Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích

Transkript

1 Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Fakulta rybářství a ochrany vod Ústav komplexních systémů Laboratoř tkáňových kultur Zámek 136, Nové Hrady

2 Laboratoř funguje od roku 2005, v roce 2008 jsme splnily podmínky auditů a získali jsme ČSN EN ISO : Od září roku 2011 jsme se stali Akreditovanou laboratoří dle zásad ČSN EN ISO/IEC : Zkouška na cytotoxicitu výluhu - vizuálně (ČSN EN ISO , článek 8.2) 2. Zkouška na cytotoxicitu přímým kontaktem vizuálně (ČSN EN ISO , článek 8.3) 3. Zkouška na cytotoxicitu dilatací buněk - vizuálně (ČSN EN ISO , článek 8.2) 4. Zkouška klastogenity na savčích buňkách - vizuálně (ČSN EN ISO , OECD TG 473)

3 Nově vznikající a vyvíjené materiály se zcela odlišnými fyzikálními vlastnostmi (například nanomateriály) určené zejména pro zdravotnictví a biotechnologie, vyžadují vývoj a vznik nových podrobnějších metod jejich zkoušení. POJMY: Cytotoxicita - je schopnost buněk nebo chemických látek ničit buňky. Cytotoxické mohou být např. léky, imunitní buňky nebo jedy.

4 Biokompatibilita (Cytokompatibilita) snášenlivost látek zejména materiálů v biologickém prostředí; biokompatibilní materiál se posuzuje podle interakce s prostředím, zejména podle cytotoxického působení, podle toxikologických a alergických reakcí, podle karcinogenních, teratogenních či mutagenních reakcí, podle vlivu na infekční procesy, podle rozsahu a kvality biodegradace. Důležité je, aby materiál neovlivňoval např. koagulace, nevyvolával zánětovou reakci, neuvolňoval potenciálně toxické látky apod.

5 Buněčná kultura Buněčná kultura je systém, kdy jsou invitro kultivovány prokaryotické, eukaryotické či rostlinné buňky za zvláštních specifických podmínek. Nejčastěji se používají eukaryotické buňky ze savčích tkání. Pojem buněčná kultura je v úzké souvislosti s výrazem tkáňová kultura. Typy zde kultivovaných buněčných kultur: L929 CaCo2 HeLa MG63

6 MG63 Human osteosarcoma Kultivační médium : MEM with Earle s Salts (without L- Glutamine) L-Glutamine 200mM Non Essential Amino Acids (NEAA) Fetal Bovine Serum (Standard Duality) Antibiotik/Antimycotic

7 Metody použití buněčná linie MG63: 1) Cytotoxicita výluhu - Stupnice cytotoxicity 0 necytotoxický % počtu buněk v negativní kontrole 1 slabě cytotoxický 70-80% počtu buněk v negativní kontrole 2 středně cytotoxický 50 70% počtu buněk v negativní kontrole 3 silně toxický pod 50% počtu buněk v negativní kontrole 2) Cytotoxicita přímým kontaktem buňka materiál - Stupnice cytotoxicity 0 necytotoxický - buňky jsou v kontaktu s testovaným vzorkem 1 slabě cytotoxický žádná z buněk není v kontaktu s testovaným vzorkem 2 středně cytotoxický kolem testovaného materiálu je zóna mrtvých buněk minimálně 30 um 3 cytotoxický kolem testovaného materiálu jsou buňky mrtvé

8 3) Cytotoxicita dilatací buněk - Stupnice cytotoxicity 0 necytotoxický % počtu buněk v negativní kontrole 1 slabě cytotoxický 70-90% počtu buněk v negativní kontrole 2 středně cytotoxický 50 70% počtu buněk v negativní kontrole 3 silně cytotoxický pod 50% počtu buněk v negativní kontrole 4) Klastogenita na savčích buňkách - Stupnice klastogenity: 0 neklastogenní procento aberantních mitóz mezi negativní kontrolou a aplikací není vyšší než 5% 1 - klastogenní procento aberantních mitóz mezi negativní kontrolou a aplikací převyšuje 5 %

9 Příklad kompletní mitózy, chromatidového zlomu a dicentrického chromosomu

10 Buněčné fáze cyklu Nedilatované Buňky nejsou ještě sedlé, volně se pohybují v médiu (po pasáži).

11 Dilatovaná Po přisednutí buňky k povrchu,buňka začne rozprostírat cytoplasmatickou membránu.

12 Interfáze doba mezi dvěma M fázemi. Buňka nabývá na objemu. Dochází k replikaci DNA.

13 Profáze ( smrštění buňky z interfáze ) replikované chromosomy pocházející ze dvou sesterských chromatid, kondenzují.vně jádra se tvoří mitotické vřeténko mezi dvěma centrosomy, které se replikovaly a pohybují se od sebe.

14 Prometafáze Začíná rozpadem jaderného obalu. Kondenzované chromosomy se nacházejí volně v cytoplasmě a mohou se připojit k mikrotubulům vřeténka svými kinetochory a zahájit aktivní pohyb (rotace uvnitř buňky).

15 Metafáze Chromosomy jsou srovnány v ekvatoriální rovině vřeténka uprostřed mezi jeho póly. Párové kinetochorové mikrotubuly na každém chromosomu jsou připojeny k opačným pólům vřeténka.

16 Anafáze párové chromatidy se synchronně oddělují od sebe a tvoří dva dceřiné chromosomy, přičemž je každý z nich pomalu tažen k pólu svého vřeténka. Póly se oddalují a dochází k separaci chromosomů.

17 Telofáze Obě sady dceřinných chromosomů se doputují k pólům vřeténka. Tvoří se nový jaderný obal, který uzavírá každou sadu, tzn. tvorba jader a konec mitozy. Rozdělením cytoplasmy se tvoří kontraktilní prstenec.

18 Cytokineze Cytoplasma je rozdělena do dvou buněk kontraktilním prstencem. A tak jsou vytvořeny dvě dceřinné buňky, každá se svým jádrem.

19 Nekroza Buňky, které umírají důsledkem poškození, poranění zvětšují objem, prasknou a vylijí svůj obsah do svého okolí.

20 Kultivace a) výměna média b) pasáž (trypsinizace) PBS fyziologický roztok pro oplach buněčných linií s ph 7,3 ( připravený z NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4) VT verzen trypsin - roztok Trypsinu EDTA(10x) a PBS pro uvolňování pouštění buněk ze dna kultivační nádoby Kultivační médium a VT je nutné před kultivací po dobu 15-20minut ohřát při 37 C. Laminární box je nutné po dobu 30minut nechat projít UV světlem.

21 1.Krok Výměna média -kontrola morfologie, množství, nahloučenosti (pro VM buňky nesmí tvořit souvislý monolayer) 2.Krok -příprava spotřebního materiálu sterilního do laminárního boxu. Jednorázové plastové pipety, kádinky, skleněné pasteurovy pipety, špičky jednorázové atd. -kontrola ohřátého média pro danou buněčnou linii 3.Krok -postup výměny média -odsajeme staré médium a 2x oplach buněk s PBS - pomocí jednorázové pipety doplníme nové médium (množství dle kultivační nádoby) - hrdlo kultivační lahvičky opálíme nad plamenem a zavíčkujeme - kontrola buněk po výměně média stav, množství - úklid kultivační lahvičky do termostatu s 5% CO2, 37 C a 85% vlhkostí

22 1.Krok viz.výměna média 2.Krok viz.výměna média Pasáž 3.Krok - odsátí starého média a 2x oplach PBS - do malé kultivační lahvičky doplnit přiměřené množství VT (300ul) - opálit hrdlo kultivační lahvičky a její uzavření - vrátit lahvičku s VT a buňkami do termostatu na individuálně dlouhou dobu dokud se buňky nezačnou pouštět Pouštění buněk z interfáze se buňky zakulatí a rozruší se monolayer a buňky se uvolní do roztoku VT (zjištění pohledem) 4.Krok - po uvolnění se buněk do roztoku VT lze provést následující kroky a) v případě nepotřebnosti 2/3 buněk odsát b) založení nové kultivační lahvičky c) použití buněk pro pokus (časosběrné snímání, nasazení na materiály atd.) 5.Krok - doplnění nového média k uvolněným buňkám v roztoku VT - úklid kultivační lahvičky do termostatu s 5% CO2, 37 C a 85% vlhkostí - za cca hodinu po pasáži zkontrolovat v mikroskopu morfologii a dilataci buněk