Kultivační metody v potravinářské mikrobiologii. Sabina Purkrtová

Transkript

1 Kultivační metody v potravinářské mikrobiologii Sabina Purkrtová

2 Mikrobiologické metody Analyt měřená komponenta vzorku Analyty v mikrobiologii mikroorganismy jako mikrobiální buňky části mikroorganismů např. DNA, proteiny produkty mikroorganismů např. enterotoxiny S. aureus Přítomnost nebo nepřítomnost analytu v určitém množství vzorku Kvalitativní metody Množství: dle legislativy EU obvykle 25 g (příp. příležitostně 10 g) Množství analytu Měřené přímo či nepřímo v určitém množství vzorku Kvantitativní metody Množství: dle legislativy EU obvykle 10 g

3 Typy metod 1. Mezinárodní, regionální či národní standardy převzaté od mezinárodně, regionálně či národně uznávaných autorit pro vývoj a validaci metod ISO, International Dairy Foods Association (IDFA), FDA (Food and Drug Administration), AIJN (European Fruit Juice Association), SZÚ (Státní zdravotní ústav, ČR) We're ISO, the International Organization for Standardization. We develop and publish International Standards. 2. Metody vyvinuté v laboratoři Metody (obvykle in vitro diagnostické testy) navržené, vyráběné a užívané v určité laboratoři 3. Nestandardní metody Převzaté z jiných zdrojů než z obecně uznávaných autorit pro vývoj a validaci metod Např. metody publikované v odborné vědecké literatuře, nepublikované laboratorní metody

4 Log 10 (počet buněk) Kultivační metody Klasické kultivační mikrobiologické metody studují mikroorganismy nikoliv jako jednotlivé buňky, ale jako populaci dceřiných buněk vzniklých dělením jedné buňky mateřské. Příklad: Přírůstek množství bakterií v exponenciální fázi (generační doba: 0.5 h) stevesbook/artifacts/images/chapter_002/section 002/typical_growth_curve_002.jpg Hod 4

5 Kultivační metody Tato populace mikroorganismů ( masa buněk ) je viditelná na ztuženém médiu jako kolonie Růst kolonie z jedné mateřské buňky (teoreticky) Video: om/watch?v=zrx7xg0g kq4 Dobře izolovaná kolonie rostoucí z jedné původní mateřské buňky ideální stav, ale pouze teoreticky (některé MO buňky v shlucích). Počet kolonií není proto označován jako odpovídající počtu buněk, ale jako odpovídající počtu kolonií tvořících jednotek (KTJ) Tato populace mikroorganismů je viditelná v tekutém médiu (bujón) Tato populace mikroorganismů je schopná dát detekovatelný signál v biochemických testech 5

6 Kultivační metody Schopnost mikroorganismů přežít a množit se (tj. být kultivovány, růst ) za daných environmentálních podmínek závisí na kompatibilitě mezi těmito podmínkami a fyziologickými a biochemickými vlastnostmi mikroorganismů. Fyzikální faktory teplota* ph* osmotický tlak* atmosféra* tlak záření (UV, γ...) Biologické faktory Vliv ostatních mikroorganismů (synergismus vzájemná podpora růstu, kompetice, antagonismus, symbióza, mutualismus ) VOLBOU KULTIVAČNÍCH PODMÍNEK LZE SELEKTIVNĚ VYBRAT SPEKTRUM MIKROORGANISMŮ, K JEJICHŽ PŘEDNOSTNÍMU POMNOŽENÍ BUDE DOCHÁZET Chemické faktory Nároky na výživu* Zdroj energie Zdroj C, N Zdroje dalších látek Antimikrobiální (bakteriocidní/bakteriostatické) a další chemické látky* Fyziologický stav ( fitness )* Kultivovatelné buňky v dobrém stavu poškozené či suprimované vnějšími podmínkami nekultivovatelné buňky *...Faktory běžně užívané nebo uvažované v kultivačních metodách potravinářské mikrobiologie 6

7 Kultivační metody obligate anaerobes: oxygen is toxic for them

8 Kultivační metody Teplotní rozsah růstu 27 kvasinek. Optimální růstová teplota je označena kolečkem. S., Saccharomyces Sc, S. cerevisiae; Sp, S. paradoxus; Smik, S. mikatae; Sarb, S.arboricolus; Scar, S.cariocanus; Su, S. bayanus var. uvarum; Sk, S. kudriavzevii; Km, Kluyveromyces marxianus; Pf, Pichia fermentans; Td,Torulaspora delbrueckii; Cs, Candida stellata; Hu, Hanseniaspora uvarum. Salvadó Z et al. Appl. Environ. Microbiol. 2011;77:

9 Kultivační metody Bacteria T min ( C) T opt ( C) T max ( C) Listeria monocytogenes Vibrio marinus Pseudomonas maltophilia Thiobacillus novellus Staphylococcus aureus Escherichia coli Clostridium kluyveri Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Bacillus flavothermus Thermus aquaticus Archaebacteria T min ( C) T opt ( C) T max ( C) Methanococcus jannaschii Sulfolobus acidocaldarius Pyrobacterium brockii Kultivační teplota pro kvasinky: 25 C. 9

10 Kultivační metody

11 Kultivační metody

12 Kultivační metody

13 Kultivační metody affectingthegrowthandsurvivalofmicro- organismsinfoods conversion-gate01/95/factors-affectingthe-growth-and-survival-of-microorganisms-in-foods jpg?cb=

14 Kultivační metody _ png Většina bakterií významných v klinické a potravinářské mikrobiologii, všechny kvasinky a plísně jsou chemoheteroorganotrofní: zdrojem uhlíku a energie a redoxních sloučenin jsou organické sloučeniny /acprof_ _graphic_012.gif 14

15 Kultivační média Dělení dle konzistence: Tekutá média (bujóny) buňka absorbuje živiny celým povrchem, lepší distribuce živin Tuhá média např. brambor, mrkve kultivace některých plísní Média ztužená agarem (polysacharid - agarosa 70 % + agaropektin 30 %, není hydrolyzován většinou bakterií) želatinou (hydrolyzát kolagenu) ztužená agarová média: 1-3 % agaru vznik jednotlivých kolonií poloztužená agarová média: 0,2-0,5 % - sledování motility média ztužená želatinou: test na ztekucování želatiny (např. Clostridium perfringens) Dělení dle složení: Média pro chemoheteroorgantrofní organismy musí obsahovat: zdroj uhlíku a energie (totožný), dusíku, u auxotrofů (nejsou schopni syntetizovat některé potřebné sloučeniny) též vitamíny a stopové prvky Syntetická (chemicky definovaná) je známo přesné chemické složení připravena z čistých chemikálií Komplexní média připravena z různých chemicky nepřesně definovaných materiálů a některých jednoduchých čistých chemikálií Dělení dle účelu kultivace 15

16 Kultivační média Různé mikroorganismy se v nárocích na výživu velice liší Výživově nenáročné mikroorganismy Např. E. coli snadno kultivovatelná Výživově náročné mikroorganismy (ang. fastidious): náročné na výživové podmínky 16

17 Kultivační média Komplexní média základní složky Různé přírodní materiály (=přesné chemické složení se liší v jednotlivých šaržích dle výrobce a způsobu přípravy) + některé jednoduché čisté chemikálie Produkty hydrolýzy různých druhů proteinů (maso, sója, želatina, kasein, rostlinná pletiva...) proteolytickými enzymy: pepsin (peptony), trypsin (tryptony), papain, pankreatin (pankreatická natrávenina...) = hlavní zdroj dusíku (též energie a uhlíku, ale utilizace je pomalejší) Kvasničný extrakt, extrakt z masa... Zdroj zvláště vitamínů a růstových faktorů (kvasničný extrakt B vitamíny) Zdroj energie a uhlíku, minoritně dusíku Další růstové faktory pro náročné mikroorganismy: Beraní/koňská krev, NADH+ Jednoduché sacharidy (glukóza, laktóza, maltóza...) zdroj uhlíku a energie Minerální soli: NaCl vhodné osmotické prostředí ( 0,85-0,90 % NaCl fyziologický roztok) Hydrogenfosforečnany a dihydrogenfosforečnany pufrovací systém udržování stabilního ph v průběhu kultivace SO 4-2, Ca 2+, Mg 2+, Fe 2+,3+, Mn 2+ aj. podpora růstu mikroorganismů 17

18 Kultivační média Dehydrated mixture prepared by the producer Ready-to-use Mixed from single parts 18

19 Kultivační média Univerzální kultivační média Vhodná pro růst všech mikroorganismů, kterým vyhovuje jejich nutriční složení (neobsahují žádná selektivní činidla) Selekce růstu mikroorganismů částečně volbou kultivační teploty, příp. atmosféru PCA (Plate Count Agar) pepton z kaseinu, masový extrakt, glukóza, agaragar; ph: 7.0 ± 0.2 při 25 C živný agar (Nutrient agar) pepton z masa, masový extrakt, agar-agar; ph: 7.0 ± 0.2 při 25 C trypton-sójový agar (Tryptic soy agar) pepton z kaseinu, pepton ze sójové drtě, NaCl, agar-agar; ph: 7.3 ± 0.2 při 25 C trypton-sójový bujón (Tryptic soy broth) - pepton z kaseinu, pepton ze sójové drtě, glukóza, K 2 HPO 4 (pufrovací aktivita v průběhu růstu), NaCl; ph: 7.3 ± 0.2 při 25 C pufrovaná peptonová voda (Buffered Peptone water) - pepton z kaseinu, glukóza, Na 2 HPO 4.12 H 2 O, KH 2 PO 4 (pufrovací aktivita v průběhu růstu), NaCl; ph: 7.0 ± 0.2 při 25 C 19

20 Živný agar (Nutrient Agar) 20

21 Kultivační média Obohacená univerzální kultivační média Obohacená některými dalšími živiny (krev, extrakty...) pro podporu růstu mikroorganismů, včetně výživově náročnějších Columbia agar pepton z kaseinu, pepton z masa, srdcový extrakt, kvasničný extrakt, škrob, NaCl, agar-agar; ph: 7.3 ± 0.2 při 25 C Columbia agar s 5 % beraní krve k základu po ochlazení na 45 C přidána beraní krev (např. 95 ml + 5 ml) možnost sledování hemolýzy též Čokoládový agar k základu po ochlazení na 45 C přidána beraní krev a směs povařena 10 min při 80 C do zhnědnutí (např. 90 ml + 10 ml) Mozko-srdcová infúze (BHI) mozko-srdcový extrakt, pepton, glukóza, NaCl, Na 2 HPO 4 ; ph: 7.4 ± 0.2 při 25 C 21

22 Columbia Agar s 5 % beraní krve Escherichia coli Streptococcus pyogenes

23 Brain Heart Infusion Broth

24 Kultivační média Selektivní kultivační média Cíl: Selektivní kultivace pouze vybrané skupiny mikroorganismů Růst ostatních nežádoucích skupin mikroorganismů je potlačen přídavkem selektivních činidel, případně složení média, ph a volbou kultivačních podmínek, která jsou pro tyto nežádoucí skupiny letální Selektivní činidla: Povrchově aktivní látky: žluč a žlučové soli, lauryl suflát sodný, tergitol Antibiotika: výběr závisí na nežádoucí skupině mikroorganismů Anorganické soli: chlorid lithný (inhibuji G- a enterokoky), tetrathionát (inhibuje G+ a koliformní bakterie), azid sodný (inhibuje G-) Barviva: krystalová violeť, briliantová zeleň, malachitová zeleň... Pomnožovací média: Navržena pro zvýšení počtu mikroorganismů na detekovatelnou úroveň Neselektivní Selektivní 24

25 Kultivační média Diferenciační (diagnostická) média Cíl: Odlišit kolonie cílové skupiny mikroorganismů od ostatních na základě některé typické biochemické reakce Např. A) fermentace cukrů za vzniku kyseliny (změna ph) a/nebo plynu (Durhamova plynovka) B) degradace některých sloučenin (např. dekarboxylace) obvykle změna ph C) tvorba určitých sloučenin za vzniku precipitátu (např. tvorba sirovodíku) D) změna barvy nebo fluorescence kolonií vzhledem k degradaci chromogenních nebo fluorogenních substrátů přímá detekce enzymu Typickým detekčním systémem je použití acidobazických indikátorů změna barvy kolonií v závislosti na ph média. Selektivně diferenciační (diagnostická) média Potlačují růst nežádoucích skupin mikroorganismů Umožňují selektivní růst cílového mikroorganismu a zároveň souběžně s vizuálním odlišením jeho kolonie 25

26 Acidobazické indikátory Chemické sloučeniny měnící barvu dle ph General.gif

27 Selektivně-diagnostická kultivační média Složení (g/l) Pepton (z masa a kaseinu) 3.0 Pankreatická natrávenina želatiny 17.0 NaCl Žlučové sole 1.5 Krystalová violeť Laktóza monohydrát 10.0 Neutrální červeň Agar ph po sterilizaci (při 25 C) 7.1±0.2 Pepton (z masa a kaseinu) Pankreatická natrávenina želatiny: Zdroj dusíku a vitamínů NaCl: osmotická rovnováha MacConkey Agar Agar pro selektivní izolaci a odlišení laktózu fermentujících a nefermentujících Enterobacteriaceae = selektivnědiagnostické médium pro koliformní bakterie Selektivní působení krystalové violeti a žlučových solí inhibuje růst většiny druhů G+ bakterií (např. S. aureus neroste) G- bakterie, zvláště enterobakterie (žijící v zažívacím traktu) rostou dobře.

28 MacConkey Agar Selektivně-diagnostická kultivační média Kmeny fermentující laktózu (koliformní bakterie) rostou červeně nebo růžově, s možnou zónou precipitované žluči Kmeny nefermentující laktózu (Shigella, Salmonella, Proteus...) jsou bezbarvé a typicky neodlišitelné vzhledem od média ph po sterilizaci (při 25 C) 7.1±0.2 Složení (g/l) Pepton (z masa a kaseinu) 3.0 Pankreatická natrávenina želatiny 17.0 NaCl Žlučové sole 1.5 Krystalová violeť Laktóza monohydrát 10.0 Neutrální červeň Agar Diagnostická složka: fermentace laktózy za vzniku kyseliny vede k poklesu ph a změně acidobazického indikátoru (neutrální červeň) při ph nižším než 6.8 ze žluté na červenou XaGKyJzCBPk/UgS8FU96L3I/ AAAAAAAAAt8/7B6bSjxLjjI/s 1600/lol.PNG

29 Chromogenní kultivační média Obsahují jeden nebo více chromogenních substrátů (substrát pro specifický enzym s připojeným chromoforem) Umožňují detekci specifických enzymů, schopných odštěpit z chromogenního substrátu chromofor (změna barvy) Koliformní bakterie (MPN metoda) YUpHuBzWmdbKoWQ79qbh3nLIhZ18ww CHROMOGENNÍ MÉDIUM (Colilert): Koliformní bakterie mají enzym β-galactosidasu a jsou schopny z ONPG odštěpit chromofor (o-nitrofenol) změna barvy na žlutou z bezbarvé.

30 Fluorogenní kultivační média Obsahují jeden nebo více fluorogenních substrátů (substrát pro specifický enzym s připojeným fluoroforem) Umožňují detekci specifických enzymů, schopných odštěpit z fluorogenního substrátu fluorofor (fluorescence po ozáření UV) E. coli (MPN metoda) FLUOROGENIC MEDIUM (Colilert): E. coli (96-97 % kmenů mimo některé patogenní sérotypy) má enzym β-d-glucuronidasu, který je schopen rozštěpit MUG a vykazovat tak fluorescenci (UV 360 nm).

31 Produktivita (P R productivity ratio) vyjadřuje schopnost růstu mikroorganismu v testovaném médiu ve srovnání se schopností růstu na referenčním médiu Pro kvantitativní vyjádření je definována následně: Produktivita Neselektivní médium (referenční) 0.2 ml P R =N S / N O N S médiu N O - celkový počet KTJ na testovaném celkový počet KTJ na příslušném referenčním médiu (min. 100 KTJ) Správný počet buněk (0.2 ml) Hodnoty P R neselektivní média..min. 0,7 selektivní média min. 0,1 Selektivní médium

32 Selektivita Selektivita (S F ) demonstruje, že médium je schopno potlačit růst nežádoucích mikroorganismů Neselektivní médium 0.2 ml Nejsou necílové mikroorganismy (doprovodná mikroflóra) schopny též růstu? Správný počet buněk (0.2 ml) Selektivní médium

33 Specifita Specificita (fyziologická charakteristika) Specifita kultivačního média označuje jeho schopnost rozlišit příbuzné organismy na základ přítomnosti/nepřítomnosti nebo míry biochemické odpovědi a velikosti kolonií a jejich morfologii. Cílový mikroorganismus roste na daném médiu ve shodě se specifikací. Jednotlivé kmeny stejné skupiny se mohou lišit testováno proto více kmenů dané skupiny. Bude mít vždy cílový mikroorganismu pozitivní reakci? Cílový mikroorganismus Dává očekávanou reakci

34 Kultivační metody stanovení počtu MO ZPRACOVÁNÍ VZORKU Plotnové metody a MPN (tekuté a tuhé vzorky) Tuhé vzorky - resuspenze vzorku ve vhodném dilučním roztoku (1:10) desítkové ředění Filtrace (tekuté vzorky) Filtrace vzorku, příp. po vhodném naředění IZOLACE NA SELEKTIVNÍ/NESELEKTIVNÍ MÉDIA Plotnové metody - výsev roztěrem či přelivem MPN inokulace tekutého média Filtrace přenos filtru na povrch ztuženého média SUB-IZOLACE PRESUMPTIVNÍCH KOLONIÍ ZE SELEKTIVNÍCH NA NESELEKTIVNÍ MÉDIA Mikrobiální kultury rostoucí na selektivních médií nejsou vhodné pro biochemické testování selektivní médiu snižuje fitness i cílových bakterií a jejich fenotypové vlastnosti, což interferuje s přesností a spolehlivostí testů KONFIRMACE/IDENTIFIKACE PRESUMPTIVNÍCH KOLONIÍ

35 Kultivační metody stanovení počtu MO VZOREK DESÍTKOVÉ ŘEDĚNÍ IZOLACE VZOREK: obvykle 10 g nebo 10 ml (1X) DILUČNÍ MÉDIUM: např. fyziologický roztok s peptonem, pufrovaná peptonová voda (prostředí neovlivňující počet MO) Ředěno 1:9 1. ředění sterilní sáček (10 g/ml + 90 ml; 1X + 9X), resuspenze/smíšení Následující ředění zkumavky (1 ml suspenze + 9 ml dilučního média) KULTIVACE POČÍTÁNÍ KOLONIÍ 1:10 1:100 1:1000 1: : : SUB-IZOLACE PRESUPMTIVNÍCH KOLONIÍ KULTIVACE A KONFIRMAČNÍ TESTY VÝSLEDEK

36 Kultivační metody stanovení počtu MO VZOREK DESÍTKOVÉ ŘEDĚNÍ IZOLACE Izolace = inokulace vybraných ředění (výběr dle limitu výskytu MO v potravině) + kultivace o Roztěrem na povrch média v Petriho misce (obvykle 0.1 nebo 0.2 ml) o Přeliv suspenze v prázdné Petriho misce sterilním rozehřátým ztuženým médiem při teplotě 45 C (obvykle 1 ml) KULTIVACE 1:100 1:1000 1: : : POČÍTÁNÍ KOLONIÍ SUB-IZOLACE PRESUPMTIVNÍCH KOLONIÍ KULTIVACE A KONFIRMAČNÍ TESTY VÝSLEDEK

37 Inokulační metody Metoda přelivu dává lepší výsledky pro fakultativně anaerobní mikroorganismy než metoda roztěru Metoda roztěru užívána pro aerobní mikroorganismy al%20growth%20ss5.htm Izolace čárkováním istry330/fall2004/abickert/images/streak.gif

38 Kultivační metody stanovení počtu MO VZOREK DESÍTKOVÉ ŘEDĚNÍ IZOLACE KULTIVACE Kultivace: čas a teplota závisí na MO a metodě Počítání kolonií: limit KTJ obvykle pro stanovení počtu všech mikroorganismů (neselektivní média), pro stanovení počtu presumptivních/typických/atypických kolonií (selektivní média) Konfirmace: výběr až 5 presumptivních/typických/atypických kolonií, pokud přítomny, z každé plotny použité k výpočtu Konfirmace biochemickými testy (viz selektivita a specifita média) Výsledek: A.B x 10 c KTJ/g, ml (např. 5.2 x 10 4 KTJ/g, ml) POČÍTÁNÍ KOLONIÍ SUB-IZOLACE PRESUPMTIVNÍCH KOLONIÍ (ADAPTED S.P.) KULTIVACE A KONFIRMAČNÍ TESTY VÝSLEDEK

39 Čeleď Enterobacteriaceae Gramnegativní fakultativně anaerobní rovné tyčinky, některé z nich pohyblivé Většina rodů roste dobře při 37 C, ačkoliv některé rostou lépe při C Fermentují glukózu, oxidáza negativní Schopny růst v přítomnosti žlučových solí Koliformní bakterie Fermentují laktózu (přítomnost enzymu β-galaktosidáza) Enterobacteriaceae VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukóza) Agar VČŽL (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Laktóza) Agar Agar dle MacConkey, ENDO agar, Chromocult Coliform agar Escherichia coli Většina kmenů (mimo některé patogenní kmeny cca 3-4 %) produkuje enzym β-d-glukuronidázu Tvorba indolu z tryptofanu TBX

40 VČŽG VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukosa) Agar půda s krystalovou violetí, violetovou červení, žlučí a glukózou Selektivní půda pro Enterobacteriaceae Escherichia coli ATCC 8739 Typické složení (l): pepton 7 g; kvasničný extrakt 3 g, chlorid sodný 5 g; D(+) glukosa 10 g; směs žlučových solí 1,5 g; methylčerveň 0,03 g; krystalová violeť 0,002 g; agar-agar 13 g. Selektivní složka Krystalová violeť inhibuje růst doprovodné grampozitivní bakteriální flóry ze vzorku. Žlučové kyseliny inhibují růst doprovodné mikroflóry a selektivně podporují růst Enterobacteriaceae Diagnostická složka Fermentace glukosy produkce kyselin je indikována změnou barvy přidaného acidobazického indikátoru methylčerveně. Půda není pro Enterobacteriaceae zcela specifická stejný vzhled mohou vykazovat např. aeromonády. Vzhled kolonií Červené, obklopené načervenalou precipitační zónou či bez zóny Bezbarvé Mikroorganismy Enterobacteriaceae a jiné Žádné Enterobacteriaceae nejsou přítomné Shigella flexneri ATCC 29903

41 Enterobacteriaceae ČSN ISO (560096) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metody pro průkaz a stanovení počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae - Část 2: Technika počítání kolonií Vzorek 0. ředění 10 g vzorku + 90 ml ŘR** - 1. ředění 1 ml (-1. ředění) + 9 ml ŘR** - 2. ředění. 1 ml (-(X+1). ředění + 9 ml ŘR** - X. ředění Příprava vzorku a desítkové ředění* Přeliv 1 ml půdou VČŽG*** VČŽG VČŽG VČŽG VČŽG VČŽG VČŽG VČŽG VČŽG Kultivace: 37 C, 24 h±2 h Izolace na selektivní ztužená média 1. den Výběr typických (příp. atypických) kolonií pro konfirmaci Přeočkování až 5 náhodně vybraných typických (příp. atypických) kolonií živný agar, 37 C, 24±3 h Přeočkování na neselektivní agar 2. den Biochemické testy: test na oxidázu, fermentace glukózy - glukózový agar (37 C, 24 h) Vyhodnocení biochemických testů Výpočet a vyjádření výsledku Konfirmační testy Vyhodnocení testů 3. den 4. den *Minimálně minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele **ŘR..ředící roztok PPV ***1 ml testované suspenze přelít půdou VČŽG temperovanou na 44 C 47 C, doba od zaočkování inokula a přelití inokula půdou nesmí přesáhnout 15 minut. Nejdříve asi 10 ml, po úplném ztuhnutí půdy převrstvit dalšími 15 ml vytvoření semi anaerobního prostředí.

42 Průkaz oxidázy Průkaz cytochromoxidáza/oxidáza Průkaz enzymů, který se podílí na oxidativních procesech v bakteriální buňce, přítomny u všech aerofilních bakterií s respiračním metabolismem. Podstata testu je reakce derivátů p-fenylendiaminu se železem obsaženým v cytochromových respiračních komlexech. Přítomnost cytochromoxidázy je detekována barevnými reakcemi pomocí příslušných činidel. Postup kultura je přenesena na plochu navhlčenou činidlem pomocí platinové či plastové kličky (nikoliv železné! možná falešně pozitivní reakce), produkce oxidázy dojde ke vzniku sytě fialové až modré barvy do cca s v závislosti na formátu testu Oxidáza pozitivní G- bakterie (OXI +) Pseudomonas sp., Aeromonas sp. Oxidáza negativní G- bakterie (OXI -) Čeleď Enterobacteriaceae, Acinetobacter sp.

43 Enterobacteriaceae ČSN ISO konfirmace a výpočty Typický vzhled (červené kolonie, obklopené načervenalou precipitační zónou či bez zóny) mohou mít na této půdě (OXI...test na oxidasu, GLU...fermentace glukózy) nejenom Enterobacteriaceae (OXI -, GLU +) ale i další G- bakterie fermentující glukózu např. Aeromonas (OXI +, GLU +) příp. i G- bakterie, které glukózu oxidují např. Strenotrophomonas sp. (OXI -, GLU -) Konfirmace potvrzení schopnosti fermentovat glukózu (anaerobní podmínky vpich do glukózového agaru) (GLU +) nepřítomnost oxidasy (OXI -) Konfirmace se provádí vždy pouze u reprezentativního počtu 5 kolonií (pokud kolonií méně než 5, konfirmace se provádí u všech) z každé plotny použité k výpočtu. Pro výpočet se vybírají plotny obsahující méně než 150 charakteristických (typických) kolonií a méně než 300 kolonií celkem. Mezní limit pro nízké počty je roven 15. Vzhledem k tomu, že některé Enterobacteriaceae mohou způsobovat odbarvení kolonií nebo půdy, vybere se pět bělavých kolonií pro konfirmaci, i v případě, že nejsou přítomny žádné charakteristické kolonie. 43

44 Stanovit koeficient konfirmovanosti pro typické a atypické kolonie Konfirmovaná kolonie = OXI -, GLUKÓZA + k typické = b typické A typické Enterobacteriaceae- výpočet k atypické = b atypické A atypické Př. Na plotně 50 typických kolonií (c typické ) a 4 atypické kolonie (c atypické ). Na konfirmaci vzato 5 typických kolonií. Čtyři z nich byly OXI a GLU +. Na konfirmaci vzaty 4 atypické kolonie. Žádná nebyla OXI a GLU +. k typické = 4 5 =0,8 k atypické = 0 4 =0 A..počet typických (či atypických) kolonií vzatých na konfirmaci b...počet konfirmovaných typických (či atypických) kolonií a = (k typické )*(c typické ) + (k atypické )*(c atypické ) = 0,8*50 + 0*4 = 40 Na dané plotně je tedy celkem 40 KTJ potvrzených (konfirmovaných) typických a atypických kolonií. Tento počet se poté používá ve vzorcích uvedených viz Escherichia coli ČSN ISO výpočty. 44

45 VČŽL Escherichia coli ATCC VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukosa) Agar půda s violetovou červení, žlučí a glukózou Selektivní půda pro Enterobacteriaceae a odlišení koliformních Typické složení (l): pepton 7 g; kvasničný extrakt 3 g, chlorid sodný 5 g; D(+) glukosa 10 g; směs žlučových solí 1,5 g; methylčerveň 0,03 g; krystalová violeť 0,002 g; agar-agar 13 g. Selektivní složka Krystalová violeť inhibuje růst doprovodné grampozitivní bakteriální flóry ze vzorku. Žlučové kyseliny inhibují růst doprovodné mikroflóry a selektivně podporují růst Enterobacteriaceae Diagnostická složka Fermentace laktózy produkce kyselin je indikována změnou barvy přidaného acidobazického indikátoru methylčerveně. Escherichia coli ATCC Salmonella gallinarum NCTC 9240 Vzhled kolonií Červené, obklopené načervenalou precipitační zónou či bez zóny Malé červené kolonie ( tečky ) Bezbarvé Mikroorganismy koliformní bakterie Příležitostně enterokoky laktóza negativní enterobakterie a jiné

46 Endo Agar Složení (l): Peptická natrávenina zvířecí tkáně 10.0 g, Laktóza 10.0, Hydrogenfosforečnan draselný 3,5, Siřičitan sodný 2.5, Základní fuchsin 0.5, Agar 15.0, ph 7,4 ± 0,2 Selektivně-diagnostické médium pro izolaci a rozlišení druhů Enterobacteriaceae a dalších gramnegativních tyček z klinických vzorků či vyšetření potravin. Selektivní složka: siřičitan sodný a základní fuchsin (částečné potlačení Gram pozitivních mikroorganismů) Shigella flexneri ATCC Diagnostická složka: Koliformní bakterie fermentace laktózy - tmavě růžové až středně červené kolonie s měňavým nazelenalým kovovým leskem a podobným zabarvením média. E. coli dochází ke krystalizaci fuchsinu nazelenalý metalický lesk. Kolonie organismů, které nefermentují, jsou na světle růžovém pozadí média bezbarvé až narůžovělé. 46

47 Endo Agar

48 ChromoCult Coliform Agar Selektivní agar pro simultánní detekci koliformů a E. coli v pitné vodě a potravinách Typical Composition (g/litre) Peptone 3.0; sodium chloride 5.0; sodium dihydrogen phosphate 2.2; di-sodium hydrogen phosphate 2.7; sodium pyruvate 1.0; tryptophan 1.0; agar-agar 10.0; Sorbitol 1.0; Tergitol ; 6-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside 0.2; 5- bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-d-glucuronic acid 0.1; isopropyl-beta- Dthiogalactopyranoside 0.1. ph: 6.8 ± 0.2 at 25 C. Escherichia coli ATCC Identifikace koliformů Salmon-GAL štěpen β-d-galactosidasou charakteristický pro koliformy lososové až červené kolonie Identifikace E. coli X-glucuronide štepen β-d-glucuronidasou charakteristické pro E. coli. E. coli též štěpí Salmon-GAL tmavěmodré až fialové kolonie. Citrobacter freundii ATCC 8090

49 TBX Chromocult TBX agar (trypton bile X-glucuronid)=chromogenní půda Escherichia coli ATCC Escherichia coli DSMZ 502 Složení (l): pepton 20 g; žlučové soli No. 3 1,5 g; X-ß-D-glukuronid 0,075 g; agar-agar 15 g. Selektivně-diagnostické chromogenní médium pro β-d-glukuronidáza pozitivní kmeny E. coli Inhibiční složka: Růst doprovodné mikroflóry je inhibován přídavkem žlučových solí a kultivační teplotou 44 C (E. coli schopna růst, ostatní Enterobacteriaceae obvykle nikoliv). Diagnostická (chromogenní složka) E. coli se odlišuje od ostatních koliformních bakterií syntézou enzymu β-dglukuronidázy, který je schopen štěpit chromogenní substrát 5-bromo-4- chloro-3-indolyl-d-glukuronid (X-ß-D-glukuronid). Dochází ke štěpení vazby mezi chromoforem 5-bromo-4-chloro-3-indolyl a D-glukuronidem, odštěpení chromoforu vede k modrozelenému zbarvení kolonií E. coli. Vzhled kolonií Mikroorganismy modrozelené E. coli indikace přítomnosti β-dglukuronidázy Bezbarvé glukuronidáza negativní E. coli (3-4 % kmenů) schopné růstu při 44 C (např. E. coli O157) (další glukuronidáza negativní E. coli jako E. coli O157:H7 při 44 C nejsou schopny růst)

50 Escherichia coli ČSN ISO (560079) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu betaglukuronidázopozitivních Escherichia coli - Část 2: Technika počítání kolonií vykultivovaných při 44 C s použitím 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-d-glukuronidu Vzorek 0. ředění 10 g vzorku + 90 ml ŘR** - 1. ředění 1 ml (-1. ředění) + 9 ml ŘR** - 2. ředění. 1 ml (-(X+1). ředění + 9 ml ŘR** - X. ředění Příprava vzorku a desítkové ředění* TBX TBX Přeliv 1 ml půdou TBX*** TBX TBX TBX TBX TBX Izolace na selektivní ztužená média 1. den TBX Kultivace: 44 C, hodin Odečet typických kolonií (biochemická reakce, která je základem vzhledu kolonií, je považována za natolik specifickou, že není prováděna konfirmace) Výpočet a vyjádření výsledku Vyhodnocení 2. den *Minimálně minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele **ŘR..ředící roztok PPV ***1 ml testované suspenze přelít asi 15 ml půdy TBX temperované na 44 C 47 C.

51 Escherichia coli ČSN ISO výpočty Předpoklad: Modrozelený vzhled kolonií je důsledek aktivity β-d-glukuronidázy z mikroorganismů schopných růstu za daných kultivačních podmínek pouze E. coli má tento enzym (další např. rody Clostridium, Peptostreptococcus či Staphylococcus) = VŠECHNY MODROZELENÉ KOLONIE JSOU UVAŽOVÁNY JAKO KOLONIE E. COLI MAXIMUM POČITATELNÝCH KOLONIÍ = 150 KTJ/PLOTNA A) > 150 typických kolonií na všech inokulovaných plotnách Více než 150/(d x V) β-glukuronidáza pozitivních E. coli v mililitru nebo gramu d.ředící faktor nejvyššího inokulovaného ředění, V objem inokula (pro X. ředění : d=10 -X, pokud použit i přímo vzorek např. tekuté výrobky d=10 0 =1 Příklad Ředění Počet typických KTJ (modrozelené) 1. > 150, > 150 > 150, > > 150, > , > 150, > , 19 B) Plotny dvou po sobě jdoucích ředění v paralele > 15 typických kolonií alespoň na jedné plotně < 150 typických kolonií na každé plotně Σa..součet typických kolonií ze všech ploten zvolených k výpočtu V..objem inokula v ml očkovaného na každou z ploten n 1 počet ploten zvolených k výpočtu z prvního (nižšího) vybraného ředění n 2 počet ploten zvolených k výpočtu z druhého (vyššího) vybraného ředění d.ředící faktor odpovídající prvnímu vybranému ředění ( nižší ředění s vyšší koncentrací KTJ), které bylo vybráno k výpočtu (např. v případě použití 1. a 2. ředění se d=10-1 ) 4. > 150, > 150 1, 3 Výsledek Více než 150/(10-4 x 1) = více než 1,5*10 6 KTJ/ml a N V ( n1 0,1n2 ). d * 2 0,1*2 * 10 = 1,1*10 4 KTJ/ml KTJ/ml, g 51

52 Celkový počet mikroorganismů ČSN EN ISO 4833 (560083) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda pro stanovení celkového počtu mikroorganismů - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 C Vzorek 0. ředění 10 g vzorku + 90 ml ŘR** - 1. ředění 1 ml (-1. ředění) + 9 ml ŘR** - 2. ředění. 1 ml (-(X+1). ředění + 9 ml ŘR** - X. ředění Příprava vzorku a desítkové ředění* PCA PCA Přeliv 1 ml půdou PCA*** PCA PCA PCA PCA PCA Izolace na neselektivní ztužená média 1. den PCA Kultivace: 30 C, 72 h±3 h Odečet kolonií Výpočet a vyjádření výsledku Vyhodnocení 4. den *Minimálně minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele. je-li to vhodné a možné, zvolí se takový stupeň ředění, která poskytnou počty kolonií mezi 15 a 300 na misku. **ŘR..ředící roztok PPV ***1 ml testované suspenze přelít asi ml půdy PCA temperovanou na 44 C 47 C, doba od zaočkování inokula po přelití inokula půdou nesmí přesáhnout 45 minut. Pouze v případě očekává-li se výskyt mikroorganismů, jejichž kolonie přerůstají povrch půdy, přelije se ztuhlá vrstva dalšími 4 ml půdy pro převrstvení.

53 PCA Univerzální kultivační média PCA (Plate Count Agar) pepton z kaseinu, kvasničný extrakt, glukóza, agar-agar; ph: 7.0 ± 0.2 při 25 C (agar s kaseinem, kvasničným extraktem a glukózou) (agar pro počítání kolonií kultivovaných při 30 C) B. subtilis 53

54 CPM: ČSN EN ISO výpočty MAXIMUM POČITATELNÝCH KOLONIÍ = 300 KTJ/PLOTNA (NÍZKÉ POČTY: MÉNĚ NEŽ 15 KTJ) A) > 300 typických kolonií na všech inokulovaných plotnách Více než 300/(d x V) mikroorganismů kultivovaných při 30 C v mililitru nebo gramu d.ředící faktor nejvyššího inokulovaného ředění, V objem inokula (pro X. ředění : d=10 -X, pokud použit i přímo vzorek např. tekuté výrobky d=10 0 =1 B) Plotny dvou po sobě jdoucích ředění v paralele > 15 kolonií alespoň na jedné plotně < 300 kolonií na každé plotně Σa..součet typických kolonií ze všech ploten zvolených k výpočtu a N V ( n1 0,1n2 ). d KTJ/ml, g V..objem inokula v ml očkovaného na každou z ploten n 1 počet ploten zvolených k výpočtu z prvního (nižšího) vybraného ředění n 2 počet ploten zvolených k výpočtu z druhého (vyššího) vybraného ředění d.ředící faktor odpovídající prvnímu vybranému ředění ( nižší ředění s vyšší koncentrací KTJ), které bylo vybráno k výpočtu (např. v případě použití 1. a 2. ředění se d=10-1 ) C) Méně než 15 kolonií na obou plotnách nejnižšího použitého ředění = odhad nízkých počtů C N Σa..součet typických kolonií ze všech ploten zvolených k výpočtu E KTJ/ml, g V n d V..objem inokula v ml očkovaného na každou z ploten n počet ploten zvolených k výpočtu z nejnižšího vybraného ředění d.ředící faktor odpovídající nejnižšímu vybranému D) žádné kolonie na žádných plotnách Méně než 1/(d x V) mikroorganismů kultivovaných při 30 C v mililitru nebo gramu d.ředící faktor nejnižšího (tj. nejvíce koncentrovaného) použitého ředění V..objem inokula v ml očkovaného na každou z ploten 54

55 3M Petrifilm Count Plates an all-in-one plating system made by the Food Safety Division of the 3M Corporation cost-effectiveness, simplicity, convenience, and ease of use

56 3M Petrifilm Count Plates - principle 3M Petrifilm Count Plates: Coating technology 1. Top Film Plastic Film coated with adhesive, indicator and cold water soluble gel. 2. Bottom Film Plastic coated paper printed with a grid, adhesive standard methods nutrients, cold water soluble gel.

57 3M Petrifilm Coliform Count Plates Koliformní bakterie fermentace laktózy za vzniku kyseliny a plynu VČŽL dehydratované médium Červeně až fialově zbarvené kolonie Umožněna však též detekce tvorby plynu (plyn je zachycen vrchním filmem) Vyšší specifita stanovení

58 Stanovení počtu metodou filtrace 1. KROK FILTRACE TEKUTINY (OBVYKLE 100 ML) 2. KROK PŘENOS FILTRU SE ZACHYCENÝMI MIKROORGANISMY NA SELEKTIVNÍ MÉDIUM 3. KROK KONFIRMACE TYPICKÝCH KOLONIÍ

59 Laktózový TTC agar s tergitolem TTC ze spodu Zvrchu Reálný vzorek 59

60 Stanovení počtu metodou MPN 1. KROK PŘÍPRAVA VÝCHOZÍ SUSPENZE TESTOVANÉ POTRAVINY A DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ 2. KROK INOKULACE VÝCHOZÍ SUSPENZE A JEDNOTLIVÝCH ŘEDĚNÍ DO SÉRIE PO 3, 5, 10 ČI 15 ZKUMAVKÁCH SE SELEKTIVNÍ POMNOŽOVACÍ PŮDOU (SPP) 10 g vzorku + 90 ml diluentu 10 ml 2X SPP + 10 ml výchozí suspenze = 1 g/ zkumavka (2x dvojnásobná koncentrace média z důvodu vysokého ředění vzorkem) 10 ml 1X SPP + 1 ml výchozí suspenze=0.1 g/ zkumavka 10 ml 1X SPP + 1 ml 2.ředění výchozí suspenze =0.01 g/ zkumavka 10 ml 1X SPP + 1 ml 3.ředění výchozí suspenze=0.001 g/zkumavka etc. 3. KROK KONFIRMACE ZKUMAVEK SE ZÍSKANOU POZITIVNÍ REAKCÍ Předpoklad: o v tekutém médiu je distribuce buněk uniformní, nejsou spojeny ve shluky, k detekovatelnému růstu (=projevuje se pozitivní reakcí) dochází i kdyby pouze jedna životaschopná buňka byla ve zkumavce) Metoda nedává příliš přesné výsledky, avšak umožňuje i rozbor tuhých nebo nefiltrovatelných vzorků s nízkým obsahem mikroorganismů (< 10 CFU/g). o Jaká je pravděpodobnost, že při X KTJ/ml suspenze, bude v A případech odebrána alespoň jedna buňka v daném objemu (poz.) a v B případech naopak žádná (neg.) = odhad počtu bakterií na základě statistiky o Zde pro vyhodnocení získán číselný kód 4-2-1

61 Stanovení počtu metodou MPN ve vzorku o objemu V je 1 částice (buňka) pravděpodobnost, že se tato částice (buňka) nebude vyskytovat ve vzorku o objemu ν ve vzorku o objemu V je b částic (buněk) pravděpodobnost, že se žádná částice (buňka) nebude vyskytovat ve vzorku o objemu ν pokud ν/v je malé, lze aproximovat b/v je densita (koncentrace) - δ ve vzorku o objemu V je b částic (buněk) pravděpodobnost, že se bude alespoň jedna částice (buňka) vyskytovat ve vzorku o objemu ν odběr n vzorků o objemu ν ze vzorku o celkovém objemu V a densitě (koncentraci) δ pravděpodobnost, že s vzorků z n vzorků bude obsahovat alespň alespoň jednu částici (pozitivní reakce) MPN hledání denzity (koncetrace) δ, při které je výše uvedená pravděpodobnost nejvyšší Spojená pravděpodobnost pozorování výskytu alespoň jedné částice v s i v ředění m při objemu vzorku ν i a n i vzorcích MPN hledání denzity (koncetrace) δ, při které je výše uvedená pravděpodobnost nejvyšší 1 v V ps 1 v V b p s exp vb V p f 1 exp v f p s exp v n! s s p 1 p s!( n s)! n! s!( n s)! n! l s!( n s)! l vexp( v ) s 1 exp v f f n s s 1 exp v exp v n s log slog 1 exp v n s v n s v 0 si 1 exp v exp v sv nv 1 exp v Výpočet SE a další materiály viz L i m i 1 siv 1 1 exp m m i v i i 1 n v i i ni si

62 Stanovení počtu metodou MPN Odhad nejvýše pravděpodobného počtu 1) Výpočet dle vzorce IS0 7218: ) Software programy 3) Použití MPN tabulek B.5 ISO 7218:2007 MPN indexy pro 3 následující ředění se 3 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (4 3 možností) B.7 ISO 7218:2007/ Tabulka A.1 ISO 7251:2005(E) MPN index pro 3 následující ředění s 5 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (6 3 možností).) Počet pozitivních výsledků Index MPN Kategorie Hranice spolehlivosti (95%) Dolní limit Horní limit Kategorie: Pokud je analýza provedena přesně, poté 95 % kombinací spadá do kategorie 1; 1.4% do kategorie 2; 0.9 % do kategorie 3 and 0.1 % do kategorie 0.

63 Stanovení počtu metodou MPN Výběr série zkumavek pro výpočet Vzor ek Tekutý vzorek 10 ml 1 ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml MPN Ostatní vzorky 1 g 10-1 g 10-2 g 10-3 g 10-4 g Tek. vzorek (ml -1 ) Ost. vzorky (g -1 ) x x10 2 Dolní limit 0.2x x10 2 Horní limit 4.0x x10 2 Pokud x gramů vzorku v první zkumavce, násobit výsledek 1/x) např. pro 10 g násobit 0.1, pro 0.1 g = násobit 10 Počet pozitivních výsledků Index MPN Kat ego rie Hranice spolehlivosti (95%) Dolní limit Horní limit 1 lepší kategorie 3-3-2: vyšší celkový počet pozitivních zkumavek

64 Horizontální metoda průkazu Průkaz přítomnosti či nepřítomnosti byť jen jediné životaschopné buňky cílového mikroorganismu v testované potravině, obvykle 25 g (dáno Nařízením č. 2073/2005) Kultivační metoda stanovení: Získání cílového mikroorganismu jako jednotlivě rostoucích kolonií, které lze dále identifikovat 1. KROK POMNOŽENÍ CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU V POTRAVINĚ V TEKUTÉM MÉDIU Primární pomnožení: X g, ml potraviny + 9X ml pomnožovacího média resuscitace a opatrné pomnožení stresovaných mikroorganismů (nižší nebo žádná koncentrace selektivních činidel, přídavek složek pro potlačení toxicity selektivních činidel) Sekundární pomnožení: přenos 0,1-10 ml z primárně pomnožené suspenze do selektivního méda - intenzivní pomnožení cílového mikroorganismu na koncentraci detekovatelnou v izolačním kroku 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z POMNOŽOVACÍHO MÉDIA NA ZTUŽENÉ MÉDIUM Vyočkování z pomnožovacího média na selektivní nebo selektivně-diagnostické půdy (obvykle jedno povinné dle ISO, druhé volitelné diverzita MO v rámci cílové skupiny) Nárůst cílového mikroorganismu v jednotlivých typických koloniích 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ Vyočkování typických kolonií na neselektivní kultivační médium a provedení příslušných biochemických testů Přímé provedení biochemických testů nemusí poskytovat spolehlivé reakce

65 Listeria monocytogenes ČSN EN ISO : Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes Část 1: Metoda průkazu (aktuální znění ČSN EN ISO /Amd 1:2004). Selektivní předpomnožení (preenrichment) 25g vzorku ml ½ Fraser (poloviční Fraser) kultivace 30 C, 24 h Sterilní očkovací kličky s očkem o objemu 10 µl zaočkujeme 0,1 ml Selektivní předpomnožení (pre-enrichment) 1. den Izolace na selektivní ztužená média ALOA* 37 C, 24±3 h Oxford** 37 C, 24±3 h Výběr typických (příp. atypických) kolonií pro konfirmaci*** 10 ml plný Fraser kultivace 37 C, 24 h Sterilní očkovací kličky s očkem o objemu 10 µl Selektivní pomnožení (enrichment) 2. den Přeočkování na neselektivní agar Konfirmační testy TSYEA 37 C, 24±3 h TSYEA 37 C, 24±3 h Biochemické testy (37 C, 24 h) ALOA* 37 C, 24±3 h Oxford** 37 C, 24±3 h Výběr typických (příp. atypických) kolonií pro konfirmaci*** TSYEA 37 C, 24±3 h TSYEA 37 C, 24±3 h Izolace na selektivní ztužená média Přeočkování na neselektivní agar 3. den 4. den Vyhodnocení testů Vyhodnocení biochemických testů Biochemické testy (37 C, 24 h) Konfirmační testy 5. den Vyhodnocení biochemických testů Vyhodnocení testů 6. den * ALOA povinný selektivní agar, **Oxford volitelný selektivní agar ***Vyočkovat z každé plotny nejméně jednu kolonii považovanou za typickou nebo suspektní na živný agar. Další čtyři kolonie se vyberou až poté, je-li první kolonie negativní. (Pro epidemiologické studie: konfirmace nejméně pěti kolonií. Pokud typických kolonií méně než pět na misce, vyberou se všechny typické nebo suspektní ke konfirmaci.)

66 Horizontální metoda průkazu Příklad: ISO :1996: Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes - Část 1: Metoda průkazu 1. KROK POMNOŽENÍ LISTERIA MONOCYTOGENES PŘÍTOMNÉ V POTRAVINĚ V TEKUTÉM MÉDIU Primární pomnožení: X g, ml potraviny + 9X ml pomnožovacího média POLOVIČNÍ BUJÓN DLE FRASER (poloviční koncentrace inhibujících složek- akriflavin, kyselina nalidixová - opatrné pomnožení stresovaných mikroorganismů Kultivace: 30 C, 24 h ±3 hodiny Sekundární pomnožení: přenos 0,1 ml z primárně pomnožené suspenze do 10 ml plného Fraserova bujónu (plná koncentrace inhibujících látek) Kultivace: 35/37 C, 48 ±3 hodiny 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z POMNOŽOVACÍHO MÉDIA NA ZTUŽENÉ MÉDIU Vyočkování z obou pomnožovacích médií na plotnu dvou selektivních ztužených půd - povinná půda ALOA (kultivace: 37 C, 24 ±24 hodiny) + druhá volitelná půda (Oxford agar, Palcam agar)

67 L. monocytogenes bujón dle Frasera Pomnožovací médium: bujón podle Frasera Složení (g/l): Proteose peptone 5.0; pepton z kaseinu 5.0; kvasničný extrakt 5.0; masový exktrakt 5.0; NaCl 20.0; hydrogenfosforečnan disodný 9.6; dihydrogenfosforečnan draselný 1.35; eskulin 1.0; chlorid lithný 3.0. ph: 7.2 ± 0.2 at 25 C. Suplementy: Suplement citrát amonno-železitý: 500 mg/l pro poloviční Fraserův bujón Selective Supplement: akriflavin 12.5 mg; kyselina nalidixová 10 mg /l pro poloviční Fraserův bujón Vysoký obsah živin Pufrovací systém - udržování stálého ph, které se mění vlivem biochemické činnosti rostoucích mikroorganismů Inhibiční látky inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií Detekce β-d-glukosidázy rodu Listeria: Glukóza eskulin je štěpen na eskuletin, který s železitým kationtem tvoří komplex v průběhu růstu L. monocytogenes dochází ke zčernání média E2BC87AC12574C6002FD7BD?opendocument&LG=EN&

68 L. monocytogenes ALOA agar ALOA agar (agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho) složení báze g/l agar-agar 13.0 Pepton z masa 18.0 Pepton z kaseinu 6.0 Kvasničný extrakt 10.0 Pyruvát sodný 2.0 Glycerofosforečnan hořečnatý 1.0 Ochrana přes letálním účinkem inhibičních látek glukóza 2.0 bohaté na živiny NaCl 5.0 Hydrogenfosforečnan disodný 2.5 pufrovací systém chlorid lithný 10.0 Síran hořečnatý 0.5 inhibice doprovodné mikroflóry Selektivní suplement (mg/l): Amphotericin B 10 mg; Ceftazidim 20 mg; Sodná sůl kyseliny nalidixové 20 mg; Polymyxin B síran U. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranosid 0.05; Chromogenní substrát detekce β-d-glukosidázové aktivity Rod Listeria má β-d-glukosidázovou aktivitu tvorba modrozelených kolonií Detekční systém Obohacovací suplement (g/l): L-α-fosfatidylinositol 2 g Detekce enzymu fosfatidylinositol fosfolipázy C (PI-PLC) - virulenčního faktoru L. monocytogenes Fosfolipázová aktivita L. monocytogenes průhledná haló zóna kolem kolonií (pro L. ivanovii tvorba zpožděná)

69 ALOA agar L. monocytogenes ALOA agar (agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho) Růst Vzhled L. monocytogenes Výborný Modrozelené kolonie Haló zóna L. ivanovii Výborný Pokud haló zóna, tak po 48 hodinách L. inocua Zpomalený Bez haló zóny L. seeligeri inhibovaný Bez haló zóny Typické kolonie brané pro další konfirmaci: Modrozelené kolonie s haló zónou nutno potvrdit (mohou být L. monocytogenes, L. ivanovii či některé bacily) Listeria monocytogenes ATCC Listeria innocua ATCC 33090

70 L. monocytogenes - Oxford agar Oxford agar složení báze g/l agar-agar 13.0 Pepton 23.0 škrob 1.0 méně výživný agar NaCl 5.0 Chlorid lithný 10.0 inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií Selektivní suplement (mg/l): Cycloheximid mg, kolistin sulfát 10.0 mg Acriflavin 2.5 mg, Cefotetan 1.0 mg, Fosfomycin 5.0 mg eskulin 1.0; citrát amonno-železitý 0.5 L. monocytogenes hydrolyzuje eskulin na eskuletin, který tvoří černý komplex s železitými kationty tvoří hnědozelené kolonie s haló efektem Listeria monocytogenes ATCC Detekční systém Listeria innocua ATCC 33090

71 L. monocytogenes - PALCAM agar Oxford agar složení báze g/l agar-agar 13.0 Pepton 23.0; glucose 0.5; starch 1.0 živiny Kvasničný extrakt 3.0; NaCl 5.0 lithium chloride 10.0 inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií Selektivní suplement (mg/l): Polymyxin B sulfate 5.0 mg, Ceftacidime 12.0 mg Acriflavine 2.5 mg eskulin 1.0; citrát amonno-železitý 0.5 L. monocytogenes hydrolyzuje eskulin na eskuletin, který tvoří černý komplex s železitými kationty hnědo-zelené kolonie s černou haló zónou D(-)mannitol 10.0; phenol red Odlišení manitol pozitivních G+ bakterií (např. stafylokoky, enterokoky) žlutý nárůst Listeria innocua ATCC Detekční systém Listeria monocytogenes ATCC 19118

72 Horizontální metoda průkazu Příklad: ISO :1996: Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes - Část 1: Metoda průkazu 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ Vyočkování 1-5 typických kolonií na neselektivní kultivační KTJ ztužené médium TSYEA (Agar s tryptonem, sójovým peptonem a kvasničným extraktem) Z každé plotny selektivního agaru vzít jednu a při negativním potvrzení až do pěti typických kolonií Kultivace: 37 C, 24 ±3 hodiny a provedení příslušných biochemických testů Biochemické testy pro potvrzení rodu Listeria Gramovo barvení: G+ štíhlé, krátké tyčinky Kataláza pozitivní Motilita Listeria spp. jsou pohyblivé při 25 C Biochemické testy pro potvrzení druhu Listeria monocytogenes Hemolýza Produkce kyseliny z CAMP test Druh Rhamnózy Xylózy S. aureus R. equi L. monocytogenes

73 Konfirmace rodu Listeria Výběr pro konfirmaci: Z každé plotny selektivního agaru vzít jednu a při negativním potvrzení až do pěti typických kolonií Konfirmační biochemické testy nutno provádět s kulturami narostlými za optimálních, nezátěžových podmínek INKUBACE NA SELEKTIVNÍCH PŮDÁCH ZATĚŽUJE I CÍLOVÉ MIKROORGANISMY, PROVÁDĚNÉ TESTY MOHOU POSKYTOVAT NESPOLEHLIVÉ REAKCE KTJ Inokulace na TSYEA (trypton-sójový agar s kvasničním extraktem) Živiny (g/l): trypton 17.0, pepton ze sóji 3.0, kvasničný extrakt 6.0, glukóza monohydrát 2.5, Osmotický a pufrovací systém: hydrogenfosforečnan disodný 2.5, NaCl 5.0, Bakteriologický agar 15.0, (g/l) Inkubace: 35 C nebo 37 C, h či déle, až je nárůst dostatečný

74 TSYEA/TSA Univerzální kultivační média trypton-sójový agar s kvasničným extraktem (Tryptone Soya Yeast Extract Agar) - pepton z kaseinu, pepton ze sójové drtě, kvasničný extrakt, NaCl, hydrogenfosforečnan draselný, glukóza, agar-agar: glukóza, Na 2 HPO 4.12 H 2 O, KH 2 PO 4 (pufrovací aktivita v průběhu růstu), NaCl; ph: 7.3 ± 0.2 při 25 C trypton-sójový agar (Tryptic soy agar) TSA: pepton z kaseinu, pepton ze sójové drtě, NaCl, agar-agar; ph: 7.3 ± 0.2 při 25 C S. aureus E. coli 74

75 Konfirmace rodu Listeria Rodová konfirmace Gramovo barvení: G+ štíhlé, krátké tyčinky Kataláza pozitivní Kataláza: enzym, který katalyzuje rozklad toxického peroxidu vodíku na vodu a kyslík 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 kataláza bubliny Průkaz katalázy do kapky 3%peroxidu vodíku přeneseme kličkou vyšetřovanou kolonii. V pozitivním případě se uvolňují bublinky kyslíku. Motilita Listeria spp. jsou pohyblivé při 25 C Přímý test za použití mikroskopie 1 kolonie suspendována ve zkumavce s trypton-sójovým bujónem s kvasničným extraktem a inkubována při 25 C, 8-24 h - pohyb je sledován po nakápnutí kultury na podložní sklíčko Agar pro motilitu Inokulace vpichem, inkubace 48 h (až pět dnů, pokud není růst dostatečný) při 25 C typický nárůst podél vpichu ve tvaru deštníku důsledek motility

76 Druh Konfirmace L. monocytogenes Hemo lýza Pozn. L. monocytogenes + úzké, jasné, světlé zóny β-hemolýzy L. innocua - bez hemolýzy L. ivanovii + široká, neohraničená zóna β-hemolýzy L. seeligeri + slabá zóna β-hemolýzy L. welshimerii (+) hemolýza: degradace hemoglobinu či lýze erytrocytů L. grayi - přidaných do půdy (hemolýza) : subsp.grayi α- hemolýza - viridace - tvoří se meziprodukty (zelenohnědé zbarvení)/β- hemolýza - projasnění půdy způsobené difúzí L. grayi - uvolněného hemoglobinu do okolí/γ - negativní hemolýza - subsp.marrayi barva půdy beze změny Inokulace na krevní agar společně s pozitivní (L. monocytogenes) a negativní (L. innocua) kontrolou, inkubace při 35 nebo 37 C, 24±2 h V: variabilní reakce, (+): slabá reakce, +: > 90 % kmenů pozitivní reakce, -: žádná reakce Poznámka : Vzácně existují kmeny L. monocytogenes, které nevykazují β-hemolýzu anebo pozitivní reakci CAMP testu za podmínek daných normou ISO

77 Konfirmace L. monocytogenes Rhodococus equi L. monocytogenes Krevní agar 1 cm 1-2 mm L. ivanovii L. inocua Testovaný izolát (L. inocua) Staphylococcus aureus Test dle Christie-Atkins-Munch-Peterson = (CAMP) test β-hemolytický Staphylococcus aureus (úplná hemolýza) a nehemolytický Rhodococcus equi Inkubace při 35 C, h L. monocytogenes (listeriolysin O způsobuje hemolýzu erythrocytes) a hemolytické reakce L. seeligeri jsou slabě zvýrazněny v zóně v blízkosti S. aureus čáry, zatímco hemolytická reakce L. ivanovii je silně zvýšena v zóně R. equi. Ostatní druhy netvoří hemolýzu anebo pouze slabou hemolýzu bez synergestického efektu (L. welshimerii).

78 Konfirmace L. monocytogenes Hemolýza Produkce kyseliny z CAMP test Druh Rhamnózy Xylózy S. aureus R. equi L. monocytogenes L. innocua - V L. ivanovii L. seeligeri (+) - L. welshimerii (+) V L. grayi subsp.grayi L. grayi subsp.marrayi V V: variabilní reakce, (+): slabá reakce, +: > 90 % kmenů pozitivní reakce, -: žádná reakce Poznámka : Vzácně existují kmeny L. monocytogenes, které nevykazují β-hemolýzu anebo pozitivní reakci CAMP testu za podmínek daných normou ISO Produkce kyseliny z cukrů: L-rhamnóza, D-xylóza Inokulace do média s jednotlivými cukry, inkubace při 35 C nebo 37 C až 5 dnů Média obsahují acidobazický indikátor pozitivní reakce (tvorba kyseliny) je indikována změnou barvy z fialové na žlutou, obvykle během 24 až 48 hodin

79 Konfirmace L. monocytogenes API Listeria 24 hodinová identifikace všech druhů Listeria sp. Výrobce Biomérieux patentované biochemické testy (DIM) Miniaturizované biochemické testy jsou zaočkovány inokulem o nízké bakteriální koncentraci (0,5 McFarland) SinglePath L.Mono Příklad LFA (lateral flow assay) imunochemická metoda detekce Listeria monocytogenes po pomnožení ve Fraserově bujónu aneb BLEB bujónu

80 Salmonella ČSN EN ISO 6579 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu bakterií rodu Salmonella 25g vzorku ml PPV (pufrovaná peptonová voda) kultivace 37 C, 18±2 h zaočkujeme 1 ml zaočkujeme 0,1 ml Neselektivní pomnožení (pre-enrichment) 1. den 10 ml Müller - Kauffman kutivace 37 C, 24±3 h 10 ml Rappaport - Vasilliadis kultivace 41 C, 24±3 h Sterilní očkovací kličky s očkem o objemu 10 µl Selektivní pomnožení (enrichment) 2. den XLD* 37 C, 24±3 h BGA** 37 C, 24±3 h XLD* 37 C, 24±3 h BGA** 37 C, 24±3 h Výběr typických (příp. atypických) kolonií pro konfirmaci*** Izolace na selektivní ztužená média 3. den živný agar 37 C, 24±3 h živný agar 37 C, 24±3 h živný agar 37 C, 24±3 h živný agar 37 C, 24±3 h Přeočkování na neselektivní agar 4. den Biochemické testy (37 C, 24 h), sérologická konfirmace, sérotypizace Konfirmační testy 5. den Vyhodnocení biochemických testů Vyhodnocení testů 6. den * XLD povinný selektivní agar, **BGA volitelný selektivní agar ***Vyočkovat z každé plotny nejméně jednu kolonii považovanou za typickou nebo suspektní na živný agar. Další čtyři kolonie se vyberou až poté, je-li první kolonie negativní. (Pro epidemiologické studie: konfirmace nejméně pěti kolonií. Pokud typických kolonií méně než pět na misce, vyberou se všechny typické nebo suspektní ke konfirmaci.)

81 Salmonella Pufrovaná peptonová voda Složení (l) : pepton 10 g; NaCl 5 g; dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného 9 g; dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 g. Pepton bohatý na obsah živin umožňuje resuscitaci buněk, subletálně poškozených či oslabených vlivem zacházení s potravinou či přídavkem konzervačních látek. Fosfátový pufrovací systém chrání bakterie před změnami ph v médiu v důsledku metabolismu, které by jinak nastaly v důsledku metabolismu rostoucích buněk. RAPPAPORT a VASSILIADIS (RVS Broth) obohacené bujóny pro salmonely Složení (l): pepton ze soji 4,5 g, hexahydrát chloridu hořečnatého 29 g; NaCl 8 g; hydrogenfosforečnan didraselný 0,4 g; dihydrogenfosforečnan draselný 0,6; malachitová zeleň 0,036 g. ph: 5.2 ± 0.2 at 25 C, kultivace 41 C, 24±3 h Selektivní podmínky pro růst salmonel v přítomnosti doprovodné bakteriální mikroflóry, zvláště Enterobacteriaceae) - vyšší rezistence k malachitové zeleni a vyššímu osmotickému tlaku (přídavek chloridu hořečnatého), nízkému ph, vyšší teplotě a nižším nároku na živiny (pepton ze sóji). Fosfátový pufrovací systém. RVS bujón není vhodný pro selektivní pomnožení S. typhi and S. paratyphi A. MULLER-KAUFFMANN (MK) bujón s tetrathionanem Složení média (l): masový extrakt 0,9 g; pepton z masa 4,5 g; kvasničný extrakt 1,8 g; NaCl 4,5 g; uhličitan vápenatý 25,0; thiosíran sodný 40,7 g; volská žluč 4,75 g. Přidává se jodid draselný 5 g; jód 4 g a briliantová zeleň 0,01 g. ph: 7.6 ± 0.2 at 25 C, kultivace 37 C, 24±3 h Inhibice doprovodné mikroflóry: žluč, briliantová zeleň G+ bakterie, tetrathionan (tvořen z thiosíranu přídavkem jódu) koliformní a dalších enterobakterie. Salmonella, Proteus a další druhy redukují tetrathionan za vzniku kyseliny sírové (následně pufrována uhličitanem vápenatým).

82 Pufrovaná peptonová voda Pufrovaná peptonová voda Složení (l) : pepton 10 g; NaCl 5 g; dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného 9 g; dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 g. Pepton bohatý na obsah živin umožňuje resuscitaci buněk, subletálně poškozených či oslabených vlivem zacházení s potravinou či přídavkem konzervačních látek. Fosfátový pufrovací systém chrání bakterie před změnami ph v médiu v důsledku metabolismu, které by jinak nastaly v důsledku metabolismu rostoucích buněk. ph: 7.0 ± 0.2 at 25 C.

83 Rappaport-Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth RAPPAPORT a VASSILIADIS (RVS Broth) obohacené bujóny pro salmonely Složení (l): pepton ze soji 4,5 g, hexahydrát chloridu hořečnatého 29 g; NaCl 8 g; hydrogenfosforečnan didraselný 0,4 g; dihydrogenfosforečnan draselný 0,6; malachitová zeleň 0,036 g. ph: 5.2 ± 0.2 při 25 C, kultivace 41 C, 24±3 h Selektivní podmínky pro růst salmonel v přítomnosti doprovodné bakteriální mikroflóry, zvláště Enterobacteriaceae vyšší rezistence k malachitové zeleni a vyššímu osmotickému tlaku (přídavek chloridu hořečnatého) nízkému ph, vyšší teplotě a nižším nároku na živiny (pepton ze sóji). Fosfátový pufrovací systém. RVS bujón není vhodný pro selektivní pomnožení S. typhi and S. paratyphi A.

84 Muller-Kauffmann Tetrathionate-Novobiocin Broth (MKTTn) Salmonella (turbidity and decoloration) 2. Shigella (turbidity and turquois) 3. Other Enterobacteriaceae (without turbidity) MULLER-KAUFFMANN (MK) bujón s tetrathionanem Složení média (l): masový extrakt 0,9 g; pepton z masa 4,5 g; kvasničný extrakt 1,8 g; NaCl 4,5 g; uhličitan vápenatý 25,0; thiosíran sodný 40,7 g; volská žluč 4,75 g. Přidává se jodid draselný 5 g; jód 4 g a briliantová zeleň 0,01 g. ph: 7.6 ± 0.2 at 25 C, kultivace 37 C, 24±3 h Inhibice doprovodné mikroflóry: žluč, briliantová zeleň G+ bakterie, tetrathionan (tvořen z thiosíranu přídavkem jódu) koliformní a dalších enterobakterie. Salmonella, Proteus a další druhy redukují tetrathionan za vzniku kyseliny sírové (následně pufrována uhličitanem vápenatým). A sediment of calcium carbonate appears in the turbid broth at the bottom of the tubes

85 Salmonella XLD agar Xylóza Lysin Deoxycholát Agar (XLD) Složení média (l): kvasničný extrakt 3 g; NaCl 5 g; D(+) xylóza 3,75 g; laktóza 7,5 g; sacharóza 7,5 g; L(+) lysin 5 g; deoxycholát sodný 1 g; thiosíran sodný 6,8 g; citrát železitoamonný 0,8 g; fenolová červeň 0,08 g; agar-agar 14,5 g. Zkvašování cukrů (xylóza, laktóza a sacharóza) za vzniku kyselin = zežloutnutí acidobazického indikátor fenolová červen. Produkce sulfanu v přítomnosti thiosíranu sodného a železitých solí - tvorba precipitátu černého sulfidu železitého ve středu kolonií. Dekarboxylace lysinu na kadaverin zvýšení ph vede ke vzniku fialového zabarvení kolem kolonií (acidobazický indikátor). Vzhled kolonií Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné se zónami precipitace Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, na povrchu slizké se zónami precipitace Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, mohou mít černý střed Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné Žluté, obklopené žlutými zónami, průsvitné s černými středem Kolonie mající stejnou barvu jako agarové médiem, průsvitné Kolonie mající stejnou barvu jako agarové médiem, průsvitné, s černým středem Oranžové, lehce neprůsvitné Růžové kolonie s tmavším růžovým středem Žluté kolonie, které mají nebo nemají černý střed Mikroorganismy Escherichia coli, Enterobacter, Aeromonas Klebsiella Citrobacter (laktosa-positivní kmeny) Serratia, Hafnia Proteus vulgaris, nejčastěji Proteus mirabilis Shigella, Providencia, Pseudomonas Typické kolonie Salmonella H 2 S+, XYL -, LAC -, SAC - Salmonella Typhi (xylóza-pozitivní kmeny) Sulfan neprodukující salmonely (S. Paratyphi A) Laktóza pozitivní salmonely Salmonella enteritidis NCTC 5188 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

86 Salmonella BG agar Salmonella enteritidis NCTC 5188 Brilliant-green agar BGA (Agar s briliantovou zelení, fenolovou červení a laktózou) Složení média (l): pepton z masa 7 g; NaCl 5 g; laktóza 15 g; fenolová červeň 0,04 g; brilliantová zeleň 0,005 g; agar-agar 13 g. Inhibiční systém: briliantová zeleň G+ bakterie, též Salmonella Typhi a rod Shigella, 0,2 % deoxycholátu sodného inhibice plazivosti kolonií rodu Proteus Diagnostický systém: zkvašování laktózy je indikováno zežloutnutím acidobazického indikátoru fenolové červeně z červené na žlutou (v alkalickém prostředí tmavě červený) Vzhled kolonií Světle růžové, průsvitné, obklopené červenými zónami Žlutozelené, neprůsvitné, obklopené žlutozelenými zónami Mikroorganismy Laktóza-negativní: Salmonella, výjimečně Proteus a Citrobacter Laktóza-pozitivní: E. coli, Enterobacter, Klebsiella. Ostatní jsou převážně inhibovány. Salmonella typhimurium ATCC 14028

87 Vzhled kolonií Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné se zónami precipitace Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, na povrchu slizké se zónami precipitace Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, mohou mít černý střed Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné Žluté, obklopené žlutými zónami, průsvitné s černými středem Kolonie mající stejnou barvu jako agarové médiem, průsvitné Kolonie mající stejnou barvu jako agarové médiem, průsvitné, s černým středem Oranžové, lehce neprůsvitné Růžové kolonie s tmavším růžovým středem Žluté kolonie, které mají nebo nemají černý střed Salmonella XLD agar Xylóza Lysin Deoxycholát Agar (XLD) Složení média (l): kvasničný extrakt 3 g; NaCl 5 g; D(+) xylóza 3,75 g; laktóza 7,5 g; sacharóza 7,5 g; L(+) lysin 5 g; deoxycholát sodný 1 g; thiosíran sodný 6,8 g; citrát železitoamonný 0,8 g; fenolová červeň 0,08 g; agar-agar 14,5 g. Zkvašování cukrů (xylóza, laktóza a sacharóza) za vzniku kyselin = pokles ph - acidobazický indikátor fenolová červeň budežlutý. Produkce sulfanu v přítomnosti thiosíranu sodného a železitých solí tvorba precipitátu černého sulfidu železitého ve středu kolonií. Bakterie, které provádějí dekarboxylace lysinu na kadaverin zvýšení ph fialové zabarvení kolem kolonií (acidobazický indikátor). Deoxycholát sodný - inhibice plazivosti kolonií rodu Proteus Mikroorganismy Escherichia coli, Enterobacter, Aeromonas Klebsiella Citrobacter (laktosa-positivní kmeny) Serratia, Hafnia Proteus vulgaris, nejčastěji Proteus mirabilis Shigella, Providencia, Pseudomonas Typické kolonie Salmonella H 2 S+, XYL -, LAC -, SAC - Salmonella Typhi (xylóza-pozitivní kmeny) Sulfan neprodukující salmonely (S. Paratyphi A) Laktóza pozitivní salmonely Salmonella enteritidis NCTC 5188 Klebsiella pneumoniae ATCC

88 Salmonella BG agar 88

89 Rapid Salmonella agar Složení média (l) (výrobce biorad - blíže nespecifikuje): Živná směs 14,5 g, Selektivní činidla 14 g Chromogenní směs 2,3 g, Agar 12,7 g ph 7,2±0,2 Salmonella spp. fialové (magenta) kolonie, ostatní Enterobacteriaceae - zelené Způsob aplikace: Jako druhé (volitelné) médium vedle XLD (inkubace: 37 C, 24±2 hod) dle ISO 6579 Jako alternativní metoda (validováno NordVAl) k EN ISO 6579 dle ISO Rapid Salmonella metoda: dvoustupňové pomnožení 25 g PPV, 37 ±1 C, 18 ±2 hod 0,5 ml do 10 ml RVS bujónu, 41, 5 ±1 C, 6 hod až 26 hod (podle typu produktu) Izolace na Rapid Salmonella agar 37 C, 24±2 hod Rapid Salmonella metoda: krátký protokol do PPV přidány Rapid Salmonella kapsule 25 g PPV, 37 ±1 C, 18 ±2 hod Izolace přímo přímo na Rapid Salmonella agar bez dvojstupňového pomnožení, 37 C, 24±2 hod 89

90 Biochemická konfirmace Salmonella spp. Kmeny Salmonella spp. S. Typhi S. Parathypi A S. Parathypi B S. Parathypi C Ostatní kmeny TSI: tvorba kyseliny z glukózy TSI: tvorba plynu z glukózy TSI: tvorby kyseliny z laktózy TSI: tvorba kyseliny ze sacharózy TSI: tvorba sirovodíku reakce % poz. reakce reakce % poz. reakce reakce % poz. reakce reakce % poz. reakce reakce % poz. reakce Štěpení močoviny Dekarboxylace lyzinu Tvorba β- galaktozidázy Voges-Proskauerova reakce Tvorba indolu

91 Biochemická konfirmace Salmonella spp. Izolace charakteristických kolonií na neselektivní média živný agar (37± C, 24± 3h) Konfirmace: Biochemická (37± C, 24± 3h) TSI Urea agar (Christensen) L-lysin dekarboxylasa β-galaktosidasa (ONPG) VP test Indol test Motile (semi-solid nutrient agar) Sérologická (37± C, 24± 3h) O antigeny (somatické) H antigeny (flagelární) Vi antigeny (kapsulární) fáze I fáze II sults-_shigella jpg /product/microgen-salmonella-latex-kit.jpg

92 Biochemická konfirmace Salmonella spp. TSI Triple Sugar Iron Agar agar s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým - detekce fermentace glukózy, sacharózy a/nebo laktózy s produkcí či bez produkce plynu, detekce tvorby sulfanu z thiosíranu v kyselém prostředí Inokulace sloupce vpichem Složení / litr Inokulace na povrch Enzymatická trávenina kaseinu... Fermentace dextrózy (glukózy) 5 g na kyselinu Enzymatická trávenina zvířecí anaerobně pokles ph = žlutý tkáně... 5 g sloupec Pepton s kvasničným extraktem... Aerobně vznik produktů, které 10 g Dextróza... 1 g jsou na vzduchu dále oxidovány Laktóza g a ph zůstává zásadité = červený Sacharóza g povrch Citran železito-amonný g Fermentace glukózy na plyn Chlorid sodný... 5 g (anaerobně ve vpichu) Thiosíran sodný g Trhliny, bublinky ve sloupci v místě Fenolová červeň g Agar g vpichu a kolem Výsledné ph: 7.3 ± 0.2 při 25 C Tvorba sulfanu (H 2 S) reakce se síranem želzitým a thiosíranem sodným vznik černého precipitátu ve sloupci Fermentace laktózy a/nebo sacharózy Aerobně i anaerobně - Tvorba kyseliny žlutý sloupec i povrch Fenolová červeň Alkalické prostředí = červená, kyselé prostředí = žlutá Bakterie fermentující laktózu a/nebo sacharózu jsou schopny fermentovat též glukózu

93 Biochemická konfirmace Salmonella spp. TSI Triple Sugar Iron Agar agar s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým - detekce fermentace glukózy, sacharózy a/nebo laktózy s produkcí či bez produkce plynu, detekce tvorby sulfanu z thiosíranu v kyselém prostředí

94 Biochemická konfirmace Salmonella spp. Agar s močovinou (Christensenův agar) - detekce štěpení močoviny ureázou za vzniku amoniaku a oxid uhličitého Fenolová červeň: Kyselé prostředí - žluté (ph 6.8±0.2) Zásaditá reakce v důsledku hydrolýzy močoviny růžová barva Složení g/l Pepton ze zvířecí tkáně Dextróza Chlorid sodný Hydrogenfosforečna disodný Dihydrogenfosforečnan draselný Fenolová červeň Agar Výsledné ph (25 C) 6.8± C phpapp01/95/campylobacter-jejunihelicobacter-pylori jpg?cb=

95 Biochemická konfirmace Salmonella spp. Test na tvorbu indolu - detekce štěpení tryptofanu na indol Složení g/l Trypton L-Tryptofan 1.00 Chlorid sodný 5.00 Výsledné ph 7.5 ± 0.1 (25 C) Inokulace tekutého média pro detekci tvorby indolu Kovácsovo činidlo p-dimethylaminobenzaldehyd HCl, 37% amylalkohol 50.0 gm ml ml Tvorba indolu z tryptofanu Produkce indolu je detekována Kovacsovým činidlem

96 Biochemická konfirmace Salmonella spp. L-lysin dekarboxyláza - Detekce dekarboxylace lysinu na kadaverin (anaerobně po inokulace do tekutého média je překry sterilní parafínovým olejem) Bujón pro L-lysin dekarboxylázu Typical Composition (g/litre) Pepton ze zvířecí tkáně 5.000; 21_m.jpg Kvasničný extrakt 3.000;Dextróza1.000 (glukóza připravená ze škrobu, chemicky ekvivalentní glukóze); L-Lysin hydrochlorid 5.000; bromokresolová červeň Výsledné ph (25 C) 6.8±0.2 Dvoustupňová detekce: 1. stupeň Dextróza je fermentována za vzniku kyseliny v kyselém prostředí bromokresolová červeň zežloutně teprve v kyselém prostředí dochází k aktivaci lysindekarboxylázy 2. step L-lysin je dekarboxylován za vzniku OH - - v alkalickém prostředí bromokresolová červeň mění svou barvu zpět do fialovo-červené Za předpokladu viditelného nárůstu kultury je výsledná fialovo-červená barva bujónu důkaz pozitivní reakce, žlutá barva bujónu důkaz negativní reakce + CO 2 + OH -

97 Biochemická konfirmace Salmonella spp. β-galactosidáza (ONPG) (use a 1 μl loop full) - stanovení přítomnosti ß-galaktosidázy za využití o-nitrofenyl-beta-dgalactopyranosidu (ONPG). - ONPG je hydrolyzováno na žlutý o-nitrofenol a galaktózu Laktózu fermentující bakterie (ONPG positive): Dva enzymy Permeáza přenos molekul laktózy do buňky β-galactosidáza štěpení galaktosidové vazby za vzniku glukózy a galaktózy, indukovatelný enzym, tvořený pouze v přítomnosti laktózy Koliformní bakterie jako E.coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp. supenze ve fyz. roztoku + toluen + substrát ONPG Bakterie se zpožděnou fermentací laktózy Permeáza není přítomna β-galactosidase přítomna ONPG test je pozitivní, ale pozitivní reakce je zpožděná Citrobacter spp., Arizona spp, Laktózu nefermentující bakterie (ONPG Negative): Permeáza není přítomna β-galactosidáza není přítomna Salmonella spp; Shigella spp; Proteus spp; Providencia spp., Morganella spp. a další ONPG je strukturně podobný laktóze, ONPG je bezbarvá sloučenina, O-nitrofenol je žlutý vizualizace hydrolýzy hydrolysi s

98 Biochemická konfirmace Salmonella spp. Voges Proskauerův (VP) test Detekce produkce acetylmethylkarbinolu (acetoinu) při fermentaci glukózy Detekce acetoinu: acetoin je přeměněn na diacetyl v přítomnost in the - naphthol (VP činidlo I nutno přidat jako první), silné zásady (VP činidlo II - 40% KOH) a kyslíku. Diacetyl a sloučeniny obsahující guanidin, které se vyskytují v peptonech, poté kondenzují za vzniku růžovo-červeného polymeru. Postup VP Testu 1.Inokulace čerstvé kultury do MRVP bujónu. 2.Inkubace: 37 C, 24 hod. 3. Přidat 6 kapek činidla VP I a dobře promíchat (aerace). 4.Přidat 6 kapek činidla VPII a dobře promíchat (aerace). 5.Pro pozitivní reakci tvorba červeného zabarvení v průběhu 30 minut. Pozitivní reakce: Růžovo-červená zbarvení Např. : viridantní streptokoky (except Streptococcus vestibularis), Listeria, Enterobacter, Klebsiella, Serratia marcescens, Hafnia alvei, Vibrio eltor, Vibrio alginolyticus, etc. Negativní reakce: Bez růžovo-červeného zbarvení Např. : Streptococcus mitis, Citrobacter sp., Shigella, Yersinia, Edwardsiella, Salmonella, Vibrio furnissii, Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus, and Vibrio parahaemolyticus etc. A copper color should be considered negative. A rust color is a weak positive reaction. Kontrola kvality VP positivní: Enterobacter aerogenes (ATCC13048) VP negativní: Escherichia coli (ATCC25922) + - Voges-Proskauer činidlo I (Barrittovo činidlo A) Alfa-Nafthol, 5% 50 gm Voges-Proskauer činidlo II (Barrittovo činidlo B) Hydroxid draselný 400 gm MRVP bujón (ph 6.9) pepton = 7.0 g/l glukóza = 5.0 g/l hydrogenfosforečnan draselný = 5.0 g/l Absolutní ethanol 1000 ml Deionizovaná voda 1000 ml

99 Konfirmace rodu Salmonella (ISO 6579) Dle ISO 6579 jsou testy prováděny ve zkumavkách s příslušnými médii (kultivace po zaočkování: 37± C for 24± 3h) TSI: tvorba kyseliny z glukózy TSI: tvorba plynu z glukózy TSI: tvorby kyseliny z laktózy TSI: tvorba kyseliny ze sacharózy TSI: tvorba sirovodíku Agar s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým (TSI agar triple sugar agar) Očkuje se na povrch šikmého agaru a poté vpichem ph indikátor fenolová červeň Tvorba kyseliny z glukózy anaerobně žluté dno (vpich), produkty aerobní oxidace na povrchu nevedou ke změně ph Tvorba plynu z glukózy anaerobně potrhání agaru kolem vpichu Tvorba kyseliny z laktózy a/nebo sacharózy (až po fermentaci glukózy) žluté dno i sloupec Štěpení močoviny Dekarboxylace lyzinu Tvorba β- galaktozidázy Tvorba sulfanu černý precipitát (v dalších aplikacích lze odečítat i deaminace a dekarboxylaci aminokyselin z peptonu či záměrně přidaných) Voges-Proskauerova reakce Tvorba indolu

100 Konfirmace rodu Salmonella (ISO 6579) Dle ISO 6579 jsou testy prováděny ve zkumavkách s příslušnými médii (kultivace po zaočkování: 37± C for 24± 3h) TSI: tvorba kyseliny z glukózy TSI: tvorba plynu z glukózy TSI: tvorby kyseliny z laktózy TSI: tvorba kyseliny ze sacharózy TSI: tvorba sirovodíku Štěpení močoviny Dekarboxylace lyzinu Tvorba β- galaktozidázy conversion-gate01/95/ jpg?cb= phpapp01/95/campylobacter-jejunihelicobacter-pylori jpg?cb= ph indikátor: Fenolová červeň Voges-Proskauerova reakce Tvorba indolu + CO 2 + OH - ph indikátor: bromokresolová červeň Tvorba kyseliny z glukózy v kyselém ph se L- lysin dekarboxyláza aktivuje dekarboxylací opět vzrůst ph pozitivní reakce: stejná barva média, avšak s viditelným růstem

101 Konfirmace rodu Salmonella (ISO 6579) Dle ISO 6579 jsou testy prováděny ve zkumavkách s příslušnými médii (kultivace po zaočkování: 37± C for 24± 3h) TSI: tvorba kyseliny z glukózy TSI: tvorba plynu z glukózy TSI: tvorby kyseliny z laktózy TSI: tvorba kyseliny ze sacharózy TSI: tvorba sirovodíku Štěpení močoviny Dekarboxylace lyzinu Tvorba β- galaktozidázy Voges-Proskauerova reakce Tvorba indolu O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) analog laktózy Fermentace laktózy (koliformní bakterie): permeáza + β-d-galaktosidáza (štěpí laktózu na galaktózu a glukózu, tvorba enzymu se indukuje pouze v přítomnosti laktózy a nedostatku glukózy lac operon) rody koliformních bakterií: Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Escherichia. Pokud však chybí permeáza je fermentace laktózy je opožděná (koliformní bakterie: Citrobacter sp.) Voges-Proskauerova reakce: tvorba acetoinu je detekován přidáním dvou činidel (VPTI, VPTII pořadí nelze zaměnit) pozitivní reakce : červená Produkce indolu z tryptofanu detekce indolu Kovacsovým činidlem

102 Miniaturizované komerční soupravy API 20E - souprava 20 biochemických reakcí pro identifikace Enterobacteriaceae a dalších nenáročných gramnegativních tyčinek (BioMerieux) Miniaturizované komerční soupravy EnteroTest 24 (Erba Lachema, ČR) souprava 24 biochemických reakcí pro rutinní identifikaci významných druhů střevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae

103 ENTEROTEST 24 Souprava ENTEROtest 24 je určena pro rutinní identifikaci významných druhů střevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae pomocí 24 biochemických testů. Pro přípravu testu: zákalu, který odpovídá stupni 1 McFarlandovy zákalové stupnice, tj. cca 3 x 10 8 buněk Enterobacteriaceae v ml (zákal stupně 1 je definován zákalem, který vytvoří sraženina BaSO 4 při smíchání 0,1 ml roztoku 1 % bezvodého BaCl 2 a 9,9 ml 1 % H 2 SO 4 )

104 ENTEROTEST 24 dekarboxylace Schopnost růst na citrátu jako jediném zdroji C (půda: Simonsův citrát) utilizace malonátu deaminace Zkvašování cukrů Hydrolýza eskulinu Zkvašování cukrů

105 Sérologická konfirmace Salmonella spp. Sérotypizace - Kaufmann-Whiteovo schéma salmonely rozděluje podle antigenních vlastností a jejich kombinací, čímž je pro každý sérotyp vytvořena specifická antigenní formule. Antigeny se nacházejí v buněčné stěně (somatické O-Antigeny), v bičících (flagelární H-antigeny) a v kapsulích (Vi Antigeny). Somatické O-Antigeny jsou endotoxickou součástí lipopolysacharidových struktur, které se nachází na vnější straně buněčné stěny. Vyvolávají specifickou imunitní reakci systému a zároveň jsou faktory patogenity, neboť chrání bakterie před bakteriolytickým účinkem komplementu. Podjednotky O-antigenu jsou tvořeny několika sacharidovými zbytky, jejich pořadí pak určuje variabilnost O-antigenu. Jeho variabilita nám umožňuje rozlišovat až 67 séroskupin, které značíme písmeny nebo číslicemi. Bičíkové H-antigeny se vyskytují u pohybu schopných salmonel, tento antigen je tvořen z bílkovin, převážně flagelinem. Bičíkové H-antigeny mají dvě rozdílné antigenní fáze (první specifická fáze H1 a druhá nespecifická fáze H2). Odlišují se primární strukturou, která je způsobena střídavou expresí jednotlivých genů řídících tvorbu bičíků. Můžeme se setkat i s monofázními izoláty, u nichž se vyskytuje pouze jeden typ bičíkového H-antigenu. Rozlišujeme celkem 89 typů H-antigenu. Kapsulární Vi antigeny jsou složeny z pouzderných povrchových polysacharidů a jsou zodpovědné za virulenci. Jsou charakteristické pro sérovary S. Typhi, S. Dublin a S. Hirschfeldii.

106 Sérologická konfirmace Salmonella spp. určení poddruhu (biochemické testy kmeny různých podruhů mohou mít stejné antigeny) rozlišení O, H a Vi antigenů aglutinačními testy za použití antisér Rozlišení izolátů s jednou antigenní H fází a s dvěma fázemi inokulace na médium, které obsahuje antisérum k určitému H-antigenu. Výsledkem je, že bakterie, které mají pouze tento určitý H-antigen, budou imobilizované antisérem, kdežto bakterie syntetizující také druhý H-antigen, budou pohybu schopné a tak porostou v celém médiu. Sklíčková aglutinace: Někteří bakteriální původci infekčních chorob uvolňují při svém množení v tekutém prostředí nadbytek svých pouzderných antigenů. Antigeny lze prokazovat např. pomocí latexových mikročástic pokrytých protilátkou proti příslušnému antigenu - částice výrazně aglutinují. Některé kmeny jsou schopny autoaglutinace k aglutinaci dochází i bez přítomnosti antisér (protilátek) aglutinaci s jednotlivými antiséry poté není možno stanovit. Identifikace na základě aglutinace s omnivalentními, polyvalentními, monovalentní O, H a Vi antiséry.

107 SALMONELLA LATEX TEST Test Latex (FT0204) latexové částice senzitivizované polyvalentními protilátkami k Salmonella (králičí IgG). Control Latex (FT0205) latexové částice senzitivizované normálními králičími globuliny. Positive Control Suspension (FT0206) suspenze neživotaschopné Salmonella sp. konzervované s 1 % formalinu Postup 1. Reagenci při pokojové teplotě, promísit. 2. Nanést jednu kapku (volně padající) Test Latex na jeden kruh testovací karty a Control Latex na druhý kruh. 3. Kolonii kultury čerstvě narostlé na neselektivním agaru smísit s Test Latex, druhou kolonii s Control Latex. Pokračovat v míxání po sekund. 4. Jemně pohybovat kartou kruhovým pohybem po 2 minuty a pozorovat aglutinaci. Pozitivní reakce: Aglutinace s Test Latex a žádná aglutinace s Control Latex. Negativní reakce: Žádná aglutinace ani s Test Latex, ani s Control Latex. Neinterpretovatelná reakce: Aglutinace s Test Latex a Control Latex (případně opakovat s nově narostlou kulturou)

108 Koagulázapozitivní stafylokoky ČSN EN ISO (560092) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu koagulázapozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy)-část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera 1. KROK PŘÍPRAVA SÉRIE DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ TESTOVANÉ POTRAVINY Ředící médium: pufrovaná peptonová voda 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z JEDNOTLIVÝCH DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ 0,2 ml testované suspenze rozetřít na plotnu Baird-Parkerova agaru, po rozetření se inokulum nechá vsáknout 15 minut Kultivace: 37 C, 48 hodin 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ, STANOVENÍ POČTU KTJ A VÝPOČET KTJ/G NEBO KTJ/ML Vybrat plotny z dvou po sobě jdoucích ředění vhodné k výpočtu a z nich náhodně vybrat 5 kolonií pro konfirmaci a přeočkovat na a) krevní agar kultivace: 30 C, 24 hodin - průkaz β hemolýzy b) BHI (brain-heart infusion, mozkosrdcová infúze) kultivace: 37 C, 24 hodin - průkaz přítomnosti plazmakoagulázy

109 BAIRD-PARKER AGAR (BP) Složení (l): Základní půda (l): Pepton z kaseinu 10.0; masový extrakt 5.0; kvasničný extrakt 1.0; pyruvát sodný 10.0; glycin 12.0; chlorid lithný 5.0; agaragar Suplement Emulze vaječného žloutku s teluričitanem Egg-yolk tellurite emulsion 50 ml; pokud požadováno, sulfamethazin 0.05 g/l Živiny: pepton, masový extrakt, kvasničný extrakt Inhibice doprovodné mikroflóry: chlorid lithný, terluričitan draselný Resuscitace oslabených buněk: glycin, pyruvát sodný Diagnostické složky: Lipolýza a proteolýza vaječného žloutku tvorba projasněných zón (přítomnost lecitinázy, lipázy atd. - typické pro S. aureus) Redukce teluričitanu draselného na telur vznik černých kolonií Staphylococcus aureus ATCC Tvorba projasněných zón kolem černých kolonií je obvykle v souvislosti s pozitivním testem na koagulázu (koagulázapozitivní stafylokoky S. aureus a další druhy)

110 Vzhled kolonií BAIRD-PARKER AGAR (BP) Typické kolonie: Černé nebo šedé, lesklé, vypouklé, 1-5 mm v průměru, obklopené zónou projasnění 2-5 mm širokou, která může být zčásti matná, po nejméně 24 hod inkubace se může v těsné blízkosti kolonií objevit opalescentní prstenec. Atypické kolonie: Šedé kolonie bez zóny projasnění, nebo černé kolonie s úzkým bílým okrajem nebo bez něj, zóna projasnění chybí nebo je sotva viditelná. Atypické kolonie vytvářejí hlavně kmeny koagulázapozitivních stafylokoků izolovaných z mléčných výrobků, mořských plodů a drobů. Černé, lesklé kolonie, nepravidelného tvaru. Matné zóny se vyvíjejí kolem kolonií po 24 hodinách. Občasný růst: velmi malé kolonie, hnědé až černé, bez projasněné zóny Tmavě hnědé, zmatnělé zóny se často objevují po 48 hodinách Bílé, bez projasněných zón Mikroorganismus Staphylococcus aureus (nebo další koagulázapozitivní stafylokoky) Staphylococcus epidermidis mikrokoky Bacillus sp. Kvasinky Maximální počitatelný počet: 150 typických a/nebo atypických KTJ/plotna (počet všech kolonií na misce je přednostně 300) Pokud nepočitatelné počty, též odebrat typické/atypické kolonie k testování zohlednění při výpočtu Staphylococcus aureus ATCC lecitináza lipáza redukce telluričitanu na tellur %20baird%20parker.jpg Vybrat počitatelná ředění spočítat typické a atypické kolonie z jedné plotny vybrat 2 typické a 2 atypické (pokud přítomny) pokud nejsou žádné plotny počitatelné, vybrat kolonie z nepočitatelných ploten inokulace části kolonie do BHI (5 ml) inokulace části kolonie na Columbia agar s 5 % beraní krve 110

111 BAIRD-PARKER AGAR (BP) Vzhled kolonií Typické kolonie: Černé nebo šedé, lesklé, vypouklé, 1-5 mm v průměru, obklopené zónou projasnění 2-5 mm širokou, která může být zčásti matná, po nejméně 24 hod inkubace se může v těsné blízkosti kolonií objevit opalescentní prstenec. Atypické kolonie: Šedé kolonie bez zóny projasnění, nebo černé kolonie s úzkým bílým okrajem nebo bez něj, zóna projasnění chybí nebo je sotva viditelná. Atypické kolonie vytvářejí hlavně kmeny koagulázapozitivních stafylokoků izolovaných z mléčných výrobků, mořských plodů a drobů. Černé, lesklé kolonie, nepravidelného tvaru. Matné zóny se vyvíjejí kolem kolonií po 24 hodinách. Občasný růst: velmi malé kolonie, hnědé až černé, bez projasněné zóny Tmavě hnědé, zmatnělé zóny se často objevují po 48 hodinách Bílé, bez projasněných zón Mikroorganismus Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis mikrokoky Bacillus sp. Kvasinky Staphylococcus aureus ATCC 25923

112 KOAGULÁZOVÝ TEST Test na produkci koagulázy (enzym schopný koagulovat plazmu) odlišení Staphylococcus aureus (tvorba enterotoxinů, podmíněně patogenní, zdravotní riziko) od méně či zdravotně nezávadných, běžně rozšířených druhů stafylokoků (S. epidermidis, S. saprophyticus), výskyt ostatních koagulázapozitivních stafylokoků (S. schleiferi, S. intermedius) není tak běžný, produkce koagulázy obvykle koreluje s patogenitou S. aureus produkuje dva typy koagulázy vázaná koaguláza (též aglutinační faktor) zůstává přichycená k buněčné stěné volná koaguláza - extracelulární enzym produkovaný při kultivaci v bujónu Sklíčkový test smísení husté suspenze ve FR s králičí plazmou shlukování detekce pouze vázané koagulázy Zkumavkový test inkubace kultury (narostlé v BHI, několika kolonií) společně s králičí plazmou detekce volné i vázané koagulázy volná koaguláza reaguje s plazmatickým faktorem za vzniku tzv. stafylotrombinu stafylotrombin katalyzuje přeměnu fibrinogenu na fibrin (tvorba chuchvalců, sraženin či úplné ztuhnutí plazmy ve zkumavce)

113 Presumptivní Bacillus cereus ČSN EN ISO 7932 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu presumptivního Bacillus cereus - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 C Vzorek 0. ředění MYP MYP MYP 10 g vzorku + 90 ml ŘR** - 1. ředění MYP 1 ml (-1. ředění) + 9 ml ŘR** - 2. ředění Roztěr 0,1 ml na MYP*** 1 ml (-(X+1). ředění + 9 ml ŘR** - X. ředění Vyhodnocení biochemických testů hemolýza (možné přídatné testy: G+ tyčinky s endosporami kataláza pozitivní) Výpočet a vyjádření výsledku *Minimálně minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele **ŘR..ředící roztok PPV *** ČR 0,2 ml, jinak 0,1 ml nebo 1 ml na celkem tři malé agarové plotny nebo na povrch větších. MYP MYP MYP MYP Kultivace: 30 C, 18±4 hodin, případně až 48 hodin, pokud nejsou kolonie viditelné Výběr typických kolonií pro konfirmaci Přeočkování až 5 náhodně vybraných typických (příp. atypických) kolonií na agar s ovčí krví průkaz hemolýzy, 30 C, 24±3 h Pokud souvislý nárůst a typické kolonie nejsou dobře izolované- nejdříve je subkultivovat na plotně kompletního agaru (18-24 h) a teprve poté konfirmovat dobře izolované kolonie. Příprava vzorku a desítkové ředění* Izolace na selektivní ztužená média Přeočkování na neselektivní agar Konfirmační testy Vyhodnocení testů 1. den 2. den 3. den 4. den Presumptivní= touto metodou nelze odlišit B. cereus a další blízce příbuzné, ale řidčeji se vyskytující druhy náležející do Bacillus cereus group (druhové skupiny) (B. anthracis, B. 113 thuringensis, B. weihenstephanensis, B. mycoides)

114 Bacillus cereus MYP agar Bacillus cereus ATCC MYP (mannitol, egg yolk, polymyxine agar) Složení média (l): masový extrakt 1 g, pepton 10 g, D-mannitol 10 g, chlorid sodný 10 g, fenolová červeň 0,025 g. Přidává se emulze polymyxinu a žloutková emulze. Polymyxin inhibuje růst doprovodné mikroflóry. B. cereus je manitol-negativní (manitol-pozitivní doprovodná mikroflóra se zbarví žlutě díky indikátoru fenolová červeň) a tvoří lecitinázu (zóna precipitace). Typické kolonie B. cereus velké růžové obvykle se zónou precipitace (některé kmeny mohou vytvářet lecitinázy málo či vůbec). Staphylococcus aureus ATCC

115 Krevní agar, Columbia agar Blood Agar Base No. 2 základ pro krevní agar č. 2 Složení (g/l): živné substráty 23,0 (kvasničný extrakt 5,0; proteose pepton nebo ekvivalentní pepton 15,0; hydrolyzát jater - 2,5) chlorid sodný 5,0; agar-agar 12,0. Po zklávování a zchlazení na C je přidáno 5-8% ovčí nebo koňské defibrinované krve (v závislosti na účelu). Pro ČSN EN ISO 7932 : 5-7 ml na 1000 ml základní půdy. Columbia agar s 5 % beraní krve Složení (l) Pankreatická natrávenina kaseinu 12,0 g, Peptická natrávenina zvířecí tkáně 5.0 Kvasničný výtažek 3.0, Hovězí výtažek 3.0, Kukuřičný škrob 1.0, Chlorid sodný 5.0, Agar 13.5, Defibrinovaná ovčí krev 5 %, ph 7,3 ± 0,2 vysoce výživné medium pro všeobecné použití určené k izolaci a kultivaci nenáročných a náročných mikroorganismů z klinických vzorků (kolonie větší a růst bujnější) dva peptony a kvasničný extrakt - podpora růsta kukuřičný škrob absorbuje toxické vedlejší produkty obsažené ve vzorku a slouží jako zdroj energie pro organismy obsahující alfa amylázy ovčí krev - zjištění hemolytických reakcí, faktor X (hem) potřebný pro růst mnoha patogenních druhů v mnoha evropských zemích se toto medium stalo nejčastěji používaným primárním izolačním médiem pro klinické vzorky. 115

116 Presumptivní Bacillus cereus ČSN EN ISO 7932 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu presumptivního Bacillus cereus - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 C K výpočtu se vyberou plotny, na nichž vyrostlo méně než 300 kolonií celkem a méně než 150 presumptivních kolonií. Mezní limit pro nízké počty je roven 10 (dle ČSN EN ISO 7218). Ke konfirmaci se vybírá pět presumptivních kolonií z každé misky použité k výpočtu. Konfirmace: β-hemolýza (úplná hemolýza projasnění kolem kolonií) (možné doplňkové testy: G+ tyčinky s endosporami kataláza pozitivní) 116

117 Kvasinky a plísně ČSN ISO (560650) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu kvasinek a plísní - Část 1: Technika počítání kolonií u výrobků s aktivitou vody vyšší než 0,95 Vzorek 0. ředění 10 g vzorku + 90 ml ŘR** - 1. ředění 1 ml (-1. ředění) + 9 ml ŘR** - 2. ředění. 1 ml (-(X+1). ředění + 9 ml ŘR** - X. ředění Příprava vzorku a desítkové ředění* DRBC DRBC Roztěr 0,1 ml na DRBC*** DRBC DRBC DRBC DRBC DRBC Izolace na selektivní ztužená média 1. den DRBC Kultivace: 25 C, 5 dní (a příp. 1-2 dny na rozp. světle), víčkem nahoru**** Odečet kolonií Výpočet a vyjádření výsledku Vyhodnocení 6. den *Minimálně dvě po sobě jdoucí ředění vysetá v paralele. **ŘR..ředící roztok pufrovaná peptonová voda (PPV) (dle ISO : 0,1% (hmotnostní) peptonová voda fyziologický roztok s 0,1 % peptonem) ***(příp. lze v případě nízkých počtů očkovat až tři plotny po 0,3 ml) ****Kultivace ploten v otevřeném plastovém sáčku-zabránění kontaminace termostatu v případě úniku spór plísní z misek. 117

118 Kvasinky a plísně Kvasinka: mezofilní aerobní mikroorganismus, který při 25 C na mykologickém agarovém médiu vytváří matné nebo lesklé okrouhlé kolonie obvykle s pravidelným okrajem a více či méně vypouklým povrchem. Plíseň: mezofilní aerobní vláknitý mikroorganismums, který při 25 C na mykologickém agarovém médiu vytváří ploché nebo chmýřovité propagule/zárodky (živá jednotka schopná růstu v živném médiu) nebo kolonie často se zbarvenými plodícími nebo sporulujícími strukturami. 118

119 DRBC Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 DRBC chloramfenikolový agar s dichloranem a bengálskou červení Složení (l): Pepton 5.0; glukóza 10.0; dihydrogenfosforečnan draselný 1.0; dichloran 0.002; síran hořečnatý 0.5; bengálská červeň 0.025; chloramfenicol 0.1; agar-agar ph: 5.6 ± 0.2 Nízké ph a chloramfenikol potlačují růst většiny bakterií. Bengálská červeň, která intracelulárně proniká do mikromycet, vede ke zmenšení velikosti kolonií a zabraňuje rozrůstání plísní (prevence jejich přerůstu přes pomalu rostoucí druhy). Dichloran má stejnou funkci zlepšení počítání kolonií. Volitelné přidání: chlortetracyklin hydrochlorid (vyšší inhibice bakterií při předpokládaném přerůstání např. syrové maso), stopové prvky (pro plný vývin morfologie zvláště pigmentace plísní). Zabránit expozici světla cytotoxické produkty rozkladu mohou snižovat množství mykoflory. Mucor racemosus ATCC 42647

120 Kvasinky a plísně ČSN ISO (560650) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu kvasinek a plísní - Část 1: Technika počítání kolonií u výrobků s aktivitou vody vyšší než 0,95 =DRBC agar ČSN ISO (560650) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu kvasinek a plísní - Část 1: Technika počítání kolonií u výrobků s aktivitou vody nižší nebo rovnou 0,95 =DG18 agar (agar s dichloranem a glycerolem) Složení (g/l) Živiny: Pepton 5.0; glukóza 10.0; Pufrovací systém: dihydrogenfosforečnan draselný 1.0; Inhibice rozrůstání kolonií: dichloran 0.002; Stopové prvky: síran hořečnatý 0.5; Inhibice: grampozitivních a gramnegativních bakterií - chloramphenicol 0.1; agar-agar ph:5.6 ± 0.2 at 25 C. Přídavek glycerolu (175 ml na 1 l média 18 %): snížení vodní aktivity na 0,95 prostředí pro xerofilní plísně a osmofilní kvasinky Wallemia sebi Eurotium rubrum 120

121 GKCH YGC Agar (Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar) - GKCH Složení (g/l): Kvasničný extrakt 5.0; glukóza 20.0; chloramfenicol 0.1; agar-agar ph: 6.6 ± 0.2 Chloramfenikol potlačuje růst většiny bakterií a je plně autoklávovatelný. Saccharomyces cerevisiae ATCC 9080 ČSN ISO a ČSN ISO platné od roku 2008, v dřívějších ISO normách pro stanovení kvasinek a plísní se používalo GKCH Aspergillus niger ATCC 16404

122 IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Identifikace na základě fenotypu: Fyziologické + biochemické znaky a) morfologie kolonie a buňky (Gramovo barvení, tvar) b) požadavky na teplotu, atmosféru, živné látky c) základní biochemické testy: oxidáza, kataláza, fermentace/oxidace glukózy, hemolýzy apod. d) Biochemické testy specifické pro určitou skupinu mikrorganismů testů Např. Bacillus cereus G+ tyčka tvořící endospóry, vlhké, snadno rostoucí kolonie při 37 C kataláza pozitivní, β-hemolýza, nefermentuje manitol + enzym lecitináza: roste v růžových koloniích se zónou precipitace na půdě MYP Souprava biochemických testů Microgen Bacillus ID (doba stanovení: 48 hodin) Images/Bacillus%20cereus%202(Gram%20stain).jpg tter164.html 122

123 Identifikace bakterií Získání čisté kultury z jediné kolonie -samostatnou dobře ohraničenou kolonii přeočkovat na neselektivní médium pro získání čisté kultury (biochemické identifikační testy nelze provádět spolehlivě s kulturou získanou izolací na selektivním médiu) 1. Zařazení do některé širší skupiny bakterií na mikroskopických a fyziologických znaků a základních biochemických vlastností a) Makroskopické znaky pouze orientační, nutno vždy ověřit Gramovým barvením a mikroskopií Barva, tvar, okraj, průřez, povrch a konzistence kolonií b) Mikroskopické znaky Gramovo barvení a tvar buněk, přítomnost endospor c) Fyziologické znaky Nároky na atmosféru a teplotu kultivace d) Biochemické vlastnosti Oxidáza, kataláza, hemolýza, fermentace/oxidaca glukózy aj. Zařazení do širší skupiny bakterií je usnadněno v případě izolace na selektivních médiích či selektivně-diagnostických médií, která ale nemusí a nejsou být zcela selektivní či selektivně-diagnostická nutno ověřit, které skupiny mikroorganismů na těchto médiích mohou růst, nutná kontrola kvality připravených médií (selektivita, specifita) 2. Určení v rámci zjištěné skupiny bakterií na základě dalších testů Např. ENTEROtest 24 sada 24 biochemických reakcí pro Enterobacteriaceae, nelze provádět bez předchozího kroku ad 1, tj. zařazení do této čeledi 123

124 Identifikace gramnegativních bakterií G- bakterie koky tyčinky oxidáza pozitivní snadno rostoucí obtížně rostoucí fermentace glukózy Neisseria Moraxella bez utilizace glukózy oxidáza pozitivní oxidace glukózy oxidáza negativní fermentace glukózy oxidace glukózy Haemophilus Legionella Bordetella Campylobacter Brucella Aeromonas Vibrio Alcaligenes Pseudomonas Enterobacteriaceae Acinetobacter Obr. 2 Zjednodušené schéma rozdělení některých významných gramnegativních bakterií izolovaných z potravin a klinických vzorků (autor SP) fermentující laktózu koliformní bakterie Escherichia, Citrobacter Enterobacter, Cronobacter Hafnia, Klebsiella nefermentující laktózu ureáza pozitivní Proteus ureáza negativní Salmonella Shigella Yersinia 124

125 Průkaz oxidázy Průkaz přítomnosti cytochromoxidasy c katalyzují transport elektronů z NADH na jejich akceptor kyslík - oxidasa pozitivní bakterie jsou aerobní - oxidasa negativní bakterie mohou být anaerobní, fakultativně anaerobní či i aerobní, ale pak nevlastní cytochrom oxidasu c (mohou ale mít jiné oxidasy) - Detekce: oxidace bezbarvých derivátů p-fenylendiaminu na modro-fialově zbarvené produkty (např. N, N, N, N - tetramethyl-p-fenylenediamin dihydrochlorid se oxiduje na indofenolovou modř) Postup kultura je přenesena na plochu navhlčenou činidlem pomocí platinové či plastové kličky (nikoliv železné! možná falešně pozitivní reakce), produkce oxidázy dojde ke vzniku sytě fialové až modré barvy do cca s v závislosti na formátu testu Oxidáza pozitivní G- bakterie (OXI +) Pseudomonas sp., Aeromonas sp., Vibrio sp., Campylobacter sp., Pasteurella sp., Moraxella sp., Legionella pneumophila aj. Oxidáza negativní G- bakterie (OXI -) Čeleď Enterobacteriaceae, Acinetobacter sp. 125

126 Metabolismus cukrů Bakterie zkvašují cukry za tvorby organických kyselin (např. octová, mléčná, propionová) detekce pomocí acidobazických indikátorů plynů jako jsou CO 2 a H 2 detekce v tekutém médiu - Durhamova zkumavka (plynovka) detekce ve ztuženém agaru (anaerobní fermentace) změny homogenity agaru ( roztrhání ) organických kyseliny a plynů současně Durhamova zkumavka Test v tekutém médiu na zkvašování cukrů za tvorby plynu a/nebo kyseliny: Zkumavky obsahují peptonovu vodu a 1% testovaného cukru (glukosa, sacharosa, laktosa, manitol, xylosa), plynovku a acidobazický indikátor. nezkvašuje tvorba kyseliny tvorba kyseliny a plynu /cho.html Acidobazický indikátor: fenolová červeň Anaerobní fermentace glukózy za tvorby kyseliny a plynu (TSI agar biochemické testy Salmonella spp.) očkování vpichem (anaerobní podmínky) acidobazický indikátor fenolová červeň roztrhání agaru 126

127 Metabolismus cukrů Metabolismus glukózy základní identifikační znak pro gramnegativní bakterie oxidativní metabolismus: tvorba kyseliny z glukózy nastává pouze za aerobních podmínek (+ malé množství CO 2 případně) fermentativní metabolismus: tvorba kyseliny nebo též plynu i za anaerobních podmínek anaerobní podmínky: Ztužená média: očkování vpichem (do média zbaveného kyslíku) Tekutá média: překryv parafínovým olejem BEZ UT. OX FERM Bez utilizace glukóza není metabolizována Oxidace glukózy pouze v přítomnosti kyslíku se tvoří z glukózy kyselina pozitivní (žlutá) pouze zkumavka bez překryvu parafínovým olejem (aerobní prostředí) Fermentace glukózy kyselina se tvoří z glukózy i v nepřítomnosti kyslíku obě zkumavky pozitivní (žlutá) (anaerobní prostředí) Anaerobní fermentace glukózy za tvorby kyseliny a plynu (TSI agar biochemické testy Salmonella spp.) očkování vpichem (anaerobní podmínky) acidobazický indikátor fenolová červeň + roztrhání agaru Hugh Leifsonovo glukosové médium: Pepton ze zvířecí tkáně, kvasničný extrakt, NaCl, glukóza (1 % - 10 g/l), bromothymolová modř 127

128 Metabolismus cukrů Fermentace glukózy Glukózový agar Složení (l): Enzymaticky natrávený kasein 10.0 g Kvasničný extrakt 1.5 g Glukóza 10.0 g Chlorid sodný 5.0 g Bromkresolová modř acidobazický indikátor Agar 9-18 g Anaerobní prostředí Očkování vpichem Bezprostředně před použitím se médium rozehřeje ve vroucí vodě nebo proudící páře po dobu 15 min, pak se rychle ochladí na inkubační teplotu Přídavek sterilního parafinového oleje nad povrch agaru

129 INDOL test Pracovní postup: na filtrační papír se nanese kapka roztoku INDOL testu očkovací kličkou se do ní vetře kolonie inkubace - při laboratorní teplotě cca 5 min E.coli Citrobacter Enterobacter

130 Rod Proteus Bakterie rodu Proteus (čeleď Enterobacteriaceae) typický plazivý růst příbojové vlny Raussův fenomén Plazivost je inhibována přídavkem deoxycholát sodného Salmonella_selective_media Proteus sp. inokulovaný do středu krevního agaru (37 C, 24 hod) 130

131 ENTEROtest 24 N Escherichia coli Výsledkem biochemické identifikace je soubor biochemických vlastností, který je srovnán s databází vlastností referenčních kmenů, na které byl test aplikován - Vyhodnocení přes software TNW - Vyhodnocení přes kódovou knihu Dle tabulky barevných hodnocení reakcí vyhodnoťte jednotlivé reakce (+/-) a zaznamenejte do záznamového archu. V jednotlivých sloupcích sečtěte čísla příslušná k pozitivním reakcím. Získaný číselný kód najděte v PDF vyhodnocovací knize a zaznamenejte výsledek identifikace, % identifikace, Tin a hodnocení identifikace.

132 ENTEROtest 24 N U každého identifikovaného taxonu jsou uvedeny následující informace: a/ procento identifikace ( % id. ) - udává pravděpodobnost, s jakou daný výsledek odpovídá danému taxonu b/ T-index (Tin) - udává, do jaké míry daný výsledek odpovídá nejtypičtějšímu výsledku pro daný taxon; hodnota (Tin) může ležet v intervalu od 0 do 1, a je nepřímo úměrná počtu atypických testů. c/ seznam atypických znaků ( AZ ) u prvního taxonu s uvedeným procentem pozitivních reakcí d/ seznam dodatkových testů s uvedeným procentem pozitivních reakcí u nedostatečně odlišených taxonů e/ komentář vytvořený na základě hodnot % id a Tin, definující úroveň spolehlivosti identifikace

133 Skupina mikroorganismů G+ koky kataláza pozitivní G+ koky kataláza negativní Čeledi/rody Staphylococcus Micrococcus Rothia, Kocuria aj. Streptococcus Enterococcus aj. G+ tyčinky mezofilní Bacillus spp. Paenibacilllus Brevibacillus Listeria G- tyčinky fermentující glukózu G- tyčinky nefermentující glukózu Identifikace bakterií a kvasinek Corynebacterium Enterobacteriaceae Vibrio Aeromonas Pseudomonas Acinetobacter Stenotrophomonas Příklady dostupných identifikačních souprav v mikrotitračním provedení* (liší se množstvím a druhem použitých reakcí, spektrem identifikovaných bakterií a rychlostí identifikace) STAPHYtest 24 (Erba Lachema, ČR) API Staph, RAPIDEC Staph (biomérieux, Francie) Microgen TM Staph-ID (Microgen, Velká Británie) STREPTOtest 24, EN-COCCUStest (Erba Lachema, ČR) API -STREP (biomérieux, Francie) Microgen TM Strep-ID (Microgen, Velká Británie) Microgen TM Bacillus-ID (Microgen, Velká Británie) API Listeria (biomérieux, Francie) Microgen TM Listeria-ID (Microgen, Velká Británie) API Coryne (biomérieux, Francie) ENTEROtest 24/24 N/16/Rapid/Screen (Erba Lachema, ČR) API 20E, API Rapid 20E (biomérieux, Francie) Microgen TM GNA-ID (Microgen, Velká Británie) NEFERMtest 24/24N (Erba Lachema, ČR) - (identifikace zahrnuje též Vibrio a Aeromonas) API -NE (biomérieux, Francie) Microgen TM GNA-ID (Microgen, Velká Británie) G- tyčinky mikroaerobní Campylobacter API -CAMPY (biomérieux, Francie) G- koky Neisseria, Branhamella (Haemophilus: API NH) G+ a G- anaerobní Clostridium bakterie Bifidobacterium Propionibacterium Kvasinky Candida Trichosporon Saccharomyces aj. NEISSERIAtest (Erba Lachema, ČR) API NH (biomérieux, Francie) ANAEROtest 24 (Erba Lachema, ČR) API 20A, Rapid ID 32A (biomérieux, Francie) CANDIDAtest 21, CANDIDA-Screen (Erba Lachema, ČR) API 20C AUX (biomérieux, Francie) 133

134 Identifikace G+ bakterie G+ bakterie koky tyčinky kataláza pozitivní kataláza negativní mající endospóry (sporulující) bez endospór (nesporulující) Staphylococcus Micrococcus STAPHYtest 24 α-, β-hemolýza Streptococcus STREPTOtest 24 γ-hemolýza Enterococcus STREPTOtest 24 Bacillus Clostridium Microgen TM Bacillus-ID ANAEROtest 24 Listeria Lactobacillus Corynebacterium API Coryne API Listeria Lactococcus ANAEROtest 24 ANAEROtest 24 Zjednodušené schéma rozdělení některých významných grampozitivních bakterií izolovaných z potravin a klinických vzorků

135 Průkaz katalázy Kataláza Enzym, který katalyzuje rozklad peroxidu vodíku (toxický) na vodu a kyslík. Tento enzym vlastní aerobní a fakultativně anaerobní bakterie, které jsou vybaveny cytochromovým systémem. 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 kataláza bubliny Průkaz katalázy do kapky 3%peroxidu vodíku přeneseme kličkou vyšetřovanou kolonii. V pozitivním případě se uvolňují bublinky kyslíku. G+ koky: Staphylococcus sp., Micrococcus sp., Kocuria sp., Dermacoccus sp. Macrococcus sp., Rothia sp. kataláza pozitivní, Streptococcus sp., Enterococcus sp., Lactococcus sp. - kataláza negativní G+ tyče tvořící endospory: Bacillus sp. (fak. anaerob) kataláza pozitivní Clostridium sp. (anaerob) kataláza negativní G- tyčinky: Enterobacteriaceae - kataláza pozitivní (mimo Shigella dysenteriae typ 1)

136 Hemolýza Ke zjištění hemolytické aktivity se používá krevního agaru, příp. dalších agarů s krví. Tvorba hemolyzinů je typická pro řadu patogenních bakterií, ale i některých podmíněně patogenních či nepatogenních (některé streptokoky, Staphylococcus aureus, hemolytické Escherichia coli, Pseudomonas, některé bacily apod.) V okolí kolonie může dojít buď k úplné hemolýze nebo neúplné hemolýze Při neúplné hemolýze neboli viridaci dochází k částečnému rozrušení hemoglobinu na zelenohnědý pigment methemoglobin a erytrocyty nejsou lyzovány. Při úplné hemolýze dojde k úplnému rozložení hemoglobinu i lýzi erytrocytů, takže kolem kolonie dojde k vytvoření průhledného dvorce. Úplná hemolýza je často nepřesně obecně označována jako β- hemolýza, neúplná hemolýza poté jako α-hemolýza. Přesné označení však závisí na označení hemolyzinu, který hemolýzu vyvolává, což je rodově odlišné. Rod Streptococcus/Enterococcus β hemolyzin α hemolyzin γ hemolýza S. aureus úplná hemolýza způsobená α hemolyzinem 136

137 Skupina mikroorganismů G+ koky kataláza pozitivní G+ koky kataláza negativní Čeledi/rody Staphylococcus Micrococcus Rothia, Kocuria aj. Streptococcus Enterococcus aj. G+ tyčinky mezofilní Bacillus spp. Paenibacilllus Brevibacillus Listeria G- tyčinky fermentující glukózu G- tyčinky nefermentující glukózu Identifikace bakterií a kvasinek Corynebacterium Enterobacteriaceae Vibrio Aeromonas Pseudomonas Acinetobacter Stenotrophomonas Příklady dostupných identifikačních souprav v mikrotitračním provedení* (liší se množstvím a druhem použitých reakcí, spektrem identifikovaných bakterií a rychlostí identifikace) STAPHYtest 24 (Erba Lachema, ČR) API Staph, RAPIDEC Staph (biomérieux, Francie) Microgen TM Staph-ID (Microgen, Velká Británie) STREPTOtest 24, EN-COCCUStest (Erba Lachema, ČR) API -STREP (biomérieux, Francie) Microgen TM Strep-ID (Microgen, Velká Británie) Microgen TM Bacillus-ID (Microgen, Velká Británie) API Listeria (biomérieux, Francie) Microgen TM Listeria-ID (Microgen, Velká Británie) API Coryne (biomérieux, Francie) ENTEROtest 24/24 N/16/Rapid/Screen (Erba Lachema, ČR) API 20E, API Rapid 20E (biomérieux, Francie) Microgen TM GNA-ID (Microgen, Velká Británie) NEFERMtest 24/24N (Erba Lachema, ČR) - (identifikace zahrnuje též Vibrio a Aeromonas) API -NE (biomérieux, Francie) Microgen TM GNA-ID (Microgen, Velká Británie) G- tyčinky mikroaerobní Campylobacter API -CAMPY (biomérieux, Francie) G- koky Neisseria, Branhamella (Haemophilus: API NH) G+ a G- anaerobní Clostridium bakterie Bifidobacterium Propionibacterium Kvasinky Candida Trichosporon Saccharomyces aj. NEISSERIAtest (Erba Lachema, ČR) API NH (biomérieux, Francie) ANAEROtest 24 (Erba Lachema, ČR) API 20A, Rapid ID 32A (biomérieux, Francie) CANDIDAtest 21, CANDIDA-Screen (Erba Lachema, ČR) API 20C AUX (biomérieux, Francie) 137

138 Stupnice McFarland Odhad koncentrace mikrobiální suspenze (KTJ/ml) na základě měření jejího zákalu (turbidity) a) přístrojem (denzilametr), b) na základě srovnání se zákalem směsi roztoků 1% BaCl 2 / 1% H 2 SO 4 Turbidita τ charakterizuje zeslabení intenzity primárního paprsku, způsobené rozptylem, při jeho průchodu disperzní soustavou tvořenou vrstvou o tloušťce x. Koncentrace (KTJ/ml) při daném McFarland závisí na velikosti a tvaru buněk při využití pro odečet KTJ/ml nutno sestavit kalibrační křivku pro daný mikroorganismus. McFarland Standard 0, ,0% BaCl 2 (ml) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4 1,0% H 2 SO 4 (ml) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6 Přibližná buněčná denzita (1X10^8 KTJ/ml) 1,5 3,0 6,0 9,0 12,0 % Transmitance (600 nm) 74,3 55,6 35,6 26,4 21,5 Absorbance (600 nm) 0,08-0,1 0,257 0,451 0,582 0,

139 Stupnice McFarland 139

140 Stupnice McFarland 140

141 Stupnice McFarland Absorbance je veličina používaná ve fotometrii a spektrofotometrii. Udává, jak mnoho světla bylo pohlceno měřeným vzorkem. Turbidita τ charakterizuje zeslabení intenzity primárního paprsku, Io, způsobené rozptylem, při jeho průchodu disperzní soustavou tvořenou vrstvou o tloušťce x. 141

142 KTJ/ml Stupnice McFarland E. coli 3,50E+09 3,00E+09 2,50E+09 2,00E+09 y = 3E+08x 1,50E+09 1,00E+09 5,00E+08 0,00E McFarland McFarland stupnice cca KTJ (x10 6 /ml) (E. coli) 1% BaCl 2 / 1% H 2 SO 4 (ml) 0.5 < / * / * / * / ,2* / ,5* / ,8* / ,1* / ,4* / ,7* / ,0* /9.0 KTJ kolonie tvořící jednotky Koncentrace mikrobiální suspenze při daném McFarland závisí i na velikosti buněk čím větší buňky, tím nižší koncentrace při stejném McFarland 1 McFarland E. coli - cca 10 8 KTJ/ml 1 McFarland Bacillus spp. - cca 10 7 KTJ/ml 1 McFarland kvasinky cca 10 6 KTJ/ml 142