VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO. FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE Ústav zootechniky a zoohygieny

Transkript

1 VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE Ústav zootechniky a zoohygieny Hygienické zabezpečení pitné a napájecí vody návody k praktickým cvičením RNDr. Hana Mlejnková, Ph.D. MVDr. Jan Chloupek, Ph.D. BRNO 2014

2 Tato skripta jsou spolufinancována z Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost: Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin (reg. č. CZ.1.07/2.2.00/ )

3 VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO Fakulta veterinární hygieny a ekologie Ústav zootechniky a zoohygieny Hygienické zabezpečení pitné a napájecí vody návody k praktickým cvičením pro posluchače Fakulty veterinární hygieny a ekologie RNDr. Hana Mlejnková, Ph.D. MVDr. Jan Chloupek, Ph.D. 1

4 Lektorovali: RNDr. Dana Baudišová, Ph.D. doc. Dr. Ing. Zdeněk Havlíček RNDr. Hana Mlejnková, Ph.D.; MVDr. Jan Chloupek, Ph.D. ISBN

5 Obsah 1 Výskyt bakterií ve vodách Pitná voda a legislativa Definice indikátorových skupin mikroorganismů Standardní mikrobiologické metody používané ke stanovení počtu bakterií ve vodách Zásady práce v mikrobiologické laboratoři, sterilizační postupy Zásady bezpečnosti práce Postup při nežádoucí kontaminaci Sterilizační postupy Pracovní pomůcky a živná média pro mikrobiologické analýzy Přístroje a zařízení v mikrobiologické laboratoři Materiál, používaný v mikrobiologické laboratoři Živné půdy pro kultivaci mikroorganismů Základní postupy práce s mikroorganismy Izolace mikroorganismů Očkování mikroorganismů Mikroskopické pozorování Kvantifikace mikroorganismů Praktická cvičení mikrobiologické stanovení jakosti pitné vody Odběr vzorků vod pro mikrobiologické stanovení Stanovení indikátorů organického znečištění Stanovení počtu kultivovatelných mikroorganismů při 22 C a 36 C Stanovení indikátorů fekálního znečištění Stanovení koliformních bakterií Stanovení fekálních koliformních bakterií a Escherichia coli Stanovení intestinálních enterokoků Literatura:

6 1 Výskyt bakterií ve vodách Voda je nezbytná pro život všech organismů, od nejjednodušších, jednobuněčných po nejdokonalejší, živočichy včetně člověka. Kvalita vody určuje možnost jejího užívání. Voda užívaná pro pitné účely nesmí obsahovat látky a organismy, které mohou způsobovat zdravotní problémy. Těmi mohou být například patogenní mikroorganismy, parazitičtí prvoci, toxické látky a některé chemické látky. Mikrobiální kontaminace vod je v současné době poměrně častým jevem, zejména v rozvojových zemích. Rizikové znečištění se do vod dostává především s fekáliemi a komunálními odpady. Bakterie jsou díky svým vlastnostem a životním nárokům přítomny téměř v každém prostředí, tedy i ve všech typech vod. K životní aktivitě potřebují prostředí, ve kterém je přítomno určité procento vody. Bez ní přežívají jen po omezenou dobu, a to ve formě klidových stádií (spór), při kterých jsou životní pochody buněk redukovány na minimum. Bakterie můžeme dělit podle různých kritérií, podle původu, potravní strategie, způsobu výživy, náročnosti na kyslík, optimální teploty, patogenity aj. Podle původu rozlišujeme ve vodách autochtonní a alochtonní bakterie. Pro autochtonní bakterie je voda jejich původní prostředí, naopak alochtonní bakterie se dostávají do vody z vnějšího prostředí, kde po krátké době hynou, za určitých podmínek však mohou některé druhy přežívat, pomnožit se a daný biotop osídlit. Podle potravní strategie, lze bakterie žijící ve vodách zařadit mezi destruenty, rozkládají a živí se organickými látkami. Rozlišujeme saprofytické a parazitické formy, saprofyté se vyznačují rozkladem neživé organické hmoty, parazité žijí na živých organických hmotách. Základním rozdělením bakterií podle způsobu výživy je na autotrofní a heterotrofní. Autotrofní bakterie využívají jako zdroj uhlíku CO 2, dále je podle typu metabolismu rozlišujeme na: fotolitotrofní - zdrojem energie je sluneční světlo, zdroj uhlíku je oxid uhličitý, 4

7 chemolitotrofní - zdroj uhlíku je oxid uhličitý, energii získávají oxidací anorganických látek. Heterotrofní bakterie využívají jako zdroj uhlíku organické látky, dále je rozlišujeme na: fotoorganotrofní - zdrojem energie je sluneční světlo, zdrojem uhlíku jsou organické sloučeniny, chemoorganotrofní - zdroj uhlíku i energie je aerobní nebo anaerobní oxidace organických sloučenin. Podle náročnosti na kyslík rozlišujeme bakterie: obligátně aerobní - rostou za dostatečného přísunu kyslíku, mikroaerofilní - rostou v prostředí s velmi nízkým obsahem kyslíku, fakultativně anaerobní - mohou růst jak za nepřístupu kyslíku, tak i za jeho přítomnosti. Pokud je přítomen kyslík, přecházejí z fermentativního metabolismu na metabolismus respirační. aerotolerantní - rostou jak za aerobních, tak i za anaerobních podmínek, ale jsou schopné i v aerobních podmínkách fermentativního metabolismu, příkladem mohou být bakterie mléčného kvašení. anaerobní -rostou za nepřístupu kyslíku. Bakterie se vyskytují ve všech typech vod, atmosférické (dešťová voda obsahuje v otevřeném terénu cca bakterií v litru vody), ve sněhu (1 ml rozpuštěného čerstvě napadaného sněhu se nachází cca desítky až stovky bakterií), v tekoucích povrchových vodách (stojaté 10 2, tekoucí 10 3 v ml). Počet a druhové zastoupení bakterií v povrchových vodách je jedním z důležitých ukazatelů stupně znečištění. Důležitým faktorem určujícím bakteriální denzitu v tekoucích vodách je střídání úseků s odlišnými procesy a charakterem toku, např. úseky s kontinuálním nebo bodovým přísunem znečištění a úseky, kde probíhají samočistící procesy. Mikrobiální znečištění je významné zejména z hygienického hlediska. Voda může být kontaminována fekálním znečištěním komunálního původu, z průsaků kanalizací, žump, odpady ze zemědělské výroby, potravinářského průmyslu apod. Ve stojatých povrchových vodách jsou počty bakterií nižší než v tekoucích povrchových vodách. Příčinou jsou procesy samočištění, sedimentace bakterií a delší expozice slunečního záření. 5

8 Zdroji pitné vody jsou jednak podzemní vody (prameny, studny) a vody povrchové (obvykle po úpravě). Podzemní vody patří mezi nejméně znečištěné vody. Pro většinu heterotrofních bakterií jsou zde málo příznivé podmínky pro život. Příčinou dobré kvality je mj. filtrační schopnost půdy. Počty se zvyšují po období dešťů až o několik řádů. Nejvíce kontaminované ze všech typů vod jsou odpadní vody, mikrobiální kontaminace je velmi častá v komunálních (splaškových) odpadních vodách, které obsahují vysoké množství organických látek, což vyhovuje bakteriím, které v těchto vodách nejen přežívají, ale také se aktivně množí, mohou se zde vyskytovat i patogenní a podmíněně patogenní bakterie. Průmyslové odpadní vody jsou velmi odlišného složení, které je závislé na typu výroby, ze které jsou odváděny. Často bývají odváděny průmyslové i komunální odpadní vody na společnou čistírnu odpadních vod. Z mikrobiologického hlediska jsou rizikové zejména odpadní vody z potravinářských a zemědělských výrob. 2 Pitná voda a legislativa Kvalita pitné vody je sledována z pohledu ochrany před šířením onemocnění přenášených vodou. V souvislosti se vstupem do EU došlo k novelizaci a harmonizaci vyhlášek a nařízení v této oblasti s evropskou rámcovou Směrnicí 2000/60/ES. Dosud platná Vyhláška č. 252/2004 Sb. byla doplněna Vyhláškou, kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou a teplou vodu a četnost a rozsah kontroly pitné vody č. 83/2014ve znění pozdějších předpisů. Mikrobiologický rozbor pitné vody vyžaduje stanovení následujících parametrů: Escherichia coli, enterokoky, koliformní bakterie, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa (pro balené vody), legionely (pro teplou vodu) a počty kolonií při 22 a 36 C. Limitní hodnoty povolené českou legislativou v oblasti mikrobiologie vod jsou uvedeny v tabulce1. Širší rozsah parametrů však není určen pro všechny typy vod. Některé jsou stanovovány pouze v určitých typech, které jsou uvedeny ve vysvětlivkách. Pro úplnost zde uvádíme celý rozsah požadavků na kvalitu pitné vody, i když přesahuje rozsah stanovení pro vody napájecí. 6

9 Tabulka 1: Limitní hodnoty Vyhlášky č. 252/2004 Sb. ukazatel jednotka limit typ limitu Vysvětlivky Clostridium perfringens KTJ/100 ml 0 MH 1 Intestinální enterokoky KTJ/100 ml 0 NMH KTJ/250 ml 0 NMH 2 Escherichia coli KTJ/100 ml 0 NMH KTJ/250 ml 0 NMH 2 koliformní bakterie KTJ/100 ml 0 MH KTJ/250 ml 0 MH 2 počty kolonií při 22 C KTJ/ml Bez abnormálních změn MH 6 KTJ/ml 200 DH 7 KTJ/ml 100 NMH 2 počty kolonií při 36 C KTJ/ml Bez abnormálních změn MH 8 KTJ/ml 40 DH 9 KTJ/ml 20 NMH 2 Pseudomonas aeruginosa KTJ/250 ml 0 NMH 2 Použité zkratky: KTJ - kolonie tvořící jednotka NMH - nejvyšší mezní hodnota MH - mezní hodnota DH - doporučená hodnota ( 3 odst. 1 zákona č. 258/2000 Sb., o ochraně veřejného zdraví a o změně některých souvisejících zákonů, ve znění pozdějších předpisů Vysvětlivky k tabulkám: 1. Stanovuje se u pitných vod upravovaných přímo z povrchových vod nebo u podzemních vod ovlivněných povrchovými vodami. Tam, kde hodnota tohoto ukazatele není dodržena, musí se prozkoumat daný vodní zdroj a technologii úpravy, aby se zjistilo, zda lidské zdraví není potenciálně ohroženo přítomností patogenních mikroorganismů, jako jsou zejména kryptosporidie. Postup odpovědné osoby stanoví 4 odst. 5 zákona. 2. Platí pouze pro balenou pitnou vodu. 6. Pokud u zásobované oblasti nelze pro malý počet vzorků určit, zda se jedná o abnormální změnu, platí jako mezní hodnota 200 KTJ/ml. 7

10 7. Pro náhradní zásobování, pro vodu dodávanou ve vzdušných, vodních a pozemních dopravních prostředcích a pro vodu z malých nedezinfikovaných zdrojů, produkujících méně než 5 m 3 za den platí doporučená hodnota do 500 KTJ/ml. 8. Pokud u zásobované oblasti nelze pro malý počet vzorků určit, zda se jedná o abnormální změnu, platí jako mezní hodnota 40 KTJ/ml. 9. Pro náhradní zásobování, pro vodu dodávanou ve vzdušných, vodních a pozemních dopravních prostředcích a pro vodu z malých nedezinfikovaných zdrojů, produkujících méně než 5 m 3 za den, platí doporučená hodnota do 100 KTJ/ml. Zákon č. 166/1999 Sb., o veterinární péči a o změně souvisejících zákonů (veterinární zákon) 5, ukládá: Chovatel hospodářských zvířat je dále povinen: d) k napájení zvířat používat vodu, která neohrožuje zdravotní stav zvířat a zdravotní nezávadnost jejich produktů, a ke krmení zvířat používat jen zdravotně nezávadná krmiva. Vzhledem k tomu, že kvalita napájecích vod není přesně definována, platí pro tyto vody dodržování limitů uvedených v tabulce 2, určených pro pitné vody. Tabulka 2: Vybrané limitní hodnoty pro napájecí vody ukazatel jednotka limit Intestinální enterokoky KTJ/100 ml 0 Escherichia coli KTJ/100 ml 0 koliformní bakterie KTJ/100 ml 0 počty kolonií při 22 C KTJ/ml 200 počty kolonií při 36 C KTJ/ml Definice indikátorových skupin mikroorganismů 1. Koliformní bakterie byly donedávna považovány za nejvýznamnější ukazatel fekálního znečištění. V současné době převládá názor, že jejich přítomnost svědčí pouze o použití nevhodné technologie úpravy vody, dodatečné kontaminaci nebo o zvýšeném obsahu organických látek. Jsou nadále využívány jako ukazatel, který indikuje zvýšený přísun nežádoucích mikroorganismů z vnějšího prostředí 8

11 Koliformní bakterie jsou gramnegativní tyčinky, které netvoří spory, mají negativní cytochromoxidázový test, za aerobních podmínek tvoří kolonie během 24 h kultivace při teplotě 36 ± 2 C na selektivním diferenciačním médiu s laktózou za současné tvorby kyselin (nebo aldehydů). 2. Termotolerantní koliformní bakterie se používají zejména jako ukazatel jakosti povrchové vody, za hlavní indikátor jakosti pitných vod je považována E. coli. Termín termotolerantní koliformní bakterie nahradil dříve a někde i v současné době používaný termín fekální koliformní bakterie. Zde budeme dále užívat termín fekální koliformní bakterie (anglicky faecalcoliforms). Termotolerantní koliformní bakterie jsou gramnegativní tyčinky netvořící spory, mají negativní cytochromoxidázový test, za aerobních podmínek tvoří kolonie během 24 h kultivace při teplotě 44 C na selektivním diferenciačním mediu s laktózou za současné tvorby kyselin (nebo aldehydů). 3. Escherichia coli je od roku 1993 dle směrnic WHO jediným správným a vyhovujícím indikátorem fekálního znečištění vody. Escherichia coli patří mezi termotolerantní koliformní bakterie, které mají navíc schopnost ve druhém stupni kultivace hydrolyzovat specifickým enzymem β-dglukuronidázou v médiu přítomný 4-metylumbelliferyl-ß-D-glukuronid (MUG), čímž vzniká 4-metylumbelliferon, vykazující v dlouhovlnném UV záření světle modrou fluorescenci. 4. Parametr kultivovatelné mikroorganismy je používán pro určení celkového počtu mikroorganismů, které se používá pro informaci o jakosti vody a její kontrolu. Stanovení se používá pro posouzení čistoty podzemních vod a účinnosti procesů úpravy vody, jako je koagulace, filtrace a dezinfekce, a indikuje čistotu a neporušenost distribučního systému. Může být rovněž použito k posouzení vhodnosti zdroje vody pro přípravu potravin a nápojů.hlavní význam stanovení počtu kolonií spočívá v detekci změn očekávaných hodnot v průběhu dlouhodobého sledování. Každé náhlé zvýšení počtu organismů může být včasným varováním před vážným znečištěním (ČSN EN ISO 6222). Rozlišují se kultivovatelné mikroorganismy, rostoucí při teplotách 22 a 36 C. Spadají sem všechny aerobníbakterie, kvasinky a mikromycety, které jsou schopné tvořit kolonie v nebo na povrchu specifického pevného kultivačního média za předem definovaných 9

12 podmínek. Organismy, kultivovatelné při 22 C, hůře snášejí vyšší teploty a nemají hygienický význam. Organismy, kultivovatelné při 36 C mají malý hygienický význam, ve vodě přežívají obtížněji a kratší dobu. 5. Intestinální enterokoky jsou považovány za indikátory fekálního znečištění, jsou stanoveny Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans, E. hirae, některé další druhy enterokoků a některé druhy rodu Streptococcus (zejména S. bovis a S. equinus). Tyto druhy streptokoků nepřežívají ve vodách delší dobu, což snižuje jejich indikační hodnotu. Intestinální enterokoky jsou grampozitivní koky, které mají schopnost redukovat 2,3,5- trifenyltetrazoliumchlorid na formazan a hydrolyzovat eskulin při teplotě 44 C na selektivním diferenciačním médiu. 2.2 Standardní mikrobiologické metody používané ke stanovení počtu bakterií ve vodách Ke stanovení počtu bakterií ve vzorcích vod lze použít jak metody nepřímé kultivační, tak metody přímé mikroskopické. V ČR jsou v současné době standardizovány metody kultivační. Ty jsou založeny na stanovení počtu kolonií vyrostlých na agarových plotnách s příslušnou živnou půdou/kultivačním mediem. Na rozdíl od mikroskopických metod neumožňují zachytit všechny přítomné bakterie, ale jen ty, které jsou v kultivovatelném stavu. Počet vyrostlých kolonií závisí na mnoha faktorech, např. na typu vzorku, jeho předúpravě, složení kultivačního média, délce či teplotě inkubace. Neznámé vzorky vod a vzorky s vyšším počtem bakterií je nutné před kultivací naředit, tak aby bylo možno rozlišit jednotlivé kolonie pro jejich kvantifikaci. V následující tabulce jsou uvedeny prováděcí normy, které jsou v ČR standardně používány pro stanovení mikroorganismů v pitných vodách. 10

13 Tabulka 3: Seznam standardních metod a prováděcích norem pro stanovení mikroorganismů v pitných vodách Metoda stanovení Norma Jakost vod - Stanovení termotolerantních ČSN (březen 2009) koliformních bakterií a Escherichia coli Jakost vod - Stanovení koliformních bakterií ČSN (březen 2010) v nedesinfikovaných vodách Jakost vod - Stanovení koliformních bakterií ČSN EN ISO a Escherichia coli Jakost vod - Stanovení intestinálních ČSN EN ISO (duben 2001) enterokoků Část 2: Metoda membránových filtrů Jakost vod - Stanovení kultivovatelných ČSN EN ISO 6222 (březen 2000) mikroorganismů Stanovení počtu kolonií očkováním do živného agarového kultivačního media Stanovení Clostridium perfringens Vyhl. č. 252/2004 Sb, příloha č. 6 Stanovení Pseudomonas aeruginosa ČSN EN ISO Mikrobiologie potravin a krmiv ČSN EN ISO (březen 2004) Horizontální metoda stanovení počtu koagulázopozitivních stafylokoků (Staphylococcusaureusa další druhy) Průkaz přítomnosti bakterií rodu Salmonella ČSN ISO Stanovení bakterií rodu Legionella ČSN ISO Zásady práce v mikrobiologické laboratoři, sterilizační postupy Práce v mikrobiologické laboratoři vyžaduje striktní dodržování bezpečnostních předpisů a metodických postupů. Každá mikrobiologická laboratoř musí mít vypracovánu směrnici, která upřesňuje požadavky konkrétního mikrobiologického pracoviště. Směrnice musí odpovídat zákonným bezpečnostním požadavkům, zahrnovat kontrolu dodržování postupů a pravidel, tak aby byla zajištěna kvalita prováděných analýz. 11

14 3.1 Zásady bezpečnosti práce Do mikrobiologické laboratoře je dovolen přístup pouze náležitě poučeným osobám v čistém oděvu a obuvi. Pracovní oblek musí být z materiálu, který je možno vyvářet, příp. jinak sterilizovat. Pracovní obuv a oděv je určen pouze pro práci na tomto pracovišti. Před začátkem a po skončení práce je nutno si důkladně umýt a dezinfikovat ruce (bez hodinek, náramků a šperků). Na mikrobiologickém pracovišti je přísně zakázáno jíst, pít, kouřit a jakkoli manipulovat s potravinami. Na pracovišti je třeba dodržovat úzkostlivou čistotu a pořádek. Úklid je prováděn ihned po dokončení práce, po sklizení použitých pomůcek jsou dokonale omyty pracovní plochy teplou vodou s detergentem a dezinfekčním roztokem. Prostor a ovzduší v laboratoři je dezinfikováno UV zářením (germicidní zářivkou) podle stanoveného režimu laboratoře, obvykle večer po ukončení prací nebo ráno před započetím práce (na pracovišti nesmí být v době dezinfekce nikdo přítomen). Při práci se vzorky, při likvidaci kontaminovaného materiálu a při přípravě půd nesmí být otevřeny dveře a okna (zabránění vzniku průvanu a kontaminace zvenku). Při práci s narostlými koloniemi je nezbytné dodržovat bezpečnostní předpisy jako při práci s patogenními organismy (koncentrace buněk, se kterými se pracuje, mnohonásobně převyšuje tzv. minimální infekční dávku, která je schopna vyvolat onemocnění i u zdravého jedince; ve vzorcích se mohou vyskytovat patogenní, podmíněně patogenní mikroorganismy nebo patogenní formy či mutanty nepatogenních mikroorganismů). Pracovní nástroje a pomůcky se v průběhu práce nesmí odkládat na pracovní plochu. Pracovní pomůcky jsou průběžně dezinfikovány nebo sterilizovány (kličky a jehly se žíhají v plameni; skleněné pipety, mikroskopická sklíčka apod. se odkládají do nádoby s dezinfekčním roztokem; špičky do nádoby na kontaminovaný odpad). Kultivační media s pomnoženými kulturami jsou ukládána do nádoby na kontaminovaný odpad nebo se před likvidací dekontaminují v autoklávu při 121 C/20 min nebo v roztoku dezinfekčního prostředku. Obsluhu autoklávu může provádět pouze vyškolený pracovník. Zvýšená opatrnost je třeba v případě drobných poranění na rukách, v tomto případě je nutné pracovat s kmeny výhradně v rukavicích. Každá nehoda nebo úraz musí být nahlášen vedoucímu cvičení. 12

15 3.2 Postup při nežádoucí kontaminaci Při kontaminaci pokožky je nutné zasažené místo okamžitě opláchnout Ajatinem. Při kontaminaci poraněné kůže desinfikujeme postižené místo jodovou tinkturou. Při zasažení oka bakteriemi okamžitě oko vypláchneme 3% roztokem kyseliny borité a dezinfikujeme ophtalmoseptonexem. Při vniknutí kontaminovaného materiálu do úst, musí být ústní dutina vypláchnuta pitnou vodou a následně slabým roztokem manganistanu draselného (slabě růžový, připravuje se čerstvý) nebo 1% roztokem peroxidu vodíku. Plocha kontaminovaná infekčním materiálem musí být převrstvena dezinfekčním roztokem, který se nechá 15 min působit, kapalina se setře papírovou utěrkou, která se vyhodí do kontejneru na kontaminovaný odpad. Plocha je následně ošetřena běžným způsobem, pracuje se v rukavicích. Kontaminovaný pracovní oděv je nutno vysterilizovat. 3.3 Sterilizační postupy laboratorní sklo se myje ve vodovodní vodě s přídavkem detergentu, důkladně opláchne teplou vodovodní vodou a nakonec vodou destilovanou; umyté sklo se sterilizuje v horkovzdušném sterilizátoru při 180 C 1 hodinu; termostaty, chladničky, mrazničky se vytíráním desinfikují desinfekčním prostředkem; filtrační aparatura, kličky a pinzety se sterilizuje v plamenu, jako dezinfekční roztoky se používají např. 0,5% roztok Persterilu, 0,5-1% roztok Jodonalu B, 10% roztok Sava, živné půdy a roztoky se sterilizují v autoklávu při 121 C/20 minut, plastové pomůcky (špičky, eppendorfky, aj.) se sterilizují v autoklávu při 121 C/15 minut. Práce v mikrobiologické laboratoři je často podceňována. Je zde nutné bezpodmínečně dodržovat pracovní kázeň, řád a bezpečnostní pravidla. 13

16 4 Pracovní pomůcky a živná média pro mikrobiologické analýzy 4.1 Přístroje a zařízení v mikrobiologické laboratoři Přístroje v mikrobiologické laboratoři slouží k zajištění provádění mikrobiologických stanovení. Musí být udržovány a provozovány tak, aby byla zajištěna jejich bezchybná funkčnost při provádění zkoušek. S tlakovými přístroji smí manipulovat pouze vyškolení pracovníci. Měřicí přístroje jsou pravidelně kalibrovány a ověřovány. Přístroje slouží zejména k předúpravě vzorků, přípravě půd, sterilizaci materiálu a kultivaci. V mikrobiologické laboratoři jsou používány následující přístroje a zařízení: Parní sterilizátor (autokláv) - je využíván ke sterilizaci půd, roztoků a plastových pomůcek při teplotě C a tlaku kpa. Horkovzdušný sterilizátor - je využíván ke sterilizaci skla suchým teplem (při C). Termostaty - jsou využívány ke kultivaci vzorků při požadované teplotě. Lednice a mrazničky - jsou využívány k uchovávání půd, chemikálií, roztoků,vzorků a biologického materiálu.vzorky a média by měly být skladovány odděleně. Laminární box - je využíván k vytvoření sterilního prostředí, které slouží k ochraně vzorku a pracovníka před kontaminací. Váhy jsou používány k přípravě půd a roztoků. Automatické pipety - využívají se k dávkování přesných objemů vzorků a roztoků. Filtrační aparatura s vývěvou slouží k filtraci vzorků vod přes membránové filtry za účelem zachycení mikroorganismů na povrchu filtru nebo při sterilizaci roztoků. 4.2 Materiál, používaný v mikrobiologické laboratoři 14

17 Při provádění mikrobiologických stanovení jsou potřebné dále uvedené pomůcky a spotřební materiál. Veškeré pomůcky, přicházející do styku se vzorkem nebo kultivačním médiem musí být sterilní. Pomůcky a materiál: skleněné vzorkovnice se zábrusem k odběru vzorků plynový kahan ke sterilizaci v plamenu skleněné zkumavky s kónickou zátkou nebo reagenční lahvičky se zabroušenou zátkou k ředění vzorků skleněné lahve pro přípravu živných půd plastové špičky na automatické pipety pro odměřování přesných objemů vzorku Petriho misky pro kultivaci vzorků na živném médiu odměrný válec pro odměřování větších objemů vzorků pinzeta s plochými hroty pro manipulaci s filtry membránové filtry o průměru 50 mm s porozitou 0,45 µm pro zakoncentrování mikroorganismů ze vzorku. 4.3 Živné půdy pro kultivaci mikroorganismů Kultivace mikroorganismů je prováděna na živných půdách (médiích), jejichž složení musí vyhovovat požadavkům stanovovaných mikroorganismů. Živná média lze rozdělit na syntetická a přirozená. Složení syntetických medií je přesně definováno, přirozená živná prostředí jsou na bázi přírodních organických látek (např. kasein, maso, droždí) po působení enzymů. Z hlediska růstu mikroorganismů se živná média dělí na univerzální, selektivní a selektivně diagnostická. Univerzální půdy vyhovují požadavkům širokého spektra mikroorganismů (např. masopeptonový agar), selektivní půdy zvýhodňují růst jednoho druhu nebo skupiny mikroorganismů, růst ostatní mikroflóry je potlačen a selektivně diagnostické půdy umožňují odlišení hledané skupiny mikroorganismů na základě určité charakteristické biochemické reakce. Většina živných půd je dodávána v požadovaném složení v práškové, nebo v granulované podobě. Při jejich přípravě je nutné dodržet pokyny výrobce. Obvykle se jedná o 15

18 rozpuštění navážky média ve vodě, úpravu ph a sterilizaci. Půdy se sterilně rozlévají do Petriho misek, po ztuhnutí jsou používány ke kultivaci. 5 Základní postupy práce s mikroorganismy 5.1 Izolace mikroorganismů Mikroorganismy se v přírodním prostředí vyskytují ve smíšených kulturách. Při stanovení jakosti vod a jiných experimentech je nutné prokázat výskyt jednoho druhu nebo skupiny. Mikroorganismy pěstované v laboratorních podmínkách na živných půdách označujeme jako kultury, jsou-li zastoupeny jedním druhem, jedná se o tzv. čisté kultury. K získání čisté kultury se využívá selektivních médií, jejichž složení vychází z požadavků a charakteru daného druhu, následovaných tzv. křížovým roztěrem. Křížový roztěr Principem je postupné ředění původního vzorku s cílem získat samostatně jednotlivé kolonie čisté kultury bakterií. Sterilní bakteriologickou kličkou vzorek rozetřeme na tuhé živné médium, vyžíhanou kličkou uděláme přes nátěr 3 4 čáry, po vyžíhání kličky postup opakujeme, na závěr nakreslíme kličkou hádka. Postup ukazuje Obr. 1. Obr 1: Izolace bakterií křížový roztěr 5.2 Očkování mikroorganismů Kultivaci mikroorganismů předchází jejich přenos ze vzorku nebo uchovávacího média do čerstvého živného prostředí, tj. očkování. Při očkování je nutné zachovávat sterilní 16

19 postupy, aby se do media nedostaly nežádoucí mikroorganismy z vnějšího prostředí. Existuje více postupů očkování, např. z tuhých médií kličkou na misky, šikmý agar nebo do tekutého média nebo z tekutého média do tekutého media nebo na tuhé médium. Sterilní, vyžíhanou a vychladlou kličkou nebo jehlou je mikroorganismus přenesen do nového prostředí, tj. naočkován na povrch tuhé půdy nebo do tekutého média (obr. 2). Tekutá média jsou očkována pipetou. Obr. 2: Očkování mikroorganismů A) žíhání kličky, B) očkování tuhé půdy, C) očkování tekutého media) 5.3 Mikroskopické pozorování Pro mikroskopická pozorování mikroorganismů je nutné jejich předchozí barvení, jinak jsou v mikroskopu velmi málo zřetelné. Používá se několik typů přípravy preparátů a barvení. Nativní preparát ukazuje mikroorganismy v reálném obraze. Fixovaný preparát se liší usmrcením buněk, které lépe přijímají barvivo a lépe přilnou na podložní sklo. Fixace bakterií se provádí protažením podložního skla se zaschlým nátěrem třikrát nesvítivým plamenem kahanu. Pro stanovení živých a mrtvých buněk se používá vitální barvení, např. metylenovou modří, která obarví mrtvé buňky modře, živé buňky se neobarví. V diagnostice bakterií se používá Gramovo barvení, které na základě odlišnosti složení buněčné stěny, rozděluje bakterie na grampozitivní a gramnegativní. 17

20 Moderní mikroskopické metody využívají vazbu fluorescenčních barviv na buněčné struktury a jejich pozorování v UV světle fluorescenčního mikroskopu. 5.4 Kvantifikace mikroorganismů Stanovení mikrobiálních počtů je využíváno při mikrobiologickém rozboru vod a jiných materiálů, v klinické diagnostice a v laboratorních experimentech. Počty mikroorganismů lze stanovit několika způsoby: 1) mikroskopickým stanovením lze určit počty všech mikroorganismů ve vzorku, tj. včetně nekultivovatelných; 2) kultivačně lze stanovit počty mikroorganismů, kterým vyhovují nabídnuté podmínky - využívají se metody plotnové, kdy jsou stanoveny počty kolonií vyrostlé na miskách a kultivace v tekutých půdách (MPN = most probablynumber ; metoda pravděpodobných počtů), kdy je výsledkem řádový počet mikroorganismů; 3) nefelometricky stanovením zákalu, odpovídajícím aktuální hustotě buněk; 4) biochemicky průkazem míry metabolické aktivity mikroorganismů. Nejčastěji používanými standardizovanými metodami pro stanovení počtu bakterií ve vzorcích vod, půd, potravin, v klinickém materiálu apod. je kultivace. Obr. 3: Stanovení počtu mikroorganismů ve vzorku vody 18

21 6 Praktická cvičení mikrobiologické stanovení jakosti pitné vody Jakost pitné vody je určována pomocí hygienických limitů mikrobiologických, biologických, fyzikálních, chemických a organoleptických ukazatelů. Vyhláškou je stanoven i rozsah a četnost kontroly dodržení jakosti pitné vody a požadavky na metody kontroly jakosti pitné vody. Mikrobiologický rozbor pitné vody vyžaduje stanovení indikátorů organického a fekálního znečištění, uvedených v kapitole 2. Stanovení jakosti napájecích vod bude určována s využitím limitů, určených pro pitné vody. Praktické cvičení bude tedy zaměřeno na stanovení následujících parametrů, podle platné legislativy ČR (viz Tab.1): 1. Odběr vzorků pitných vod (ČSN ISO , ČSN EN ISO 19458) 2. Stanovení intestinálních enterokoků (ČSN EN ISO ) 3. Stanovení Escherichia coli(čsn ) 4. Stanovení koliformních bakterií (ČSN ) 5. Stanovení počtů kolonií při 22 C (ČSN EN ISO 6222) 6. Stanovení počtů kolonií při 36 C (ČSN EN ISO 6222) 6.1 Odběr vzorků vod pro mikrobiologické stanovení Základem dobře provedené analýzy vzorku vod je správně provedený odběr vzorku. Postup a pravidla odběru jsou standardizována normou ČSN ISO : Jakost vod Odběr vzorků část 5: Návod na odběr vzorků pitné vody z úpraven vody a vodovodních sítí a normou ČSN EN ISO Jakost vod odběr vzorků pro mikrobiologické analýzy Postup odběru vzorku pitné vody pro mikrobiologickou analýzu 19

22 Vzorky vod pro mikrobiologický rozbor jsou odebírány do sterilních skleněných vzorkovnic. Lahve jsou opatřeny zábrusovými zátkami nebo šroubovacími uzávěry a jsou odolné pro sterilizaci. Vzorkovnice jsou kryty alobalem k ochraně před kontaminací. Dezinfekce odběrového místa je provedena ethylalkoholem, mechanické nečistoty jsou předtím odstraněny kartáčkem, voda se nechá odtékat 2 3 minuty. Skleněná vzorkovnice je naplněna vzorkem přímo z kohoutku, ventilu nebo jiného vhodného odběrového místa podle typu zdroje do cca 2/3 objemu vzorkovnice (aby šel vzorek dobře promíchat). Při odběru je nutné pečlivě bránit možné kontaminaci vzorku, hrdla ani zábrusu se nesmí dotknout ruka ani jiný předmět, zátku držíme za část chráněnou hliníkovou fólií. Vzorky jsou transportovány do laboratoře v chladničce s chladícími vložkami v co nejkratším čase. Pro každý odběr vzorku pitné vody je veden záznam o odběru. Není-li možné odebrat vzorek přímo do vzorkovnice, použijí se pomocné vzorkovače, např. připevněné na řetěz nebo lano dostatečné délky. Pomocné odběrové nádoby jsou po převezení do laboratoře vymyty horkým roztokem detergentu, několikrát propláchnuty horkou vodou a nakonec vypláchnuty destilovanou vodou. Při vzorkování desinfikované vody se do vzorkovnice přidává 1,8% sterilní roztok thiosíranu sodného (0,1 ml na 100 ml vzorku). Mikrobiologická analýza musí být zahájena co nejdříve po odběru vzorku, do odběru je vzorek uchováván v chladničce. 6.2 Stanovení indikátorů organického znečištění Stanovení počtu kultivovatelných mikroorganismů při 22 C a 36 C Princip Stanovení spočívá v kultivačním pomnožení mikroorganismů přítomných ve vzorku vody na neselektivním živném mediu při teplotách 22 C a 36 C. Množství mikroorganismů odpovídá kontaminaci zkoušené vody organickými látkami. Zkouška je prováděna ve shodě 20

23 s ČSN EN ISO 6222.Pro tyto skupiny se používají zkratky HPC 22 a HPC 36, odvozené od heterotrophic plate counts a kultivační teploty. Media a materiál Přednostně jsou používána hotová komerční kultivační média a činidla o složení odpovídajícím požadavkům normy. TYEA - agar s kvasničným extraktem (Trypton Yeast Extract Agar) o složení odpovídajícím ČSNEN ISO 6222 trypton 6,0 g kvasničný extrakt 3,0 g agar g (podle viskozity agaru) destilovaná voda do ml Jednotlivé složky se přidají do vody a za zahřívání se rozpustí. Pokud je třeba, upraví se hodnota ph tak, aby po sterilizaci byla 7,2 při teplotě 25 C. Médium se sterilizuje v autoklávu při teplotě 121 C po dobu 15 min. Před použitím se kultivační médium rozehřeje, nechá zchladnout na 45 C a nalévá se do misek se vzorky. Fyziologický roztok 8,5 g chloridu sodného se doplní do ml destilovanou vodou, sterilizuje se v autoklávu ve skleněných nádobách o objemu 500 ml při teplotě 121 C po dobu 15 min. Před použitím se asepticky plní po 9 ml do zkumavek. 0,2M NaOH a 0,2M HCl pro úpravu ph V odměrné baňce na ml se v destilované vodě rozpustí 8 g NaOH a objem se doplní po rysku. Do odměrné baňky na ml se pipetou odměří 17 ml HCl a objem se doplní po rysku destilovanou vodou. Pomůcky a materiál: horkovzdušný sterilizátor autokláv váhy 21

24 termostaty na kultivaci při teplotách 362 C a 222 C automatické pipety - fixní na objem 1 ml, nastavitelná na vyšší objemy počítačka kolonií s lupou a bočním osvětlením plynový kahan skleněné zkumavky skleněné lahve na přípravu média plastové špičky na objem 1 a 10 ml, Petriho misky o průměru 9 cm (skleněné nebo plastové), Veškeré pomůcky, přicházející do styku se vzorkem nebo kultivačním médiem musí být sterilní. Postup zkoušky: Provádí se podle schématu Příprava vzorku - vzorky jsou před zpracováním vytemperovány na laboratorní teplotu a bezprostředně před rozborem dokonale promíchány ručním třepáním po dobu 7 sekund. 2. Ředění vzorku - obvykle se zpracovává 1 ml vzorku, u více znečištěných vod (povrchové a odpadní) se vzorky ředí. Stupeň ředění se volí tak, aby po kultivaci vyrostlo 10 až 300 kolonií na misce. Obvykle se zpracovávají 2 stupně zředění. U neznámých vzorků se připravuje více stupňů ředění. o Postup ředění vzorku: do sterilních skleněných zkumavek se napipetuje 9 ml fyziologického roztoku. Počet zkumavek je zvolen od potřebného stupně naředění vzorku. Z promíchaného vzorku se odebere pipetou 1 ml a přenese se do první zkumavky s fyziologickým roztokem. Vzorek se dokonale promíchá a 1 ml se přenese do další zkumavky s fyziologickým roztokem. Postup se opakuje do dosažení požadovaného ředění (viz Obr. 3). 3. Očkování - do 2 sterilních Petriho misek o průměru 9 cm se pro každý parametr napipetuje po 1 ml neředěného nebo zředěného vzorku, pro zvýšení přesnosti metody se očkují 2 misky ze2 sousedních stupňů ředění (např a 10-3 ), aby se zvýšila pravděpodobnost záchytu vhodného počtu kolonií na miskách (10 300). Pipetování se 22

25 provádí současně s ředěním. Misky musí být jednoznačně označeny - identifikací vzorku, datem počátku kultivace, typem stanovení a použitým ředěním. Po naočkování se misky opatrně zalijí cca 15 ml roztopeného kultivačního média, ochlazeného na teplotu cca 45 C (nepálí po přiložení na tvář). Po zakrytí víčkem se médium se vzorkem pomalým krouživým pohybem promíchá, tak aby se nepotřísnily stěny nebo víčko misky. Médium se vzorkem se nechá ztuhnout při laboratorní teplotě. Doba zpracování vzorku nesmí překročit 15 min. 4. Kultivace - misky se ukládají do termostatu v plastových sáčcích dnem vzhůru. Misky pro stanovení kultivovatelných mikroorganismů při 22 C jsou uloženy do termostatu vytemperovaného na 222 C na dobu 684 hod, misky pro stanovení kultivovatelných mikroorganismů při 36 C se kultivují při 36 C2 C po dobu 444 hod. 5. Hodnocení výsledků - po vyjmutí z termostatu se počítají všechny kolonie narostlé na povrchu i uvnitř média v misce obrácené dnem vzhůru na černé podložce, nejlépe pomocí počítačky kolonií s lupou při 10 násobném zvětšení. 6. Vyjadřování výsledků - počty kultivovatelných mikroorganismů se vyjadřují v KTJ (kolonie tvořící jednotky) v 1 ml. Hodnotí se přednostně misky, na kterých narostlo kolonií. Misky, na nichž nelze rozlišit jednotlivé typické kolonie z důvodu velkého počtu narostlých kolonií, se označují jako "nepočitatelné". Misky, na nichž nelze provést odečet z důvodu plazivého růstu některých mikroorganismů, se označují jako "přerostlé". Je-li více než 300 kolonií na miskách s nejvyšším stupněm zředění, vyjadřují se výsledky jako >300 nebo pouze jako přibližné. 23

26 Schéma 1: Stanovení počtu kultivovatelných mikroorganismů při 22 C a 36 C vzorek vody 1 ml pipetou 1 ml pipetou Výsev do kultivačního media: naočkovat 1 ml do Petriho misky, zalít roztopeným mediem TYEA Výsev do kultivačního media: naočkovat 1 ml do Petriho misky, zalít roztopeným mediem TYEA kultivace při 222 C po dobu 684 hod kultivace při 362 C po dobu 444 hodiny Počty kultivovatelných mikroorganismů při 22 C: všechny kolonie narostlé na povrchu i uvnitř média Počty kultivovatelných mikroorganismů při 36 C: všechny kolonie narostlé na povrchu i uvnitř média Výsledek HPC 22: KTJ/1 ml Výsledek HPC 36: KTJ/1 ml 24

27 6.3 Stanovení indikátorů fekálního znečištění Stanovení koliformních bakterií Princip Stanovení spočívá v kultivačním pomnožení mikroorganismů přítomných ve vzorku vody na selektivním živném mediu Endo agaru při teplotě 36 C po dobu 24 nebo 48 hodin. Narostlé kolonie jsou následně konfirmovány cytochromoxidázovým testem. Množství koliformních bakterií odpovídá kontaminaci zkoušené vody fekálním znečištěním. Zkouška je prováděna ve shodě s ČSN Media a materiál Přednostně jsou používána hotová komerční kultivační média a činidla o složení odpovídajícím požadavkům normy. Endo agar - o složení odpovídajícím ČSN : pepton 10 g masový výtažek 8,6 g laktóza 10 g siřičitan sodný (bezvodý) 1,2 g chlorid sodný 5 g agar 12 g 5 % roztok bazického fuchsinu v etylalkoholu 3,4 ml destilovaná voda do ml Roztok bazického fuchsinu bazický fuchsin 1 g 95% etylalkohol 20 ml 25

28 Jednotlivé složky se postupně rozpustí v ml destilované vody. Přidá se roztok bazického fuchsinu. Sterilizuje se 30 min při teplotě 100 C. Výsledná hodnota ph má být 7,5. Fyziologický roztok (dle ČSN EN ISO 8199) chlorid sodný destilovaná voda do 8,5 g ml Sterilizuje se v autoklávu ve skleněných nádobách o objemu 500 ml při teplotě 121 C po dobu 15 min. Před použitím se asepticky plní po 9 ml do zkumavek. Roztok pro cytochromoxidázový test tetramethyl-p-fenylendiamindihydrochlorid pentahydrátthiosíranu sodného disodná sůl kys. ethylendiamintetraoctové (Chelaton 3) destilovaná voda do 1,0 g 0,2 g 0,1 g 100 ml zmodrat. Roztok nesmí přijít do styku se železem a musí se chránit před světlem. Roztok nesmí 0,2M NaOH a 0,2M HClpro úpravu ph V odměrné baňce na ml se v destilované vodě rozpustí 8 g NaOH a objem se doplní po rysku. Do odměrné baňky na ml se pipetou odměří 17 ml HCl a objem se doplní po rysku destilovanou vodou. Pomůcky a materiál: horkovzdušný sterilizátor autokláv váhy termostaty na kultivaci při teplotách 362 C automatické pipety - fixní na objem 1 ml, nastavitelná na vyšší objemy počítačka kolonií s lupou a bočním osvětlením filtrační aparatura na membránové filtry 26

29 plynový kahan skleněné zkumavky skleněné lahve na přípravu média plastové špičky na objem 1 a 10 ml, Petriho misky o průměru 9 cm (skleněné nebo plastové), Veškeré pomůcky, přicházející do styku se vzorkem nebo kultivačním médiem musí být sterilní. Postup zkoušky: Provádí se podle schématu Příprava vzorku - vzorky jsou před zpracováním vytemperovány na laboratorní teplotu a bezprostředně před rozborem dokonale promíchány ručním třepáním po dobu 7 sekund. 2. Filtrace a očkování 100 ml nebo 10 ml (v případě předpokládané kontaminace) vzorku se přefiltruje přes sterilní membránový filtr o porozitě 0,45 µm umístěný ve filtračním zařízení, které bylo vysterilizováno žíháním v plamenu. Filtrace se provádí membránovým čerpadlem. Manipulace s filtrem se provádí vždy sterilní pinzetou (sterilizace pinzety se provádí v plamenu). Po filtraci se filtr přenese na povrch agaru v označených Petriho miskách. Filtr se položí na agar tak, aby pod ním nevznikly vzduchové bubliny. Misky jsou označeny identifikací vzorku, datem počátku kultivace a typem stanovení. 3. Kultivace Kultivace probíhá v termostatu při teplotě 362 C po dobu 18 až 24 hod v plastových sáčcích, misky se ukládají do termostatu dnem vzhůru. V případě, že po 24 hod nevyrostly žádné typické kolonie, prodlouží se kultivační doba o dalších 24 hod. 4. Vyhodnocení výsledků na membránových filtrech Po inkubaci se spočítají všechny laktózapozitivní kolonie, tj. sytě červené kolonie s tmavě červenou spodní částí a červené kolonie s kovovým leskem. 27

30 5. Potvrzující testy Pokud se po primární kultivaci na modifikovaném Endo agaru vyskytují typické, tj. laktózapozitivní kolonie, přenese se celý membránový filtr na filtrační papír v Petriho misce nasycený činidlem pro cytochromoxidázový test. Po 2 min se spočítají kolonie koliformních bakterií, které jsou laktóza pozitivní s negativním cytochromoxidázovým testem, tj. vyloučí se kolonie, které působením činidla zmodraly. 6. Vyjadřování výsledků Výsledek se udává v KTJ počtů presumptivních koliformních bakterií a koliformních bakterií na 100 ml. 28

31 Schéma 2: Stanovení koliformních bakterií vzorek vody 100 ml odměrným válcem membránová filtrace (0,45 µm) pomocí pinzety přenos filtru na povrch Endo agaru kultivace při 362 C po dobu 18 až 24 hod (Pokud po 24 hod nevyrostly žádné typické kolonie, prodlouží se kultivační doba o dalších 24 hod) laktóza pozitivní kolonie: sytě červené kolonie tmavě červené ze spodu filtru a červené kolonie s kovovým leskem laktóza negativní kolonie cytochromoxidázový test: - přenos filtru na papírový filtr nasycený činidlem, - vyloučí se kolonie, které působením činidla do 2 minut zmodraly Výsledek: koliformní bakterie nejsou přítomné koliformní bakterie = laktóza pozitivní s negativním cytochromoxidázovým testem Výsledek: počet koliformních bakterií v KTJ/100 ml 29

32 6.3.2 Stanovení fekálních koliformních bakterií a Escherichia coli Princip Stanovení spočívá v kultivačním pomnožení mikroorganismů přítomných ve vzorku vody na selektivním živném mediu mfc agaru při teplotě 44 C po dobu 24 hodin. Množství fekálních (termotolerantních) koliformních bakterií odpovídá kontaminaci zkoušené vody fekálním znečištěním. Zkouška je prováděna ve shodě s ČSN Media a materiál Přednostně jsou používána hotová komerční kultivační média a činidla o složení odpovídajícím požadavkům normy. M-FC agar- o složení odpovídajícím ČSN tryptóza 10 g proteose pepton č. 3 nebo polypepton 5 g kvasničný extrakt 3 g chlorid sodný (NaCl) 5 g laktóza 12,5 g žlučové sole č.3 nebo směs žlučových solí 1,5 g anilínová modř 0,1 g kyselina rosolová- alkalický roztok 10,0 ml agar 15 g destilovaná voda do ml Předepsané složky se postupně rozpustí v ml destilované vody, která obsahuje 10 ml alkalického roztoku kyseliny rosolové. Médium se zahřeje pod bod varu a ihned ochladí na teplotu C. Nesterilizuje se, ph se upraví na hodnotu 7,4. 30

33 Alkalický roztok kyseliny rosolové kyselina rosolová 1,0 g 0,2M NaOH 100 ml Po dokonalém rozpuštění kyseliny rosolové v roztoku NaOH se roztok přefiltruje. Změní-li se barva roztoku z tmavě červené na hnědou, nelze jej použít. Fyziologický roztok (dle ČSN EN ISO 8199) chlorid sodný destilovaná voda do 8,5 g ml Sterilizuje se v autoklávu ve skleněných nádobách o objemu 500 ml při teplotě 121 C po dobu 15 min. Před použitím se asepticky plní po 9 ml do zkumavek. Kultivační médium s 4-methyl-umbelliferyl-β-D-glukuronidem (MUG) pepton 2,5 g masový extrakt 1,5 g MUG (4-methylumbelliferyl-β-D-glukuronid) 0,05 g Agar 7,5 g destilovaná voda 500 ml Jednotlivé složky se rozpustí v destilované vodě zahříváním. Médium se sterilizuje v autoklávu při 121 C po dobu 15 min, ph po sterilizaci 6,9. Po ochlazení na C se rozlévá do Petriho misek. 0,2M NaOH a 0,2M HClpro úpravu ph V odměrné baňce na ml se v destilované vodě rozpustí 8 g NaOH a objem se doplní po rysku. Do odměrné baňky na ml se pipetou odměří 17 ml HCl a objem se doplní po rysku destilovanou vodou. 31

34 Pomůcky a materiál: horkovzdušný sterilizátor autokláv váhy termostaty na kultivaci při teplotách 362 C a 440,5 C automatické pipety - fixní na objem 1 ml, nastavitelná na vyšší objemy počítačka kolonií s lupou a bočním osvětlením filtrační aparatura na membránové filtry plynový kahan skleněné zkumavky skleněné lahve na přípravu média plastové špičky na objem 1 a 10 ml, Petriho misky o průměru 9 cm (skleněné nebo plastové), být sterilní. Veškeré pomůcky, přicházející do styku se vzorkem nebo kultivačním médiem musí Postup zkoušky: Provádí se podle schématu Příprava vzorku - vzorky jsou před zpracováním vytemperovány na laboratorní teplotu a bezprostředně před rozborem dokonale promíchány ručním třepáním po dobu 7 sekund. 2. Filtrace a očkování 100 ml nebo 10 ml vzorku se přefiltruje přes sterilní membránový filtr o porozitě 0,45 µm umístěný ve filtračním zařízení, které bylo vysterilizováno žíháním v plamenu. Filtrace se provádí membránovým čerpadlem. Manipulace s filtrem se provádí vždy sterilní pinzetou (sterilizace pinzety se provádí v plamenu). Po filtraci se filtr přenese na povrch agaru v označených Petriho miskách. Filtr se položí na agar tak, aby pod ním nevznikly vzduchové bubliny. Misky jsou označeny identifikací vzorku, datem počátku kultivace a typem stanovení. 32

35 3. Kultivace Kultivace probíhá v termostatu při teplotě 442 C po dobu 18 až 24 hodin v plastových sáčcích, misky se ukládají do termostatu dnem vzhůru. V případě, že po 24 hod nevyrostly žádné typické kolonie, tj. modře zbarvené, prodlouží se kultivační doba o dalších 24 hod. 4. Sekundární kultivace-stanovení Escherichia coli Membránový filtr s koloniemi se přenese sterilní pinzetou na povrch kultivačního média obsahujícího MUG. Uzavřené misky se kultivují 2 hod při teplotě 36±2 C. Po skončení kultivace, se v temné místnosti pod UV lampou (360 nm) odečítají modře fluoreskující kolonie. Pokud je odečet negativní, kultivují se misky další 2 hod a potom se počítání kolonií opakuje. 5. Vyhodnocení výsledků na membránových filtrech Po inkubaci se spočítají všechny laktóza pozitivní kolonie, tj. modře zbarvené kolonie. Takto jsou stanoveny fekální koliformní bakterie. Fekální koliformní bakterie s pozitivním testem na přítomnost β-d-glukuronidázy (s modrou fluorescencí v UV světle) se počítají jako E. coli. 6. Vyjadřování výsledků Výsledek se udává v KTJ počtů fekálních (termotolerantních) koliformních bakterií a Escherichia colive 100 ml. 33

36 Schéma 3: Stanovení fekálních koliformních bakterií a Escherichia coli vzorek vody 100 ml odměrným válcem membránová filtrace (0,45 µm) pomocí pinzety přenos filtru na povrch m FC agaru kultivace při 442 C po dobu 18 až 24 hod (pokud po 24 hod nevyrostly žádné typické kolonie, prodlouží se kultivační doba o dalších 24 hod) laktóza pozitivní kolonie = fekální koliformní bakterie: modře zbarvené laktóza negativní kolonie Stanovení E. coli: přenos filtru na povrch kultivačního média obsahujícího MUG Výsledek: fekální koliformní bakterie nejsou přítomné kultivace při 362 C po dobu 2 hod UV lampa (360 nm) Escherichia coli: modře fluoreskující kolonie Výsledek: počet E. coli v KTJ/100 ml Výsledek: počet fekálních koliformních bakterií v KTJ/100 ml 34

37 6.3.3 Stanovení intestinálních enterokoků Princip Stanovení spočívá v kultivačním pomnožení mikroorganismů přítomných ve vzorku vody na selektivním živném mediu podle Slanetz-Bartleyové při teplotě 36 C po dobu 48 hodin a potvrzení na žluč-eskulinovém agaru při teplotě 44 C po dobu 2 hod. Množství enterokoků indikuje čerstvé fekální znečištění vody. Zkouška je prováděna ve shodě s ČSN EN ISO Media a materiál Přednostně jsou používána hotová komerční kultivační média a činidla o složení odpovídajícím požadavkům normy. Médium podle Slanetz-Bartleyové - o složení odpovídajícím ČSN EN ISO tryptóza 20 g kvasničný extrakt 5 g glukóza 2 g hydrogenfosforečnan sodný nebo draselný 4 g azid sodný 0,4 g agar 15 g destilovaná voda do ml Žluč-eskulin-azidový agar o složení odpovídajícím ČSN EN ISO trypton 17 g pepton 3 g kvasničný extrakt 5 g volská žluč dehydratovaná 10 g chlorid sodný (NaCl) 5 g eskulin 1 g citran železitý 0,5 g agar 15 g destilovaná voda do ml 35

38 Fyziologický roztok (dle ČSN EN ISO 8199) chlorid sodný destilovaná voda do 8,5 g ml Sterilizuje se v autoklávu ve skleněných nádobách o objemu 500 ml při teplotě 121 C po dobu 15 min. Před použitím se asepticky plní po 9 ml do zkumavek. 0,2M NaOH a 0,2M HCl pro úpravu ph V odměrné baňce na ml se v destilované vodě rozpustí 8 g NaOH a objem se doplní po rysku. Do odměrné baňky na ml se pipetou odměří 17 ml HCl a objem se doplní po rysku destilovanou vodou. Pomůcky a materiál: horkovzdušný sterilizátor autokláv váhy termostaty na kultivaci při teplotách 362 C a 440,5 C automatické pipety - fixní na objem 1 ml, nastavitelná na vyšší objemy počítačka kolonií s lupou a bočním osvětlením filtrační aparatura na membránové filtry plynový kahan skleněné zkumavky skleněné lahve na přípravu média plastové špičky na objem 1 a 10 ml, Petriho misky o průměru 9 cm (skleněné nebo plastové), být sterilní. Veškeré pomůcky, přicházející do styku se vzorkem nebo kultivačním médiem musí 36

39 Postup zkoušky: Provádí se podle schématu Příprava vzorku - vzorky jsou před zpracováním vytemperovány na laboratorní teplotu a bezprostředně před rozborem dokonale promíchány ručním třepáním po dobu 7 sekund. 2. Filtrace a očkování 100 ml nebo 10 ml vzorku se přefiltruje přes sterilní membránový filtr o porozitě 0,45 µm umístěný ve filtračním zařízení, které bylo vysterilizováno žíháním v plamenu. Filtrace se provádí membránovým čerpadlem. Manipulace s filtrem se provádí vždy sterilní pinzetou (sterilizace pinzety se provádí v plamenu). Po filtraci se filtr přenese na povrch agaru v označených Petriho miskách. Filtr se položí na agar tak, aby pod ním nevznikly vzduchové bubliny. Misky jsou označeny identifikací vzorku, datem počátku kultivace a typem stanovení. 3. Kultivace Kultivace probíhá v termostatu při teplotě 362 C po dobu 444 hodiny v plastových sáčcích, misky se ukládají do termostatu dnem vzhůru. 4. Vyhodnocení výsledků na membránových filtrech Po inkubaci se spočítají všechny červené, kaštanové nebo růžové kolonie, které jsou celé zbarvené nebo mají barevný střed. Odečet je prováděn ze všech misek, kde lze rozlišit jednotlivé typické kolonie. Jsou označovány jako presumptivní intestinální enterokoky. 5. Potvrzující testy Pokud se po primární kultivaci na selektivním agaru dle Slanetz-Bartleyové vyskytují typické kolonie, přenese se celý membránový filtr na povrch žluč-eskulin-azidového agaru a kultivuje při teplotě 44±0,5 C po dobu 2 hod. Kolonie vykazující tříslově hnědé až černé zbarvení média v bezprostředním okolí se považují za intestinální enterokoky. 6. Vyjadřování výsledků 37