MONOFLUO TM SCREEN R.S.V.

Transkript

1 MONOFLUO TM SCREEN R.S.V. 80 TESTŮ DETEKCE RESPIRAČNÍHO SYNCYTIÁLNÍHO VIRU PŘÍMOU IMUNOFLUORESCENCÍ

2 OBSAH 1- KLINICKÝ VÝZNAM PRINCIP TESTU OBSAH SOUPRAVY UPOZORNĚNÍ ODBĚR VZORKŮ TECHNIKA ODBĚRU VZORKU ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ PŘED IMUNOFLUORESCENČNÍM VYŠETŘENÍM IZOLACE VIRU V BUNĚČNÉ KULTUŘE PRACOVNÍ POSTUP NEZBYTNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY PRACOVNÍ POSTUP INTERPRETACE VÝSLEDKŮ KONTROLA KVALITY VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ OMEZENÍ TESTU ÚČINNOST CITLIVOST SPECIFIČNOST KŘÍŽOVÉ REAKCE KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM LITERATURA... 11

3 1- KLINICKÝ VÝZNAM Respirační syncytiální virus, virus chřipky A a B, virus parainfluenzy 1, 2 a 3 a adenovirus jsou odpovědné za závažné respirační infekce u dětí a starších nebo oslabených osob. Diagnóza virového nebo bakteriálního původu těchto infekcí je základním předpokladem pro zavedení vhodných terapeutických opatření. Diagnóza uvedených virových onemocnění je založena na izolaci viru. Sérologická diagnostika neposkytuje uspokojivé výsledky; titry protilátek se signifikantně zvyšují teprve za dnů po nástupu klinických příznaků a zpravidla nemohou být detekovány u dětí. Referenční metodou tak zůstává izolace viru z buněčné kultury (buňky HeLa, KB, Hep-2 nebo fibroblastické buněčné linie embryonálního původu) a jejich identifikace z nasofaryngeálních vzorků nebo ze vzorků bronchoalveolární tekutiny, získané výplachem. Vzorek se získává během fáze maximální virové exkrece, za 1 až 6 dnů po nástupu onemocnění. Spojení monoklonálních protilátek, specifických pro tyto viry s tropismem k respiračnímu traktu a imunofluorescenční techniky, umožňuje rychlou diagnózu uvedených onemocnění (přímým vyšetřením vzorku) bez nutnosti použít metodu buněčné kultivace, která se obtížně provádí. Pro každý z uvedených virů byly selektovány monoklonální protilátky namířené proti virovým proteinům, v prvé řadě z důvodu jejich specifičnosti, a dále vzhledem ke kvalitě zobrazení pozorovaného při použití imunofluorescence; obvyklým zobrazením je zřetelně viditelná granulární fluorescence nebo fluorescence částeček v cytoplasmě infikovaných buněk. Tyto monoklonální protilátky mohou být také použity k identifikaci každého z uvedených virů po jejich izolaci z buněčné kultury. Vzhledem k prevalenci různých virových infekcí firma Bio-Rad navrhla přípravu rychlého diagnostického testu pro detekci onemocnění virového původu: Respirační syncytiální virus (RSV) je odpovědný za více než 60 % těchto infekcí; test MONOFLUO TM SCREEN R.S.V. (kód 52216) se používá k identifikaci tohoto viru v odebraném vzorku přímou imunofluorescenční technikou v jednom kroku. Virus chřipky A a B, virus parainfluenzy 1, 2 a 3 a adenovirus způsobují různými mechanismy podle oblasti a roční doby přibližně 30 % těchto infekcí. Souprava MONOFLUO TM SCREEN INFLUENZA, PARA-INFLUENZA, ADENOVIRUS (kód 52217) se používá k potvrzení

4 nebo vyloučení přítomnosti některého z těchto virů ve vzorku přímou imunofluorescenční technikou v jednom kroku; v případě pozitivní reakce lze konkrétní virus identifikovat pomocí: MonoFluo TM Kit INFLUENZA (kód 52209). MonoFluo TM Kit PARA INFLUENZA (kód 52211). MonoFluo TM Kit PARA INFLUENZA 3 (kód 52212). MonoFluo TM Kit ADENOVIRUS (kód 52210). 2- PRINCIP TESTU Souprava MonoFluo TM Screen R.S.V. je určena k detekci respiračního syncyciálního viru (RSV) v infikovaných buňkách přímou imunofluorescenční metodou pomocí monoklonálních protilátek specifických pro RSV značených fluoresceinem. Tyto značené protilátky se váží na antigen exprimovaný v cytoplazmě infikovaných buněk, získaných ze vzorků obsahujících sekrety nebo buněčné exudáty z respiračního traktu, nebo po izolaci viru z buněčných kultur. Buňky, na které se vážou specifické monoklonální protilátky namířené proti virovým proteinům, vykazují zejména cytoplazmatickou fluorescenci zrnitou nebo vzhledu částeček při vyšetření fluorescenčním mikroskopem. 3- OBSAH SOUPRAVY Podmínky uchovávání a datum exspirace jsou uvedeny na štítku krabičky. Reagencie uchovávané při teplotě C v nepřítomnosti bakteriální kontaminace jsou stabilní až do data exspirace uvedeného na štítku (i po otevření). Štítek Složení reagencie Obsah R1 Conjugate Konjugát (hotový k použití): Monoklonální protilátka (myší) proti R.S.V. (klony 18 B2) značená fluorescein isothiokyanátem, Evansova modř. Konzervační činidlo: < 0,1 % azidu sodného. 1 x 2,5 ml (lavička s kapátkem) R2 Mounting medium Montovací médium (hotové k použití): Pufrovaný glycerol pro imunofluorescenci. Konzervační činidlo: < 0,1 % azidu sodného. 1 x 3 ml (lavička s kapátkem)

5 4- UPOZORNĚNÍ Kvalita výsledků závisí na dodržování následujících pravidel správné výrobní praxe: Nepoužívejte reagencie s prošlým datem exspirace. Během jednoho běhu testu nemíchejte a nekombinujte reagencie ze souprav s různým číslem šarže. Před použitím nechte všechny reagencie ustálit na pokojovou teplotu ( C). Používejte laboratorní sklo důkladně umyté a opláchnuté deionizovanou vodou nebo přednostně materiál na jedno použití. Pro každý vzorek použijte novou pipetovací špičku. Zkontrolujte kvalitu deionizované vody. Jsou-li patrné fluoreskující organismy u negativní kontroly, je nutné sterilizovat používanou vodu filtrací. Během barvení nenechte konjugát zaschnout na sklíčku. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY A OCHRANA ZDRAVÍ Používejte rukavice na jednorázové použití. Nepipetujte ústy. Všechny materiály, které se dostanou do přímého kontaktu se vzorky, považujte za kontaminované, tj. za infekční materiály. Zabraňte rozlití. Dodržujte vždy aktuálně platné techniky a upozornění týkající se ochrany proti mikrobiologickým rizikům a předpisy pro zacházení s materiály a biologickými produkty použitými k reakci a pro jejich odkládání. Azid sodný může reagovat s mědí nebo olovem v odpadním potrubí za vzniku vysoce výbušných azidů kovů. V případě odložení vylitím do výlevky vypláchněte odpadní potrubí velkým množstvím vody. 5- ODBĚR VZORKŮ Respirační syncytiální virus je svým výskytem omezen na sekrety a buněčné exsudáty z horní části respiračního traktu. K provedení přímé diagnózy pomocí fluorescence se odebírají odloupané buňky z nosních nebo tracheobronchiálních sekretů. Vzorky musí být zpracovány okamžitě.

6 Je-li zapotřebí izolovat virus z buněčných kultur, je možné použít imunofluorescenční techniku i na buňky infikované in vitro, a to ihned po detekci cytopatického účinku TECHNIKA ODBĚRU VZORKU R.S.V. se stanovuje ze vzorků obsahujících nosní nebo tracheobronchiální sekrety získané stěrem pomocí vatového tamponu Q-tip nebo odsátím nebo výplachem nosu pomocí pufrovaného roztoku PBS. Respirační sekrety lze přenést do laboratoře k přímému vyšetření vzorků imunofluorescencí. V případě izolace viru se sekrety odebírají do vhodného transportního média, které umožňuje zachování viru: přednostně do fyziologického roztoku nebo do pufrovaného média MEM (protože některé kmeny R.S.V. rychle ztrácejí svou infekční povahu v kyselém médiu) obohaceného některými látkami, které zajišťují ochranu virů, jako jsou hovězí albumin, želatina, kuřecí sérum, sacharóza a antibiotika. Příkladem je následující složení: MEM, hovězí albumin 5 mg/ml, HEPES 4,76 mg/ml, hydrogenuhličitan sodný 0,22 mg/ml, penicilin 1500 jednotek/ml, streptomycin 1000 µg/ml. Vzorky pro izolaci musí být přepravovány zmrazené nebo chlazené. Zásadním předpokladem je získání dostatečného množství sekretů. Respirační sekrety jsou zpravidla mukózní povahy, proto je zpravidla účinnější a vhodnější provádět odběr aspirací pomocí malé hadičky připojené jedním koncem k odběrové lahvi pomocí hadičky, zavedené do nosu dítěte. Tento systém je běžně dostupný pod označením nosní odsávačka. Není-li možné provést odsátí u lůžka dítěte, je vhodné použít stříkačku o velkém objemu (50 ml), ruční podtlakovou odsávačku nebo případně elektrický aspirační systém. V některých případech, například u bronchiolitidy, je nosní sliznice dítěte suchá a není možné získat dostatečné množství sekretů. V takovém případě je možné použít nosní výplach: několik milimetrů roztoku se nakape do jednoho nosního průduchu a tato tekutina se okamžitě odsaje. Nosní odsátí umožňuje ve většině případů odebrání minimálně 0,2 až 0,5 ml sekretů. Tento materiál se poté přenese do laboratoře nebo se umístí do vhodného transportního média pro izolaci viru v buněčné kultuře ZPRACOVÁNÍ VZORKŮ PŘED IMUNOFLUORESCENČNÍM VYŠETŘENÍM V laboratoři je nezbytné několikanásobné po sobě následující promytí aspirovaného materiálu pro získání suspenze nosních buněk bez hlenu.

7 Naředěním koncentrovaného roztoku ve sterilní destilované vodě připravte potřebný objem PBS pufru ke zpracování a promytí vzorku. Přidejte 5 ml PBS na přibližně 0,5-1 ml sekretů. Opatrně protřepejte. Centrifugujte 10 minut při 500 g (pokud možno při +2-8 C). Slijte tekutý supernatant (který lze použít k izolaci viru po přidání antibiotik). Přidejte k precipitátu 5 ml PBS a centrifugujte. Opakujte tento promývací krok dvakrát nebo třikrát, aby byl hlen zcela odstraněn. Po poslední centrifugaci přidejte k buněčnému precipitátu 1ml PBS. Homogenizujte suspenzi pomocí pipety. Naneste buňky na sklíčka. Proveďte fixaci a barvení buněk (viz barvící technika) IZOLACE VIRU V BUNĚČNÉ KULTUŘE Protože jsou některé z uvedených virů termolabilní, je třeba dbát, aby mezi odběrem vzorků a inokulací buněčné kultury nedocházelo k prodlevám. V laboratoři zamrazte a rozmrazte testované vzorky, aby došlo k popraskání buněk a uvolnění virových částic. Centrifugujte 10 minut při 500 g při teplotě +2-8 C pro odstranění buněčné drti (2000 rpm). Naočkujte získaný vzorek do buněčné kultury, určené pro tento účel. Používané buněčné linie jsou: Hep-2, HeLa nebo KB a dále diploidní buněčné linie z lidských embryonálních fibroblastů v médiu MEM obsahujícím 5-8 % fetálního telecího séra. Množství inokula a kultivačního média se liší v závislosti na nádobce použité ke kultivaci buněčné kultury. V případě použití Leightonových zkumavek naočkujte kulturu 0,3 ml vzorku. Nechte inkubovat po dobu 2,5 hodiny při 37 C a poté nařeďte pomocí kultivačního média na 1,2 ml. V případě použití lahvičky o objemu 25 cm 3 naočkujte 1 ml vzorku. Inkubujte při 37 C po dobu 2,5 hodiny, poté nařeďte kultivačním médiem na 12 ml. Inkubujte buňky při 37 C až je pozorován cytopatický efekt viru (přibližně 4 až 6 dnů). Pozorování cytopatického efektu Prohlížejte inokulované buňky pomocí inverzního fázového optického mikroskopu a sledujte vývoj cytopatického účinku. Proveďte barvení i tehdy, jestliže cytopatický účinek nebude patrný ani 6 dnů po inokulaci vzorku. Namnožení viru v této fázi může být dostačující k detekci imunofluorescenční metodou. Vhodná může být i druhá pasáž do buněčné kultury.

8 6- PRACOVNÍ POSTUP 6.1- NEZBYTNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Destilovaná nebo zcela deionizovaná voda. Chlornan sodný. Absorpční papír. Latexové rukavice na jednorázové použití. Fosfátový pufr (PBS) ph 7,2 pro IF (10X koncentrovaný) - 50 ml - kód Aceton. Sterilní Pasteurovy pipety. Automatické nebo poloautomatické, nastavitelné nebo fixní pipety pro pipetování objemů µl a 1 ml. Zkumavky se stupnicí o objemu 10 ml nebo 25 ml. Zkumavky na jednorázové použití. Centrifugační zkumavky. Sklíčka pro imunofluorescenční mikroskopii - kód (2 jamky) nebo (6 jamek). Krycí sklíčka. Fluorescenční mikroskop. Nádoba na infekční odpad PRACOVNÍ POSTUP Nanesení a fixace buněk Přímé vyšetření vzorku - Naneste 20 µl zpracovaného vzorku (zbytek po centrifugaci buněk) do jamky na sklíčku. - Vysušte vzorky na sklíčku fénem nebo je nechte zaschnout při pokojové teplotě ( C). - Proveďte fixaci v acetonové lázni při -20 C po dobu 5 minut. - Nechte sklíčka zaschnout na vzduchu. Buněčná kultura na sklíčku - Opláchněte sklíčko v PBS lázni dvakrát po dobu 1 minuty. - Nechte sklíčko zaschnout na vzduchu. - Proveďte fixaci v acetonové lázni při -20 C po dobu 5 minut. Buněčná kultura v lahvích - Odstraňte médium. Buňky seškrabejte do 1 ml PBS. - Resuspendujte buňky pomocí pipety několikanásobným nasátím a vyfouknutím.

9 - Poté naneste buňky a proveďte fixaci jako u přímého vyšetření vzorku Nanesení protilátky 1. Naneste po kapce specifické monoklonální protilátky (R1) do jamek a přitom dbejte na to, aby došlo k pokrytí celého kruhového povrchu jamky. 2. Inkubujte sklíčko po dobu 30 minut při 37 C ve vlhké komůrce. 3. Naředěním 10X koncentrovaného roztoku ve sterilní vodě připravte potřebné množství fosfátového pufru (PBS) k promývání. 4. Po uplynutí doby inkubace opatrně opláchněte sklíčko roztokem PBS pomocí střičky. 5. Promyjte dvakrát po dobu 2 až 5 minut roztokem PBS. Opatrně protřepejte. 6. Ponořte sklíčko (na několik sekund) do destilované vody. 7. Nechte sklíčko zaschnout na vzduchu. 8. Přiložte krycí sklíčko pomocí pufrovaného glycerolu (R2). Zkontrolujte, zda nejsou v preparátu vzduchové bubliny. Zafixujte sklíčko lakem. 7- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 7.1- KONTROLA KVALITY Obarvěte zároveň referenční sklíčko s použitím pozitivních a negativních buněk VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ Prohlídněte sklíčka pomocí fluorescenčního mikroskopu při zvětšení 100 x a 400 x. Pozitivní reakce: intracytoplasmatická granulární fluorescence mezi ostatními načervenalými buňkami; pozorování minimálně jedné charakteristicky fluoreskující buňky. Negativní reakce: není přítomna žádná fluoreskující buňka. Prohlédněte pečlivě všechny jamky. Poznámka: sklíčka prohlédněte okamžitě. Sklíčka však lze uchovávat v temnu při +2-8 C po dobu 24 hodin.

10 8- OMEZENÍ TESTU Diagnózu recentní infekce lze stanovit pouze na základě kombinace klinického vyšetření a sérologických údajů. Výsledek jednoho testu neposkytuje dostatečný důkaz pro diagnózu akutní infekce. 9- ÚČINNOST 9.1- CITLIVOST SPECIFIČNOST 283 vzorků (nosní, faryngeální a bronchoalveolární) odebraných od pacientů v nemocničním ošetření vykazujících symptomy akutní respirační infekce bylo testováno (přímým vyšetřením) pomocí dvou schválených referenčních testů pro detekci RSV (ELISA Ag capture test a přímý imunofluorescenční test dle Bartela) a pomocí testu MonoFluo TM Screen R.S.V. 42 vzorků, které reagovaly s oběma referenčními testy, bylo pozitivních i při použití testu MonoFluo TM Screen R.S.V. Relativní citlivost nebo shoda testu činila 100 %. 241 vzorků, které byly stanoveny jako negativní pomocí dvou referenčních testů, bylo rovněž negativních při použití testu MonoFluo TM Screen R.S.V. a relativní specifičnost testu činila 100 % podle výsledku této studie, zahrnující 241 vzorků KŘÍŽOVÉ REAKCE Nepřítomnost křížové reakce byla ověřena přímým vyšetřením buněk pěstovaných buněčných linií (Hep-2, Vero, HEL, MRC 5, HAF) infikovaných respiračními viry (virus parainfluenzy 1,2,3, virus chřipky A a B, CMV, Herpes 1 a Adenovirus). Abnormální reaktivita nebyla též prokázána na různých kmenech bakterií (Chlamydiae, Staphylococcus aureus a Escherichia coli). 10- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné reagencie jsou připravovány podle našeho systému jakosti, počínaje převzetím surovin až po finální komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propouštěna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá předem definovaným akceptačním kritériím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u společnosti Bio-Rad.

11 11- REFERENCES 1. FREYMUTH F., QUIBRIAC M., PETITJEAN J., DAON F., BESNARD A., PIERRE C.Mise en évidence des antigènes viraux par immunofluorescence : méthode rapide de détection et d'identification des virus respiratoires. Revue Française des Laboratoires, 1985, 137, GADNER P.S., MC QUILLIN J. Respiratory Syncytial Virus = Rapid virus diagnosis application of immunofluorescence. London, Butterworth, 1980, GOUYON J.B., POTHIER P., GUIGNIER F., SANDRE D., PUJOL P.H. et ALISON N. Problèmes posés par une épidémie à virus respiratoire syncytial dans un service de néonatalogie à propos de 23 cas. Méd. Hyg., LUCAS G., POTHIER P., DELAGNEAU J.F. Diagnostic rapide du Virus Respiratoire Syncytial (VRS) par immunofluorescence indirecte à l'aide d'anticorps monoclonaux. Biologie Prospective - 6ème colloque, 1985, Pont à Mousson, France. 5. POTHIER P., NICOLAS J.C., PRUDHOMME DE SAINT MAUR G., GHIM S., KAZMIERCZAK A. et BRICOUT F. Monoclonal antibodies against Respiratory Syncytial Virus and their use for rapid detection of virus in nasopharyngeal secretions. Journal of Clinical Microbiology, 1985, Vol. 21, n 2,

12 98

13 99

14 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2007 Fax.: +33 (0) code: