Stabilita fytokanabinoidů při skladovaní Cannabis sativa

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Stabilita fytokanabinoidů při skladovaní Cannabis sativa (Rigorózní práce) Vedoucí rigorózní práce: RNDr. Michaela Hamerníková, Ph.D. Hradec Králové, 2008 Mgr. Jitka Myšíková

2 Dovoluji si poděkovat RNDr. Michaele Hamerníkové, Ph.D. za odborné vedení, ochotu a pomoc při vypracování této rigorózní práce, Ing. Ivu Vykydalovi z Policie ČR za dodání vzorků marihuany a též všem ostatním, kteří mi byli jakkoliv nápomocni. 2

3 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. 3

4 Abstrakt: Název: Stabilita fytokanabinoidů při skladování Cannabis sativa Autor: Mgr. Jitka Myšíková Vedoucí rigorózní práce: RNDr. Michaela Hamerníková, Ph.D. Zabývala jsem se problematikou stanovení 9 -THC, CBD a CBN a jejich prekurzorů. Posuzovala jsem vliv doby a způsobu skladování na marihuanu a na n-hexanový extrakt z marihuany. Provedla jsem validaci metody stanovení 9 -THC, CBD a CBN pomocí HPLC s UV detekcí při vlnové délce 220 nm, mobilní fází metanol : voda ( 85 : 15), kolona SUPELCOSIL TM LC-18-DB. Hlavním cílem bylo zjištění vlivu různých způsobů skladování v závislosti na délce skladování na obsah hlavních obsahových složek marihuany. K dispozici jsem měla 2 druhy marihuany, které jsem rozdělila každý na 12 vzorků, přičemž 6 vzorků jsem vždy umístila do igelitového sáčku a 6 do plátěného. Poté jsem na celkem 6 stanovišt umístila vždy jeden vzorek marihuany v polyetylenovém sáčku a jeden v plátěném, a to od každého druhu. Místa skladování jsem volila s ohledem na možná umístění od uživatelů marihuany či na jejich možné experimenty s touto drogou. Sledování probíhalo po 8,5 měsíce. Vzorky jsem umístila do lednice, mrazícího boxu, do místnosti za přístupu světla, na venkovní okenní parapet, pod UV lampu či jsem vzorky střídavě přibližně jednou týdně namáčela a následně vysoušela při pokojové teplotě. Změna množství 9 -THC, CBD a CBN ve vzorku závisela jak na místě skladování, na obalovém materiálu, tak na počátečním množství prekurzorů sledovaných analytů. Naměřené změny jsou součástí rigorózní práce. Vždy došlo ke snížení prekurzorů. Nejstabilnější byly vzorky skladovené za snížené teploty (lednice, mrazící box) za tmy. Pokus o zjištění stability n-hexanového z marihuany potvrdil, že extrakt je stabilní po velmi krátkou dobu a jeho složení se mění velmi rychle. 4

5 Abstract: (English version) Title: Stability of Phytocanabinoids during Storage of Cannabis Sativa Author: Mgr. Jitka Myšíková Supervisor: RNDr. Michaela Hamerníková, Ph.D. The rigorous work deals with the issue of determination 9 -THC, CBD and CBN and their precursors. I assessed the effect of storage time and storage methods on marijuana and n-hexan extract made from marijuana. Validation of the method of 9 -THC, CBD and CBN determination was carried out through HPLC with UV detection at wave length of 220 nm, mobile phase methanol : water (85 : 15), column SUPELCOSIL TM LC-18-DB. The main aim was to detect the effect of storage time and various storage methods on key substances contained in marijuana. There were two different types of marijuana available, each type was divided into twelve samples, six of them placed in plastic bags and the other six in linen bags. Then from each type of marijuana, one sample in the plastic bag and one sample in the linen bag were located in 6 places. The places of storage were chosen with respect to possible storage locations by marijuana users or to their possible experiments with the marijuana. The observations went on for period of 8,5 months. The samples were placed in a refrigerator, an ice-box, a room with daylight, on an exterior window sill, under a UV lamp or the samples were soaked in water and then dried during room temperature one a week. The changes of 9 -THC, CBD and CBN quantities in the samples depended on the storage time, the storage place, the packaging material and on the initial quantity of precursors observed analytes and the measured changes are documented in the work. Quantities of the precursors were always reduced. The most stable marijuana samples were those ones stored at a reduced temperature (the refrigerator and the ice-box) in the dark. The stability test of the n-hexano extract made from marijuana proved that the extract is stable for a very short period of time and its content is subject to quick changes. 5

6 Obsah: 1. Úvod Současný stav problematiky Konopná rostlina Variabilita obsahu 9 -THC v závislosti na věku, pohlaví a části rostliny Kriteria zaměřená na rozdíl mezi technickým konopím a konopím, které patří k drogovému typu Ostatní strategie používané pro klasifikaci konopných rostlin Produkty Cannabis Obsahové látky Cannabis sativa Nespecifické obsahové látky Specifické obsahové látky Přírodní kanabinoidy Biosyntéza a funkce kanabinoidů Stabilita obsahových složek konopí a extraktů z konopí Vliv světla a použitého rozpouštědla Vliv teploty Vliv kyslíku Analýza kanabinoidů v konopných rostlinách a derivátech Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Plynová chromatografie (GC) Spektrometrie v UV oblasti Infračervená spektrometrie (IČ) Experimentální část Přístroje, chemikálie a ostatní pomůcky Podmínky HPLC analýzy Příprava mobilní fáze Příprava z marihuany a vzorku Výpočet obsahu 9 -THC, CBN, CBD Validace metody stanovení 9 THC pomocí HPLC Kalibrační křivka 9 -THC Určení přesnosti pro stanovení 9 THC Určení správnosti pro stanovení 9 THC Určení výtěžnosti pro stanovení 9 THC Určení opakovatelnosti měření obsahu 9 THC Určení meze stanovitelnosti 9 THC Určení meze detekce 9 THC Validace metody stanovení CBD pomocí HPLC Kalibrační křivka CBD Určení přesnosti pro stanovení CBD Určení správnosti pro stanovení CBD Určení výtěžnosti pro stanovení CBD Určení opakovatelnosti měření obsahu CBD Určení meze stanovitelnosti CBD Určení meze detekce CBD Validace metody stanovení CBN pomocí HPLC Kalibrační křivka CBN Určení přesnosti pro stanovení CBN

7 Určení správnosti pro stanovení CBN Určení výtěžnosti pro stanovení CBN Určení opakovatelnosti měření obsahu CBN Určení meze stanovitelnosti CBN Určení meze detekce CBN Stabilita kanabinoidů při skladovaní marihuany Stabilita n-hexanového z marihuany Zjištění stability po šesti dnech Zjištění stability po dvanácti dnech výsledky a diskuze Validace metody stanovení 9 THC pomocí HPLC Kalibrační křivka 9 -THC Určení přesnosti pro stanovení 9 THC Určení správnosti pro stanovení 9 THC Určení výtěžnosti pro stanovení 9 THC Určení opakovatelnosti měření obsahu 9 THC Určení meze stanovitelnosti 9 THC Určení meze detekce 9 THC Validace metody stanovení CBD pomocí HPLC Kalibrační křivka CBD Určení přesnosti pro stanovení CBD Určení správnosti pro stanovení CBD Určení výtěžnosti pro stanovení CBD Určení opakovatelnosti měření obsahu CBD Určení meze stanovitelnosti CBD Určení meze detekce CBD Validace metody stanovení CBN pomocí HPLC Kalibrační křivka CBN Určení přesnosti pro stanovení CBN Určení správnosti pro stanovení CBN Určení výtěžnosti pro stanovení CBN Určení opakovatelnosti měření obsahu CBN Určení meze stanovitelnosti CBN Určení meze detekce CBN Stabilita kanabinoidů při skladovaní rostliny Cannabis sativa Stanovení obsahu 9 THC v závislosti na délce a způsobu skladování Stanovení obsahu CBD v závislosti na délce a způsobu skladování Stanovení obsahu CBN v závislosti na délce a způsobu skladování Souhrn množství sledovaných analytů při skladovaní marihuany Stabilita n-hexanového z marihuany Zjištění stability po šesti dnech Zjištění stability po dvanácti dnech Závěr Přílohy Literatura

8 Seznam zkratek: 9 -THC 8 -THC 9 -THCA 9 -THCA-A 9 -THCA-B CBN CBNA CBD CBDA SD RSD 9 -tetrahydrokanabinol 8 -tetrahydrokanabinol deriváty 9 -THC, které nesou karboxylovou skupinu kyselina 9 -tetrahydrokanabinolová A kyselina 9 -tetrahydrokanabinolová B kanabinol kyselina kanabinolová kanabidiol kyselina kanabidiolová směrodatná odchylka relativní směrodatná odchylka 8

9 1. ÚVOD 9

10 Konopné drogy jsou nejrozšířenější nelegální psychoaktivní drogy. Užívají se obvykle inhalačně nebo perorálně ve formě marihuany, hašiše (konopná pryskyřice) nebo hašišového oleje (extrakt z konopné pryskyřice). 1,2 Rostlina marihuany (konopí seté, Cannabis sativa) se vyskytuje po celém světě ve dvou základních kultivarech, technickém a drogovém konopí. O tom, zda rostlina produkuje především vlákno nebo omamnou pryskyřici, rozhodují jak genetické, tak klimatické vlivy. 1 V konopí bylo dosud identifikováno více než 483 sloučenin, 2 z toho více než 70 kanabinoidů 3 a stále se objevují nové. V čerstvé rostlině konopí setého je většina kanabinoidů přítomna ve formě karboxylových kyselin. Hlavními složkami jsou 9 -THC, CBN, CBD a jejich prekurzory-odpovídající karboxylové kyseliny. 4 Slibný terapeutický potenciál 5 např. při léčbě migrény a bolestí hlavy, 6 astmatu, 7 glaukomu 8 apod. vede k tomu, že v některých zemích jsou k dostání preparáty obsahující 9 -THC nebo jeho deriváty. V USA jsou známé jako Marinol a Cesamet. To vede v některých zemích k liberálnějšímu pohledu na užívání konopí. V Kanadě je konopí uvolněno pro lékařské použití, v Nizozemsku je částečně legalizované, Švýcarsko, Belgie, Itálie, Španělsko a Portugalsko netrestají přechovávání a pěstování pro vlastní potřebu a v ČR se zvažuje zařazení do nižší třídy společenské nebezpečnosti. 9 Mají skončit též dohady kolem povoleného množství drog v držení. Dosud se v praxi postupovalo zejména dle přílohy k Závaznému pokynu policejního prezidenta č. 39/1998, kde jsou uvedeny mj. orientační hodnoty malého množství omamných a psychotropních látek, přičemž pro 9 -THC to je maximálně 0,3 g. Maximálnímu množství, které je uvedeno, zpravidla odpovídá 20 cigaret - jointů (u konopí pěstovaného v našich podmínkách s koncentrací okolo 1,5 % v sušině použitelné části konopí, při váze jointu cca 1 gram). 10,11 Uplatnil se i zákon č. 466/2004Sb o návykových látkách, kde Hlava V, zakazuje pěstování konopí s obsahem 9 -THC > 0,3%. 11 Poslanci přijetím nového trestního zákoníku vládě uložili, že musí jasně říci, kolik rostlin konopí může člověk pěstovat, aniž by se vystavil riziku policejního stíhání. Vláda má vůbec poprvé jasně říci, co je u drog považováno za "množství větší než malé". Poněkud nejasný slovní obrat je totiž důležitý pro určení toho, zda policie někoho začne za držení drog stíhat. Jednotné hodnocení zatím v Česku neexistuje. A vize je taková, že za pěstování více než tří rostlin konopí bude hrozit v základní trestní sazbě šest měsíců vězení a trest za držení zhruba 20 cigaret bude v základní sazbě do jednoho roku vězení

11 Ačkoli jsou účinky kanabinoidů studovány již velmi dlouho, výraznější pokrok v poznání molekulárních mechanismů jejich působení byl možný až po průkazu existence kanabinoidních receptorů v roce 1988 a po objevení endogenního metabolitu s afinitou ke kanabinoidnímu receptoru v roce Hlavní psychoaktivní složkou konopné pryskyřice je 9 -tetrahydrokanabinol ( 9 -THC), ale konopí obsahuje desítky různých kanabinoidů, z nichž některé vykazují podobné účinky jako 9 -THC. 2 Pouze 8 -THC, který je přítomný ve velmi malých koncentracích v rostlině, ale může být získán docela snadno i chemickou syntézou nebo se vytvořit z 9 -THC, ukázal podobné psychoaktivní vlastnosti. Kanabinol, který je v podstatě chemický degradační produkt 9 -THC, také ukázal určitou aktivitu; jeho koncentrace se všeobecně zvyšuje se stářím vzorku. Čerstvé zkušební vzorky Cannabis sativa L. obvykle obsahují kanbinoidy ve formě svých karboxylových kyselin. Tyto tetrahydrokanabinolové kyseliny, jmenovitě kyselina 9 -THCA-A a kyselina 9 -THCA-B, snadno dekarboxylují na neutrální 9 -THC, když se zahřejí. V důsledku toho nelze tyto tetrahydrokanabinolové kyseliny zkoumat přímo plynovou chromatografií s teplotním programem. V létě teplota určitých částí rostliny dosahuje pravděpodobně takových hodnot (teplota C je docela běžná pro listy rostliny), které umožňují částečnou dekarboxylaci některých kanabinoidních kyselin. Většina neutrálních kanabinoidů se pravděpodobně vytvoří pomalu během schnutí pryskyřičných frakcí rostliny. Podobně kouření cannabis má za následek téměř kompletní konverzi kyselin na jejich dekarboxylované aktivní protějšky. Potraviny nebo nápoje obsahující cannabis nebo kanabisové extrakty, které se vaří nebo ohřívají před podáváním, obsahují pouze stopové množství kyselin. Účinnost přípravku proto lépe popisuje totální koncentrace 9 -THC, obvykle jako % celkové 9 -THC (tj. neutrální 9 -THC + jeho kyselé prekurzory) k sušené váze materiálu. Taxonomie cannabis se také odvíjí od relativních podílů koncentrací kanabinoidů, které jsou navrženy jako suma neutrální sloučeniny a korespondující karboxylové kyseliny. V případě orálního podání nezahřátého rostlinného materiálu, musí být neutrální frakce 9 -THC, o které se předpokládá, že je zodpovědná za psychoaktivní účinky, určena samostatně. 3 Farmakokinetika 9 -THC je silně ovlivněna jeho lipofilními vlastnostmi a tedy akumulací v tukových tkáních. Akutní účinky konopných drog na psychické, psychomotorické a fyziologické funkce jsou dobře známy, méně spolehlivých údajů je zatím o vlivu jejich chronického užívání. V současné době se diskutují jak negativní účinky 9 -THC, tak možnost lékařského využití kanabinoidů a jejich analogů. 2 11

12 Cíl práce: Cílem rešeršní části bylo shrnout: 1. základní informace o konopí chemické složení, botanické aspekty, druhy a klasifikace konopí, účinky na lidský organismus 2. stabilitu obsahových složek konopí, jeho extraktů a porovnání výsledků různých autorů 3. biosyntézu a funkci kanabinoidů 4. analýzu kanabinoidů v konopí a její úskalí Cílem experimentální části bylo: 1. provést validaci metody pro stanovení obsahu 9 -THC, CBN, CBD, tj. sestrojení kalibrační přímky, určení přesnosti, správnosti, výtěžnosti, opakovatelnosti, meze detekce a meze stanovitelnosti 2. prozkoumat a porovnat změnu obsahu 3 základních složek marihuany ( 9 -THC, CBN, CBD) a jejich prekurzorů, tj. kyselin na 2 různých vzorcích v závislosti na délce skladování a podmínkách skladování 3. stanovit stabilitu n-hexanového z marihuany při skladování v chladu 12

13 2. SOUČASNÝ STAV PROBLEMATIKY 13

14 2.1. Konopná rostlina Cannabis sativa L. roste v přírodě jako jednoletá, dvoudomá bylina tj. rostlina, která má jednopohlavné květy; na některých jedincích jsou umístěny samičí květy (pestíkové) a na jiných jedincích jsou umístěny samčí květy (prašníkové). Některé variety jsou jednodomé, s oběma typy květů (samčími a samičími) na jedné rostlině. Rostlina je široce rozšířená, a to i v různých teplotních pásmech. 3 Původně pochází z mírného pásma Asie, odkud se druhotně rozšířila téměř po celém světě. 13 Pro konopnou rostlinu jsou charakteristické dlanité listy se zubatým okrajem, které se skládají obvykle z 5-9 úzkých podlouhlých listů. Samčí květy jsou shromážděny v latách, zatímco samičí květy tvoří kompaktní vrcholík. Samičí květy mají 5 okvětních segmentů a jsou obemknuty velkým trvalým listenem. Povrch těchto listenů je hustě pokryt vyměšovacími chlupy a cystolity (útvary obsahující uhličitan vápenatý). 3 Na povrchu všech částí rostliny s výjimkou kořenů a semen se nacházejí pryskyřičné žlázky, v nichž je ve speciálních buňkách vytvářena pryskyřice. Pryskyřice, v níž jsou obsaženy specifické látky konopí, tzv. kanabinoidy, se získává především ze žlaznatých listenů obalujících květy a plody. V závislosti na klimatických podmínkách, v nichž rostliny rostou, je její složení odlišné. Tvorba a složení pryskyřice jsou ovlivňovány fyzikálními faktory - slunečním svitem, suchem, teplem. V mírném klimatu obsahuje především kyselinu kanabidiolovou s bakteriostatickými účinky, v subtropickém a tropickém podnebí převažuje aktivní forma tetrahydrokanabinolu. Protože rostliny rostoucí v tropickém pásmu obsahují pryskyřice nejvíce, předpokládá se, že má pro rostliny význam ochranný, tzn. chrání je před extrémními podmínkami. 13 Krátké dny podněcují kvetení a rostlina se fotoperiodicky adaptuje, aby ukončila růst v závislosti na délce růstové sezóny v určité oblasti. Neexistuje však v tomto všeobecná shoda co se týče mezidruhového taxonomického chování kanabis. Společně s chmelem (Humulus lupulus) patří konopná rostlina do čeledi Cannabaceae 3, 14, (dříve se řadila do čeledi Urticaceae a následně do Moraceae), 9,11 která patří do řádu Rosales. 3 A v encyklopedii Wikipedia se uvádí řád Urticales. 14 Morfologie listů se použila pro rozlišení C. sativa L., C. indica Lam a C. ruderalis Janischevsky (konopí rumištní). 3 Systematičtí botanici nejsou v taxonomické klasifikaci konopí zcela jednotní. Někteří rozlišují více druhů, tj. konopí seté, konopí indické, konopí rumištní. Jiní považují konopí indické za varietu konopí setého. 13 Ale vzhledem k tomu, že to vypadá, že neexistují bariéry pro úspěšné křížení v rámci rodu, je zřejmé, 14

15 že je nutné považovat konopí jako monotypický rod s jedním polymorfním druhem: Cannabis sativa L. Variace v rodu Cannabis je z velké části následkem selekce, kterou vytvořil člověk. Dva jevy usnadňují křížení a míchání konopných rostlin, a to únik kultivovaných rostlin do volné přírody a jejich opylení pomocí větru. Obsah kanabinoidů se používá k popsání charakteristiky fenotypů nebo chemotypů; buď patří k drogovému nebo technickému typu konopí Variabilita obsahu 9 -THC v závislosti na věku, pohlaví a části rostliny 9 -THC se koncentruje do pryskyřice, která se vylučuje do trichomů, které se nachází na malých listech (listenech) a listencích (jsou to drobné listeny na stopce a obklopují semeník) na kvetoucích vrcholcích samičí rostliny. Samčí rostlina produkuje rovnocenné množství aktivní složky, která se nachází v celé rostlině. Samičí konopné květy zůstávají plodné během krátké periody. O konopí je známo, že vytváří velké množství nových květů, dokud není opylené. Zabránění opylení tedy stimuluje vytváření nových květů a zvyšuje tedy výnos kanabinoidů. Tato strategie je známa pěstitelům drogových kultivarů jako tzv. bezsemenná technologie. 3 GC-FID analýzy hlavních částí konopné rostliny prokázaly, že jednotlivé části rostliny snížují obsah 9 -THC v následujícím pořadí: listeny, květy, listy, menší stopky,větve, kořeny a semena. Všechny rostlinné části ale obsahují kanabinoidy. Prokázalo se, že pylová zrna, vlákna a semena obsahují nízkou hladinu kanabinoidů. Při dalším podrobnějším zkoumání pomocí elektronového mikroskopu se zjistilo, že vzorky pylových zrn obsahují epidermální žlaznaté trichomy promíchané s pylovými zrny. Toto zjištění naznačuje, že nízká hladina kanabinoidů představuje spíše znečištění, které pochází spíše ze žláz než z pylových zrnek, protože o žlaznatých trichomech je všeobecně známo, že obsahují kanabinoidy. Přítomnost většiny kanabinoidů v semenech by mohla být taky vysvětlena vnějším znečištěním. Bylo zjištěno, že ve skutečnosti se vyskytuje 9 -THC v nažkách hlavně na vnějším povrchu osemení a pravděpodobně je výsledkem vzájemného fyzického působení s rostlinnými listeny během zpracování. Až do současnosti byl hodně rozšířený předpoklad, že intoxikační vlastnosti konopné pryskyřice jsou značně modifikovány životním prostředím. Nyní se zdá, že intoxikační charakteristiky pryskyřice jsou v rozumné míře konzervativní. Navíc nebylo sledováno žádné podstatné kolísání relativního množství hlavních kanabinoidů, 15

16 tj. 9 -THC, kanabidiolu a kanabichromenu v různých typech Cannabis sativa, které se zatím analyzovaly Kriteria zaměřená na rozdíl mezi technickým konopím a konopím, které patří k drogovému typu Studie a analýzy konopných rostlin naznačují, že konopné druhy nebo kultivary mohou být klasifikovány do dvou hlavních chemických fenotypů podle obsahu kanabinoidů. Druhy, které řadíme do skupiny technické konopí všeobecně obsahují více kanabidiolu než 9 -THC, zatímco pro pryskyřičné konopné rostliny, patřící k drogovým typům, je charakteristický hmotnostní poměr 9 -THC ku kanabidiolu vyšší než 1. Konopí lze klasifikovat takto: Fenotyp 9 -THC CBD poměr 9 -THC/CBD Vláknité konopí méně než 0,5 více než 0,5 méně než 1 Pryskyřičná Cannabis více než 0,5 méně než 0,5 více než 1 Jestliže vezmeme v úvahu možnou degradaci 9 -THC na kanabinol, konopí je klasifikováno do dvou hlavních fenotypů podle hodnoty poměru množství kanabinoidů: ( 9 -THC + CBN) / CBD. Jestliže poměr přesáhne 1, konopné rostliny jsou klasifikovány jako drogové fenotypy, jinak patří mezi vláknité fenotypy Ostatní strategie používané pro klasifikaci konopných rostlin Dělá se mnoho různých pokusů ve snaze o lepší charakteristiku různých konopných odrůd různého původu a jejich vzájemné rozlišení. 3 Jedna strategie je použít elektroforézní profily proteinů semen. Rozdílné DNA profily dokázaly ohodnotit genetické souvislosti druhů, kultivarů a dokonce jednotlivců. Například, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA používající polymerázovou řetězovou reakci) se uplatnila, aby se získaly informativní a reprodukce schopné fragmenty, které prokazovaly jasně rozdíly mezi vzorky z odlišných zdrojů. 3 16

17 Produkty Cannabis V pryskyřici pestíkových vrcholových květenství byla nalezena největší koncentrace kanabinoidů. Pro tuto zaschlou a zformovanou pryskyřici se používá název hašiš. 13 Procento pryskyřice v hašiši určuje jeho barvu, konzistenci a obsah 9 -THC. 3 Uživateli drog je také požívána nadzemní část rostlin (nejvyšší koncentrace kanabinoidů je v květech a vrcholových lístcích samičích rostlin) pod označením marihuana. Z vrcholků těchto rostlin se extrakcí organickými rozpouštědly připravuje hašišový olej, který může obsahovat, tak jako hašiš, až 40 % aktivní formy 9 -THC (marihuana obsahuje průměrně 8 až 12 %) Obsahové látky Cannabis sativa Nespecifické obsahové látky V rostlinách konopí lze najít poměrně velké množství obsahových látek, které patří k primárním i sekundárním metabolitům. Turner se svými spolupracovníky jich v r popsali 421. Od té doby byly objeveny další, dnes se hovoří o sloučeninách, které lze v konopí nalézt. 13 Někteří autoři uvádí i větší množství. 2 Většina z nich patří k látkám běžně rozšířeným v živých organizmech Specifické obsahové látky Termín kanabinoidy byl poprvé použit Mechoulamem roku 1967 pro sloučeniny s 21 uhlíky, jejich karboxylové kyseliny, analoga a transformační produkty, které jsou přítomné v konopí. Některé z nich mohou vykazovat určité biologické účinky, např. po vazbě na kanabinoidní receptory (CB). Množství a zastoupení jednotlivých kanabinoidů má zásadní význam pro psychoaktivní i jiné biologické účinky pryskyřice a rostlin Přírodní kanabinoidy Přírodní kanabinoidy se člení na několik strukturních typů. Delta-9-trans-tetrahydrokanabinolový typ zahrnuje kyseliny delta-9- -tetrahydrokanabinolovou (obr. č. 1 a 2), tetrahydrokanabivarolovou, tetrahydrokanabivarinovou, delta-9-tetrahydrokanabinol, delta-9-tetrahydrokanabivarol a delta-9-terahydrokanabivarin. Delta-9-trans-tetrahydrokanabinol ( 9 -THC) (obr. č. 3) z této skupiny je nejvýznamnější zástupce kanabinoidů vůbec, vyznačuje se 17

18 psychoaktivními účinky. Ve skupině kanabinoidů může tvořit 0 až 95 %. K jeho tvorbě dochází až ve starších rostlinách. Posledním stupněm jeho biosyntézy je dekarboxylace 9 -tetrahydrokanabinolové kyseliny. Rychleji může tento proces nastat při zahřívání, k čemuž dochází např. při kouření marihuany. Roku 1964 se podařilo 9 -THC izolovat a objasnit strukturu jeho molekuly. Ta je tvořena dihydrobenzopyranovou strukturou s 21 uhlíky, hydroxyskupinou na C1 a alkylovým řetězcem na C3 aromatického kruhu. Obr.č. 1: 9 -THCA-A OH COOH O Obr. č. 2: 9 -THCA-B OH O COOH Obr. č. 3: 9 - THC OH O Chemicky se jedná o (6aR-trans)6a,7,8,10a-tetrahydro-6,6,9-trimethyl-3-pentyl- -6H-dibenzo(b,d)pyran-1-ol, sumárního vzorce C 21 H 30 O 2, se střední relativní molekulovou hmotností Mr = 314,47. Mezinárodní nechráněný název pro trans izomer delta-9- tetrahydrokanabinolu, který má několikanásobně vyšší biologickou aktivitu než cis izomer, je dronabinol. Při pokojové teplotě je to nažloutlá, pryskyřičnatě lepivá látka, citlivá na světlo, teplo, působení atmosférického kyslíku, přičemž působením 18

19 olej. 9 Obr. č. 5 : kanabinol těchto faktorů dochází k pomalému rozkladu na kanabinol. Má největší terapeutické uplatnění, s výjimkou některých indikací, pro něž jsou vhodnější jiné kanabinoidy nebo jejich kombinace. Tetrahydrokanabivarin (THCV), který je propylderivátem 9 -THC, byl nalezen především v rostlinách z jihovýchodní a střední Asie a z Afriky, ve kterých tvořil asi 50 % z celkového obsahu přítomných kanabinoidů. Údajů o jeho působení v organismu je jen málo. Kanabidiolový typ je zastoupen kanabidiolem, jeho methyletherem, kyselinami kanabidivarinovou, kanabidorkolovou, kanabidiolovou, kanabidivarinem, kanabidorkolem. Z tohoto typu je významný kanabidiol (2-[3-methyl-6-(1- -methylethenyl)-2-cyklohexen-1yl]-5-pentyl-1,3-benzendiol) (CBD) sumárního vzorce C 21 H 30 O 4 (obr. č. 4). Protože nepůsobí přes kanabinoidní receptory, nemá psychoaktivní účinky. Projevuje určité vlastnosti sedativní, analgetické, antibiotické a zlepšuje snášenlivost 9 -THC antagonizací jeho psychotropního působení. Vzniká dekarboxylací z kyseliny kanabidiolové. Obr. č. 4: kanabidiol OH HO Kanabinolový typ reprezentují kanabinol, jeho methylether, kanabinolová kyselina, kanabivarin, kanabiorkol. Kanabinol (CBN) C 21 H 26 O 2 (obr. č. 5) je degradačním (oxidačním) produktem THC, není tedy jako takový rostlinou produkován. Čerstvé vzorky konopí ho obsahují jen minimální množství. Čistý má nanejvýš 10 % psychotropní aktivity 9 -THC. Jeho účinky se projevují spíše jako pocity ztráty orientace, vnitřní rozpolcenosti, závratě. 13 Kanabinol je tzv. hrubý produkt tzv. červený OH O 19

20 Dalším je typ kanabichromenový, k němuž patří kyseliny kanabichromenová a kanabichromevarinová, kanabichromevarin a kanabichromen. Kanabichromen byl nalezen pouze v usušených rostlinách v nižších koncentracích. Jedná se zřejmě o degradační produkt některého z kanabinoidů. Předpokládá se, že nemá psychotropní účinky. Ke kanabigerolovému typu patří kanabigerol, jeho methylether, kyseliny kanabigerolová a kanabigerovarinová, kanabigerovarin. Kromě uvedených skupin kanabinoidů je v rostlinách řada dalších sloučenin nepatřících k žádnému z těchto typů. Jsou to např. kanabielsion, kanabicyklol, kanabicyklolová kyselina, kanabicyklovarin, kanabifuran, dehydrokanabifuran, kanabiripsol, kanabicitran, kanabichromanon. Také diskutabilní kanabispirany, které v některých pracích nejsou řazeny ke kanabinoidům. 13 Vědci též rozeznávají i další typy kanabinoidů, a to typ 8 terahydrokanabinol ( 8 THC), kanabinodiol a další typy Biosyntéza a funkce kanabinoidů Biosyntéza 9 -THC byla dopodrobna prozkoumána teprve nedávno: kondenzací geranylpyrofosfátu s olivetolovou kyselinou pomocí konopné transferázy (prenyltransferáza) vzniká kanabigerolová kyselina (CBGA), která je následně substrátem pro 9 -THCA-A syntázu. 3 Produktem této biosyntézy je 9 -THCA-A a ne 9 -THC. (obr. č.6). 9 -THCA-A tedy vzniká z CBGA a ne z CBDA, jak se dříve předpokládalo. 15 Obr. č. 6: Biosyntéza 9 -THCA-A z triketokyseliny 20

21 Dříve byl předpoklad takový, že kanabidiol je prekursor 9 -THC. Kanabidiol je také syntetizován z největší pravděpodobností, obdobně jako 9 -THC, jako jeho karboxylový derivát, tj. kanabidiolová kyselina (obr. č. 7). Ačkoliv je nepsychoaktivní, je prokázáno, že tato sloučenina vykazuje antikonvulzivní a anxiolytické vlastnosti. Do dnešní doby není ještě zcela objasněna regulace syntézy kyseliny 9 -THCA-A a její vzájemná souvislost s jinými biosyntetickými cestami např. terpenoidská cesta a vyžaduje další studie. 3 Jsou načrtnuté ale hlavní biosyntetické cesty a popsány na enzymatické a genetické úrovni. 15 Obr. č. 7: Syntéza 9 -THCA-A, CBDA a CBCA z CBGA, která zde má centrální roli. Je i několik hypotéz, které se zabývají biologickou funkcí kanabinoidů; většina z nich pojednává o adaptaci na stres životního prostředí, a to zejména na množství zálivky a teplotu. Navíc kanabinoidy by mohly poskytovat ochranu proti UV záření, patogenům (antibiotický efekt) a škůdcům např. mšice, které mohou být vlákány do léčky v podobě pryskyřice díky kanabinoidům. 3 Jedná se ale pouze o hypotézy a skutečná funkce je stále neznámá. 15 Profil kanabinoidů v každé odrůdě je dědičný a kontrolovaný pomocí mnoha enzymatických reakcí. 9 -THCA-A syntáza katalyzující biosyntézu 9 -THCA-A (oxidocyklizaci) z CBGA se vyskytuje především v listech Cannabis sativa. Je 21

22 zajímavé, že transformované vláskovité kořeny tabáku po exogenním přidání prekurzoru CBGA produkují kyselinu 9 -THCA-A Stabilita obsahových složek konopí a extraktů z konopí Již dlouho je známo, že konopná pryskyřice a konopí ve formě sušené drogy, tj. marihuany ztrácí účinnost při skladování. Tvrdí se, že tato nestabilita byla v minulosti důvodem, který hovořil v neprospěch používání cannabis v medicíně. Po zjištění skutečnosti, že účinnost cannabis je hlavně díky obsahu 1 - trans THC 16 (dřívější označení 9 -THC) 2, některé experimenty na pryskyřici a rostlině konopí skutečně potvrdily, že obsah 9 -THC se snižuje při skladování (Lerner, 1969; Muander, 1970; Mechoulam, 1970; Schou & Nielsen, 1970). Další tři studie naznačují, že etanol snad projevuje znatelný stabilizační účinek (Ecker&Miller, 1917; Kubena, Barry&others, 1972; Razdan, Puttick&others). Ale pouze málo experimentů v předchozích studiích se uskutečnilo na pečlivě datovaných vzorcích a patřičnými metodami analýzy, přičemž různé podmínky skladování nebyly ani zkoumány detailně. V roce 1971 začal J.W. Fairbairn, J.A. Libmann a M.G. Rowan experimenty zaměřené na testování vlivu zřejmých faktorů jako je světlo, kyslík a teplota, přičemž zahrnuli do svých úvah fakt, že v rostlině je aktivní pryskyřice uložena v žlázách, které lze chápat prakticky jako dobře naplněné a uzavřené nádobky. Když se připravuje pryskyřice z cannabis a některé druhy marihuany, jako je ganja 16 (neopylené horní květy samičích rostlin bohaté na pryskyřici jsou usušeny a slisovány) 2, mnoho těchto žláz praskne a uvolněná pryskyřice je vystavena vzdušné oxidaci. Autoři také zkoumali extrakty z konopí za použití různých rozpouštědel pro jejich přípravu, protože příprava těchto extraktů je s největší pravděpodobností nutná pro další experimenty Vliv světla a použitého rozpouštědla 16 Za nejdůležitější výsledek práce J.W. Fairbairna, J.A. Libmanna a M.G. Rowana 16 ze 70. let minulého století lze považovat skutečnost, že autoři zdůraznili nezanedbatelný vliv světla na marihuanu, na což nebyl dříve kladen dostatečný důraz. Vliv světla na roztoky kanabinoidů je obrovský. Čistý 9 -THC v lehké naftě je téměř úplně rozložen v řádu dnů při pokojové teplotě, kdežto ve tmě prakticky nenastávají ztráty. V roztocích 22

23 CHCl 3 je rozložení 9 -THC méně patrné. Zřejmě ani přítomnost pigmentů v surových extraktech nemá nějaký ochranný vliv proti světlu. Oproti 9 -THC je CBD v CHCl 3 očividně méně stabilní, a to dokonce i ve tmě. Tato skutečnost podporuje mj. výsledky uvedené v publikaci Parker&kolektiv (1974), který prokazuje podstatné ztráty CBD během jednoho dne a téměř úplnou ztrátu po 8 dnech skladování ve tmě. Samozřejmě v surových vzorcích je CBD velmi stabilní ve tmě, přestože přítomné pigmenty nechrání před škodlivým vlivem světla. Tato stabilita v surovém ve tmě je potvrzena předchozí prací autorů na komerční pryskyřici. Z práce Turner&kolektiv (1973) vyplývá, že 9 -THC a CBD v surových extraktech v CHCl 3 jsou stabilní po 6 dní, ale není rozdíl ve stabilitě při skladovaní na světle a ve tmě. Později Turner&Henry (1975) publikovali zprávu, že 9 -THC a CBD ať už v roztoku nebo ve formě surového jsou stabilní po 6 dní při přírodním a umělém světle. Navrhli, že nestabilita oznámená Parker&kolektiv (1974) možná bude kvůli tomu, že použili nečistý CHCl 3. Hlavní problém vyvolaný výsledky J.W. Fairbairna, J.A. Libmanna a M.G. Rowana a těmi od Parkera&kol je použití CHCl 3 v kvantitativním rozboru cannabis (např. Fairbairn&Liebmann, 1973). Naštěstí procedura extrakce je krátká (asi 1 hod. nanejvýš), takže dojde k nepatrnému rozkladu, ale extrakty CHCl 3 nebo roztoky by se neměly očividně nechat stát po delší dobu před dokončením kvantitativního rozboru, ani by neměly být vystaveny silnému světlu. Etanolové extrakty jsou také docela stabilní ve tmě, ale vystavení světlu vede k docela rychlé ztrátě kanabinoidů. Tyto výsledky souhlasí s těmi pro jiná rozpouštědla, ale nepodporují výsledek prezentovaný Kubena&kol. (1972), že etanolový extrakt (tekutý extrakt cannabis USP (The United States Pharmacopeia)) ztratil malé nebo dokonce žádné množství kanabinoidů z původního množství po 43 letech skladování v jantarových lahvích při různých teplotách, které mohly dosáhnout až 38 C. Očividně nejsou k dispozici žádné údaje o původní koncentraci 9 -THC, ale doporučení USP ukazují, že USP extrakt je připraven ze suchých kvetoucích vršků pestíkových rostlin, a že 1 ml by měl představovat 1 g drogy. Ve světle skutečnosti, že kvetoucí vršky Cannabis vypěstované v Anglii obsahují 2 7% 9 -THC (Fairbairn&Liebmann, 1974), by bylo rozumné předpokládat, že cannabis USP (pravděpodobně z Indie) by obsahoval nejméně 4% 9 -THC. Kubena a kol. uvedl, že extrakt obsahuje pouze 0,4 % 9 -THC, což naznačuje, že zůstalo pouze asi 10% původního obsahu 9 -THC, tj. hodnota, která je shodná s výsledky J.W. Fairbairna, J.A. Libmanna a M.G. Rowana. 23

24 Z uvedeného vyplývá, že bez přítomnosti světla pečlivě usušené konopí je docela stabilní, a to ve skutečnosti více než se dříve myslelo. Lerner (1969) odhadoval rychlost ztráty 9 -THC 3 5% za měsíc při pokojové teplotě, což je ve shodě s roční ztrátou asi 31 46%. Za předpokladu lineární rychlosti rozkladu Turner&kol. (1973a) zjistili, že ztráta 9 -THC je 7% za rok při pokojové teplotě, když bylo cannabis skladováno v jantarových lahvích buď ve tmě nebo při minimálním vystavení světlu. J.W. Fairbairn, J.A. Libmann a M.G. Rowan skladovali konopí rozmělněné na hrubý prášek ve tmě po dobu jednoho roku a ztráty 9 -THC u různých vzorků se pohybovali v rozmezí od 7 26% s průměrem 13% Vliv teploty J.W. Fairbairn, J.A. Libmann a M.G. Rowan nezaznamenali při svých experimentech vliv teploty na obsah 9 -THC při pokusech v teplotním rozmezí 5 20ºC. Turner&kol. (1973) ale prokázali, že při teplotním rozmezí 37 50ºC se objevují podstatné ztráty 9 -THC, přičemž své experimenty prováděli v troubách. Proto se dá předpokládat, že světlo nehrálo žádnou roli při rozkladu a ztrátě obsahu 9 -THC. Coffman&Gentner (1974) také studovali vliv vyšších teplot po časový úsek do 64 hodin. Nepatrný rozklad zaznamenali při 65 C., ale značné ztráty se objevily při C Vliv kyslíku 16 Vliv kyslíku na rostlinu cannabis se zdá mnohem méně důležitý než vliv světla a vysoké teploty. Možná je to díky skutečnosti, že v pečlivě usušené rostlině jsou kanabinoidy uchovávány v dobře uzavřených nádobkách - ve žlázách. Jestliže tyto žlázy prasknou při nešetrném zacházení nebo při přípravě pryskyřice, pak jsou ztráty při oxidaci více pravděpodobné. Ztráty v jemném prášku (směs prachu o velikosti 0,33 mm), kde je zničeno více žláz, jsou lépe průkazné a výsledky i více homogenní než v hrubě mletém prášku (směs prachu o velikosti 1 mm). Jemný prášek obsahuje průměrně o 11% méně kanabinoidů než hrubý prášek po jednoročním skladování. Volně rozprostřený prášek vykazuje menší ztráty 9 -THC po jednom roce než stlačený prášek, ve kterém popraskalo mnohem více žláz. Samozřejmě, pokud je stlačený prášek udržován a uchováván jako jedna hrouda, ztráta je omezena hlavně na povrchové vrstvy, které tedy chrání vnitřní vrstvy před porušením. Toto také prokázali J.W. 24

25 Fairbairn, J.A. Libmann a M.G. Rowan v experimentu na pákistánském vzorku pryskyřice, ve kterém vnitřní vrstvy vždy obsahovaly více 9 -THC než vnější. Výsledky J.W. Fairbairn, J.A. Libmann a M.G. Rowan prokazují, že vliv kyslíku je mnohem méně důležitý než působení světla, protože při porovnání výsledků vzorků uchovávaných za stejných podmínek s jediným rozdílem v přístupu světla, jsou jednoznačně vyšší ztráty u vzorků vystavených působení světla. Razdan&kol. (1972) ovšem provedli experiment, při kterém úmyslně zvětšili možný vliv kyslíku tím, že rozprostřeli 9 -THC na filtrační papír ve tmě při 25 C. Za těchto podmínek uchovávání poté stanovili ztrátu 75% za 10 měsíců. Souhrnně lze tedy říci, že pryskyřice cannabis je docela stabilní, jestliže je skladována ve tmě ve velkých hroudách, čímž je zabráněno přístupu vzduchu dovnitř. Rozklad 9 -THC na světle nevede ke zvýšení CBN, ačkoliv CBN není výrazně nestálý na světle. Přeměna na CBN se uskutečňuje, jak se zdá, na pryskyřici uskladněné jak ve tmě, tak na světle. Levine (1944) publikoval článek, který popisuje podstatnou přeměnu 9 -THC na CBN v pryskyřici skladované ve tmě po tři roky. Pokusy Fairbairna a kol 16 na pákistánské pryskyřici také ukázaly, že nízký obsah 9 -THC koresponduje s vysokým CBN a naopak Analýza kanabinoidů v konopných rostlinách a derivátech Kapilární plynová chromatografie s detekcí plamenou ionizací (GC-FID) nebo hmotnostní spektrometrií (GC-MS) a vysokoúčinná kapalinová chromatografie s UV detekcí (HPLC-UV) nebo s detekcí diodového pole ( HPLC-DAD) jsou metody, které se všeobecně používají, aby se vyvořil chemický profil vzorků Cannabis a provedlo určení kanabinoidů. Bez derivatizace metoda GC poskytuje výtěžek tak zvané totální 9 -THC ( tj. neutrální 9 -THC + jeho kyselinové protějšky). Utvoření alkylboronátu, ostatních derivátů stabilizujích kyseliny, nebo stabilizace pomocí silylace umožní oddělené určení 9 -THC a jeho kyselých protějšků ( 9 -THCA-A a 9 -THCA-B). Pro účel potravinové kontroly a řízení je HPLC všeobecně preferována před GC technologiemi. Metoda HPLC s možností programovatelného složení mobilní fáze na reverzní fázi s UV nebo fluorescentní detekcí se začala nedávno používat pro určení 9 -THCA-A a 9 -THC v potravinách jako je jedlý olej, bylinné čaje, bylinné konopí nebo konopné semeno. Jedním z hlavních nedostatků těchto metod je, že není 25

26 k dispozici komerčně certifikovaný referenční standard 9 -THCA-A. 9 -THCA-A tedy musí být izolována, vyčištěna a identifikována před jejím použitím jako standardu pro kvantifikaci THCA-A je komerčně dostupná pouze od cca poloviny roku 2004, kdy firma Lipomed oznámila, že obchoduje s komerčním 9 -THCA-A jako standardem. 17 Tento standard je ale velmi drahý a některé laboratoře proto stále zůstávají u izolace 9 -THCA-A. 18 Před analýzou známými chromatografickými procedurami musí být kanabinoidy extrahovány z tkáně rostliny nebo z potravin. Všeobecně jsou nejprve rostlinné tkáně přes noc usušeny v sušárně, pak rozdrceny v mixéru a přesáty. Výsledkem je homogenní a jemný prášek. Malá alikvótní část prášku je extrahována s organickým rozpouštědlem (např. petroléterem, metanol/dichlormetan 9:1 (v/v)) přes noc s nebo i bez ultrazvukové vibrace nebo během pouze několika minut. 3 Podle M.A.ElSohly, S. A. Ross, Z. Mehmedic, R. Arafat, B. Yi, B. Banahan 19 určité hašišové vzorky a vzorky hašišového oleje projevily neobvyklé vlastnosti, tím že jsou nerozpustné v organických rozpouštědlech, ale rozpustné ve vodě. Aby je rozpustili, použili možnosti dělení malých alikvotních množství mezi chloroform a vodu. Všechny analýzy se musí provést ve třech vyhotoveních. Jako vnitřní standard pro určení kanabinoidů se může použít skvalen, 4-androsten-3,17-dion a tetrakosan. 9 -THC nebo kanabinol, který je stabilnější, může být použit jako standard pro stanovaní kalibračních křivek (dle Doporučení pro analýzu konopí, Skupina pro forenzní chemii, Švýcarská společnost forenzní medicíny, 2001). 3 Hazekamp et al 20 popisuje pro předběžnou identifikaci určitých kanabinoidů použití TLC. Hlavní výhodou TLC systémů je jejich schopnost detekovat všechny skvrny sloučenin, když se analyzuje několik vzorků najednou za stejných podmínek během krátkého časového úseku. Nedostatek v selektivitě být může někdy překonán použitím selektivních detekčních činitel. Samozřejmě v případě kanabinoidů se zdá nemožné dosáhnout ideální separace s pozitivní identifikací všech kanabinoidů. Je proto potřeba několik systémů TLC pro předběžnou identifikaci. Například CBDA (kyselina kanabidiolová) a CBGA (kyselina kanabigerolová) nebo CBD a CBG (kanabigerol), které nebyly separovány v nepolárním systému, se můžou rozeznat, když se použije silikagel jako stacionární fáze. Na druhou stranu bylo zjištěno, že 8 -THC a 9 -THC se vymývají spolu na obou systémech. 26

27 Závěrem lze říci, že metoda TLC je velmi užitečná při rychlém prověřování vzorků, jestli jsou přítomny kanabinoidy v surovém z rostlin Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Zoller 21 popisuje stanovení kanabinoidů na C18 koloně s mobilní fází acetonitrilvodný roztok kyseliny fosforečné s gradientovou elucí s UV detekcí, resp. fluorescenční detekcí. Dussy 22 popisuje HPLC analýzu na koloně C18 s mobilní fází acetonitrilmethanol-vodný roztok kyseliny octové (ph 4,75). Hazekamp 20 popisuje použití kolony C18 s mobilní fází methanol-voda obsahující 25 mm kyseliny mravenčí (ph 3) v gradientovém režimu, DAD a fluorescenční detekce v porovnání s použitím mobilní fáze skládající se z acetonitrilu a fosfátového pufru (10 mm, ph 7,5) s gradientovou elucí taktéž na koloně C18 s DAD a FLD. Chtěl takto porovnat vliv ph mobilní fáze na stanovení kanabinoidů. Při gradientové eluci je většina kanabinoidů oddělena jako ostré píky až na základní linii. Je zajímavé si povšimnout, že retenční čas kyselých kanabinoidů může být ovlivněn změnou ph vymývacího rozpouštědla, zatímco pořadí vymývání pro neutrální kanabiniody zůstává stejné. Navzdory těmto rozdílům v ph, eluční pořadí THC-COOH ( 11-nor-9-karboxy- 9 -THC, jeden ze dvou hlavních lidských metabolitů 9 -THC) a 9 -THC se nezměnilo. Překryv chromatografických píků kyselých a neutrálních kanabinoidů může být tedy snížen pomocí změny elučního ph. 20 UV Spektrum analyzovaných kanabinoidů se nezměněnilo, když bylo ph mobilní fáze změněno z 3 na 7,5, fluorescenční spektrum se ale značně liší. Kyselé kanabinoidy kompletně ztrácejí svoji fluorescenci za kyselých podmínek, zatímco CBC (kanabichromen) nemá žádnou fluorescenci za bazických podmínek a CBN nemá fluorescenční vlastnosti vůbec. Fluorescenční vlastnosti jiných analyzovaných kanabinoidů nejsou ovlivněny ph. 20 V určitých případech částečně neurčené píky nemohou být identifikovány, protože jejich UV a fluorescenční spektra jsou identická. 20 Chromofor kanabinoidů se shoduje svým substituovaným fenolickým kruhem, protože toto je společný strukturální prvek mezi testovanými kanabinoidy. Spektrum UV u 9 -THC je identické se spektrem u olivetolu, které vykazuje tutéž fenolickou kruhovou struktury a je prekurzor 9 -THC a jiných kanabinoidů. Alkylovaná strana řetězce neovlivní schopnost pohlcovat UV, proto není rozdíl mezi UV spektrem 27

28 9 -THCA-A (C 5 -vedlejší řetězec) a THVA ( 9 -tetrahydrokanabivarinová kyselina) (C 3 - vedlejší řetězec). Cyklizace nefenolických částí kanabinoidů také nemá žádný vliv na schopnost absorpce kromě případu, kdy je zaveden jiný aromatický kruh (CBNkanabichromen, CBNA-kyselina kanabichromenová) nebo konjugovaná dvojná vazba (CBC, CBCA). 20 V případě, že dochází k překrývání píků u HPLC, může informace o struktuře kanabinoidu a jeho totožnosti poskytnout detekce pomocí MS spojená s HPLC (LC- MS) a dále ještě lepších výsledků se dosáhne detekcí LC-MS-MS. V kyselém systému (ph = 3) byla použita kyselina mravenčí, která je jako eluční činidlo slučitelná s hmotnostní spektrometrií. Na rozdíl od HPLC-DAD nebo HPLC s fluorescenční detekcí, jež jsou prováděny při pokojové teplotě, LC-MS s ionizací pomocí iontového spreje při relativně vysoké teplotě (např. 500 o C), může mít za následek termální rozklad kyselých kanabinodů. Na rozdíl od GC-MS, která pracuje při režimu EI, hmotnostní spektra jsou velmi jednoduchá s jedním význačným [MH] + nebo [M/H] - pseudomolekulárním iontem a velmi malou fragmentací Plynová chromatografie (GC) 20 Jestliže se nepoužije žádná derivatizace, hmotnostní spektra získaná pomocí GC-MS jsou podobná pro kyseliny a jejich odpovídající neutrální kanabinoidy (např. 9 -THCA-A a 9 -THC). Ačkoliv CBD je svojí strukturou docela vzdálené od CBC (kanabichromen) a CBL (kanabicyklol), vykazují tyto tři kanabinoidy podobné spektrum MS. Také jejich retenční časy v GC jsou podobné, ale jejich separace je dostatečná. Kanabidiol se liší od CBC a CBL jedním důležitým fragmentem při m/z = 246. Retro Diels-Alderova reakce podává vysvětlení pro formování minoritního iontu při m/z = 246. Následující ztráta metylového fragmentu má za následek příspěvek tohoto iontu při m/z = 231. Základní vrchol všech testovaných kanabinoidů (kromě 8 -THC) nekoresponduje s molekulárním iontem, ale s fragmentem, což indikuje, že tyto kanabinoidy jsou jednoduchým způsobem rozdělitelné pomocí GC-MS. Při absenci derivatizace vysoká teplota, která se používá při GC, způsobuje dekarboxylaci kyselých kanabinoidů na jejich odpovídající neutrální formu. Protože konopí obsahuje hlavně kyselé formy kanabinoidů, analýza GC není metodou výběru, kterou by se stanovil metabolický profil kanabinoidního vzorku. Aby se předešlo dekarboxylaci, musí být kyseliny derivatizovány např. pomocí silylace nebo vytvořením 28

29 alkylboronátu. Samozřejmě je obtížné dosáhnout 100% výtěžnost u derivatizace. Kromě toho Hazekamp et al 20 předpokládá, že termická degradace (oxidace, izomerizace) kanabinoidů se může také objevit ve vstřikovacím portu a sloupci. V případě analýzy standardu 9 -THC bylo v chromatografu GC detekováno podstatné množství 8 -THC a CBN, zatímco jiné analýzy (HPLC, NMR, TLC) neukázaly tyto sloučeniny, které jsou známé jako degradační produkty 9 -THC. Navzdory těmto problémům spojených s GC zůstává tato metoda jako velmi užitečná metoda pro analýzy kanabinoidů Spektrometrie v UV oblasti Je uvedeno pouze několik UV absorpčních spekter kalibrovaných kanabinoidů ve vědecké literatuře. Jsou všeobecně charakterizovány několika parametry (maximum a minimum, úbočí UV spektra). Molární absorpční koeficienty jsou uváděny velmi zřídka. Protože většina kanabinoidů se liší ve svých UV spektrech s několika absorpčními vrcholy, může být vybráno pro kvantifikaci mnoho vlnových délek. Absorpce všeobecně klesá se vzrůstající vlnovou délkou. Lepší citlivosti je dosaženo při rozsahu 200-2l0 nm, zatímco při výběru vyšší vlnové délky se zvýší selektivnost v důsledku snížení rizika interference jiných sloučenin při měření Infračervená spektrometrie (IČ) 20 Infračervená spektroskopie je při experimentech běžný způsob pro identifikaci a objasnění struktury kanabinoidů a derivátů při izolaci a syntéze. Stejně jako UV spektra jsou obvykle spektra IČ uváděna udáním pouze několika absopčních maxim. Dále je zřejmé, že uváděná spektra IČ v literatuře byla měřena velkou škálou IČ spektrometrů. Závěrem lze říci, že chromatografické a spektroskopické údaje představují nezbytný předpoklad pro určení a identifikaci jednotlivých kanabinoidů. Při jednoznačné identifikaci kanabinoidů se nemůže úplně spoléhat pouze na jednu z testovaných metod, protože vždy může dojít ke záměně některých běžných kanabinoidů. 29

30 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 30

31 3.1. Přístroje, chemikálie a ostatní pomůcky a) Přístroje a ostatní materiál UV detektor LCD 2040, Laboratorní přístroje Praha Vysokotlaké čerpadlo HPP 5001, Laboratorní přístroje Praha Stanice CSW 1.7, DataApex Kolona SUPELCOSIL TM LC-18-DB (250 mm 4,6 mm, 5 μm), Supelco Dávkovací smyčka (20 μl), Supelco Laboratorní magnetická míchačka, Laboratorní přístroje Praha Analytické váhy, Helago s.r.o. Horkovzdušná sušárna UV lampa b) Chemikálie Ultračistá voda, FaF UK Metanol pro HPLC, Lach-Ner, s.r.o. Hydroxid sodný, p. a., Lachema n-hexan pro HPLC, Sigma-Aldrich Standard 9 -THC, Alltech Applied Science Standard CBN, Alltech Applied Science Standard CBD, Alltech Applied Science Standard 8 -THC, Alltech Applied Science Stlačený dusík, helium, Linde Technoplyn a.s. c) Pomůcky Injekční stříkačka Laboratorní sklo Automatická pipeta PTFE filtr 0,22 μm Hamiltonova stříkačka 31

32 3.2. Podmínky HPLC analýzy Kalibrační roztoky, roztoky standardů a vzorky jsem proměřovala za následujících podmínek: - kolona: SUPELCOSIL TM LC-18-DB (250 mm 4,6 mm, 5 μm) - mobilní fáze: metanol pro HPLC ultračistá voda (85:15) - průtoková rychlost: 2 ml/min - vlnová délka detekce: 220 nm - dávkovací smyčka 20 μl Pomocí Hamiltonovy stříkačky jsem nastřikovala kalibrační roztoky, roztoky standardů a vzorky na kolonu a podrobila je HPLC analýze Příprava mobilní fáze Mobilní fázi, kterou jsem použila pro HPLC, jsem vytvořila smísením metanolu a ultračisté vody v poměru 85:15. Před vlastní HPLC analýzou jsem mobilní fázi odplynila heliem a nasála do pumpy. Hlavním účelem tohoto kroku bylo odstranění rozpuštěných plynů, které by mohly negativně ovlivnit průběh analýzy Příprava z marihuany a vzorku Postup přípravy a vzorku, podmínky HPLC analýzy a mobilní fázi jsem volila na základě doboručení od Ing. Iva Vykydala z Policie ČR. Odvážila jsem 1 g sušené marihuany a vsypala do 100 ml n-hexanu. Vzniklou směs jsem promíchávala cca 3 hodiny na magnetické míchačce. Při nedostatku marihuany k experimentům jsem volila poloviční množství jak marihuany, tak n-hexanu, aby zůstal zachován poměr a bylo možno porovnávat výsledky. Vždy jsem uvedla, kolik marihuany jsem použila. Směs jsem následně přefiltrovala přes PTFE filtr o velikosti pórů 0,22 μm, aby nedocházelo k zanášení předkolony, případně samotné HPLC kolony. Odpipetovala jsem do zkumavky 200 μl přefiltrovaného a odfoukala jsem n-hexan pomocí dusíku do sucha. Přidala jsem 1 ml metanolu a obsah zkumavky jsem protřepala. Tímto jsem získala vzorek, který jsem následně nastříkla na HPLC kolonu pomocí Hamiltonovy stříkačky. 32