TRADIČNÍ A MODERNÍ BIOMARKERY V EKOTOXIKOLOGII EXPERIMENTÁLNÍ VYUŽITÍ

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA CENTRUM PRO VÝZKUM TOXICKÝCH LÁTEK V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ TRADIČNÍ A MODERNÍ BIOMARKERY V EKOTOXIKOLOGII EXPERIMENTÁLNÍ VYUŽITÍ Jana Lebedová Bakalářská práce Vedoucí: doc. RNDr. Luděk Bláha, PhD. Konzultantka: RNDr. Hana Paskerová Brno, Česká republika, 2011

2 Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucímu své bakalářské práce doc. RNDr. Luďku Bláhovi PhD. a RNDr. Haně Paskerové za jejich cenné rady při zpracování práce a za pomoc a rady v laboratoři

3 Seznam použitých zkratek BHT: butylovaný hydrotoluen BSA: bovinní albumin CAT: kataláza DTNB: 2,2 -dinitro-5,5 -dithiobenzoová kyselina EDTA: ethylendiamintetraoctová kyselina ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay - imunologická metoda detekce protilátek EROD: ethoxyresorufin-o-deethyláza GPx: glutathion peroxidáza GR: glutathion reduktáza GSH: redukovaný glutathion GSSG: oxidovaný glutathion GST: glutathion-s-transferáza KLH: keyhole limpet hemocyanin - modelový antigen, metaloprotein LPO: lipidní peroxidace MCs: microcystiny MDA: malondialdehyd Nod: nodularin PBS: Phosphate Buffered Saline fosfátový pufr ROS: reactive oxygen species - reaktivní kyslíkové radikály SOD: superoxid dismutázy TBA: kyselina thiobarbiturová TBARS: thiobarbituric acid reactive substances - látky reaktivní s kyselinou thiobarbiturovou TCA: kyselina trichloroctová TRIS: 2-Amino-2-hydroxymethyl-propan-1,3-diol - 3 -

4 Obsah 1. Úvod a cíle Teoretická část Biomarkery Charakteristika biomarkerů Požadavky na biomarkery Biochemické parametry využívané jako biomarkery Sinice cyanobakterie Charekteristika sinic Význam sinic Cyanotoxiny Microcystiny Vliv sinic a jejich toxinů na ostatní organismy Materiál a metody Charakteristika expoziční studie Popis expozice Příprava vzorků - homogenizace tkání Metody stanovení biomarkerů Metoda stanovení koncentrace proteinů dle Lowryho Metoda stanovení redukovaného glutathionu (GSH) Metoda stanovení lipidní peroxidace pomocí testu s TBA Analýza dat: Výsledky Stanovení koncentrace proteinů Stanovení redukovaného glutathionu - GSH Stanovení lipidní peroxidace pomocí testu s TBA Diskuze Závěr Literatura

5 Abstrakt Stanovování biomarkerů je důležitým zdrojem informací o působení stresorů na organismy. Jedním z aktuálně řešených problémů je masivní rozvoj sinic a vznik tzv. vodního květu. Ten má za následek omezení nebo i znemožnění využití vodních nádrží a ohrožení celých vodních ekosystémů. Jedním z negativních projevů rozvoje sinic je produkce toxinů. Tato práce se zabývá chronickým působením cyanotoxinů na modelový organismus - potkana obecného (Rattus norvegicus var. alba). Jednotlivé skupiny potkanů byly krmeny rybím masem s přídavkem microcystinů, biomasy sinic Microcystis, Spirulina nebo řasy Chlorella, polovině zkoumaných zvířat bylo intraperitoneálně aplikováno placebo, druhé polovině modelový antigen KLH. V jaterní tkáni byly sledovány biochemické parametry biotransformace (glutathion) a oxidativního poškození tkání (lipidní peroxidace). Byly zjištěny statisticky významné rozdíly v hladině redukovaného glutathionu a v lipidní peroxidaci mezi jednotlivými skupinami potkanů. Interpretace výsledků však byla problematická a rozdíly ve sledovaných biomarkerech byly spíše menší

6 Abstract Determination of biomarkers is an important source of information about the effect of stressors on organisms. One of the problems currently being solved is the massive development of cyanobacteria and the emergence of so-called water bloom. This causes restricting or blocking the use of water area and the threat for entire aquatic ecosystems. One of the negative impacts of the development of cyanobacteria is toxins production. This work deals with the chronic effects of cyanotoxins on model organism rat (Rattus norvegicus - var. alba). Individual groups of rats were fed with fish meat with the addition of microcystin, biomass of cyanobacteria Microcystis, Spirulina or algae Chlorella. A half of the animals had intraperitoneally applied placebo, second half of the group had model antigen KLH. Biochemical parameters in liver tissue such as biotransformation (glutathione) and oxidative tissue damage (lipid peroxidation) were monitored. There were statistically significant differences in levels of reduced glutathione and lipid peroxidation between the groups of rats. Interpretation of results, however, was problematic, and differences in observed biomarker were rather small

7 1. Úvod a cíle Ekotoxikologické biomarkery jsou důležitými ukazateli expozice a vlivu stresoru na modelový organismus a do určité míry i na přírodní populace. To umožňuje jejich využití pro predikci účinků toxických látek v prostředí, včetně působení sinic a jejich toxinů. Problematika sinic je v posledních letech často diskutovaným tématem. Díky masivnímu rozvoji cyanobakterií se jedná o významný problém sladkovodních nádrží ale i některých mořských ekosystémů. Přemnožení sinic a vznik vodního květu je především důsledkem eutrofizace vod, jejíž hlavní příčinou je lidská činnost. Vodní květ způsobuje narušení vodního ekosystému svými negativními účinky na ostatní vodní organismy a často také znemožňuje jakékoliv využití nádrže člověkem. Provedené výzkumy se zaměřily především na testy akutní toxicity cyanotoxinů u modelových savců, akutní a chronické toxicity na rybách, ojediněle na ptácích. Studií zabývajících se přenosem toxinů sinic a jejich negativních účincích v potravním řetězci je prozatím velmi málo. Cílem bakalářské práce je teoretické a praktické seznámení se základními biomarkery, s jejich využitím a s postupy stanovení biochemických biomarkerů glutathionu a lipidní peroxidace. Důležitým cílem bylo praktické provedení analýzy biomarkerů ve vzorcích tkání, jako součásti experimentu zabývajícím se přenosem cyanotoxinů v potravním řetězci, s následným vyhodnocením a prezentací výsledků studie

8 2. Teoretická část 2.1. Biomarkery Charakteristika biomarkerů Biomarkery jsou časné varovné signály (early-warning signals) odrážející odpověď organismu na strestory (přírodní toxiny, látky antropogenního původu, fyzikální změny apod.) (Bucheli and Fent 1995). D.B. Peakall (1994) definuje biomarker jako změnu biologické odpovědi (od molekulární přes buněčnou až po změny v chování), která může souviset s expozicí nebo toxickým efektem chemických látek v prostředí. Biomarkery můžeme dělit do tří skupin: biomarkery expozice se týkají měření exogenních látek, jejich metabolitů nebo produktů interakce s molekulami nebo buňkami organismu jsou využívány k potvrzení a zhodnocení expozice konkrétní látkou, poskytují informaci o vztahu mezi vnější expozicí a dávkou toxikantu v organismu biomarkery účinku měření biochemických, fyziologických nebo jiných změn ve tkáních organismu, které mohou souviset s působením stresorů jsou dokladem předklinických změn nebo nepříznivých účinků v důsledku expozice a absorpce chemických látek biomarkery citlivosti pomáhají objasnit rozmanitost odpovědí na expozici mezi jednotlivci (van der Oost et al. 2003) Nevhodná aplikace nebo interpretace biomarkerů však vede k chybným závěrům. Konkrétní reakce známé pro jeden druh nejsou nutně platné pro druhy ostatní. Navíc, ekotoxikologická data zjištěná v laboratorních experimentech mohou být obtížně využitelná pro předpovědi účinků v polních studiích. Vzhledem k možnému nadhodnocení či podhodnocení musí být laboratorní výsledky vždy ověřeny terénním výzkumem (van der Oost et al. 2003)

9 Požadavky na biomarkery citlivost odpovědi na expozici toxickou látkou dobře definované vlastnosti biomarkeru (pro rozlišení mezi přirozenou variabilitou a stresem vyvolaným kontaminací) znalost dalších zkreslujících faktorů znalost mechanismu vztahu mezi expozicí a odpovědí biomarkeru znalost toxikologického významu biomarkeru, například vztah mezi jeho odpovědí a dlouhodobým vlivem toxikantu na organismus (van der Oost et al. 2003) Biochemické parametry využívané jako biomarkery I. Parametry biotransformace Biotransformace je enzymaticky řízený proces, při kterém se xenobiotikum mění ve většině případů na polárnější a tím i ve vodě rozpustnější formu, která se z organismu snadněji vyloučí. Největší metabolickou kapacitu mají játra, proto také bývají po expozici nejvíce postižena. Zpravidla jsou rozlišovány dvě fáze biotransformace. V první fázi dochází k reakcím zvyšujícím hydrofilitu látky (oxidace, hydroxylace, redukce, dehydrogenace apod.) katalyzovaným skupinou enzymů cytochrom P450. Těmito reakcemi vznikají primární metabolity, které ve druhé fázi biotransformace konjugují s endogenními látkami (např. s glutathionem, glycinem, glukuronovou kyselinou) (Toftgard and Gustafsson 1980). Tyto konjugáty pak mohou mít nižší (detoxikace) nebo vyšší (bioaktivace) toxicitu než původní látka. Obr.1: Schéma biotransformace xenobiotik

10 Změny aktivit enzymů a hladin endogenních látek reagujících s xenobiotiky jsou využívány jako biomarkery. Mezi důležité biomarkery biotransformace patří například hladina redukovaného glutathionu a aktivita glutathion-s-transferázy. V praktické části jsem se zabývala stanovením biomarkeru drufé fáze biotransformace hladinou redukovaného glutathionu GSH. Redukovaný glutathion - GSH Glutathion (γ-glutamylcysteinglycin) je tripeptid obsahující γ-amidovou vazbu. Jeho hlavní funkcí je konjugace s xenobiotiky v druhé fázi biotransformace. Mimo to se podílí na detoxikaci, transportu a různých metabolických pochodech (např. slouží jako substrát při odstraňování peroxidů viz reakce níže). Enzym glutathion reduktáza katalyzuje redukci oxidované formy glutathionu (GSSG) na jeho redukovanou formu (GSH). Rovnováha mezi GSH a GSSG pomáhá udržovat správný oxidační stav sulfhydrylových skupin proteinů uvnitř buněk (Voet and Voet 1990). Obr. 2: Struktura redukovaného glutathionu ( Rovnice redukce GSSG na GSH: E + NADPH + H + EH 2 + NADP + EH 2 + GSSG E + 2GSH E zde představuje plně oxidovaný enzym glutathion reduktázu, EH 2 redukovaný meziprodukt. Jednou z funkcí GSH je detoxikace peroxidů probíhající dle reakce: H 2 O GSH 2 H 2 O + GSSG II. Parametry oxidativního stresu Oxidativním stresem se rozumí účinky reaktivních kyslíkových radikálů (tzv. ROS), mezi které patří například superoxidový anion O 2 -, peroxid vodíku H 2 O 2 a hydroxylový anion OH -. Superoxid a hydrogen peroxid jsou relativně nereaktivní, jejich negativní působení spočívá hlavně ve snadné produkci velmi reaktivních hydroxylových radikálů (Storey 1996). ROS reagují s makromolekulami zapojenými do buněčných procesů, jejich přerušením mohou způsobit poškození buněk až buněčnou smrt

11 Regulace ROS probíhá v buňce pomocí antioxidačního systému, který se skládá z enzymatické a neenzymatické části. Antioxidační enzymy, které jsou zároveň využívány jako biomarkery, jsou: glutathion peroxidáza (GPx), glutathion reduktáza (GR), superoxid dismutáza (SOD) a kataláza (CAT). Neenzymatická ochrana: redukovaný glutathion (viz. výše), β-karoten, kyselina askorbová, α-tokoferol, ubichinol (Buttke and Sandstrom 1994). Zvýšená produkce ROS v buňce se projeví nárůstem aktivit těchto antioxidačních enzymů a hladin látek neenzymatické ochrany. Rovnice vzniku radikálů kyslíku: O 2 + ē O 2 - O 2 + ē + 2H + H 2 O 2 H 2 O 2 + ē + H + H 2 O + OH OH + ē + H + H 2 O III. Parametry oxidativního poškození tkání Oxidativní poškození nastává v případě, že působení stresoru překročí limity antioxidačních systémů. Napadení proteinů může vést ke změnám ve struktuře aminokyselin, oxidacím sulfhydrylových skupin vedoucím ke konformačním změnám, změnám v aktivitě enzymů, štěpení peptidových vazeb, ztrátám kovů v metaloproteinech. ROS také způsobují zlomy v DNA a modifikace bází vedoucí k bodovým mutacím. Zvláště náchylné k poškození radikály jsou nenasycené mastné kyseliny (Storey 1996). K parametrům oxidativního poškození tkání se řadí lipidní peroxidace, peroxidace proteinů, oxidativní poškození DNA. V praktické části jsem se zabývala mírou poškození nenasycených mastných kyselin, neboli stanovením lipidní peroxidace. Lipidní peroxidace LPO Při lipidní peroxidaci reagují ROS s nenasycenými mastnými kyselinami, jež jsou důležitou součástí buněčných membrán. Jejich poškození může vést k narušení propustnosti membrány pro ionty a poškození energetické rovnováhy, změnám struktur buněk až celých orgánů (Storey 1996, van der Oost et al. 2003). V praktické části jsem se zaměřila na stanovení hladiny redukovaného glutathionu a lipidní peroxidace, a to ve tkáni obratlovců vystavených působení sinic a jejich toxinů, kterými se zabývá následující kapitola

12 2.2. Sinice cyanobakterie Charekteristika sinic Sinice jsou autotrofní prokaryota s jednobuněčnou nebo vláknitou stélkou. Patří mezi gramnegativní organismy s fotosyntézou rostlinného typu (Kalina 1998). Sinice se vyskytují ve sladkých vodách i v mořích, nalezneme je v povrchových vrstvách půdy i na vlhkých skalách. (Kalina 1998). Ve své struktuře obsahují útvary umožňující jim přežít i v nepříznivých podmínkách. Pohyb ve vodním sloupci jim zajišťují aerotopy seskupení plynových vezikulů jejichž stěna je propustná pro všechny plyny rozpuštěné ve vodě. Dalšími charakteristickými útvary jsou heterocyty a arthrospory neboli akinety. Heterocyty vznikají především v podmínkách dusíkového hladovění. Jsou to tlustostěnné nezelené buňky, obsahující enzym nitrogenázu, díky níž jsou sinice schopné fixovat plynný dusík. Arthrospory jsou trvalé tlustostěnné buňky, sloužící k přečkání nepříznivých podmínek. Pro jejich tvorbu je rozhodující narůstající nedostatek živin a stáří populace. Po určité době z nich klíčí nová vlákna (Kalina 1998). Obr.3: Heterocyt sinice Anabaena sphaerica ( akinety Zygogonium ( Význam sinic Sinice jsou primárními producenty biomasy v akvatických ekosystémech. Netoxické druhy (např. Spirulina) jsou využívány jako přírodní léčiva, přísady do kosmetických přípravků a do krmných směsí v zemědělství (Kalina 1998). Nadměrný růst sinic však způsobuje tzv. vodní květ. Primární příčinou rozvoje vodních květů obecně je zvýšený přísun živin do vodního ekosystému neboli eutrofizace. Velkou roli však hrají i další faktory. Za hlavní důvod převládnutí sinic nad řasami je považována schopnost sinic fixovat dusík. Při teplotní stratifikaci vody dochází k vyčerpání živin ve svrchních vrstvách a organismy bez této schopnosti jsou nuceny k přesunu do větších hloubek, kde jsou limitovány nízkou intenzitou světla. Sinice mohou pomocí aerotopů korigovat svůj pohyb ve vodním sloupci a v hlubších vrstvách (s vyšším obsahem živin) jim přítomnost barviv fykoerythrinů umožňuje využít i velmi nízkou intenzitu světla (Zapomělová 2006, Briand et al. 2003)

13 Masivní rozvoj sinic má za následek úbytek světla a kyslíku, zvýšení ph (Wiegand and Pflugmacher 2005) a koncentrace sinicových toxinů (cyanotoxinů) ve vodě převážně po kolapsu vodního květu (Kopp a kol. 2008) Cyanotoxiny Sinicové toxiny cyanotoxiny jsou sekundárními metabolity sinic, tedy látkami které se přímo neúčastní procesů růstu, vývoje či rozmnožování. Přesný význam produkce cyanotoxinů nebyl dosud zcela objasněn (Carmichael 1992). Cyanotoxiny mohou být tříděny podle účinku na ostatní organismy na hepatotoxiny (microcystiny a cylindrospermopsiny), neurotoxiny (anatoxiny a saxitoxiny) a látky dráždivé či alergizující (lipopolysacharidy) (WHO 2006). V praktické části mé bakalářské práce jsem se zabývala účinkem hepatotoxinů sinic - microcystinů Microcystiny Microcystiny jsou nejznámějšími toxiny sinic. Jsou to cyklické peptidy složené ze sedmi aminokyselin. Zahrnují více než 60 strukturních variant, lišících se kombinacemi aminokyselin a také toxicitou. Nejběžnějším, nejtoxičtějším a zároveň nejlépe prostudovaným microcystinem je MC-LR. MCs jsou produkovány planktonními i bentickými sinicemi rodů Microcystis, Anabaena, Planktothrix, Hapalosiphon, Nostoc a podle novějších informací také Aphanothece, Aphanocapsa a Arthrospira (Babica a kol. 2006) Výskyt MCs je doprovázen zvětšováním kolonií Microcystis, je tedy pravděpodobné že těmto sinicím vytváří konkurenční výhodu. Je prokázáno že MCs zprostředkovávají mezibuněčnou komunikaci v kolonii. Jejich toxicita tak může být pouze vedlejším efektem (Šejnohová a Maršálek 2006). V této bakalářské práci se však zabývám právě toxickými účinky microcystinů

14 Obr. 4: Obecná struktura microcystinu ( Je známo, že hlavní cestou vstupu MCs do organismu je příjem spolu s vodou. Dalšími expozičními cestami mohou být: kontakt s vodou (náhodné pozření a inhalace), konzumace kontaminovaného rybího masa (bioakumulace v rybích tkáních), konzumace kontaminovaných rostlinných produktů (bioakumulace v rostlinách zavlažovaných vodou s MCs) (Babica a kol. 2006). Část MC-LR je absorbována v žaludku, za hlavní cestu absorpce je však považováno tenké střevo (Ito et al. 2000). Absorbovaný MC je převzat do hepatocytů a v menší míře do dalších buněk pomocí multispecifických proteinových přenašečů žlučových kyselin (Bury et al. 1998, Wiegand and Pflugmacher 2005). Toxicita microcystinů Jedním z diskutovaných mechanismů toxicity microcystinů je jejich schopnost vyvolávat oxidativní stres. V jaterních buňkách indukují produkci ROS (reactive oxygen species), což může vést ke zvýšené oxidaci proteinů, DNA a nenasycených tuků v buněčných membránách a vyvolat až apoptózu buněk (Gehringer et al. 2004, Canezave et al. 2006b). Dalším toxickým efektem microcystinů je schopnost inhibice fosfatázy 1 a 2A, vedoucí ke zvýšené fosforylaci proteinů v hepatocytech, která přímo souvisí s jejich cytotoxicitou a schopností působit jako promotory karcinogeneze. Microcystiny jsou však také genotoxické (Zegura 2006). U obratlovců jsou primárně postižena játra, díky aktivnímu příjmu microcystinů pomocí transportních proteinů. Postiženy však mohou být i další orgány. Detoxikace microcystinu-lr v játrech probíhá konjugací s glutathionem za pomoci glutathion-s-transferázy (GST). Konjugovaný glutathion je transportován do ledvin a střev odkud je vyloučen (Gehringer et al. 2004)

15 2.4. Vliv sinic a jejich toxinů na ostatní organismy Jak již bylo řečeno výše, sinice mají schopnost ovlivňovat kvalitu vody ve vodním ekosystému, čímž ovlivňují také ostatní vodní organismy. Díky své schopnosti produkovat cyanotoxiny mohou negativně ovlivnit také ostatní organismy včetně suchozemských obratlovců. V oblastech s masivním rozvojem vodního květu sinic byly zaznamenány úhyny ptáků, dobytka, ovcí, prasat či psů obvykle v důsledku pití kontaminované vody (Briand 2003, Thomas et al. 1998). Při pitvě uhynulých zvířat byly zaznamenány zvýšené koncentrace cyanotoxinů v žaludcích (Ndetei and Muhandiki 2005) a pozorovány změny v játrech a dalších orgánech (Thomas et al. 1998). Úhyny volně žijících i domácích zvířat nejsou většinou způsobeny pouze cyanotoxiny, ale také dalšími faktory, jako například působení pesticidů a toxických kovů (Ndetei and Muhandiki 2005) nebo přidružené infekce (Murphy et al. 1999). Spolupůsobení cyanotoxinů a dalších stresorů na ostatní organismy je však zatím málo prostudováno. Podobně je tomu také u studia transferu cyanotoxinů a jejich negativních účinků. Touto problematikou se zabývaly ojedinělé studie s křepelkami (Pikula a kol. 2008, Pikula a kol. 2010) a potkany (Paskerová 2009) na pracovišti RECETOX ve spolupráci s Veterinární a farmaceutickou univerzitou a Mendelovou univerzitou Brno. Experiment s potkany, ke kterému přispěla tato bakalářská práce analýzou biomarkerů GSH a LPO navazuje na předchozí práce a zabývá se vlivy izolovaných toxinů a komplexních vzorků biomasy sinic

16 3. Materiál a metody 3.1. Charakteristika expoziční studie Cílem studie bylo sledovat možnost přenosu negativního vlivu metabolitů sinic v rámci potravního řetězce. Jako modelový organismus byl použit potkan obecný (Rattus norvegicus var. alba). Studie byla realizována ve spolupráci s Mendelovou univerzitou a Veterinární a farmaceutickou univerzitou Brno. V rámci širší studie s experimentálními zvířaty byla analyzována řada parametrů (parametry růstu, hematologie, biochemie krve, imunologické markery atd.). Tyto výsledky byly analyzovány na spolupracujících pracovištích a nejsou předmětem předkládané bakalářské práce, která se specificky věnuje analýze biomarkerů GSH a LPO Popis expozice Studie sledovala vliv krmné směsi s přídavkem rybího masa na laboratorního potkana po expozici 28 dní. Kromě kontrolní skupiny, které bylo předkládáno živinově optimální krmivo bez rybího masa (skupina A), bylo u všech skupin do krmné směsi přidáno 25 % rybího masa (mletý filet z kapra obecného - skupiny B-K). Dále byla ke krmné směsi přidána lyofilizovaná biomasa toxické sinice Microcystis (skupiny D-E) nebo lyofilizovaná biomasa netoxické sinice Spirulina (F-G) nebo lyofilizovaná biomasa zelené řasy Chlorella (H-I), vše v množství 1 % hmotnosti krmné dávky. U dvou skupin J-K byly do rybího masa přidány microcystiny (MCs) ve stejných koncentracích, které obsahovala biomasa toxické sinice Microcystis (sk. D-E). Polovině experimentálních skupin bylo dále intraperitoneálně aplikováno placebo (fosfátem pufrovaný izotonický roztok), druhé polovině byl aplikován modelový antigen KLH, aby mohla být posouzena imunitní odpověď (produkce anti-klh protilátek). KLH (keyhole limpet hemocyanin) je metaloprotein získaný z hemolymfy plže děrnatky obrovské (Megathura crenulata), který je silně imunogenní a přitom netoxický, je proto využíván jako proteinový nosič vakcín. Expozice jednotlivými kombinacemi krmiv je shrnuta v tabulce 1. varianta krmivo A placebo B rybí maso 25 % placebo C rybí maso 25 % KLH D rybí maso 25 % Microcystis 1 % placebo E rybí maso 25 % Microcystis 1 % KLH F rybí maso 25 % Spirulina 1% placebo G rybí maso 25 % Spirulina 1% KLH H rybí maso 25 % Chlorella 1 % placebo I rybí maso 25 % Chlorella 1 % KLH J rybí maso 25 % MCs 1 % placebo K rybí maso 25 % MCs 1 % KLH Tab. 1: Experimentální design pokusu s vyznačením složení potravy u jednotlivých skupin potkanů

17 Potkani byli rozděleni do 11 skupin po sedmi jedincích. Krmeni byli ad libitum, s neomezeným přístupem k vodě. Konzumace potravy byla denně sledována. Na konci testu byli všichni jedinci zváženi a usmrceni, tkáně a krev shromážděna pro další analýzy. Byla zjištěna hmotnost hlavních orgánů (játra, ledviny, mozek, brzlík, slezina a varlata). V této studii jsem se podílela na stanovení parametrů biotransformace (GSH) a oxidativního poškození (LPO) v jaterní tkáni Příprava vzorků - homogenizace tkání Vzorky zmražených jaterních tkání se nakrájí a zváží na analytických vahách. Dále se uchovávají na ledu. Homogenizace se provádí také na ledu, ve fosfátovém pufru PBS (phosphate buffered saline - 0,8% NaCl; 0,02% KCl; 0,29% Na 2 HPO 4.12H 2 O; 0,02% KH 2 PO 4 v deionizované vodě, ph 7,2), v množství 1 ml PBS na 100 mg tkáně, pomocí rotačního homogenizátoru Bandelin Sonopuls přibližně po dobu dvou minut. Vzorky se poté centrifugují podle metody stanovení: pro stanovení redukovaného glutathionu a proteinů centrifugace po dobu 15 minut při rpm = 9391 g a 4 C, pro lipidní peroxidaci pomocí testu s TBA bez centrifugace Metody stanovení biomarkerů Metoda stanovení koncentrace proteinů dle Lowryho Princip metody: Podstatou stanovení koncentrace proteinů ve vzorku dle Lowryho (Lowry et al. 1951) je reakce měďnatých iontů ze síranu měďnatého s peptidovými vazbami vzorku v zásaditém prostředí (zajištěném hydroxidem sodným) a redukce fosfomolybdátu ve Folin-Ciocalteu reagentu přes konjugované boční řetězce aminokyselin tyrosinu a tryptofanu. Redukcí fosfomolybdátu vzniká modře zabarvený komplex který je stanovován. Citlivost metody je v rozsahu 0,005 až 2 mg proteinů v ml (Dunn 1992, Price et al. 1996). Metoda modifikovaná na mikrodeskové provedení využívá spektrofotometrické koncovky při 680nm. Reagencie: NaOH (4,5% NaOH (w/v), 8,5% Na HCO 3 (w/v)) CuSO 4 (0,1% CuSO 4 (w/v), 0,392% citronan sodný (w/v)) Folin reagent (Folin-Ciocalteu reagent a destilovaná voda v poměru 1:4) BSA - bovinní albumin (1 mg/ml PBS)

18 Postup: Kalibrace Připraví se roztok BSA (1 mg/ml PBS), který se dále ředí podle koncentrační řady: 1; 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 mg/ml. Vzniklé roztoky se pipetují do mikrodesky spolu s blankem a reagenciemi (viz.níže) a měří při 680 nm. Na základě měření se sestaví kalibrační křivka. Koncentrace [g/l] 1 g/l BSA *μl+ PBS *μl , , , , , , , blank Tab. 2: Ředění kalibrační řady pro stanovení proteinů. Stanovení Do mikrodesky se pipetuje 40 μl BSA standardu/blanku (PBS)/homogenátu vzorku ředěného 1:30 (vše minimálně ve třech opakováních), poté se multikanálovou pipetou přidá 35 μl NaOH, 105 μl CuSO 4 a 70 μl Folin-Ciocalteu reagentu. Vše se promíchá pipetou. Mikrodesky [μl] PBS vzorek NaOH CuSO 4 Folin r. blank vzorek Tab. 3: Schéma pipetování do mikrodesky. Mikrodeska se nechá přesně 30 minut inkubovat na třepačce, ve tmě a při pokojové teplotě. Poté je proti blanku měřena absorbance při 680 nm. Vyhodnocení: Koncentrace proteinů se vypočítá na základě kalibrační křivky pro BSA, v rozsahu 0,025 až 1 mg/ml

19 Metoda stanovení redukovaného glutathionu (GSH) Princip metody: Podstatou je reakce Ellmanovy reagencie (DTNB = 2,2 -dinitro-5,5 -dithiobenzoová kyselina) s volnými SH skupinami za tvorby barevného komplexu, který je měřen (Ellman 1959). Volné SH skupiny jsou ve vzorku zbaveného proteinů přítomny převážně v molekule redukovaného glutathionu. Metoda je modifikovaná na mikrodeskové provedení a využívá spektrofotometrické koncovky při 420nm. Obr. 5: Reakce DTNB s -SH skupinami. Vzniklý 2-nitro-5-thiobenzoat (NTB - ) se ve vodě ionizuje na NTB 2-, který vytváří žluté zabarvení ( Reagencie: TRIS pufr (0,8 M TRIS; 0,02 M EDTA; ph 8,9) DTNB (0,02 M 2,2 -dinitro-5,5 -dithiobenzoová kyselina v methanolu) GSH (1 g/l v PBS) TCA (25% kyselina trichloroctová) Postup: Kalibrace Připraví se standardní roztok GSH o koncentraci 1 mg/ml a následně se zředí na 0,1 mg/ml, poté se připraví koncentrační řada: 0,075; 0,05; 0,025; 0,015; 0,01; 0,0075; 0,005; 0,0025 mg/ml a blank (roztok PBS). GSH *μm+ GSH [g/l] GSH 0,1 g/l *μl+ pufr *μl , ,85 0, ,42 0, ,85 0, ,57 0, ,42 0, ,5 462,5 16,28 0, ,14 0, ,5 487,5 Tab.4: Ředění kalibrační řady pro stanovení GSH

20 K 500 μl standardů a k blanku se přidá 50 μl TCA, roztok se promíchá na vortexu (10 sekund), nechá 15 minut odstát a centrifuguje 10 minut při rpm a 4 C. Poté se pipetuje do mikrodesky 190 μl pufru, 50 μl standardu s TCA a 10 μl DTNB, promíchá a nechá se přesně 5 minut inkubovat při pokojové teplotě. Připravují se dvě koncentrační řady, každá ve třech opakováních. Měří se absorbance při 420 nm proti blanku a pozadí při 680 nm. Na základě měření se sestaví kalibrační křivka. Obr. 6: Kalibrace GSH, zleva od nejnižší po nejvyšší koncentraci (vlastní foto). Odstranění proteinů ze vzorku K 90 μl supernatantu vzorku se přidá 90 μl PBS a 18 μl TCA, promíchá se na vortexu, nechá 15 minut odstát a centrifuguje se 10 minut při 8000 rpm a 4 C. Pro další postup je použit supernatant (zbavený proteinů). Stanovení GSH Do mikrodesky se napipetuje 190 μl TRIS pufru, 250 μl vzorku nebo blanku a 10 μl 0,02 M DTNB (každý minimálně ve třech opakováních). Jako blank bez TCA se pipetuje 240 μl pufru a 10 μl DTNB. Vše se promíchá a nechá přesně 5 minut inkubovat při pokojové teplotě. Měří se absorbance při 420 nm proti blanku, pozadí při 680 nm. Vyhodnocení: Podle kalibrační křivky pro standardní redukovaný glutathion se vypočte koncentrace redukovaného glutathionu ve vzorku. Výsledné hodnoty jsou vyjádřeny v nmol GSH/mg proteinů

21 Metoda stanovení lipidní peroxidace pomocí testu s TBA Princip: TBARS test (thiobarbituric acid reactive substances) je založen na tvorbě barevných produktů vznikajících reakcí malondialdehydu (MDA) s kyselinou thiobarbiturovou (TBA). MDA vzniká jako sekundární produkt oxidace polynenasycených mastných kyselin působením reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) (Uchiyama and Mihara 1978). Rovnice reakce: ROS + nenasycené mastné kyseliny MDA MDA + 2 TBA barevný komplex Metoda je modifikovaná na mikrodeskové provedení a využívá spektrofotometrické koncovky při 532 nm. Reagencie: TCA-BHT (20% kyselina trichloroctová (w/v), 2% butylovaný hydrotoluen (w/v), v poměru 200:1 TCA:BHT) HCl (0,6 M) TRIS-TBA (25mM TRIS, 100mM TBA v destilované vodě, ph 7,4) Standard MDA (0,22% 1,1,3,3-tetraethoxypropan (w/v) v 1% H 2 SO 4 ) FeSO 4 v PBS (2 mm) H 2 SO 4 (1% w/v)

22 Postup: Kalibrace Připraví se standardní roztok MDA (10 mm v 1% H 2 SO 4 ) a nechá se 2 hodiny odstát aby proběhla hydrolýza. Poté se roztok dále ředí kyselinou sírovou (1%) na koncentraci 100 μm a připraví se koncentrační řada: 2; 4; 8; 16; 20; 24; 28; 32 μm a blank. nmol/reakci 100 μm MDA *μl+ PBS *μl+ blank ,5 (tzn. 2 μm) Tab. 5: Ředění kalibrační řady pro stanovení LPO. K 750 μl roztoků standardu a blanku se přidá 225 μl roztoku TCA-BHT, promíchá se na vortexu a centrifuguje se 20 minut při rpm a 4 C. Do mikrozkumavky se pipetuje 250 μl supernatantu, 50 μl HCl a 200 μl TRIS-TBA poté se vaří v termobloku při 90 C po dobu 45 minut. Po vychladnutí se pipetuje 250 μl do mikrodesky a ve spektrofotometru se měří absorbance při 550 nm, pozadí při 590 nm. Na základě měření se sestaví se kalibrační křivka. TBARS test K 250 μl nezcentrifugovaného homogenátu vzorku a blanku se přidá 75 μl roztoku TCA-BHT, promíchá se na vortexu a centrifuguje 20 minut při rpm a 4 C. Do mikrozkumavky se pipetuje 250 μl supernatantu, 50 μl HCl a 200 μl TRIS-TBA a vaří se v termobloku 45 minut při 90 C. Po ochlazení na pokojovou teplotu se pipetuje 250 μl do mikrodesky. Vzniklé zabarvení se měří ve spektrofotometru při 550 nm proti blanku, pozadí při 590 nm. Vyhodnocení: Podle kalibrační křivky se standardním roztokem MDA se vypočítá koncentrace vzniklých produktů. Výsledek je vyjádřen jako nmol TBARS/mg proteinů

23 absorbance 680 nm 3.4. Analýza dat: Výsledné hodnoty byly zpracovány pomocí programu STATISTICA 9.1. Jednotlivé skupiny byly porovnávány analýzou rozptylu jednoduchého třídění (ANOVA) a post-hoc analýzou LSD testem. Homogenita rozptylů byla hodnocena pomocí Levenova testu. Signifikantní změny jsou v grafech označeny hvězdičkou *, popřípadě jsou vyznačeny i skupiny proti kterým je daná varianta statisticky významně odlišná. 4. Výsledky V pokusu byly měřeny vybrané parametry biotransformace a oxidativního poškození jaterní tkáně potkana obecného (Rattus norvegicus var. alba). Jednotlivé skupiny potkanů byly vystaveny perorální expozici biomase sinic Microcystis, Spirulina, řasy Chlorella nebo cyanotoxinu microcystin. Podrobnější popis těchto expozic byl shrnut v Tab. 1. Statisticky významné rozdíly jsou v grafech (Graf 3 a 5) vyznačeny hvězdičkou * Stanovení koncentrace proteinů Kalibrační křivka Kalibrační křivka byla sestavena na základě měření standardních roztoků koncentrační řady: 1; 0,8; 0,6; 0,4; 0,2; 0,1; 0,05; 0,025 mg/ml. Následně byla vypočítána rovnice regrese: y = 0,5063x + 0,0094 R 2 = 0,9972 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,5063x + 0,0094 R 2 = 0, ,2 0,4 0,6 0,8 1 koncentrace proteinů *g/l+ Graf 1: Kalibrační křivka koncentrace proteinů

24 absorbance 420 nm Koncentrace proteinů Podle rovnice regrese vyplývající z kalibrační křivky byly vypočítány koncentrace proteinů ve vzorcích (Tab.6). PROTEINY skupiny číslo jedince A B C D E F G H I J K 1 13,57 12,80 15,33 13,89 13,65 13,04 15,65 13,04 13,00 13,73 13, ,19 13,69 13,38 14,23 12,55 13,79 13,87 15,16 13,16 12, ,98 12,96 12,86 12,09 12,90 13,85 13,54 12,53 22,68 14,07 12, ,10 13,46 14,07 12,69 12,75 12,53 14,58 12,57 13,30 13,04 12, ,43 12,23 12,51 11,78 13,12 12,11 15,43 12,63 13,28 13,26 12, ,56 12,59 14,23 12,65 12,31 14,23 15,95 12,67 15,31 13,30 11, ,27 13,93 13,61 12,73 13,59 13,99 12,65 12,37 14,13 12,71 12,13 průměr 12,87 13,10 13,71 12,86 12,98 13,36 14,52 12,99 15,28 13,32 12,49 [g/l] Tab. 6: Naměřené koncentrace proteinů u jednotlivých skupin Stanovení redukovaného glutathionu - GSH Kalibrační křivka Kalibrační křivka byla sestavena na základě měření standardních roztoků koncentrační řady: 0,075; 0,05; 0,025; 0,015; 0,01; 0,0075; 0,005; 0,0025 mg/ml. Následně byla vypočítána rovnice regrese: y = 0,0018x + 0,0039 R 2 = 0,9989 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 y = 0,0018x + 0,0039 R 2 = 0, koncentrace GSH [nmol/mg] Graf 2: Kalibrační křivka koncentrace GSH

25 Koncentrace redukovaného glutathionu - GSH Podle rovnice regrese vyplývající z kalibrační křivky byly vypočítány koncentrace GSH ve vzorcích, které byly dále přepočítány na množství proteinů. GSH skupiny číslo jedince A B C D E F G H I J K 1 90,53 88,45 122,66 82,60 167,31 117,80 43,03 147,90 165,44 35,82 36, ,24 135,45 108,20 48,37 158,44 113,27 65,90 18,04 54,54 249, ,75 99,09 120,87 91,20 71,70 136,05 25,67 98,68 85,21 31,54 123, ,58 48,11 124,21 75,85 108,91 169,04 77,92 100,73 174,01 77,76 78, ,36 38,39 150,95 95,85 105,80 154,34 185,96 128,71 50,99 122,01 132, ,20 52,90 149,90 122,36 124,49 60,35 52,22 127,72 47,84 38,94 96, ,15 33,45 54,63 132,66 87,40 47,87 110,94 126,29 118,97 148,60 89,07 průměr 127,12 70,84 118,77 92,70 117,72 114,10 80,23 106,87 107,08 72,74 115,17 [nmol/mg proteinu] Tab. 7: Množství redukovaného glutathionu na 1 mg proteinu. Vyhodnocení výsledků Graf 3: Hladina redukovaného glutathionu v játrech potkana (popis jednotlivých expozičních skupin viz.tab. 1) Signifikantní změny jsou vyznačeny hvězdičkou s vyznačením skupin proti kterým je varianta statisticky významně odlišná. V jaterní tkáni bylo zjištěno statisticky významné snížení hladiny GSH u potkanů z varianty s rybím masem a placebem (B) a varianty s microcystinem a placebem (J) oproti kontrolní skupině bez rybího masa (A). Další expozice nevyvolaly významnou změnu hladin

26 absorbance 550 nm 4.3. Stanovení lipidní peroxidace pomocí testu s TBA Kalibrační křivka Byla připravena koncentrační řada standardních roztoků MDA (1,1,3,3-tetraethoxypropanu), jejíž absorbance byla změřena ve spektrofotometru při 550 nm. Kalibrační křivka byla sestavena na základě měření standardních roztoků koncentrační řady: 0,075; 0,05; 0,025; 0,015; 0,01; 0,0075; 0,005; 0,0025 mg/ml. Následně byla vypočítána rovnice regrese: y = 0,1044x + 0,0493 R 2 = 0,997 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 y = 0,1044x + 0,0493 R 2 = 0, ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 koncentrace MDA [nmol/mg] Graf 4: Kalibrační křivka závislosti absorbance na koncentraci MDA. Podle rovnice regrese vyplývající z kalibrační křivky s MDA byly vypočítány koncentrace TBARS (thiobarbituric acid reactive substance) ve vzorcích, které byly dále přepočítány na množství proteinů. LPO skupiny číslo jedince A B C D E F G H I J K 1 0,37 0,31 0,36 0,33 0,28 0,20 0,46 0,35 0,46 0,50 0,59 2 0,31 0,32 0,26 0,42 0,30 0,20 0,31 0,45 0,20 0,29 3 0,29 0,30 0,36 0,34 0,35 0,25 0,42 0,58 0,25 0,52 0,25 4 0,43 0,32 0,35 0,32 0,31 0,19 0,54 0,44 0,30 0,19 0,21 5 0,35 0,44 0,30 0,21 0,33 0,33 0,24 0,32 0,23 0,41 0,45 6 0,37 0,52 0,36 0,19 0,25 0,53 0,56 0,33 0,41 0,41 0,37 7 0,25 0,20 0,27 0,45 0,19 0,36 0,51 0,53 0,32 0,30 0,13 průměr 0,34 0,34 0,32 0,32 0,29 0,30 0,43 0,43 0,33 0,36 0,33 [nmol/mg proteinu] Tab. 8: LPO v 1 mg proteinu

27 Vyhodnocení výsledků Graf 5: Lipidní peroxidace v játrech potkana (popis jednotlivých expozičních skupin viz. Tab. 1). Signifikantní změny jsou vyznačeny hvězdičkou s vyznačením skupin proti kterým je varianta statisticky významně odlišná. U skupiny G, tedy varianty s rybím masem, Spirulinou a KLH, bylo zjištěno statisticky významné zvýšení lipidní peroxidace proti kontrole s rybím masem a KLH (skupina C) a variantě E s rybím masem, Microcystis a placebem. Další signifikantní zvýšení bylo změřeno v játrech potkanů ze skupiny H (rybí maso + Chlorella + placebo) proti skupině E (rybí maso + Microcystis + placebo). Významné zvýšení LPO bylo pozorováno také u potkanů z variant G a H, tedy po expozici rybím masem, Spirulinou a KLH a expozici rybím masem, Chlorellou a placebem

28 5. Diskuze V experimentální části této bakalářské práce byly stanovovány parametry biotransformace (hladina GSH) a oxidativního poškození tkání (míra lipidní peroxidace). Tato stanovení byla použita ke zjištění možnosti přenosu negativního působení sinic, jejich metabolitů a dalších stresorů v rámci potravního řetězce (sinice ryba savec). Jako modelový savec byl použit potkan obecný (Rattus norvegicus - var. alba), který byl krmen potravou s obsahem zkoumaných stresorů. Biochemické parametry byly stanovovány ve tkáni jater, jako centrálním orgánu metabolismu, včetně metabolismu cizorodých látek. Diskutovat výsledky této studie je obtížné, protože další práce zabývající se efekty chronické expozice při perorálním podávání zkoumaných látek v koexpozicích nebyla nalezena. Většinou lze srovnávat pouze se studiemi zabývajícími se vlivy akutní expozice čistými cyanotoxiny. Studie však navazuje na experiment realizovaný na pracovišti RECETOX ve spolupráci s Mendelovou univerzitou v Brně, jehož výsledky zatím nebyly publikovány. V této studii byly sledovány negativní účinky sinic na savce a možný přenos microcystinů v potravním řetězci. Mladí jedinci (6 týdnů) potkana obecného byli v předchozí studii krmeni standardním krmivem s přídavkem rybího masa a microcystinů po dobu 28 dní. Celková expoziční dávka na jedince byla 186,4 mg MC. Byly zde sledovány biochemické parametry včetně GSH, u něhož nebyla zaznamenána statisticky významná změna ve srovnání s kontrolou. Dále byly sledovány parametry oxidativního poškození tkání, konkrétně lipidní peroxidace, u které bylo změřeno statisticky významné zvýšení, průměrně o 25 % (Paskerová 2009). V našem případě došlo k signifikantnímu snížení GSH u potkanů ze skupiny vystavené microcystinům s placebem. U lipidní peroxidace nebyla zaznamenána významná změna, pouze u skupiny vystavené sinici Microcystis (spolu s KLH) došlo ke snížení ve srovnání se skupinou exponovanou Spirulinou a KLH. Další studií zkoumající vystavení microcystinům je chronická expozice samců myší po i.p. aplikaci MC-LR. Myši byly exponovány celkovou dávkou 25 μg MC-LR na 1 kg živé hmotnosti každých 48 hodin po jeden měsíc, poté následovala fáze progrese nebo zotavení po dobu jednoho nebo dvou měsíců. Jako placebo pro kontrolní skupiny sloužil fyziologický roztok. Hladina glutathionu byla oproti kontrole signifikantně zvýšená po 30 dnech expozice. Po 30 a 60 dnech vymývání již nebyl statisticky významný rozdíl zaznamenán (Sedan 2010). V naší studii bylo oproti tomu zjištěno signifikantní snížení hladiny glutathionu ve variantě s microcystinem a placebem proti kontrolní skupině bez rybího masa, pouze s podáváním placeba. Další statisticky významné snížení hladiny GSH bylo zaznamenáno u varianty s rybím masem a placebem opět proti kontrolní skupině s pouhým podáváním placeba. Způsoby podání microcystinu jsou však odlišné, proto nelze výsledky příliš srovnávat

29 Pro porovnání reakcí LPO na expozici microcystinem byly dále nalezeny pouze akutní studie. Potkani (samci o váze asi 200 g) byli exponováni dvěma dávkami 100 nebo 150 μg čistého MC-LR na 1 kg váhy. V kontrolní skupině byl použit fyziologický roztok. Zvířata ze skupiny exponované 150 μg uhynula, zvířata ze skupiny exponované 100 μg a skupiny kontrolní byla usmrcena po osmi hodinách. Úroveň lipidní peroxidace jakožto množství MDA byla signifikantně zvýšená proti kontrole u obou skupin, u vyšší dávky byla zvýšena více (Morena, 2005) V případě naší studie byla lipidní peroxidace skupiny exponované Microcystis snížená proti variantě exponované řasou Chlorella a variantě se Spirulinou. Varianta exponovaná microcystinem nevykazovala žádné statisticky významné změny proti jakékoliv skupině

30 6. Závěr Tato práce se zaměřila na metody stanovení ekotoxikologických biomarkerů účinků sinic a jejich toxinů, a to především na praktické provedení, vyhodnocení a prezentaci výsledků experimentu. Negativní vlivy sinic a potažmo jejich toxinů jsou v současné intenzivně studovány, především kvůli množství vodních nádrží s vodním květem. Předmětem výzkumu jsou jak akutní účinky čistých cyanotoxinů tak v poslední době také chronické testy působení celé biomasy sinic. Praktická část této práce se zabývala vlivem sinic Microcystis a Spirulina, řasy Chlorella nebo čistého microcystinu na modelový organismus potkana obecného. Expozice pokusných zvířat probíhala perorální cestou, která lépe vystihuje přírodní podmínky. V průběhu zpracování bakalářské práce jsem se seznámila a naučila stanovování biochemických biomarkerů glutathionu a lipidní peroxidace. Byla provedena praktická analýza těchto biomarkerů ve vzorcích jaterní tkáně potkana obecného (Rattus norvegicus var. alba), jež byla součástí experimentu zabývajícím se přenosem sinicových toxinů a jejich účinků v potravním řetězci. Z praktického měření byly vyhodnoceny výsledky, které byly v bakalářské práci zpracovány a prezentovány. Uvnitř i mezi experimentálními skupinami potkanů byla pozorována značná variabilita ve stanovených hodnotách a v některých případech byly pozorovány statisticky významné rozdíly mezi skupinami. Biologická interpretace pozorovaných rozdílů však byla problematická a rozdíly v sledovaných biomarkerech GSH a LPO byly spíše menší

31 7. Literatura Babica P., Bláha L., Kohoutek J., Adamovský O., Bláhová L. & Maršálek B. (2006) Microcystiny v pitných vodách ČR. sborník konference: Briand J. F., Jacquet S., Bernard C. & Humbert J. F. (2003) Health hazards for terrestrial vertebrates from toxic cyanobacteria in surface water ecosystems. Veterinary Research 34: Bucheli T. D. & Fent K. (1995) Induction of Cytochrome-P450 as a Biomarker for Environmental Contamination in Aquatic Ecosystems. Critical Reviews in Environmental Science and Technology 25: Bury N. R., Newlands A. D., Eddy F. B. & Codd G. A. (1998) In vivo and in vitro intestinal transport of H-3-microcystin-LR, a cyanobacterial toxin, in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology 42: Buttke T. M. & Sandstrom P. A. (1994) Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Canezave J., Bistoni M. D. A., Pesce S. F. & Wunderlin D. A. (2006b) Differential detoxification and antioxidant response in diverse organs of Corydoras paleatus experimentally exposed to microcystin-rr. Aquatic Toxicology 76(1): Carmichael W. W. (1992) Cyanobacteria Secondary Metabolites - the Cyanotoxins. Journal of Applied Bacteriology 72: Dunn M. J. (1992) Protein determination of total protein concentration. Harris, E. L. V., Angal, S., [Eds], Protein Purification Methods. Oxford: IRL Press. Ellman G. L. (1959) Tissue Sulfhydryl Groups. Archives of Biochemistry and Biophysics 82: Gehringer M. M., Shephard E. G., Downing T. G., Wiegand C. & Neilan B. A. (2004) An investigation into the detoxification of microcystin-lr by the glutathione pathway in Balb/c mice. International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36: Ito E., Kondo F. & Harada K. (2000) First report on the distribution of orally administered microcystin-lr in mouse tissue using an immunostaining method. Toxicon 38: Kalina T. (1998) Systém a vývoj sinic a řas. Karolinum. Kopp R., Adamovský O., Hilscherová K., Ziková A., Mareš J., Navrátil S., Palíková M., Hlávková J., Babica P., Maršálek B. & Bláha L. (2008) Akumulace microcystinů v rybách a potravních řetězcích. sborník konference: Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. L. & Randall R. J. (1951) Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry 193: Morena I., Pichardo S., Jos A., Gomez-Amores L., Mate A., Vazquez C. M. & Camean A. M. (2005) Antioxidant enzyme activity and lipid peroxidation in liver and kidney of rats exposed to microcystin-lr administered intraperitoneally. Toxicon 45: Murphy T., Lawson A., Nalewajko C., Murkin H., Ross L., Oguma K. & McIntyre T. (1999) Algal toxins - Initiators of avian botulism? 9th International Symposium on Toxicity Assessment (ISTA 9), Pretoria, South Africa, John Wiley & Sons Inc

32 Ndetei R. & Muhandiki V. S. (2005) Mortalities of lesser flamingos in Kenyan Rift Valley saline lakes and the implications for sustainable management of the lakes. Lakes & Reservoirs: Research & Management 10(1): Paskerová H. (2009) Subletální účinky a biomarkery ekotoxicity sinic. Diplomová práce. Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii. Přírodovědecká fakulta. Masarykova univerzita. Peakall D. B. (1994) The Role of Biomarkers in Environmental Assessment.1. Introduction. Ecotoxicology 3: Pikula J., Adamovsky O., Bandouchova H., Hilscherova K., Horakova J., Machat J., Marsalek B. & Paskova V. (2008) Effects of co-exposure to cyanobacterial biomass, lead and immunological challenge in Japanese quails. Toxicology Letters 180: S197-S197. Pikula J., Bandouchova H., Hilscherova K., Paskova V., Sedlackova J., Adamovsky O., Knotkova Z., Lany P., Machat J., Marsalek B., Novotny L., Pohanka M. & Vitula F. (2010) Combined exposure to cyanobacterial biomass, lead and the Newcastle virus enhances avian toxicity. Science of the Total Environment 408: Price N. C., B. D. Hames and D. Rickwood (1996) Proteins Labfax. Oxford, Academic Press. Sedan D., Andrinolo D., Telese L., Giannuzzi L., de Alaniz M. J. T. & Marra C. A. (2010) Alteration and recovery of the antioxidant system induced by sub-chronic exposure to microcystin-lr in mice: Its relation to liver lipid composition. Toxicon 55: Storey K. B. (1996) Oxidative stress: Animal adaptations in nature. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 29: Šejnohová L., Maršálek B. (2006) Microcystis dominující rod vodních květů: nové poznatky v autekologii. sborník konference Thomas A., Saker M. L., Norton J. H. & Olsen R. D. (1998) Cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii as a probable cause of death in cattle in northern Queensland. Australian Veterinary Journal 76: Toftgard R. & Gustafsson J. A. (1980) Biotransformation of Organic-Solvents - a Review. Scandinavian Journal of Work Environment & Health 6: Uchiyama M. & Mihara M. (1978) Determination of Malonaldehyde Precursor in Tissues by Thiobarbituric Acid Test. Analytical Biochemistry 86: van der Oost R., Beyer J. & Vermeulen N. P. E. (2003) Fish bioaccumulation and biomarkers in environmental risk assessment: a review. Environmental Toxicology and Pharmacology 13: Voet D. & Voet J. G. (1990) Biochemie. Victoria Publishing Praha. World Health Organization (2006) Guidelines for drinking-water quality. Wiegand C. & Pflugmacher S. (2005) Ecotoxicological effects of selected cyanobacterial secondary metabolites a short review. Toxicology and Applied Pharmacology 203: Zapomělová E. (2006) Ekologie planktonních sinic rodu Anabaena - literární přehled. sborník konference:

33 Zegura B., Lah T. T. & Filipic M. (2006) Alteration of intracellular GSH levels and its role in microcystin-lr-induced DNA damage in human hepatoma HepG2 cells. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 611: