Vývoj a optimalizace ELISA metody pro stanovení obsahu glykovaného hemoglobinu ve vzorcích krve. Masarykova univerzita v Brně. Přírodovědecká fakulta

Transkript

1 Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Vývoj a optimalizace ELISA metody pro stanovení obsahu glykovaného hemoglobinu ve vzorcích krve Zpracovala: Radka Obrusníková Rok zpracování: 2008 Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Jan Přibyl, Ph.D.

2 Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto bakalářskou práci vypracovala pod vedením svého vedoucího zcela samostatně, s použitím literatury níže uvedené, a potvrzuji, že mé získané výsledky jsou originální. V Brně dne

3 Poděkování Chtěla bych tímto poděkovat svému vedoucímu, panu Mgr. Janu Přibylovi, Ph.D., za velmi ochotné vysvětlování teorie daného téma, pomoc při zpracovávání mé bakalářské práce a při studiu odborného jazyka. Mé poděkování patří také paní doc. RNDr. Michaele Wimmerové, Ph.D., za starostlivost při zařizování bakalářské práce. V neposlední řadě bych ráda poděkovala svému příteli a rodině, kteří byli v době vypracovávání práce mou velkou psychickou oporou. 3

4 Obsah SEZNAM ZKRATEK... 6 ÚVOD... 8 I TEORETICKÁ ČÁST Glykovaný hemoglobin Lidský hemoglobin Stanovení celkového hemoglobinu Stanovení v celé krvi přes kyanomethemoglobin Stanovení hemoglobinu jako alkalického hematinu Stanovení v séru, plasmě a moči s deriváty benzidinu Proces glykace Vznik glykovaného hemoglobinu Stanovení glykovaného hemoglobinu Referenční metoda DCCT Referenční metoda IFCC Změna kalibrace hemoglobinu A 1c a referenčních mezí Stanovení pomocí iontoměničové chromatografie a elektroforézy Stanovení pomocí HPLC Imunochemické stanovení Stanovení založené na inhibiční latexové aglutinaci Stanovení pomocí analyzátoru Dade International Dimension Stanovení ELISA metodou Metody ELISA Stručný úvod do imunochemie Definice používaných termínů v ELISA Základní systémy ELISA Přímá ELISA Nepřímá ELISA Sendvičová ELISA Konjugace Periodátová metoda Glutaraldehydová metoda II EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Chemikálie a přístrojová vybavení Použitý software Příprava roztoků Pufry Ostatní roztoky

5 7 Optimalizace vysycení povrchu jamky hemoglobinem Glykace hemoglobinu Konjugace Příprava reagentů Konjugace specifické a referentní primární protilátky Konjugace sekundární protilátky Přímá ELISA Imobilizace protilátky (anti-ghb) na stěnu ELISA desky Stanovení koncentrace THb ve vzorku GHb a krve Vazba GHb na protilátku na povrchu ELISA desky Stanovení celkového hemoglobinu (THb) Nepřímá ELISA se značenou primární protilátkou Pokrytí ELISA desky hemoglobinem a zkouška specifity konjugátů Testování účinnosti vysycovacích činidel Nepřímá ELISA se značenou sekundární protilátkou Stanovení obsahu glykovaného hemoglobinu ve vzorku III VÝSLEDKY A DISKUSE Časová závislost adsorpce hemoglobinu Stanovení přesné koncentrace THb ve vzorcích Optimalizace ELISA systémů Metoda nepřímé ELISA Metoda přímé ELISA Metoda nepřímé ELISA s koncentrací určenou standardní metodou Nespecifické interakce konjugátů Interakce protilátek s GHb Signál při různém obsahu GHb ve vzorku ZÁVĚR LITERATURA

6 Seznam zkratek BB (Borate buffer) BCR (B-cell receptor) CB (Sodium carbonate/bicarbonate buffer) CPRL DCCT (Diabetes Control and Complications Trial) EDTA EIA (Enzyme Immuno Assay) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) GHb HbA (Adult hemoglobin) HbA 10 HbA 1c HbF (Fetal hemoglobin) HbS (Sickle hemoglobin) HPLC (High performance liquid chromatography) HPLC-CE HPLC-ESI/MS IFCC (International Federation of clinical chemistry and laboratory medicine) IgA IgD borátový pufr receptor lymfocytů B pro antigen karbonátový pufr centrální primární referenční laboratoř referenční metoda pro stanovení glykovaného hemoglobinu Disodná sůl kyseliny ethylendiaminotetraoctové enzymová imunoanalýza imunoanalýza s vázaným enzymem na imunosorbent glykovaný hemoglobin hemoglobin A neglykovaný hemoglobin jedna z frakcí glykovaného hemoglobinu hemoglobin F hemoglobin S vysokoúčinná kapalinová chromatografie kombinace vysokoúčinné kapalinové chromatografie a kapilární elektroforézy kombinace vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie s elektrospray ionizací referenční metoda pro stanovení glykovaného hemoglobinu imunoglobulin A imunoglobulin D 6

7 IgE IgG IgG-HRP IgM IgM-HRP ICHS (International Committee for Standardization in Hematology) NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program) PB (Phosphate buffer) PBS (Phosphate buffer saline) PBST POD PRL SB (Substrate buffer) SRL THb (Total hemoglobin) TMB imunoglobulin E imunoglobulin G konjugát imunoglobulinu G s křenovou peroxidasou imunoglobulin M konjugát imunoglobulinu M s křenovou peroxidasou referenční metoda pro stanovení hemoglobinu v kalibrátorech program standardizace a certifikace měření glykovaného hemoglobinu fosfátový pufr fosfátový pufr s přídavkem chloridu sodného fosfátový pufr s přídavkem chloridu sodného a detergentu Tween 20 Peroxidasa primární referenční laboratoř substrátový pufr sekundární referenční laboratoř celkový hemoglobin 3,3,5,5 -tetramethylbenzidin 7

8 Úvod Hemoglobin (Hb) v erytrocytech podléhá neenzymové glykaci, při níž vzniká jako nejdůležitější derivát glykovaného hemoglobinu (GHb, HbA 1 ) frakce HbA 1c, jejíž molekuly mají glukosu navázanou na β-terminálním konci valinu. Obsah glykovaného hemoglobinu v krvi je důležitý pro indikaci onemocnění diabetes mellitus. Z těchto hodnot lze určit stav diabetu v posledních asi třech měsících. Díky neenzymatickému způsobu vzniku je jeho stanovení oproti jiným stanovovaným analytům v klinické biochemii poměrně specifické, což znamená, že nelze použít stanovení enzymatické. Specifita stanovení je dána také tím, že glykovaný hemoglobin je udáván jako procento obsahu glykovaného hemoglobinu z celkového hemoglobinu v krvi. Cílem mé bakalářské práce je vyvinout heterogenní imunoafinitní metodu (ELISA; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), pomocí níž bude stanoven obsah glykovaného hemoglobinu v krvi. Nejprve budou stěny ELISA desky pokryty hemoglobinem, přičemž bude fotometricky změřen obsah celkového hemoglobinu. Poté bude určen obsah glykovaného hemoglobinu pomocí přímé a nepřímé ELISA. Dále bude zahájena práce na glykaci hemoglobinu a přípravě konjugátu protilátka-peroxidasa. Bude následovat optimalizace vysycení ELISA desky a zkouška specifity konjugátů. 8

9 I Teoretická část 1 Glykovaný hemoglobin Glykovaný hemoglobin (HbA 1c ) je velmi důležitým ukazatelem dlouhodobé kompenzace diabetes mellitus (lidově cukrovka). Toto onemocnění je způsobeno chronickou poruchou v metabolismu glukosy, konkrétně absolutním nebo relativním nedostatkem insulinu. Je charakterizováno zvýšenou koncentrací glukosy v krvi (hyperglykémie). Dochází ke změnám v hospodaření organismu s živinami a je ovlivněna celková přeměna látek v organismu. Rozeznáváme dva základní typy diabetu, diabetes mellitus prvního a druhého typu, lišící se původem svého vzniku. Diabetes prvního typu je nazýván cukrovkou dětí a mladistvých (tzv. juvenilní diabetes), jelikož právě tuto populaci postihuje nejvíce. Důvodem jejího vzniku je nedostatečná tvorba insulinu buňkami Langerhansových ostrůvků v pankreatu. Tento typ je méně častý než typ druhý, který je charakteristický tím, že je na buňkách snížený počet receptorů pro insulin a buňky na něj neumí správně reagovat. V určitých případech mohou nastat komplikace diabetu, jako hypoglykémie při léčbě insulinem, při které poklesne glykémie na hodnotu, která již není mozkovými buňkami snášena a projevuje se ztrátou vědomí. Pojmem pozdní komplikace je myšlena naopak hyperglykémie, která je dlouhotrvající a projeví se právě zvýšenou hodnotou glykovaného hemoglobinu v krvi. Ten je pouze ukazatelem dlouhodobé kompenzace. Komplikace jsou způsobeny glykací proteinů vnitřních orgánů [1]. Díky opakované nebo i trvale zvyšující se koncentraci glukosy v krvi nastává rozsáhlejší neenzymová glykace bílkovin, přičemž jedním z takto vzniklých je již zmíněný glykovaný hemoglobin [2]. 1.1 Lidský hemoglobin Hemoglobin (Hb) je bílkovina, která se nachází v erytrocytech a dává jim charakteristickou červenou barvu. Patří mezi konjugované bílkoviny tvořené spojením bílkoviny (globinu) a organickým komplexem obsahujícím železo (hem) [3]. Čtyři pyrrolové kruhy propojené methinovými můstky tvoří porfyrin, jehož derivátem je 9

10 heterocyklická molekula hemu. Hem je označován jako protoporfyrin IX, s centrálně vázaným dvojmocným atomem železa, který má jako substituenty (postranní řetězce) čtyři methylové, dvě propionátové a dvě vinylové skupiny (viz Obr. 1). Právě v komplexu Fe II -hem se na šesté koordinační místo železa váže kyslík, který molekula hemoglobinu přenáší z plic do vlásečnic, kde je využíván pro dýchání [4]. Molekula hemoglobinu je prostorovým tetramerem tvořeným dvěmi polypeptidovými řetězci α a dvěmi řetězci β (viz Obr. 1). V dutinách globulinových řetězců se nacházejí porfyrinové kruhy s atomem dvojmocného železa. Ten je spojen přes histidinový zbytek s polypeptidovým řetězcem [3]. Obr. 1: Kvartérní konformace molekuly hemoglobinu (vlevo). Fe II -hem neboli protoporfyrin IX s centrálně vázaným atomem železa (vpravo) [5]. V erytrocytech zdravého dospělého jedince se nacházejí různé druhy hemoglobinu (viz Tabulka 1). Fetální hemoglobin HbF je v krátké době po narození člověka nahrazován HbA (Adult = dospělý). HbF a HbA 2 jsou genetické varianty HbA (označován též někdy jako HbA 0 ) [7]. 10

11 Tabulka 1: Jednotlivé druhy hemoglobinu a jejich procentické zastoupení v celkovém hemoglobinu [6]. Druh hemoglobinu Zastoupení jednotlivých složek v % Struktura A 2 2,5 α 2 δ 2 F 0,2 α 2 γ 2 A 1 6,0 A 1aI 0,2 A 1aII 0,2 A 1b 0,6 A 1c 5,0 α 2 β 2 (postsynteticky změněný β-řetězec) 1.2 Stanovení celkového hemoglobinu Hemoglobin (Hb) se stanovuje nejčastěji v celé krvi. Vykazuje tzv. pseudoperoxidasovou aktivitu, jelikož hem obsahující železnaté ionty je schopen katalyzovat, podobně jako peroxidasa (POD), oxidaci některých leukobarviv typu benzidinu peroxidem vodíku, čímž vznikají oxidované barvené formy. Na této reakci je založeno stanovení stop hemoglobinu v séru, plasmě, moči či stolici [3] Stanovení v celé krvi přes kyanomethemoglobin Fotometrické stanovení kyanomethemoglobinu se používá jako referenční metoda pro stanovení celkového hemoglobinu ve vzorku krve. Pokud je používaná jiná metoda (např. fotometrické stanovení oxyhemoglobinu, atd.), měla by být nastavená k získání srovnatelných výsledků s kyanomethemoglobinovou metodou. Není doporučováno stanovení hemoglobinu jako heminchloridu (kyselý hematin), jelikož tato metoda není spolehlivá. V krvi existuje spousta derivátů hemoglobinu, které jsou použitím vhodného reagentu, s výjimkou sulfohemoglobinu, převedeny na kyanomethemoglobin. Reagent musí být takové kvality, aby po zředění vzorku krve nevznikl zákal. Vhodný reagent obsahuje K 3 [Fe(CN) 6 ], KCN, KH 2 PO 4 a potřebné množství neiontového detergentu ve vodě. ph by mělo být okolo 7,4 [8]. Reagent není v chladu stálý, protože hexakyanoželezitan rychle oxiduje kyanid na kyanatan a sám se redukuje na hexakyanoželeznatan, proto musí být uchováván při pokojové teplotě. 11

12 Hemoglobin je nejprve uvolněn z erytrocytů díky lýze krvinek, kterou urychluje detergent. Hexakyanoželezitan oxiduje hemoglobin (Hb) na methemoglobin (MetHb) obsahující Fe 3+ (hemiglobin). Následuje převedení methemoglobinu kyanidem na kyanidový komplex, kyanomethemoglobin (MetHbCN; hemiglobinkyanid) [3]: Hb + Fe MetHb + CN 3 ( CN ) MetHb + Fe( CN ) MetHbCN Stanovení hemoglobinu jako alkalického hematinu Stanovení hemoglobinu jako alkalického hematinu bylo poprvé popsáno H.Wu v roce 1922 [9]. Nicméně tato metoda byla charakteristická jistou nevýhodou, a to časovou náročností na přípravu. V případě metody alkalického hematinu D-575 již tomu tak není. Všechny deriváty hemu a hemoglobinové deriváty jsou kvantitativně převedeny na jednotný reakční produkt, to jest alkalický hematin D-575, který je měřen fotometricky. Kvantitativně převedenými deriváty mohou být např. hemoglobin, oxy-hemoglobin, karboxy-hemoglobin, hemiglobin, sulfo-hemiglobin, kyano-hemiglobin, fetální hemoglobin a chlorohemin. Po přidání vzorku krve k reakčnímu roztoku je reakce ukončena nejpozději do dvou minut. Reakční roztok se skládá, např. z vodného roztoku 0,1 M NaOH a vhodného detergentu, kterým může být polyethylenglykol-mono-[p- -(1,1,3,3,-tetramethylbutyl)-phenyl]-ether, dostupný pod obchodním názvem Triton X-100. Produkt, alkalický hematin D-575, má intenzivní zelenou barvu. Výsledek na konci reakce může být posuzován i vizuálně. Měření se ale provádí nejčastěji pomocí fotometru při vlnové délce 575 nm, které může být efektivní po 1 až 2 minutách. Produkt zůstává stabilní i po několik dnů, proto může být měření provedeno také později. Ke stanovení mohou být použity komerčně dostupné fotometry s filtry, kde zvolený filtr propouští úzký svazek paprsku o vlnové délce 575 nm [10]. Chlorohemin (C 34 H 32 ClFeN 4 O 4 ), jako stabilní a přesně definovaná sloučenina o vysoké čistotě (víc než 99 %), může být použit jako základní standard pro standardizaci metody stanovení hemoglobinu jako alkalického hematinu D-575. Standardizace s čistým chloroheminem je výhodnou metodou pro svou jednoduchost přípravy standardních roztoků, snadnou proveditelnost v každé laboratoři a stabilitu chloroheminu a jeho roztoků v alkalickém Triton X-100 [11]. 12

13 1.2.3 Stanovení v séru, plasmě a moči s deriváty benzidinu Peroxid vodíku, který vzniká při různých enzymových reakcích, je možné využít přímo k oxidaci vhodných látek. Tyto látky při oxidaci dávají barevné produkty. Jedná se o oxidoredukční indikátory, které jsou většinou v redukovaném stavu bezbarvé leukobáze. Takovou skupinou látek jsou diaminoderiváty bifenylu, z nichž nejjednodušším je benzidin (p,p -diaminobifenyl), který se oxiduje na benzidinovou modř dle schématu: POD H 2 N C6H 4 C6H 4 NH 2 + H 2O2 HN = C6H 4 = C6H 4 = NH + 2H 2 O Jelikož je benzidin silně kancerogenní, bývá nahrazován nekancerogenním 3,3,5,5 -tetramethylbenzidinem (TMB). Oxidací všech derivátů benzidinu peroxidem vodíku vznikají modré oxidační produkty. Reakce je katalyzována peroxidasou (POD) nebo látkami s tzv. pseudoperoxidasovou aktivitou. Na Obr. 2 se nachází schéma oxidace TMB na benzidinovou modř. Oxidace probíhá přes semichinon, což je radikálový kation s volným elektronem na dusíku. Benzidinová modř není stálá a po delším čase přechází na difenyldichinony. Oxidace leukobází může být využita pro stanovení všech tří aktivních složek, kterými jsou benzidin, peroxid vodíku a POD, ale i dalších látek s pseudoperoxidasovou aktivitou. Mezi tyto látky se řadí např. hemoglobin, myoglobin aj., které spolu s POD patří mezi tzv. metaloproteiny obsahující ve své molekule prosthetickou skupinu hem s centrálním atomem Fe 2+ /Fe 3+, díky kterému mají tyto látky peroxidasovou aktivitu [3]. H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 H 2 N NH 2 + H 2 O 2, POD -2H 2 O HN NH H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 H 2 N N H +H + H 2 N + N H 2 -H + H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 Obr. 2: Oxidace TMB na benzidinovou modř (první reakce). Vznik semichinonu (druhá reakce). 13

14 1.3 Proces glykace Louis Maillard, jež pozoroval hnědnutí bílkovin při zahřívání s cukry, poprvé popsal proces glykace jako vazbu karbonylových sloučenin včetně redukujících sacharidů na volné aminoskupiny biomolekul bez katalytického působení enzymů [12]. V roce 1971 se zjistilo, že tato reakce probíhá v každém živém organismu, především při galaktosemii nebo diabetes mellitus, kde je zvýšená koncentrace sacharidů v organismu. Nejprve byla studována glykace in vivo molekul hemoglobinu a kolagenu. Dále se zjistilo, že tyto adukty se nacházejí ve zvýšené míře u diabetiků, což vedlo k zavedení nových vyšetřovacích metod v klinické praxi. Reakce je zahájena tvorbou nestabilní Schiffovy báze, která vzniká neenzymovou kondenzací redukujícího cukru a aminu. Pokud je redukujícím cukrem aldosa, podléhá Schiffova báze Amadoriho přesmyku 1 a pokud je ketosou, vzniká Heynsův produkt [13]. Poslední produkty glykace se nazývají AGEs (advanced glycosylation end-products). Krystaliny oční čočky, kolagen a některé glykované lipoproteiny jsou jedny z glykovaných bílkovin, které se podílejí na pozdních komplikacích diabetu [14]. Pozornost v publikacích je věnována především Amadoriho produktům vázaným na bílkoviny. Studium přesné struktury konečných produktů glykací je zatím málo publikováno. Reaktivita cukru je nejmenší pro hexosy a největší pro triosy, což vytváří základní obranu organismu proti glykaci, jelikož glukosa, jakožto hexosa, je hlavním metabolickým zdrojem energie. U zdravého jedince je koncentrace reaktivních cukrů v plasmě i buňkách poměrně nízká [13]. V plasmě podléhá glykaci především albumin, čímž vzniká glykovaný protein fruktosamin, a v krvi hemoglobin, kde je produktem glykovaný hemoglobin. Při pozdních komplikacích u diabetu vznikají ale i další glykované proteiny. Mezi tyto proteiny podléhající glykaci patří např. kolagen, elastin, fibrinogen, proteiny trombocytů, močové aminokyseliny a peptidy, membránové proteiny, proteiny oční čočky a periferních nervů, šlachové a arteriální proteiny, lipoproteiny atd. [15]. 1 Průběh reakce viz kapitola

15 1.4 Vznik glykovaného hemoglobinu Glykované hemoglobiny jsou látky, které vznikají v erytrocytech reakcí glukosy i ostatních sacharidů s různými aminokyselinami řetězců hemoglobinu. Jejich sledování je velmi důležité při péči o diabetiky. Komise IUPAC doporučila užívat název glykovaný hemoglobin z toho důvodu, že se nejedná o glykoprotein, ani o vazbu glukosy na protein glykosidickou vazbou, proto nemůže být označován jako glykohemoglobin nebo glykosylovaný hemoglobin [16]. Složka HbA 1 představuje největší podíl z obsahu celkového hemoglobinu a některé starší metody takto označují výsledek stanovení tří derivátů glykovaného hemoglobinu, kterými jsou frakce HbA 1a, HbA 1b a HbA 1c. Frakce HbA 1c představuje vlastní stabilní ketoamin, a proto je správnější stanovení pouze tohoto derivátu [17]. Glykovaný hemoglobin (HbA 1c ) je stabilním a specifickým analytem pro sledování a terapii diabetu. Vzniká neenzymovou reakcí glukosy s N-terminálním zbytkem aminokyseliny valinu, jež se nachází na β řetězci hemoglobinu a. Chemickým mechanismem (viz Obr. 3) lze tuto reakci vyjádřit jako tvorbu labilních a snadno disociovatelných Schiffových bází, tzv. aldiminových meziproduktů, v prvním stupni reakce. Následným Amadoriho přesmykem vznikají stabilní ketoaminové formy [18]. Reakce probíhá pomalu a postupně. Podíl glykovaného hemoglobinu in vivo je úměrný koncentraci glukosy v krvi, což vyplývá z reakční rovnováhy dané reakce. U pacientů s trvale zvýšenou hladinou glukosy se proto tvoří větší množství glykovaného hemoglobinu. Doba života červené krvinky je normálně 120 dní, proto je vzniklý glykovaný hemoglobin, dalo by se říci, biochemickou pamětí předcházející hyperglykémie [19]. 15

16 Obr. 3: Proces glykace hemoglobinu [20]. 2 Stanovení glykovaného hemoglobinu U diabetes mellitus je důležité určení včasné diagnózy a nasazení adekvátní léčebné terapie. Při podezření na onemocnění diabetem se vyšetřují především dva hlavní parametry, kterými jsou glukosa a glykovaný hemoglobin HbA 1c. Důležitým parametrem je také glykovaný albumin neboli fruktosamin. Vyšetření obsahu glukosy v krvi, tzv. glykémie, poskytuje informaci o okamžitém stavu množství glukosy v krvi a o aktuálním stavu metabolismu sacharidů, jelikož hladina glukosy v krvi je v čase značně kolísavá. U zdravých osob se pohybuje v rozmezí 3,3-5,8 mmol.l -1 [21]. Koncentrace fruktosaminu umožňuje představu o průměrné glykémii za posledních 1-3 týdnů, jelikož biologický poločas albuminu je okolo 19 dní. Odráží střední stav hladiny glukosy v krvi [22]. Obsah glykovaného hemoglobinu vypovídá o dlouhodobém stavu glykémie, jelikož jeho stanovením lze získat průměrné hodnoty za posledních 6-8 týdnů. Umožňuje tedy posoudit výskyt déle trvajících hyperglykémií a díky tomu i riziko rozvoje komplikací diabetu. Při delším trvání menšího zvýšení glykémie, které nepůsobí větší subjektivní potíže, může být hodnota glykovaného hemoglobinu zvýšená. Naopak krátkodobý výkyv glykémie i na vyšší hodnoty, jež pacient včas upraví, hladinu glykovaného hemoglobinu 16

17 zvyšovat nemusí. Odběr krve pro stanovení není nutné odebírat nalačno jako pro stanovení glukosy. Referenční meze zdravých dospělých osob jsou podle nové kalibrace 2,8 až 4,0 %. Podle hodnot glykovaného hemoglobinu lze měnit dávky insulinu. Úpravy režimu lze provádět pouze na základě měření glykemických profilů. Hodnoty glykovaného hemoglobinu závisí na metodice stanovení. Od zavedla IFCC (International Federation of clinical chemistry and laboratory medicine; Světová federace klinické chemie a laboratorní medicíny) novou referenční metodu založenou na principu vysokoúčinné kapalinové chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií nebo v kombinaci s kapilární elektroforézou (HPLC-MS, resp. HPLC-CE). Úlohou referenční metody není každodenní rutinní použití v klinické laboratoři, ale korelace výsledků dosažených novými metodami uváděnými do praxe, kontrola výsledků rutinních analýz a produkce certifikovaných kalibrátorů (roztoky o definovaném a kontrolovaném složení). Tato metoda poskytuje významně nižší výsledky měření než metoda DCCT [23]. 2.1 Referenční metoda DCCT Referenční metoda DCCT (Diabetes Control and Complications Trial; Komise pro kontrolu komplikací způsobených diabetem) je metodou založenou na principu vysokoúčinné kapalinové iontově výměnné chromatografie (metoda HPLC, Bio Rex) [24]. Tato metoda je důležitou vědecko-výzkumnou součástí činnosti ADA (American Diabetes Association-ADA; Americká asociace pro diabetes). Program standardizace a certifikace měření HbA 1c -NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program; Národní standardizační program pro glykovaný hemoglobin) je zase důležitou dílčí součástí programu DCCT. Funkcí NGSP je realizace referenční metody, certifikace měřících systémů a klinických laboratoří, produkce certifikovaných referenčních materiálů. Uvedené činnosti jsou realizovány prostřednictvím sítě referenčních laboratoří. Původně byl NGSP národním (USA) programem, ale v současné době se jedná o mezinárodní měřící systém pro HbA 1c, úzce spolupracující s pracovní skupinou IFCC a s Evropskou referenční laboratoří HbA 1c [25]. Referenční metoda HPLC-DCCT-Bio Rex musí vykazovat reprodukovatelnost CV% 3,0. Používá se k určování hodnot HbA 1c v certifikovaných referenčních materiálech a validaci návaznosti měření HbA 1c v síti referenčních laboratoří NGSP. 17

18 V síti referenčních laboratoří NGSP řídí analytickou činnost celého systému centrální primární referenční laboratoř (CPRL). Udržuje referenční metodu DCCT, produkuje certifikované referenční materiály a uděluje certifikáty ostatním referenčním laboratořím sítě. Primární referenční laboratoře (PRL) jsou zálohou CPRL a zprostředkovatelem návaznosti ostatních referenčních laboratoří na CPRL. Referenční metoda DCCT je nástrojem jejich činnosti. Návaznost ostatních referenčních laboratoří sítě realizují pomocí speciálního programu mezilaboratorního porovnávání zkoušek. CPRL a PRL ověřují též porovnatelnost referenčních metod IFCC a DCCT. Sekundární referenční laboratoře (SRL) mají validovanou, certifikátem potvrzenou návaznost měření na CPRL, čili na referenční metodu. Nemusí nutně využívat referenční metody DCCT, ale metoda, kterou používají, na ni musí vykazovat návaznost. Certifikace měřících systémů výrobců je založena na simultánním měření HbA 1c v sérii stejných vzorků metodou, používanou SRL a metodou realizovanou certifikovaným měřícím systémem. Analyzuje se 40 krví diabetiků dárců v koncentračním rozmezí 6-11 %. Počty vzorků o koncentracích v určitých intervalech jsou algoritmovány a musí být dodrženy. K dosažení 1 rok platného certifikátu je nutné, aby maximální hodnota přesnosti CV% byla 5,0 a odchylka od srovnávací metody, používané SRL, nepřesáhla 1 % jejího 95% intervalu spolehlivosti. Certifikaci podléhají všechny složky měřícího systému (přístroje, reagenty, kalibrátory). Certifikace klinických laboratoří se provádí na stejném principu jako certifikace meřících systémů. Totožné vzorky se analyzují paralelně v certifikované laboratoři a v certifikující sekundární referenční laboratoři a zisk certifikátu se opět považuje za validaci návaznosti měření v rutinní klinické laboratoři. Hlavní úsilí Evropské referenční laboratoře pro HbA 1c je orientováno na vývoj a zkoušení sekundárních (matricových) lyofilizovaných referenčních materiálů na bázi hemolyzátů lidské krve a také na určování hodnot v těchto materiálech referenční metodou [26]. 2.2 Referenční metoda IFCC Referenční metoda IFCC pro stanovení glykovaného hemoglobinu HbA 1c byla navržena a validována mezilaboratorními experimenty v průběhu roku Následně byla předložena ke schválení národním společnostem klinické chemie a laboratorní 18

19 medicíny a po schválení publikována v lednu Metodu vypracovala pracovní skupina IFCC pro standardizaci HbA 1c. Autorský kolektiv je složen z evropských, amerických a japonských autorů a metoda sama byla uveřejněna v časopise Clinical Chemistry and Laboratory Medicine Měřeným analytem je stabilní adukt glukosy s N-terminální aminoskupinou valinu β řetězce hemoglobinu. Ke vzorku čerstvé lidské krve je přidán stabilizační roztok EDTA a erytrocyty jsou izolovány centrifugací. Tyto jsou promyty roztokem chloridu sodného a ponechány v něm po dobu čtyř hodin k odstranění labilních Schiffových bází (tzv. pre-hba 1c ). Lidské erytrocyty jsou pak odděleny, promyty a hemolyzovány ve vodě. Skladují se v pufru o ph = 6,2, při teplotě -20 C. Takto připravený čistý hemolyzát je při tomto způsobu skladování stabilní minimálně jeden rok. Dále následuje enzymové štěpení hemoglobinu, kdy je roztok hemoglobinu hydrolyzován endoproteinasou Glu-C na různé hemoglobinové peptidy. Jedním z těchto peptidů je i glykovaný hexapeptid, který odpovídá přítomnosti glykovaného hemoglobinu HbA 1c a druhým je neglykovaný hexapeptid, který je důkazem o přítomnosti neglykovaného hemoglobinu HbA 10. Struktura glykovaného hexapeptidu je Glukosa-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu a neglykovaného hexapeptidu Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu. Směs těchto dvou hexapeptidů je separována postupem HPLC-ESI/MS (kombinace vysokoúčinné kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie s elektrospray ionizací) za použití on-line propojení obou separačních systémů. Oba hexapeptidy jsou separovány ze směsi peptidů a poté kvantifikovány na podkladě rozdílných hodnot m/z. Z poměru hodnot m/z vzorků a kalibrátorů se počítá hodnota koncentrace HbA 1c. Nebo postupem HPLC-CE (kombinace vysokoúčinné kapalinové chromatografie a kapilární elektroforézy). První separační krok je proveden pomocí HPLC. Jednotlivé eluované frakce se sbírají. Poté se směs frakcí podrobí následné další separaci pomocí CE. Glykovaný a neglykovaný hexapeptid jsou odděleny na bázi různých elektromigračních časů a kvantifikovány spektrofotometrickou detekcí při 214 nm. Jako kalibrátor se používá směs čistých hemoglobinů HbA 1c a HbA 10. Hodnota hemoglobinu je v kalibrátorech stanovena referenční metodou ICHS (International Committee for Standardization in Hematology; Mezinárodní hematologická společnost). Používá se řady šesti kalibrátorů, pokrývajících rozsah koncentrace 0 až 15 % HbA 1c. Při referenční metodě nebyly zjištěny žádné významné interference karbamylovaného Hb, acetylovaného Hb ani geneticky anomálních izoforem HbS a HbC [27]. 19

20 2.3 Změna kalibrace hemoglobinu A 1c a referenčních mezí Česká společnost klinické biochemie ČLS JEP (ČSKB) a Česká diabetologická společnost (ČDS) ČLS JEP ve spolupráci s Referenční laboratoří pro klinickou biochemii a na základě rozhodnutí Světové federace klinické chemie a laboratorní medicíny (IFCC) ohlásili, že s platností od 1. ledna 2004 se mění způsob kalibrace stanovení hemoglobinu A 1c a dochází ke změnám referenčních hodnot a rozhodovacích limitů. Referenční meze zdravých dospělých osob podle nové kalibrace jsou 2,8 až 4,0 % (95% interval). Česká diabetologická společnost navrhla k používání v České republice kritéria kompenzace diabetu (viz Tabulka 2). Připouští se vyjadřování v procentech (%) i ve zlomku z jedné (1,0). Jiné vyjadřování výsledků je v zásadním rozporu s návazností tohoto stanovení na mezinárodně doporučené postupy. Změna kalibrace za použití kalibrátoru IFCC je pro laboratoře závazná ke stejnému datu. Technicky je aplikace tohoto doporučení zajištěna dodavateli. Další informace jsou uvedeny v doporučení ČSKB Laboratorní diagnostika a sledování stavu diabetu mellitu [28]. Tabulka 2: Kritéria kompenzace diabetu mellitu: Kompenzace diabetu Meze pro dosavadní kalibraci DCCT, platné do Meze pro kalibraci IFCC, platné od Výborná < 6,5 % < 4,5 % Uspokojivá 6,5 7,5 % 4,5 6,0 % Neuspokojivá > 7,5 % > 6,0 % 2.4 Stanovení pomocí iontoměničové chromatografie a elektroforézy Společné těmto metodám je, že se zde látky dělí podle svých elektrických nábojů. Elektroforetická separace probíhá na základě různé pohyblivosti nabitých částic v elektrickém poli. V případě iontoměničové chromatografie se jedná o separaci díky různě silným reverzibilním vazbám částic na nosič. Post-translačním připojením glukosy na molekulu hemoglobinu dochází ke spontánní vazbě a další přeměně, přičemž vznikají 20

21 zejména bazické aminokyseliny hemoglobinu. Díky tomu se mění počet kladných nábojů hemoglobinu. V laboratorní praxi se nejvíce vyskytuje iontoměničová chromatografie s využitím katexové pryskyřice, kde se jednotlivé frakce hemoglobinu dělí [29]. Získané výsledky při měření jsou závislé na minimálních změnách ph, iontové síly elučních roztoků [30], na rozměrech kolonek a množství aplikovaného hemolyzátu [31] a na výkyvech teploty v laboratoři při měření [32]. Díky použití komerčních souprav se odstraní problémy s rozměry kolonek a se složením roztoků. Nežádoucí vliv teploty lze odstranit vložením kolonek do termostatu [33]. Nevýhodou této metody je poměrně vysoká cena komerčních souprav, ale i společné putování labilní aldiminové formy spolu s ketiminovou formou glykovaného hemoglobinu kolonou během chromatografie. Při makrometodě se aldimin rozloží během promývání krvinek a přípravy hemolyzátu, který při nanesení na kolonu obsahuje již jen stabilní formu HbA 1c. Výrobci mikrokolon kvůli urychlení analýzy nedoporučovali promývání krvinek a přípravu hemolyzátu, což mělo za následek rozdílné hodnoty koncentrace HbA 1c [34]. Elektroforetické metody se v praxi příliš nerozšířily, i když skýtají spoustu výhod. Důvodem je rozšíření mikrochromatografických souprav a vyšší nároky na obsluhující personál, co se týče odborné znalosti dané metody [35]. Na druhou stranu jsou tyto metody poměrně rychlé a umožňují sériové měření velkého počtu vzorků z malého množství krve (několik mikrolitrů) [36]. 2.5 Stanovení pomocí HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) se liší od jednoduché jen v technických detailech. Umožňuje separaci hemoglobinu na jednotlivé frakce během několika minut [34]. Velkou výhodu této metody udává automatizace měření [37]. Dále pak také nově vyvinuté speciální náplně umožňující ostré dělení malých složek i v přítomnosti různých abnormálních hemoglobinů, což je např. u novorozenců, kde lze nalézt směs HbA a HbF [38]. Stallingsovi a Abrahamovi se podařilo rozdělit pomocí této metody HbA 1c na aldiminovou a ketiminovou formu [39]. Řada komerčně dostupných analyzátorů pracuje na ionexovém principu (např. HA 8140 Menarini). Například přístroj DCA 2000 využívá katexovou chromatografii ve spojení s gradientovou 21

22 elucí separovaných hemoglobinových subtypů (včetně HbA 1c ) z hemolyzované plné krve, přičemž se využívá rozdílné hodnoty izoelektrických bodů HbA 1c a HbA 10 (7,4 a 6,95). Separované frakce jsou monitorovány světelnou absorpcí [40]. HPLC analyzátor glykovaného hemoglobinu TOSOH G8 zajišťuje přesnou separaci a kvantifikaci stabilní frakce HbA 1c s automatickou eliminací labilní frakce HbA 1c. Navíc separuje i variantní hemoglobiny HbD, HbS, HbC. Pracuje přímo s plnou krví, zásobník podavače je pro 90 nebo 290 vzorků a má i statimovou pozici. Separace frakcí hemoglobinu trvá pouze 1,6 minuty. Výhodou je jednoduchá obsluha a nenáročnost na údržbu, po skončení separace se přístroj sám promyje a vypne [41]. 2.6 Imunochemické stanovení Stanovení založené na inhibiční latexové aglutinaci Pomocí analyzátoru Bayer's DCA 2000, což je malý spektrofotometr, se stanovuje latexová aglutinace při inhibičním imunostanovení pomocí monoklonálních protilátek. Stanovení vyžaduje 1 µl krve a čas pro jednu analýzu 9 minut [42]. Stanovení má několik kroků. Vzorek krve se spolu s EDTA nebo heparinem (nesrážlivá krev) smíchá s denaturačním činidlem obsahujícím enzym proteasu. Erytrocyty jsou lyzovány a hemoglobinový řetězec je proteasou rozštěpen. V jednom alikvotu tohoto vzorku se stanoví celkový hemoglobin přes alkalický hematin a ve druhém alikvotu se stanoví HbA 1c inhibiční latexovou aglutinací. Latexové částice jsou potaženy specifickou myší protilátkou proti lidskému HbA 1c. K suspenzi latexových částic se přidá aglutinační činidlo a vzorek. Za přítomnosti HbA 1c ve vzorku dochází ke kompetici o protilátku na latexových částicích s aglutinačním činidlem a tím ke zpomalení aglutinace. Rychlost aglutinace je sledována měřením absorbance při 600 nm. Obsah HbA 1c se vyjadřuje jako procentický podíl z obsahu celkového hemoglobinu [3] Stanovení pomocí analyzátoru Dade International Dimension Dalším analyzátorem, který pracuje na principu imunostanovení je analyzátor Dade International Dimension (Dudingen, Švýcarsko). Základem tohoto stanovení je uvolnění hemoglobinu z erytrocytů, následované enzymatickou digescí s pepsinem, 22

23 čímž dochází k odštěpení β-n-terminálních fragmentů hemoglobinu. Tyto fragmenty jsou poté navázány na monoklonální protilátky, jež jsou přítomny v přebytku, upevněné na letexu. Zbývající nenavázané molekuly protilátky postupně reagují se syntetickým polymerem (polyvalentní komplex β-n-terminálních fragmentů) a vzniká aglutinace. Reakce je sledována turbidimetricky při 540 nm a výsledek je nepřímo úměrný koncentraci HbA 1c. Množství přítomného celkového hemoglobinu (THb) je získáno ze stejného hemolyzátu použitím metody alkalického hematinu. Jako imunogen k tvorbě monoklonálních hybridomových buněk se užívá syntetický peptid obsahující 6 aminokyselin identických pro lidský β-řetězec hemoglobinu, glykovaný na N-terminálním valinovém zbytku [43] Stanovení ELISA metodou Firma Dako Diagnostics vyvinula Novoclone HbA 1c ELISA metodu pro stanovení glykovaného hemoglobinu. Metoda je založena na třech základních krocích. V prvním kroku se glykovaný hemoglobin ze vzorku váže přímo na polystyrenový povrch mikrotitrační destičky. Dále je přidána monoklonální protilátka proti GHb značená peroxidasou, tzv. konjugát, který se specificky váže na molekuly glykovaného hemoglobinu, jež je zachycen na povrchu mikrotitrační destičky. Nakonec enzym peroxidasa katalyzuje reakci přeměny chromogenního substrátu (o-fenyldiamin) z bezbarvé formy na formu barevnou (viz Obr. 4). Množství vzniklého barevného produktu je úměrné množství glykovaného hemoglobinu ve vzorku. Barevná změna je hodnocena spektrofotometricky, měřením absorbance při vhodné vlnové délce [44]. NH 2 NH NH 2 + H2 O2 peroxidasa -2H 2 O NH Obr. 4: Oxidace aromatické bezbarvé struktury o-fenyldiaminu peroxidem vodíku, za katalýzy peroxidasou, na chinoidní bezbarvou strukturu. 23

24 Systémy ELISA, použitelné i pro stanovení glykovaného hemoglobinu, jsou podrobněji popsány v následující kapitole. 3 Metody ELISA ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay; enzymová imunoanalýza s vázaným enzymem na imunosorbent) je zvláštním typem EIA (Enzyme Immuno Assay; enzymová imunoanalýza). V literatuře ji lze nalézt pod názvem heterogenní EIA, která je charakteristická na rozdíl od homogenní EIA tím, že po vzniku imunokomplexu se vlastnosti signálu nemění, a tedy je nutné před měřením signálu volnou a vázanou frakci od sebe oddělit. Obě tyto metody patří k imunoanalýze se značenými reaktanty, založené na fotometrických principech. 3.1 Stručný úvod do imunochemie Součástí imunitní reakce je interakce antigenů a protilátek a mechanismus jejich reakce spolu s dalšími molekulami. Antigenem se rozumí prakticky jakákoliv chemická struktura. Může to být protein, komplexní sacharid, lipoprotein či celá buňka. Tyto látky jsou většinou pro organismus cizorodé a imunitní systém na ně reaguje, což je označováno jako imunitní odpověď. Tím je myšlena tvorba protilátek, které jsou specifické pro daný antigen. Protilátky ale nerozeznávají celé cizí buňky či molekuly, nýbrž pouze určitá místa na jejich povrchu, jejich determinantní skupiny, tzv. epitopy. Protilátky jsou heterogenní glykoproteinové molekuly, které svou elektroforetickou pohyblivostí patří mezi globuliny, frakce β až γ, nazývány imunoglobuliny. Ty mohou být polyklonální (vytvářené několika klony B-lymfocytů; s nerovnocennými vazebnými místy na všech molekulách) nebo monoklonální (s rovnocennými vazebnými místy). Jsou to proteiny s charakteristickou strukturou a specifickými vazebnými místy pro antigen [3]. Typické strukturní rysy molekul protilátek jsou uvedeny na Obr. 5. Jsou tvořeny dvěma těžkými řetězci (H), které jsou spojeny disulfidickými můstky. Ke každému těžkému řetězci je cystinovým můstkem připojen jeden lehký řetězec (L). Těžké řetězce jsou složeny ze čtyř, u některých tříd z pěti domén, které jsou strukturně podobné, tvořené 24

25 sekvencí aminokyselin. Jednotlivé domény jsou spojeny krátkými úseky polypeptidového řetězce. Lehké řetězce jsou složeny ze dvou imunoglobulinových domén. Domény na N-konci těžkého i lehkého řetězce jsou variabilní a označují se V H a V L. Pojmem variabilní je myšleno to, že detaily jejich struktury jsou individuálně odlišné mezi molekulami produkovanými různými klony B-lymfocytů. Konstantní domény lehkých řetězců se označují C L a domény těžkých řetězců C H 1, C H 2, C H 3, popř. C H 4, kde číslování se provádí od N-konce k C-konci. Indexy L a H jsou nahrazovány označením konkrétních typů řetězců. Existují dva typy lehkých řetězců, a to κ a λ, jež se liší primární strukturou konstantních domén a které jsou kódovány odlišnými geny nacházejícími se na různých chromosomech. Konstantní části různých izotypů (tříd) těžkých řetězců jsou kódovány genovými úseky uspořádanými na úseku jediného chromosomu. Tyto těžké řetězce se nazývají µ, δ, γ, α a ε. U řetězců γ existují čtyři subtypy γ 1 -γ 4, u řetězců α dva subtypy α 1 a α 2. Imunoglobuliny tvořené těmito různými typy řetězců se nazývají IgM, IgD, IgG (IgG 1 -IgG 4 ), IgA (IgA 1, IgA 2 ) a IgE. Řetězce γ a α mají tři konstantní domény a ostatní těžké řetězce čtyři konstantní domény. Jakýkoliv typ H-řetězce se může párovat s jakýmkoliv typem lehkého řetězce a vytvářet kompletní molekulu imunoglobulinu. Vazebné místo pro antigen je společně tvořeno variabilními doménami H a L-řetězců. Molekulu imunoglobulinu lze proteolyticky rozštěpit na fragmenty (viz Obr. 5), kde lze v případě použití enzymu papainu získat dva identické fragmenty zvané Fab (každý obsahuje jedno vazebné místo pro antigen, jsou monovalentní) a fragment Fc. Při štěpení pepsinem vznikne jeden bivalentní fragment F(ab ) 2 a zbytek molekuly je enzymem rozštěpen na malé kousky. Oblast, ve které jsou těžké řetězce spojeny cystinovými můstky, se nazývá pantová oblast a uděluje Fab částem molekuly určitou flexibilitu, díky které se může vzdálenost mezi vazebnými místy pohotově měnit v závislosti na dostupnosti antigenu. Těžké řetězce jsou v Fc části značně glykosylovány, což ukazuje, že imunoglobuliny jsou téměř jako všechny sekretované proteiny glykoproteiny. 25

26 Obr. 5: Schéma protilátky s příslušným enzymatickým štěpením molekuly. Převzato z [45]. IgM a IgD jako monomery se nacházejí na povrchu B-lymfocytů a tvoří BCR. Sekretovaný IgM existuje jako pentamer (M. h. okolo 900 kda), kde jsou jednotlivé základní jednotky spojeny do kruhu cystinovými můstky a strukturně zcela odlišným řetězcem zvaným J. Pentamer IgM je molekulou s deseti vazebnými místy pro antigen. Řetězce µ jsou silně glykosylovány. IgM je prvním izotypem protilátek, který se tvoří po setkání s antigenem, teprve poté se tvoří další izotypy (IgG, IgA, IgE). Nejhojnějším sérovým izotypem je IgG (M. h. 155 kda), především IgG 1. IgA se vyskytuje jako slizniční a sérová forma, kde slizniční IgA se skládá ze dvou monomerů spojených J-řetězcem a ze sekreční komponenty. IgE se vyskytuje u zdravých jedinců pouze v nepatrných koncentracích. Převážně se uplatňuje proti mnohobuněčným parazitům na sliznicích a je příčinou atopických alergických reakcí [46]. 26

27 Obr. 6: Struktury jednotlivých tříd imunoglobulinů [47]. Organismus začne produkovat protilátky po styku s antigenem, což je výsledek přirozené imunizace, nebo probíhá po umělém podání antigenu očkováním. V dnešní době se imunizují zvířata pro přípravu polyklonálních protilátek. Monoklonální protilátky jsou produkovány umělou buněčnou kulturou (tzv. hybridomy), která se získává imunizací příslušným antigenem (nejčastěji myší) a spojením imunitních buněk s nádorovými. Takto získají schopnost neomezeně se množit a přitom produkovat protilátku. Při reakci antigenu s protilátkou se uplatňují především nekovalentní interakce bílkovin, podobně jako např. při reakci enzymu se substrátem. Protilátky nemění ireverzibilně strukturu antigenu. Uplatňují se zde hlavně vodíkové vazby a nepolární hydrofobní interakce [3]. 27

28 3.2 Definice používaných termínů v ELISA ELISA používá v imunologickém testu enzymy, připojené k jednomu z reaktantů. Po přidání vhodného substrátu, dochází k vývoji barvy, jejímž vyhodnocením (kvantifikací) se získají kvantitativní výsledky. ELISA tedy zahrnuje postupné přidávání a reakci látek se substancí vázanou na pevné fázi, včetně inkubace a separace vázaných a volných reagentů promytím. Enzymatická reakce slouží k poskytnutí barvy a ke kvantitativnímu určení reakce, použitím enzymaticky značeného reaktantu. Jako pevná fáze obvykle slouží mikrotitrační deska s jamkami. Komerčně dostupné jsou speciálně připravené ELISA desky. Ty mají 8 x 12 jamek a mohou být použity v různých speciálních zařízeních, obsahujících multikanálové pipety, konstruovaných pro rychlou manipulaci se vzorky. Používají se i tzv. stripy, což je část ELISA desky obsahující 8 jamek, uchycené v ELISA rámečku (viz Obr. 7). Obr. 7: ELISA rámeček se stripy (vlevo). Speciálně připravené ELISA desky (vpravo) [48]. Adsorpcí je myšleno přidávání antigenu, v tomto případě glykovaného hemoglobinu nebo protilátky, což je myší IgM, ředěných v pufru a jejich pasivní navázání na pevnou fázi při inkubaci. Toto je jednoduchá cesta pro imobilizaci jednoho z reaktantů v ELISA a jeden z hlavních předpokladů její úspěšnosti. Promytí je jednoduché naplnění a vyprázdnění jamek roztokem pufru, důležité pro separaci vázaných a nenavázaných reagentů v ELISA. To je opět klíčový prvek ke zdárnému využití ELISA. Jako promývací pufry mohou být použity PBS nebo PBST. 28

29 Jako reagenty se v ELISA používají antigeny, které při aplikaci zvířatům vyvolají produkci protilátek. Takové protilátky mohou specificky reagovat s použitým antigenem, a proto mohou být použity k detekci tohoto antigenu. Protidruhové (antidruhové) protilátky jsou produkovány v případě, že proteiny (protilátky) z jednoho druhu zvířete jsou injektovány do jiného druhu. Tedy sérum morčete vstříknuto králíkovi vyvolá produkci anti-morčecích králičích protilátek. Enzym je látka, která může reagovat v malé koncentraci jako katalyzátor k podpoření specifické reakce. V ELISA je obvykle používáno několik druhů enzymů se svými specifickými substráty. Např. křenová peroxidasa a TMB. Jako enzymový konjugát vystupuje protein (obvykle protilátka) s ireverzibilně vázaným enzymem. Např. antidruhový enzymový konjugát je králičí anti-morčecí protilátka s navázanou křenovou peroxidasou. Substrát používaný v ELISA je chemická sloučenina, se kterou enzym specificky reaguje. Tato reakce je využívána k vytvoření signálu, který je charakterizován mírou intenzity zabarvení (přímo jako barevná změna substrátu nebo nepřímo jako účinek na jinou chemikálii). Chromofor je chemická látka, která následkem enzymatické interakce se substrátem mění barvu. Např. TMB se při rekci s peroxidem vodíku, katalyzované křenovou peroxidasou, mění z bezbarvé formy na formu modrou. Zastavením se v tomto stanovení myslí proces ukončení reakce enzymu se substrátem. Tento krok má vliv na zastavení jakékoliv další změny barvy v ELISA. Zastavení reakce je provedeno přídavkem zředěné kyseliny (chlorovodíkové, sírové, fosforečné), přičemž se barva produktu změní z modré na žlutou. Nakonec tzv. čtení, což znamená měření barvy vyvolané v ELISA. To je provedeno použitím speciálních spektrofotometrů, které čtou při určitých vlnových délkách odpovídajících specifickým barvám získaným díky konkrétním enzym/chromofor systémům. Testy mohou být vyhodnoceny i vizuálně. Při hodnocení obsahu glykovaného hemoglobinu se měří absorbance při 450 nm. 29

30 3.3 Základní systémy ELISA Zde použitá terminologie ne vždy souhlasí s tou, která je používaná jinými autory a je třeba si princip stanovení vždy přečíst, jelikož se nemusí shodovat s jinými literárními zdroji. Tři hlavní metody tvoří základ všech systémů ELISA: 1. Přímá ELISA 2. Nepřímá ELISA 3. Sendvičová ELISA [49] Imunoanalýzu lze rozdělit na kompetitivní a nekompetitivní. Na příkladu stanovení antigenu ve vzorku lze vysvětlit kompetitivní stanovení. Kompetitivní imunoanalýza využívá protilátku, která je v reakci přítomna v omezeném množství. O její vazebná místa soutěží (kompetuje) značený antigen, který je v mírném přebytku, s antigenem neznačeným, který je stanovovaným vzorkem. Kvantifikaci umožňuje značený antigen. Množství komplexu se značeným antigenem je nepřímo úměrné množství stanovovaného neznačeného antigenu. Tedy čím vyšší je koncentrace vzorku, tím nižší bude intenzita měřeného signálu v komplexu a tím vyšší bude koncentrace (signál) nenavázaného značeného antigenu. Nekompetitivní imunoanalýza používá protilátku v nadbytku. Reakce se účastní pouze jeden antigen a tím je analyzovaná látka. Kvantifikace závisí na značené protilátce, která reaguje s antigenem [3] Přímá ELISA Přímá ELISA může být považována za nejjednodušší formu ELISA. Průběh stanovení, jež je názorně předveden na Obr. 8, lze popsat takto: Antigen je zředěn pufrem, který má obvykle vysoké ph (9,6), což je karbonátový pufr (CB) nebo neutrální fosfátový pufr s přídavkem chloridu sodného (PBS). Důležité je, že pufr neobsahuje žádné jiné proteiny, které by mohly soutěžit s cílovým antigenem o navázání na plastovou (polystyrenovou) pevnou fázi. Antigeny jsou hlavně přírodní proteiny, připojující se pasivně během doby inkubace na pevnou fázi. Teplota a doba inkubace nejsou tak důležité, ale zásadní je standardizace podmínek a upřednostňované 30

31 použití inkubátorů na 37 C (jelikož jsou běžně dostupné v laboratoři). Po inkubaci je jakýkoli nadbytek antigenu odstraněn jednoduchým promytím, naplněním a vyprázdněním jamek, použitím neutrálního pufru, např. PBS. Nyní jsou přidány protilátky konjugované s enzymem, tzv. konjugáty, které mají specifitu proti antigenním místům reagentů navázaných na pevnou fázi. Konjugované protilátky jsou ředěné pufrem obsahujícím několik látek, které inhibují pasivní adsorpci proteinu, ale které stále umožňují imunologickou vazbu. Takové látky jsou buď jiné proteiny, které jsou přidány, ve vysoké koncentraci, pro soutěžení s protilátkou o místa na pevné fázi, nebo to jsou detergenty, v nízké koncentraci, označované jako blokační činidla, obsažené v pufrech, nazývaných blokačními pufry. Při inkubaci se konjugáty váží k antigenu a odstranění nenavázaných konjugátů je opět provedeno promytím. Pak je přidán substrát (chromofor), který reaguje se specifickým enzymem vázaným na protilátky. Účelem je umožnit vývoj barvy díky enzymaticky katalyzované reakci. Reakce se nechá vyvíjet po určitou dobu, po které je zastavena změnou ph systému, nebo přidáním inhibičního reaktantu. Nakonec je barva detekována spektrofotometricky při odpovídající vlnové délce pro vzniklou barvu. 31

32 Obr. 8: Přímá ELISA. V první jamce je přidaný antigen (Ag) pasivně adsorbován na pevnou fázi. Po promytí jsou přidány enzymem značené protilátky (Ab*) vázající se na antigen, což je naznačeno v druhé a třetí jamce. Po inkubaci a promytí je přidán substrát/chromofor (S) a dochází k barvené změně (viz jamka čtvrtá). Nakonec je přidán stopping solution, čímž dojde k další barevné změně a především zastavení reakce Nepřímá ELISA Nepřímá ELISA, ilustrována na Obr. 9 má první dva stupně stanovení, což je přidání antigenu a odstranění nenavázaných komponent, vcelku stejné. Další krok obsahuje přidávání neoznačené detekční protilátky, která je přidávána v pufru obsahujícím látky zabraňující nespecifické vazbě protilátky na povrch desky (blokační pufr). Dále následuje inkubace a vymytí nadbytku nenavázané protilátky, k docílení specifické vazby. Poté je přidán konjugát enzymem značené antidruhové protilátky v blokačním pufru, opět následuje inkubace a promytí a výsledkem je vazba konjugátu na neznačené protilátky, navázané na pevné fázi. Pak je přidán substrát (chromofor) k vázanému konjugátu, čímž se začne vyvíjet barva. Reakce je nakonec zastavena změnou ph a vyhodnocena spektrofotometricky. Nepřímá ELISA je podobná přímé v tom, že antigen je přímo navázán na pevnou fázi a na něj se váže protilátka (detekční protilátka). Nicméně, 32

33 tyto přidané protilátky nejsou konjugované, ale až samy cílové protilátky (sekundární) jsou konjugované s enzymem. Takové protilátky jsou produkovány proti určitému druhu imunoglobulinů. Tedy, kdyby byly detekční protilátky produkovány králíky, enzymem značené protilátky by měly být přírodní anti-králičí IgG. Použití antidruhových konjugátů umožňuje velkou flexibilitu, jelikož mohou být použity různé specifické konjugáty k detekci jednotlivých imunoglobulinů vázaných na vzorku. Dnes jsou k dispozici doslova tisíce komerčně dostupných konjugátů. Například, protidruhový konjugát by mohl být anti-igm, anti-igg 1, anti-igg 2, atd. Nepřímý systém skýtá výhodu v tom, že může být analyzován jakýkoliv počet druhů antisera po vazbě na daný antigen, použitím jediného protidruhového konjugátu. Tyto systémy byly hojně využívány v diagnostice, zvláště pro vyšetření velkého množství vzorků. Bohužel, mají ale kolísavý stupeň nespecifických vazeb v individuálních sérech, což způsobuje variabilitu výsledků, a proto vzniká potřeba analyzovat více sér pro stanovení jistoty. Obr. 9: Nepřímá ELISA. V tomto uspořádání se na navázaný antigen váže v druhé jamce neznačená detekční protilátka (Ab). V dalším kroku je přidán konjugát (Ab*), který se váže na neznačené protilátky. Následující kroky jsou shodné s předchozím systémem. 33

34 3.3.3 Sendvičová ELISA Sendvičová ELISA je rozdělena na dva systémy, a to na přímou sendvičovou ELISA a nepřímou sendvičovou ELISA. Přímá sendvičová ELISA Prvním krokem stanovení je pasivní zachycení protilátek na pevnou fázi, které pak váží přidané antigeny zředěny blokačním pufrem, který má opět funkci bránící nespecifické vazbě na pevnou fázi. Komponenty blokačního pufru by neměly obsahovat jakékoli látky, které by se mohly vázat na zachycené protilátky. Po inkubaci a promytí je komplex protilátka-antigen vázán na pevné fázi. Zachycený antigen, někdy nazývaný jako uvězněný, je pak detekován přídavkem a inkubací s enzymem značenou specifickou protilátkou v blokačním pufru, což je konjugát vázající se na zachycený antigen. Tato druhá protilátka může být stále stejná jako je používaná pro zachycení, nebo může být jiná v rámci specifického zvířecího zdroje nebo druhu, kterým byla produkována. Po inkubaci a vymytí je přidán substrát (chromofor) pro vývoj barvy, který je pak zastaven a nakonec vyhodnocen spektrofotometricky, viz Obr. 10. Protože je použit jediný konjugát enzym-protilátka, systém je omezený na specifičnost a vlastnosti tkvící v určité protilátkové skupině. Systém je také limitovaný v antigenech, které musí mít nejméně dvě antigenní místa (epitopy), protože je vyžadují k vazbě obě protilátky. Zde se může vyskytnout omezení možnosti stanovení poměrně dlouhých antigenních komplexů. Navázané protilátky (na pevné fázi) a detekční protilátky, mohou mít specifitu proti rozdílným epitopům na antigenním komplexu, což může být užitečné v orientaci antigenních molekul tak, že je zvýšená šance, že detekční protilátky budou navázány. To může být také výhoda v případě, kdy jsou analyzovány malé rozdíly mezi přípravky v antigenních vlastnostech molekul při použití rozdílných detekčních protilátek. Použití přesně stejné protilátky pro navázání a detekci může vést k vážnému omezení dostupnosti vazebných míst pro detekující protilátku. Velikost a prostorové uspořádání epitopů na antigenním terči je také rozhodující a může vážně ovlivnit stanovení. 34

35 Obr. 10: Přímá sendvičová ELISA. Zde jsou na povrch první jamky navázány protilátky (Ab), na které se specificky váže antigen (Ag). Pak je přidán konjugát (Ab*), který se váže na zachycený antigen. Další kroky jsou opět shodné jako u předchozího stanovení. Nepřímá sendvičová ELISA Stanovení u nepřímé sendvičové ELISA je dosti podobné přímé sendvičové ELISA (viz Obr. 11). Tedy, protilátky jsou pasivně navázány na pevnou fázi a antigeny jsou zachyceny. V dalším kroku ale přidané detekční protilátky, vázající se na antigen, nejsou konjugovány s enzymem. Po inkubaci a promytí jsou navázané detekční protilátky vázány, po přidání a inkubaci, s protidruhovým enzymovým konjugátem. Další postup je shodný s přímou sendvičovou ELISA. Výhoda stanovení je, že může být použito jakékoliv množství druhů protilátky za předpokladu, že živočišný druh, ve kterém byla protilátka vytvořena, není stejný jako ten, ze kterého pochází antigen. Sekundární (antidruhová) protilátka by se pak vázala nejen na primární protilátku, ale také na antigen. Konkrétněji, enzymový konjugát protidruhové protilátky by měl reagovat jen s protilátkami a ne se zachyceným antigen. To je možné s použitím stejného druhu protilátky, pokud jsou použity imunochemické techniky k vybrání a produkci jediných forem protilátek, s přihlédnutím ke specifitě používaného enzymového konjugátu. Např. vázaná protilátka by mohla být zpracována 35

36 v bivalentní molekulu bez Fc fragmentu a detekční protilátky by mohly být neupravované. Enzymový konjugát by pak mohla být protidruhová anti-fc protilátka, která by reagovala jen s protilátkami obsahujícími Fc části, a proto ne se zachycenou molekulou [49]. Obr. 11: Nepřímá sendvičová ELISA. První dva kroky jsou stejné jako u přímé sendvičové ELISA. V dalším kroku je ale přidána neznačená detekční protilátka (Ab 2 ), na kterou se váže konjugát (Ab*). Další kroky jsou opět shodné jako u předchozích systémů. 3.4 Konjugace V roce 1971 byly enzymy poprvé použity v imunoanalýze jako indikátory a nahradily některé radionuklidy. Enzym je kovalentně vázán neboli konjugován na antigen nebo protilátku. V připraveném enzymovém konjugátu musí mít použitý imunoreaktant, tedy antigen či protilátka, zachovány své původní imunospecifické vlastnosti, tedy antigen své determinanty a protilátka svá vazebná místa. Použitý enzym musí splňovat zejména následující základní požadavky. Musí mít snadno měřitelnou katalytickou aktivitu, nesmí se sám vyskytovat v měřeném vzorku, enzymový substrát 36