ELISA-VIDITEST anti-mycoplasma pneumoniae IgG. Návod k použití soupravy

Transkript

1 ELISA-VIDITEST anti-mycoplasma pneumoniae IgG OD-137 Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, Jesenice, tel.: , 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-mycoplasma pneumoniae IgG ELISA souprava pro detekci protilátek třídy IgG proti antigenu M. pneumoniae. 2. POUŽITÍ: Souprava je určená pro laboratorní diagnostiku chorob vyvolaných baktérií Mycoplasma pneumoniae. Test se využívá zejména pro diagnostiku všech druhů zánětů dýchacích cest od lehkých katarů až po těžké pneumonie, včetně komplikací jako perikarditis, meningoencefalitis, otitis, erytema nodosum. Pro kvalitní laboratorní stanovení diagnózy pomocí ELISA je ideální sledovat dynamiku tvorby protilátek, kde předpokladem je vyšetření dvou vzorků sér jednoho pacienta, tzv. párových sér první vzorek je odebrán v akutní fázi onemocnění, druhý v době, kdy se předpokládá vytvoření detekovatelné hladiny protilátek, tj. cca za dnů od odběru prvního vzorku. Vzhledem k odlišné dynamice tvorby protilátek jednotlivých imunoglobulinových tříd se doporučuje v každém vzorku paralelní vyšetření specifických protilátek třídy IgG, IgA a IgM. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-m. pneumoniae IgG je imunoanalytický test na pevné fázi. Na povrch jamek je navázán specifický antigen M. pneumoniae. Jsou-li v testovaných sérech přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizovaný antigen. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgG značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní séra nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku potažené specifickým antigenem STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml kalibrátoru r.t.u. 1) CAL 1 lahvička 1,3 ml pozitivního kontrolního séra r.t.u. CONTROL + 1 lahvička 1,3 ml negativního kontrolního séra r.t.u. CONTROL - 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou (konjugát anti-igg Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 125 ml promývacího roztoku anti-mycoplasma pneum. 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 100 ml ředicího roztoku anti-mycoplasma pneum. r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB-O 1 lahvička 13 ml stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. a ředicí roztok r.t.u, jsou určeny pouze pro soupravu ELISA-VIDITEST anti-mycoplasma pneumoniae IgG, IgM, IgA a NEJSOU VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÉ mezi ostatními soupravami ELISA-VIDITEST vyráběných firmou VIDIA spol. s r.o.. 1

2 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr. 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Důkladně zamíchejte ředicí roztok r.t.u., roztok Px-konjugátu r.t.u. a chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. c. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, kalibrátor a kontrolní séra. Testovaná séra řeďte 101x (např. 5 μl séra μl ředicího roztoku). Kontrolní séra a kalibrátor neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). d. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho ve vodní lázni +32 C až +37 C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 měsíc při laboratorní teplotě. e. Roztok konjugátu anti-igg Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem důkladně uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Naplňte příslušné jamky po 100 μl kalibrátoru, kontrolních sér a ředěných testovaných sér podle následujícího schématu: První jamku naplňte samotným ředicím roztokem pro stanovení pozadí reakce (DIL). Další dvě jamky naplňte kalibrátorem (CAL). Další jamky naplňte negativním kontrolním sérem (CONTROL -) a pozitivním kontrolním sérem (CONTROL +). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými séry (S1 ). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku (S1, S2, S3, ) - viz Schéma aplikace vzorků. Pro kontrolu je vhodné aplikovat také pozitivní kontrolní sérum (CONTROL +). Každé sérum stačí aplikovat na jednu jamku. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, aplikujte Kalibrátor na tři jamky, vyšetřovaná a kontrolní séra aplikujte po dvou jamkách. Inkubujte 30 minut (+/- 2 min.) při laboratorní teplotě. c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY). Jamky poté 4 x promyjte 250 μl promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-igg Px r.t.u. (CONJ) a napipetujte do jamek po 100 μl konjugátu anti-igg Px r.t.u. (CONJ). Inkubujte 60 minut (± 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4 x 250 μl promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 μl chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 15 minut (+/- 30 sec.) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 μl stop roztoku. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 20 minut od zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr nm. 2

3 Obr. 1: Schéma aplikace vzorků: a DIL S5 b CAL S c CAL d CONTROL - e S1 f S2 g S3 h S4 8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot kalibrátoru, kontrolních sér a testovaných sér Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD kalibrátoru (CAL). Pokud aplikujete kalibrátor na tři jamky a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 2. Stanovte cut-off hodnotu tak, že průměrnou hodnotu OD kalibrátoru vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru je uvedena v certifikátu kontroly kvality pro danou šarži soupravy. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pozitivity pro jednotlivé vzorky sér: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér tak, že vydělíte OD testovaného séra cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity séra. Příklad: Získaná OD kalibrátoru = 1,390; 1,474 Průměrná hodnota OD kalibrátoru = 1,432 OD vzorku séra = 0,900 Korekční faktor kalibrátoru = 0,21 Cut-off hodnota = 1,432 x 0,21 = 0,301 Hodnota indexu = 0,900 / 0,301 = 2,99 HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ : Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-3,00 + 3,01-5, ,01-8, >8,

4 Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že sérum leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li sérum po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou nebo použijte sérum z nového odběru od téhož jedince. 9. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ: Při hodnocení sérologických nálezů je optimální vyšetření sér ve všech 3 třídách protilátek (IgG, IgM i IgA), nejlépe vyšetření párových vzorků sér. IgG IgM IgA Interpretace výsledků - + (+) časná akutní infekce časná akutní infekce bez tvorby protilátek IgM (nebo solitárně perzistující IgA) akutní infekce pozdní akutní infekce + - (+) primoinfekce nebo reinfekce infekce prodělaná v dřívější době seronegativita (bez kontaktu s Mycoplasma pneumoniae ) 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: Platnost testu Hodnota OD Kalibrátoru (CAL) by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže soupravy. Hodnoty absorbancí kontrolních sér by měly být: CONTROL - < CAL < (CONTROL +). Hodnota absorbance OD samotného ředicího roztoku r.t.u. (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,100. Hodnota indexu negativního kontrolního séra (CONTROL -) by měla být < 0, Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnost (interassay) a během testu - opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A ±δ CV opak. 16 3,001 0,117 3,9 % 14 0,753 0,029 3,8 % 4

5 Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A ±δ min - max CV opak 9 0,117 0,016 0,098-0,145 13,7 % 12 1,155 0,124 0,960-1,360 10,8 % 9 2,867 0,214 2,491-3,071 7,5 % Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, protilátek anti-hiv-1,2 a anti- HCV. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, ředicí roztok r.t.u pro séra a chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. jsou vzájemně zaměnitelné pouze mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST anti- Mycoplasma pneumoniae IgG, IgM a IgA. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kalibrátor, kontrolní séra, ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti-igg Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok TMB nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním doby inkubací uvedených v bodě 7 * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo Px-konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 5

6 * kontaminací pipety, používané pro aplikaci vzorků, kontrol nebo chromogensubstrátového roztoku TMB, Px konjugátem (doporučujeme pro aplikaci konjugátu používat pipetu, vyhrazenou pouze pro tyto účely). 13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 C až +10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách, doba přepravy do 72 hodin nemá na expiraci vliv. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 C až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 C až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných sér v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. Doporučená literatura: M. Karppelin, K. Hakkarainen, M. Kleemola, and A. Miettinen: Comparison of three serological methods for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection. Clin Pathol.; 46(12): , December M. Granstrom, T. Holme, A. M. Sjogren, A. Ortqvist and M. Kalin: The role of IgA determination by ELISA in the early serodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection, in relation to IgG and mucapture IgM methods. The Journal of Medical Microbiology, Vol 40, Issue , Ken B. Waites and Deborah F. Talkington: Mycoplasma pneumoniae and Its Role as Human Pathogen. Clinical Microbiology Reviews, p , Vol. 17, No. 4, October

7 14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Krok 2. Krok 3. Krok 4. Připravte reagencie a testovaná séra v pracovním ředění Aplikujte 100 μl/ jamku kontrolních a testovaných sér Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl/ jamku), vyklepněte Aplikujte 100 μl/ jamku konjugátu anti-igg Px Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 μl/ jamku), vyklepněte Aplikujte 100 μl/ jamku chromogensubstrátového roztoku TMB Inkubujte 15 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Krok 6. Aplikujte 100 μl/ jamku stop roztoku Změřte absorbanci při 450 / ( ) nm do 20 minut Datum poslední verze tohoto návodu: 03/2013 7

8 8