lipidů Buněčný cyklus Apoptosa

4 Buněčné proteiny vážící Ca 2+ Tyto bílkoviny mění svou konformaci a náboj po vazbě kationtu vápníku Tyto proteiny existují ve dvou stavech : - apo-forma bez vápníku - intracelulární Ca 2+ koncentrace je okolo 50nM (klidový stav) - kalcium-forma s navázaným Ca 2+ - po zvýšení intracelulární Ca 2+ koncentrace k 1000nM (aktivovaný ýstav vpos stimulaci) Typický motiv polypeptidického řetězce, který váže Ca 2+ a moduluje konformaci příslušné bílkoviny, je EF-hand motiv

5 EF-hand motiv vazného místa pro vápník

6 Proteiny obsahující EF-hand doménu Kalmodulin subrodina kalmodulin, troponin C, lehký řetězec myosinu Kalcineurin subrodina kalcineurin (fosfatasa 2B) Ostatní subrodiny kalpain (proteolytický enzym), kalbindin (cytosolický (y ýp protein vážící Ca 2+ )

7 Kalmodulin (CaM) všudypřítomný v buňkách eukaryontů malý, acidický protein přibližně 148 aminokyselin dlouhý (17kDa) vysoce konservovaná aminokyselinová sekvence čtyři EF-hand domény respektive čtyři vazná místa pro vápníkový kation vazba vápníku moduluje jeho konformaci a komplex Ca 2+ -kalmodulin je schopen odlišné interakce se svými cílovými proteiny. Komplex Ca 2+ -kalmodulin-cílový protein vykazuje odlišné funkční vlastnosti oproti disociovanému nekomplexovanému cílovému proteinu

8 Konformační změny kalmodulinu po vazbě vápníkových iontů

9 Ca 2+ Blue circles

10 Proteiny tvořící funkčně změněný komplex s Ca 2+ -kalmodulin Protein kinasy (CaMK) Kalcineurin (protein fosfatasa 2B) Adenylat cyklasy NO synthasy camp fosfodiesterasa Iontové ékanály Receptory

11 Kalcium/kalmodulin-dependentní protein kinasy CaMK enzymová rodina je aktivována zvýšením it intracelulární llá íkoncentrace Ca 2+ a fosforyluje f OH skupinu serinu nebo threoninu pomocí ATP

12 Kalcium/kalmodulin-dependentní protein kinasy (CaMK) s vysokou specifitou CaMLCK - myosin light chain kinase fosforyluje lehký řetězec myosinu a tato fosforylace stačí pro svalovou kontrakci. Enzym existuje ve dvou formách - SkCaMLCK v skeletálních svalových buňkách a SmCaMLCK je přítomná nejen v hladkých svalových buňkách, ale i v odlišných typech buněk. Obě CaMLCKs jsou stimulovány vazbou Ca 2+ - kalmodulin, ale tato vazba může být v případě p SmCaMLCK inhibována vlastní fosforylací (způsobenou různými jinými kinasami)

13 CaMK s vysokou specifitou PhK kinasa fosforylasy fosforyluje a aktivuje glykogen fosforylasu (zvýšení degradace glykogenu) eef-2k (CaMKIII) - eukaryotického elongačního faktoru 2 kinasa fosforyluje Thr-56 v eef-2 (tento faktor pomáhá ribosomální translokaci podél mrna během translace) a tak inhibuje jeho aktivitu. Aktivita eef-2k se zvýší vazbou Ca 2+ -kalmudulin a down- reguluje autofosforylací způsobenou jinými kinasami

14 CaMK s širokou specifitou CaMKI - Kalcium/kalmodulin-dependentní protein kinasa I tři isoformy jsou produktem odlišných genů. Bylo popsáno několik substrátů pro tento enzym, ale fysiologické substráty a jejich role jsou zatím neznámé CaMKII- Kalcium/kalmodulin-dependentní acu a depe de protein kinasa II Velmi důležitý enzym nervové tkáně. ě.je lokalizován ov v pre- a postsynaptickém kompartmentu. Čtyři isoformy fosforylují různé proteiny v každé části buňky. Vykazuje také autoregulační vlastnosti. CaMKII hraje významnou roli v procesech učení a paměti

15 CaMK s širokou specifitou CaMKIV - Kalcium/kalmodulin-dependentní protein kinasa IV Obsahuje sekvenci pro jadernou lokalisaci a proto je odpovědná za Ca 2+ -dependentní fosforylaci různých jaderných transkripčních faktorů (ale fosforyluje i cytosolické proteiny). CaMKK - Kalcium/kalmodulin-dependentní dependentní protein kinasy kinasa dramaticky zvyšuje aktivitu CaMKI a CaMKIV po vazbě CaMKK ke Ca 2+ -kalmodulinu a následné fosforylaci CaMKI a CaMKIV

16 Kalcineurin (protein fosfatasa-2b) Heterodimerická molekula s vysoce konservovanou strukturou Aktivní katalytické centrum obsahuje železo a zinek Protein fosfatasa - defosforyluje jak fosfoserin/threonin tak fosfotyrosin Vazné místa pro vápník (čtyřief-hand domény v B řetězci kalcineurinu) Přednostně defosforyluje peptidy s basickými AK na N-konci a bez acidických AK na C-konci polypeptidického p řetězce substrátu Hlavním známým substrátem je NFAT (nuclear factor of activated T cells)

17 červené kuličky -vápník šedé a modré kuličky železo a zinek žlutá páska - CnA modrá páska - CnB

18 Kalcineurin (protein fosfatasa-2b) Reguluje genovou expresi Malá aktivace pozorována po zvýšení koncentrace Ca 2+ Vysoká aktivace je pozorována po přidání komplexu Ca 2+ -kalmodulin a jeho následné komplexaci s kli kalcineurinem i ; násobné zvýšení ív max. Afinitní it konstanta komplexu Ca 2+ -kalmodulin-kalcineurin je > Inhibitorem kalcineurinu je cyclosporin A (immunosupresivum) Dráha genová aktivace T lymfocytů probíhá v pořadí růst koncentrace Ca 2+ -růst aktivity Cn - defosforylace NFAT v cytoplasmě ě - tvorba komplexu NFAT-Cn a jeho transport do jádra - indukce cytokinových genů (IL-2,3,4, TNF-α, α,gm-csf)

19 Adenylát cyklasy enzymy syntetizující camp (první identifikovaný secondary messenger ) devět isoforem je vázáno na plasmatickou membranu a jedna isoforma je v cytoplasmě aktivita pěti membránových isoforem je modulována vápníkem dvě isoformy 5 and 6 jsou inhibovány zvýšenou intracelulární koncentrací Ca 2+ dvě isoformy 1 and 8 jsou aktivovány vazbou s komplexem kalcium-kalmodulin isoforma 3 je inhibována komplexem kalciumkalmodulin-kalmodulin kinasa

20 Specifická regulace isoforem adenylát cyklasy ionty vápníku

21 NO syntasy y (NOS) Generují oxid dusnatý z L-argininu Tři typy NOS : nnos, inos a enos nnos a enos jsou kostitutivně syntetizovány a jsou známy jako kalciumdependentní (jejich j enzymatická aktivita je determinována koncentrací vápníku) Všechny tři typy sice váží kalmodulin, ale pouze nnos a enos jsou aktivovány vazbou s komplexem Ca 2 -kalmodulin.

22 Vazba Ca 2+ -kalmodulin k nnos

23 Působení intracelulárního Ca2+

24 Zvýšení cytoplasmatické koncentrace Ca Transport Ca 2+ z extracelulárního prostoru - transport probíhá přes vápníkové kanály řízené agonistou (např. hormonem) nebo napětím 2. Uvolněním Ca 2+ z vápníku skladovaného v endoplasmatickém/sarkoplasmatickém retikulu - ER/SR jsou relativně bohaté na vápník-vázající proteiny y( (třídy I a II) a Ca 2+ je uvolněn do cytoplasmy po stimulaci IP 3. (tvořeného z fosfatidylinositol bisfosfátu štěpením za katalysy enzymem fosfolipasa C)

25 Signalizační dráhy Ca2+

26 Oscilace intracelulární koncentrace Ca 2+ v různých buňkách