Metody práce s proteinovými komplexy

Transkript

1 Metody práce s proteinovými komplexy Zora Nováková, Zdeněk Hodný Proteinové komplexy tvořeny dvěma a více proteiny spojenými nekovalentními vazbami Van der Waalsovy síly vodíkové můstky hydrofobní interakce nekovalentní asociace mohou být narušeny odchylkou od fyziologických podmínek

2 Možný vliv proteinových interakcí změna kinetiky proteinů konverze substrátu vytvoření nového vazebného místa inaktivace proteinu změna substrátové specifity Stabilita proteinových komplexů faktory ovlivňující stabilitu: iontová síla ph teplota použití detergentů proteiny jsou nejstabilnější ve vodném prostředí při neutrálním ph, při fyziologické iontové síle (330 miliosmolů) a v přítomnosti dalších proteinů

3 Význam studia proteinových interakcí identifikace partnera interagujícího se známým proteinem Obecný postup studia 1. určení všech případných vazebných partnerů i v případě nedodržení fyziologických podmínek 2. ověření existence interakcí, nalezených v kroku 1, za fyziologických podmínek 3. studium povahy nalezené interakce (např. její modulace v buňce nebo stabilita) Metodické přístupy nativní izolace a separace hmotnostní spektrometrie crosslinking funkční testy dvojhybridní systém genetické metody mutační analýza vzhledem v obtížnosti udržení fyziologických podmínek při studiu nekovalentních proteinových interakcí je nutné ověřit výsledky alespoň dvěma nezávislými metodami

4 Purifikace a separace komplexů afinitní chromatografie imunoprecipitace, značené fúzní proteiny gelová filtrace separace podle velikosti částic centrifugace diferenční c. oddělení kompartmentů použití sacharosových nebo glycerolových gradientů: izokinetická c. separace podle hmotnosti a tvaru částic v mírném gradientu izopyknická c. separace podle hustoty částic ve strmém gradientu Purifikace a separace komplexů (pokr.) elektroforetická separace BN PAGE (Blue Native PAGE separace podle molekulové hmotnosti komplexu) CN PAGE (Colorless Native PAGE separace podle celkového náboje komplexu) nativní agarosová gelová elektroforesa (separace velkých částic např. virové partikule)

5 Afinitní chromatografie proteinový komplex izolován přes specifickou afinní vazbu protein ligand ligand kovalentně navázán na nosič ligand protein, cukr, nukleová kyselina, protilátka, kofaktor, ATP,... Molekula antigen enzym receptor protein važící nukleovou kyselinu polysacharid, glykoprotein Ligand protilátka substrát ligand nukl. kyselina lektin Afinitní chromatografie (pokr.) eluce komplexu z kolony změna ph, zvýšení koncetrace solí, přebytek volného ligandu, chaotropní činidla imunoprecipitace ligandem je protilátka koimunoprecipitace izolace nekovalentně asociovaných proteinů, proteinových komplexů detekce protein proteinových interakcí

6 Imunoprecipitace eluce volným ligandem Eluce proteinů z kolony za fyziologických podmínek eluce kompetujícím proteinem

7 Afinitní značky peptidy (proteiny) kovalentně připojené na studovaný protein (takto značený protein vzniká expresí fúzního genu) interagují s malou molekulou ligandu zakotveném na pevném povrchu NEBO vazebným partnerem zakotveném na chromatografické matrici NEBO protilátkou připojenou na matrici nástroj pro purifikaci rekombinantních proteinů a nativních proteinových komplexů umožňují izolaci z hrubých buněčných extraktů Přehled používaných afinitních značek J. J. Lichty et al., 2005 Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expression and Purification 41,

8 Faktory ovlivňující úspěšnost afinitní purifikace struktura proteinu (malý protein se lépe produkuje a imobilizuje, reaguje méně nespecificky) výběr buněčného materiálu (purifikovaný protein/komplex musí být přítomen ve vzorku v dostatečném množství) volba nosiče a protokolu (nespecifická vazba na nosič může být minimalizována volbou vhodného typu oplachů a blokací) separace a detekce izolovaných proteinů/komplexů na SDS PAGE, na 2D IEF/SDS PAGE nebo pomocí hmotnostní spektrometrie (rozhodujeme se podle síly nespecifického pozadí a podle složitosti izolovaného komplexu) Tandemová afinitní purifikace izolace proteinového komplexu za nativních podmínek pomocí dvou značek kazeta obsahující sekvenci: nízkoafinní značka (calmodulin binding peptide) místo enzymatického štěpení vysokoafinní značka (protein A)

9 Afinitní purifikace/ms analýza limitace množstvíproteinupotřebné pro MS analýzu band detekovatelný CBB barvením ~50 10 ng ~ 50 kda protein obsažený v 1 buňce v kopiích izolovaný z 6 x 10 7 buněk je výhodné obohatit výchozí frakci o izolovaný protein, tj. izolovat předem buněčný kompartment, v němž se protein vyskytuje

10 Gelová filtrace separace podle velikosti částic stacionární fáze tvořena kuličkami z porózního materiálu, póry mají různou velikost náplně: dextran (Sephadex), agarosa (Sepharose, Bio Gel A), polyakrylamid (Bio Gel P) nejmenší molekuly putují nejpomaleji jsou zdržovány průchodem všemi póry, střední molekuly prochází jen některými póry a putují tedy rychleji, velké molekuly obtékají kuličky a rychle vytékají z kolony ven Gelová filtrace

11 BN PAGE (Blue Native PAGE) separuje proteinové komplexy v nativním stavu při ph 7,5 separace v gradientovém gelu probíhá v rozsahu kda CBB G udává proteinům záporný náboj aminokapronová kyselina udržuje komplexy v solubilním stavu během separace, zabraňuje arteficiálním agregacím v kombinaci s SDS PAGE vznikají dvourozměrné mapy proteinů, z nichž je možné určit podjednotkové složení proteinových komplexů BN PAGE RNA Pol II nuclear DNA helicase II jádra HeLa buněk membrány kvasinek RNA Pol I gel blot MW [kda] 669 MW [kda]

12 2. dimension SDS-PAGE kda ,5 38,5 33,5 2D BN/SDS-PAGE proteiny cytoplasmatické membrány 1. dimension BN-PAGE kda Hmotnostní spektrometrie MALDI analýza jednotlivých separovaných proteinů iontová past analýza proteinových komplexů, směsných vzorků

13 Proteins nad Proteomics, R. J. Simpson, CSHL Press, 2003 Crosslinking vznik nové kovalentní vazby mezi proteinovými řetězci chemický crosslinkery o různé délce (řádově 1 nm), formaldehyd indukovaný UV arylazidy, benzafenony indukovaný dlouhovlnným světlem Ru(II)(bpy) 3 2+

14 1. rozměr SDS-PAGE neredukující 2. rozměr SDS-PAGE redukující Dvojhybridní systém studium přímé interakce mezi dvěma proteiny detekce neznámých asociačních partnerů kvasinkový Gal4 protein tvorba fúzních proteinů omezení pro: proteiny ovlivňující reporterový gen proteiny vyžadující posttranslační modifikaci nebo neproteinovou složku (např. DNA)

15 Princip metody nativní Gal4 transkripce UAS G GAL1-lacZ aktivační doména nativního Gal4 proteinu hybridní Gal4 - X X UAS G DNA vazebná doména Gal4 GAL1-lacZ vazebná doména nativního Gal4 proteinu hybridní Gal4 - Y Y aktivační doména Gal4 X UAS G GAL1-lacZ hybrid vazebné domény a proteinu X interakce mezi X a Y obnoví Gal4 aktivitu X Y transkripce Y UAS G GAL1-lacZ hybrid aktivační domény a proteinu Y Literatura Proteins nad Proteomics, R. J. Simpson, CSHL Press, 2003 Protein Protein Interactions, E. Golemis, CSHL Press, 2002 E. M. Phizicky and S. Fields, 1995, Microb Rev, Protein Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis, 59, 1,