Kultivační metody v potravinářské mikrobiologii. Sabina Purkrtová

Transkript

1 Kultivační metody v potravinářské mikrobiologii Sabina Purkrtová

2 VYŠETŘOVACÍ METODY Metody průkazu ( kvalita ) zjištění přítomnosti cílového mikroorganismu v testované potravině přítomen/nepřítomen Metody stanovení počtu ( kvantita ) zjištění počtu buněk cílového mikroorganismu v testované potravině vztažených na g, ml Kultivační metody průkazu a kultivační metody stanovení počtu -založeny na kultivaci mikroorganismů, jejich identifikaci a stanovení počtu -mikroorganismus je v dané potravině kultivován a/nebo z ní izolován -využití tekutých a/nebo pevných půd

3 Kultivace mikroorganismů Klasické mikrobiologické metody studují bakterie nikoliv jako jednotlivé buňky, ale jako populaci dceřiných buněk vzniklých dělením jedné buňky mateřské. Masa takovéto bakteriální populace je poté viditelná na ztužených médií jako kolonie nebo jako zákal v tekuté pomnožovací půdě a je schopná dávat detekovatelný signál při biochemických testech. Růst kolonie Předpoklad, že dobře izolovaná kolonie vyrostla pouze z jedné buňky je teoretický. Počet kolonií na plotně se tedy nedává do rovnosti s počtem buněk, ale označuje se jako počet kolonii tvořících jednotek- KTJ. Při ideálním stavu odpovídá kolonii tvořící jednotka jedné buňce. 3

4 salmonella-ifood-tv.jpg Kultivace mikroorganismů Schopnost mikroorganismu přežívat a rozmnožovat se ( růst ) za daných podmínek závisí na podmínkách životního prostředí a jejich kompatibilitě s fyziologickými a biochemickými vlastnostmi daného mikroorganismu 1) fyzikální faktory (teplota, tlak, UV záření, γ záření, ph, osmotický tlak, atmosféra) 2) chemické faktory (zdroje C, zdroje N a ostatní živiny, přítomnost antimikrobiálních látek, jiných chemických látek) 3)biologické faktory (vliv ostatních mikroorganismů) schopnost růst a růstová rychlost při dané teplotě, ph, atmosféře, osmotickém tlaku apod. v závislosti na přítomnosti živin a dalších látek potřebných pro metabolismus Kultivovatelné mikroorganismy vs. nekultivovatelné mikroorganismy 4

5 harmaceutical-industry/mlt-other-media- Clostridium/Reinforced-Clostridial-Broth-M443 Kultivační půdy Rozdělení dle definovanosti složení: Komplexní média (tekutá, ztužená, tuhá) vycházejí z živočišných nebo rostlinných tkání a pletiv, často jsou opracovány enzymy (peptony, tryptony), pro většinu heterotrofních MO Syntetická média (tekutá, ztužená) definovaná média tvořená směsí jednoduchých sloučeniny, známé složení, pro specifické typy heterotrofních MO, chemoautotrofů, fototrofů, mikrobiologické eseje Rozdělení dle konzistence složení: Tekutá média (bujóny) příjem živin celým povrchem buňky, Ztužená média = tekutá média + přídavek ztužující látky (agar, želatina, guma) Izolované kolonie (diagnostika pouhým okem) Želatina bílkovina, rychlý rozklad, agar polysacharid z mořských čas, odolný k mikrobiálním enzymům - převládající činidlo, konečná koncentrace obvykle 15 g/l Tuhá média (např. plátky mrkve, chleba hlavně plísně)

6 Kultivační půdy Základní složky půd pro chemoheteroorganotrofní mikroorganismy (bakterie vyskytující se v potravinách, kvasinky, plísně) Zdroje dusíku peptony/tryptony, bílkovinné hydrolyzáty, aminokyseliny Hydrolytické štěpení bílkovin různého původu (maso, sója, želatina, kasein, rostlinná pletiva apod.) proteolytickými enzymy (pepsin, trypsin, papain, pankreatin) Tyto látky mohou být též zdrojem energie a uhlíku, ale jejich utilizace probíhá pomaleji. Některé tryptony též zdroj vitamínů. Zdroje energie a uhlíku - hlavně glukóza a další cukry Růstové faktory (vitamíny, sérum, krev, NADH...) Kvasničný autolyzát zdroj vitamínů (též zdroj N, C a energie), půdy s přídavkem beraní nebo koňské krve, půdy s přídavkem NADH Minerální soli a kovy NaCl osmotický tlak ( 0,85-0,90 % NaCl fyziologický roztok) Fosforečnany, sírany, Ca, Mg, Fe, Mn a stopové prvky - v odpovídajících hladinách zlepšují růst MO Pufrovací soli (rozpustné fosforečnany, acetáty, ) Pro udržení stabilní hodnoty ph v průběhu kultivace 6

7 Všeobecné kultivační půdy Neselektivní, všeobecné kultivační půdy umožňují růst všech mikroorganismů, pro které poskytují vhodné nutriční látky Např. nenáročné bakterie - PCA (plate count agar), živný agar, náročnější bakterie Columbia agar s 5 % beraní/koňské krve kvasinky, plísně Sabouradův agar s 4 % maltózou/4 % glukózou PCA - Plate Count Agar (Casein-peptone Dextrose Yeast Agar) Agar z kaseinového peptonu s dextrózou a kvasničným extraktem Složení (g/l): Pepton z kaseinu - 5,0 g; Kvasničný extrakt - 2,5 g; D (+) glukosa - 1,0 g; Agar-agar 14,0 g; Použití: Stanovení celkového počtu mikroorganismů teplota kultivace 30 C 72 h : při této teplotě a času narostou i kvasinky a plísně 7

8 Selektivní kultivační půdy Selektivní kultivační půdy obsahují další složky (selektivní činidla), která jsou schopna potlačit růst některé skupiny nežádoucích mikroorganismů anebo zvýhodnit růst určité (cílové) skupiny MO ze vzorku na detekovatelnou úroveň bez toho, aby stimulovala růst ostatní bakteriální populace (nabohacovací kultivační půdy) Povrchově aktivní látky Složky žluči, žlučové soli, další povrchově aktivní sloučeniny (sulfát kys. laurové, tergitol) Antibiotika (ATB) Umožňují cílenou selektivitu v závislosti na spektru účinnosti Anorganické soli Chlorid lithný inhibuje proti G- a enterokoky, tetrathionan inhibuje G+ a koliformní bakterie, azid sodný inhibuje G- Barviva Akridinová a trifenylmetanová barviva Krystalová violeť, brilantová a malachitová zeleň 8

9 Diagnostické kultivační půdy Diagnostické kultivační půdy obsahují látky umožňující detekovat vizuálně (změna barvy kolonie, vznik zóny) činnost určitých enzymů specifických pro daný mikroorganismus Např. zkvašování cukrů (glukóza, laktóza aj.) médium obsahuje daný cukr jako substrát Při zkvašování dochází ke změně ph indikovány acidobazickými barvami neutrální červeň, bromokrezolový purpur)- změna barvy kolonií v závislosti na schopnosti zkvašovat přítomný substrát Chromogenní půdy Speciální typ diagnostických kultivačních půd, substrát pro sledovaný enzym je uměle připraven jako chromogen nebo fluorogen působením enzymu dojde k odštěpení části molekuly a změně barvy či fluorescence Selektivně-diagnostické půdy Obsahují kombinaci selektivních a diagnostických složek Inhibice růstu nežádoucích mikroorganismů, podpora růstu žádoucích mikroorganismů, odlišení žádoucích mikroorganismů na základě vzhledu kolonií

10 Čeleď Enterobacteriaceae Čeleď Enterobacteriaceae Gramnegativní fakultativně anaerobní rovné tyčinky, některé z nich pohyblivé, Většina rodů roste dobře při 37 C, ačkoliv některé rostou lépe při C Fermentují glukózu, oxidáza negativní a kataláza pozitivní (mimo Shigella dysenteriae typ 1) Schopny růst v přítomnosti žlučových solí (adaptace na střevní trakt teplokrevných zvířat) Jednotlivé druhy celosvětově rozšířeny (půda, voda, rostliny a zvířata, člověk - součást přirozené střevní mikroflóry) Zástupci - rody: Calymmatobacterium, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Cronobacter, Erwinia, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Morganella, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia Většina rodů a druhů je nepatogenních, ale některé jsou podmíněně patogenní a některé druhy jsou nebezpečnými původci vážných i smrtelných nemocí (např. Salmonella, Shigella, Y. pestis, některé kmeny E.coli).

11 VČŽG VČŽG (Violeť, Červeň, Žlučové kyseliny, Glukosa) Agar půda s violetovou červení, žlučí a glukózou Selektivní půda pro Enterobacteriaceae Escherichia coli ATCC 8739 Typické složení (l): pepton 7 g; kvasničný extrakt 3 g, chlorid sodný 5 g; D(+) glukosa 10 g; směs žlučových solí 1,5 g; methylčerveň 0,03 g; krystalová violeť 0,002 g; agar-agar 13 g. Selektivní složka Krystalová violeť inhibuje růst doprovodné grampozitivní bakteriální flóry ze vzorku. Žlučové kyseliny inhibují růst doprovodné mikroflóry a selektivně podporují růst Enterobacteriaceae Diagnostická složka Fermentace glukosy produkce kyselin je indikována změnou barvy přidaného acidobazického indikátoru methylčerveně. Půda není pro Enterobacteriaceae zcela specifická stejný vzhled mohou vykazovat např. aeromonády. Vzhled kolonií Červené, obklopené načervenalou precipitační zónou či bez zóny Bezbarvé Mikroorganismy Enterobacteriaceae a jiné Žádné Enterobacteriaceae nejsou přítomné Shigella flexneri ATCC 29903

12 Enterobacteriaceae Koliformní bakterie Podskupina čeledi Enterobacteriaceae (biochemické vlastnosti podobné E. coli) Fermentují laktózu (přítomnost enzymu β-galaktosidáza) Podmíněný indikátor fekálního znečištění (mohou pocházet i z dalších zdrojů) Např. rody : Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter Escherichia coli indikátor fekálního znečištění (může být nalezena v zažívacím traktu a fekáliích člověka a zvířat) přítomnost v pitné vodě indikuje nedávnou fekální kontaminaci vyšší riziko přítomnosti patogenů přítomnost v potravinách indikuje špatnou hygienu či nedostatečné skladovací podmínky (došlo k jejich pomnožení Většina kmenů (mimo některé patogenní kmeny cca 3-4 %) produkuje enzym β-d-glukuronidázu

13 Agar dle MacConkeyho Složení (l): Pankreatická natrávenina želatiny 17,0 g, Pankreatická natrávenina kaseinu 1,5, Peptická natrávenina zvířecí tkáně 1,5, Laktóza 10,0, Žlučové soli 1,5, Chlorid sodný 5,0, Neutrální červeň 0,03, Krystalová violeť 0,001 Agar 13,5, ph 7,1 ± 0,2 Selektivně-diagnostické médium pro izolaci a rozlišení druhů Enterobacteriaceae a dalších gramnegativních tyček z klinických vzorků či vyšetření potravin. Výživná složka Směs několika druhů peptonu Selektivní složka Krystalová violeť inhibuje růst doprovodné grampozitivní bakteriální flóry ze vzorku (v tomto užití zvláště stafylokoky, enterokoky). Žlučové kyseliny inhibují růst doprovodné mikroflóry a selektivně podporují růst Enterobacteriaceae nižší koncentrace nižší selektivita Diagnostická složka Fermentace laktózy produkce kyselin je indikována změnou barvy přidaného acidobazického indikátoru neutrální červeně - bezbarvé nebo růžové až červené kolonie jsou produkovány v závislosti na schopnosti izolátu fermentovat laktózu. 13

14 TBX Chromocult TBX agar (trypton bile X-glucuronid)=chromogenní půda Escherichia coli ATCC Složení (l): pepton 20 g; žlučové soli No. 3 1,5 g; X-ß-D-glukuronid 0,075 g; agar-agar 15 g. Selektivně-diagnostické chromogenní médium pro β-d-glukuronidáza pozitivní kmeny E. coli Inhibiční složka: Růst doprovodné mikroflóry je inhibován přídavkem žlučových solí a kultivační teplotou 44 C. Diagnostická (chromogenní složka) E. coli se odlišuje od ostatních koliformních bakterií syntézou enzymu β- D-glukuronidázy, který je schopen štěpit chromogenní substrát 5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-D-glukuronid (X-ß-D-glukuronid). Dochází ke štěpení vazby mezi chromoforem 5-bromo-4-chloro-3-indolyl a D-glukuronidem, odštěpení chromoforu vede k modrozelenému zbarvení kolonií E. coli. Vzhled kolonií modrozelené indikace přítomnosti β-d-glukuronidázy Bezbarvé Mikroorganismy E. coli glukuronidáza negativní E. coli (3-4 % kmenů) schopné růstu při 44 C (např. E. coli O157) (další glukuronidáza negativní E. coli jako E. coli O157:H7 při 44 C nejsou schopny růst) Escherichia coli DSMZ 502

15 Fluorogenní médium pro E. coli Přítomnost MUG (4-methylumbelliferyl) v médiu β-d-glukuronidáza pozitivní kmeny E. coli jsou schopny odštěpit z tohoto substrátu β- D-glukuronidázy fluoreskující sloučeninu methyl umbelliferon. Po osvětlení UV světlem při 365 nm fluoreskuje.

16 Horizontální metoda průkazu Průkaz přítomnosti či nepřítomnosti byť jen jediné životaschopné buňky cílového mikroorganismu v testované potravině, obvykle 25 g (dáno Nařízením č. 2073/2005) Kultivační metoda stanovení: Získání cílového mikroorganismu jako jednotlivě rostoucích kolonií, které lze dále identifikovat 1. KROK POMNOŽENÍ CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU V POTRAVINĚ V TEKUTÉM MÉDIU Primární pomnožení: X g, ml potraviny + 9X ml pomnožovacího média resuscitace a opatrné pomnožení stresovaných mikroorganismů (nižší nebo žádná koncentrace selektivních činidel, přídavek složek pro potlačení toxicity selektivních činidel) Sekundární pomnožení: přenos 0,1-10 ml z primárně pomnožené suspenze intenzivní pomnožení cílového mikroorganismu na koncentraci detekovatelnou v izolačním kroku 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z POMNOŽOVACÍHO MÉDIA NA ZTUŽENÉ MÉDIU Vyočkování z pomnožovacího média na selektivní nebo selektivně-diagnostické půdy Nárůst cílového mikroorganismu v jednotlivých typických koloniích 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ Vyočkování typických kolonií na neselektivní kultivační médium a provedení příslušných biochemických testů Přímé provedení biochemických testů nemusí poskytovat spolehlivé reakce

17 Horizontální metoda průkazu Příklad: ISO :1996: Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes - Část 1: Metoda průkazu 1. KROK POMNOŽENÍ LISTERIA MONOCYTOGENES PŘÍTOMNÉ V POTRAVINĚ V TEKUTÉM MÉDIU Primární pomnožení: X g, ml potraviny + 9X ml pomnožovacího média POLOVIČNÍ BUJÓN DLE FRASER (poloviční koncentrace inhibujících složek- akriflavin, kyselina nalidixová - opatrné pomnožení stresovaných mikroorganismů Kultivace: 30 C, 24 h ±3 hodiny Sekundární pomnožení: přenos 0,1 ml z primárně pomnožené suspenze do 10 ml plného Fraserova bujónu (plná koncentrace inhibujících látek) Kultivace: 35/37 C, 48 ±3 hodiny 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z POMNOŽOVACÍHO MÉDIA NA ZTUŽENÉ MÉDIU Vyočkování z obou pomnožovacích médií na plotnu dvou selektivních ztužených půd - povinná půda ALOA (kultivace: 37 C, 24 ±24 hodiny) + druhá volitelná půda (Oxford agar, Palcam agar)

18 L. monocytogenes bujón dle Frasera Pomnožovací médium: bujón podle Frasera Složení (g/l): Proteose peptone 5.0; pepton z kaseinu 5.0; kvasniční extrakt 5.0; masový exktrakt 5.0; NaCl 20.0; hydrogenfosforečnan disodný 9.6; dihydrogenfosforečnan draselný 1.35; eskulin 1.0; chlorid lithný 3.0. ph: 7.2 ± 0.2 at 25 C. Suplementy: Suplement citrát amonno-železitý: 500 mg/l pro poloviční Fraserův bujón Selective Supplement: akriflavin 12.5 mg; kyselina nalidixová 10 mg /l pro poloviční Fraserův bujón Vysoký obsah živin Pufrovací systém - udržování stálého ph, které se mění vlivem biochemické činnosti rostoucích mikroorganismů Inhibiční látky inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií Detekce β-d-glukosidázy rodu Listeria: Glukóza eskulin je štěpen na eskuletin, který s železitým kationtem tvoří komplex v průběhu růstu L. monocytogenes dochází ke zčernání média E2BC87AC12574C6002FD7BD?opendocument&LG=EN&

19 L. monocytogenes ALOA agar ALOA agar (agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho) složení báze g/l agar-agar 13.0 Pepton z masa 18.0 Pepton z kaseinu 6.0 Kvasničný extrakt 10.0 Pyruvát sodný 2.0 Glycerofosforečnan hořečnatý 1.0 Ochrana přes letálním účinkem inhibičních látek glukóza 2.0 bohaté na živiny NaCl 5.0 Hydrogenfosforečnan disodný 2.5 pufrovací systém chlorid lithný 10.0 Síran hořečnatý 0.5 inhibice doprovodné mikroflóry Selektivní suplement (mg/l): Amphotericin B 10 mg; Ceftazidime 20 mg; Nalidixic acid sodium salt 20 mg; Polymyxin B sulphate U. 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranosid 0.05; Chromogenní substrát detekce β-d-glukosidázové aktivity Rod Listeria má β-d-glukosidázovou aktivitu tvorba modrozelených kolonií Detekční systém Obohacovací suplement (g/l): L-α-fosfatidylinositol 2 g Detekce enzymu fosfatidylinositol fosfolipázy C (PI-PLC) - virulenčního faktoru L. monocytogenes Fosfolipázová aktivita L. monocytogenes průhledná haló zóna kolem kolonií (pro L. ivanovii tvorba zpožděná)

20 ALOA agar L. monocytogenes ALOA agar (agar pro listerie podle Ottavianiho a Agostiho) Růst Vzhled L. monocytogenes Výborný Modrozelené kolonie Haló zóna L. ivanovii Výborný Pokud haló zóna, tak po 48 hodinách L. inocua Zpomalený Bez haló zóny L. seeligeri inhibovaný Bez haló zóny Typické kolonie brané pro další konfirmaci: Modrozelené kolonie s haló zónou nutno potvrdit (mohou být L. monocytogenes, L. ivanovii či některé bacily) Listeria monocytogenes ATCC Listeria innocua ATCC 33090

21 L. monocytogenes - Oxford agar Oxford agar složení báze g/l agar-agar 13.0 Pepton 23.0 škrob 1.0 méně výživný agar NaCl 5.0 Chlorid lithný 10.0 inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií Selektivní suplement (mg/l): Cycloheximid mg, kolistin sulfáte 10.0 mg Acriflavin 2.5 mg, Cefotetan 1.0 mg, Fosfomycin 5.0 mg eskulin 1.0; citrát amonno-železitý 0.5 L. monocytogenes hydrolyzuje eskulin na eskuletin, který tvoří černý komplex s železitými kationty tvoří hnědozelené kolonie s haló efektem Listeria monocytogenes ATCC Detekční systém Listeria innocua ATCC 33090

22 L. monocytogenes - PALCAM agar Oxford agar složení báze g/l agar-agar 13.0 Pepton 23.0; glucose 0.5; starch 1.0 živiny Kvasničný extrakt 3.0; NaCl 5.0 lithium chloride 10.0 inhibice doprovodné mikroflóry a některých druhů listerií Selektivní suplement (mg/l): Polymyxin B sulfate 5.0 mg, Ceftacidime 12.0 mg Acriflavine 2.5 mg eskulin 1.0; citrát amonno-železitý 0.5 L. monocytogenes hydrolyzuje eskulin na eskuletin, který tvoří černý komplex s železitými kationty hnědo-zelené kolonie s černou haló zónou D(-)mannitol 10.0; phenol red Odlišení manitol pozitivních G+ bakterií (např. stafylokoky, enterokoky) žlutý nárůst Listeria innocua ATCC Detekční systém Listeria monocytogenes ATCC 19118

23 Horizontální metoda průkazu Příklad: ISO :1996: Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Listeria monocytogenes - Část 1: Metoda průkazu 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ Vyočkování 1-5 typických kolonií na neselektivní kultivační KTJ ztužené médium TSYEA (Agar s tryptonem, sójovým peptonem a kvasničným extraktem) Z každé plotny selektivního agaru vzít jednu a při negativním potvrzení až do pěti typických kolonií Kultivace: 37 C, 24 ±3 hodiny a provedení příslušných biochemických testů Biochemické testy pro potvrzení rodu Listeria Gramovo barvení: G+ štíhlé, krátké tyčinky Kataláza pozitivní Motilita Listeria spp. jsou pohyblivé při 25 C Biochemické testy pro potvrzení druhu Listeria monocytogenes Hemolýza Produkce kyseliny z CAMP test Druh Rhamnózy Xylózy S. aureus R. equi L. monocytogenes

24 Konfirmace rodu Listeria Výběr pro konfirmaci: Z každé plotny selektivního agaru vzít jednu a při negativním potvrzení až do pěti typických kolonií Konfirmační biochemické testy nutno provádět s kulturami narostlými za optimálních, nezátěžových podmínek INKUBACE NA SELEKTIVNÍCH PŮDÁCH ZATĚŽUJE I CÍLOVÉ MIKROORGANISMY, PROVÁDĚNÉ TESTY MOHOU POSKYTOVAT NESPOLEHLIVÉ REAKCE KTJ Inokulace na TSYEA (trypton-sójový agar s kvasničním extraktem) Živiny (g/l): trypton 17.0, pepton ze sóji 3.0, kvasničný extrakt 6.0, glukóza monohydrát 2.5, Osmotický a pufrovací systém: hydrogenfosforečnan disodný 2.5, NaCl 5.0, Bakteriologický agar 15.0, (g/l) Inkubace: 35 C nebo 37 C, h či déle, až je nárůst dostatečný

25 Konfirmace rodu Listeria Rodová konfirmace Gramovo barvení: G+ štíhlé, krátké tyčinky Kataláza pozitivní Kataláza: enzym, který katalyzuje rozklad toxického peroxidu vodíku na vodu a kyslík 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 kataláza bubliny Průkaz katalázy do kapky 3%peroxidu vodíku přeneseme kličkou vyšetřovanou kolonii. V pozitivním případě se uvolňují bublinky kyslíku. Motilita Listeria spp. jsou pohyblivé při 25 C Přímý test za použití mikroskopie 1 kolonie suspendována ve zkumavce s trypton-sójovým bujónem s kvasničným extraktem a inkubována při 25 C, 8-24 h - pohyb je sledován po nakápnutí kultury na podložní sklíčko Agar pro motilitu Inokulace vpichem, inkubace 48 h (až pět dnů, pokud není růst dostatečný) při 25 C typický nárůst podél vpichu ve tvaru deštníku důsledek motility

26 Druh Konfirmace L. monocytogenes Hemo lýza Pozn. L. monocytogenes + úzké, jasné, světlé zóny β-hemolýzy L. innocua - bez hemolýzy L. ivanovii + široká, neohraničená zóna β-hemolýzy L. seeligeri + slabá zóna β-hemolýzy L. welshimerii (+) hemolýza: degradace hemoglobinu či lýze erytrocytů L. grayi - přidaných do půdy (hemolýza) : subsp.grayi α- hemolýza - viridace - tvoří se meziprodukty (zelenohnědé zbarvení)/β- hemolýza - projasnění půdy způsobené difúzí L. grayi - uvolněného hemoglobinu do okolí/γ - negativní hemolýza - subsp.marrayi barva půdy beze změny Inokulace na krevní agar společně s pozitivní (L. monocytogenes) a negativní (L. innocua) kontrolou, inkubace při 35 nebo 37 C, 24±2 h V: variabilní reakce, (+): slabá reakce, +: > 90 % kmenů pozitivní reakce, -: žádná reakce Poznámka : Vzácně existují kmeny L. monocytogenes, které nevykazují β-hemolýzu anebo pozitivní reakci CAMP testu za podmínek daných normou ISO

27 Konfirmace L. monocytogenes Rhodococus equi L. monocytogenes Krevní agar 1 cm 1-2 mm L. ivanovii L. inocua tested isolates (L. inocua) Staphylococcus aureus Test dle Christie-Atkins-Munch-Peterson = (CAMP) test β-hemolytický Staphylococcus aureus a nehemolytický Rhodococcus equi Inkubace při 35 C, h L. monocytogenes (listeriolysin O způsobuje hemolýzu erythrocytes) a hemolytické reakce L. seeligeri jsou slabě zvýrazněny v zóně v blízkosti S. aureus streak, zatímco hemolytická reakce L. ivanovii je silně zvýšena v zóně R. equi. Ostatní druhy netvoří hemolýzu anebo pouze slabou hemolýzu bez synergestického efektu (L. welshimerii).

28 Konfirmace L. monocytogenes Hemolýza Produkce kyseliny z CAMP test Druh Rhamnózy Xylózy S. aureus R. equi L. monocytogenes L. innocua - V L. ivanovii L. seeligeri (+) - L. welshimerii (+) V L. grayi subsp.grayi L. grayi subsp.marrayi V V: variabilní reakce, (+): slabá reakce, +: > 90 % kmenů pozitivní reakce, -: žádná reakce Poznámka : Vzácně existují kmeny L. monocytogenes, které nevykazují β-hemolýzu anebo pozitivní reakci CAMP testu za podmínek daných normou ISO Produkce kyseliny z cukrů: L-rhamnóza, D-xylóza Inokulace do média s jednotlivými cukry, inkubace při 35 C nebo 37 C až 5 dnů Média obsahují acidobazický indikátor pozitivní reakce (tvorba kyseliny) je indikována změnou barvy z fialové na žlutou, obvykle během 24 až 48 hodin

29 Konfirmace L. monocytogenes API Listeria 24 hodinová identifikace všech druhů Listeria sp. Výrobce Biomérieux patentované biochemické testy (DIM) Miniaturizované biochemické testy jsou zaočkovány inokulem o nízké bakteriální koncentraci (0.5 McFarland) SinglePath L.Mono Příklad LFA (lateral flow assay) imunochemická metoda detekce Listeria monocytogenes po pomnožení ve Fraserově bujónu aneb BLEB bujónu

30 Salmonella ČSN EN ISO 6579 Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda průkazu bakterií rodu Salmonella Neselektivní předpomnožení (pre-enrichment) 25g vzorku ml PPV (pufrovaná peptonová voda) kultivace: 37 C, 18±2 h 1 ml 10 ml Müller Kauffman bujón kutivace 37 C, 24±3 h 0,1 ml 10 ml Rappaport - Vasilliadis kultivace 41 C, 24±3 h Selektivní pomnožení (enrichment) Sterilní očkovací kličky s očkem o průměru 3 mm či o objemu 10 µl BGA volitelná selektivní půda 37 C, 24±3 h XLD povinná selektivní půda 37 C, 24±3 h BGA volitelná selektivní půda 37 C, 24±3 h XLD povinná selektivní půda 37 C, 24±3 h Izolace na selektivnědiagnostické půdy PCA, 37 C, 24 hodin, biochemická konfirmace, sérologická konfirmace a sérotypizace Vyočkovat z každé plotny nejméně jednu kolonii považovanou za typickou nebo suspektní na živný agar. Další čtyři kolonie se vyberou až poté, je-li první kolonie negativní. (Pro epidemiologické studie: konfirmace nejméně pěti kolonií. Pokud typických kolonií méně než pět na misce, vyberou se všechny typické nebo suspektní ke konfirmaci.) Konfirmace typických (příp. atypických kolonií)

31 Salmonella Pufrovaná peptonová voda Složení (l) : pepton 10 g; NaCl 5 g; dodekahydrát hydrogenfosforečnanu disodného 9 g; dihydrogenfosforečnan draselný 1,5 g. Pepton bohatý na obsah živin umožňuje resuscitaci buněk, subletálně poškozených či oslabených vlivem zacházení s potravinou či přídavkem konzervačních látek. Fosfátový pufrovací systém chrání bakterie před změnami ph v médiu v důsledku metabolismu, které by jinak nastaly v důsledku metabolismu rostoucích buněk. RAPPAPORT a VASSILIADIS (RVS Broth) obohacené bujóny pro salmonely Složení (l): pepton ze soji 4,5 g, hexahydrát chloridu hořečnatého 29 g; NaCl 8 g; hydrogenfosforečnan didraselný 0,4 g; dihydrogenfosforečnan draselný 0,6; malachitová zeleň 0,036 g. ph: 5.2 ± 0.2 at 25 C, kultivace 41 C, 24±3 h Selektivní podmínky pro růst salmonel v přítomnosti doprovodné bakteriální mikroflóry, zvláště Enterobacteriaceae) - vyšší rezistence k malachitové zeleni a vyššímu osmotickému tlaku (přídavek chloridu hořečnatého), nízkému ph, vyšší teplotě a nižším nároku na živiny (pepton ze sóji). Fosfátový pufrovací systém. RVS bujón není vhodný pro selektivní pomnožení S. typhi and S. paratyphi A. MULLER-KAUFFMANN (MK) bujón s tetrathionanem Složení média (l): masový extrakt 0,9 g; pepton z masa 4,5 g; kvasničný extrakt 1,8 g; NaCl 4,5 g; uhličitan vápenatý 25,0; thiosíran sodný 40,7 g; volská žluč 4,75 g. Přidává se jodid draselný 5 g; jód 4 g a briliantová zeleň 0,01 g. ph: 7.6 ± 0.2 at 25 C, kultivace 37 C, 24±3 h Inhibice doprovodné mikroflóry: žluč, briliantová zeleň G+ bakterie, tetrathionan (tvořen z thiosíranu přídavkem jódu) koliformní a dalších enterobakterie. Salmonella, Proteus a další druhy redukují tetrathionan za vzniku kyseliny sírové (následně pufrována uhličitanem vápenatým).

32 Vzhled kolonií Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné se zónami precipitace Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, na povrchu slizké se zónami precipitace Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné, mohou mít černý střed Žluté, obklopené žlutými zónami, neprůsvitné Žluté, obklopené žlutými zónami, průsvitné s černými středem Kolonie mající stejnou barvu jako agarové médiem, průsvitné Kolonie mající černý střed, téměř průsvitné a mají narůžovělou barvu v důsledku změny barvy indikátoru Oranžové, lehce neprůsvitné Růžové kolonie s tmavším růžovým středem Salmonella XLD agar Xylóza Lysin Deoxycholát Agar (XLD) Složení média (l): kvasničný extrakt 3 g; NaCl 5 g; D(+) xylóza 3,75 g; laktóza 7,5 g; sacharóza 7,5 g; L(+) lysin 5 g; deoxycholát sodný 1 g; thiosíran sodný 6,8 g; citrát železitoamonný 0,8 g; fenolová červeň 0,08 g; agar-agar 14,5 g. Zkvašování cukrů (xylóza, laktóza a sacharóza) za vzniku kyselin zežloutnutí acidobazického indikátor fenolová červen. Produkce sulfanu v přítomnosti thiosíranu sodného a železitých solí tvorba precipitátu černého sulfidu železitého ve středu kolonií. Žluté kolonie, které mají nebo nemají černý střed Mikroorganismy Escherichia coli, Enterobacter, Aeromonas Klebsiella Citrobacter (laktosa-positivní kmeny) Serratia, Hafnia Proteus vulgaris, nejčastěji Proteus mirabilis Shigella, Providencia, Pseudomonas Typické kolonie Salmonella Salmonella typhosa (xylóza-pozitivní kmeny) Sulfan neprodukující salmonely (S. paratyphi A) Laktóza pozitivní salmonely Salmonella enteritidis NCTC 5188 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

33 Salmonella BG agar Salmonella enteritidis NCTC 5188 Brilliant-green agar BGA (Agar s briliantovou zelení, fenolovou červení a laktózou) Složení média (l): pepton z masa 7 g; NaCl 5 g; laktóza 15 g; fenolová červeň 0,04 g; brilliantová zeleň 0,005 g; agar-agar 13 g. Inhibiční systém: briliantová zeleň G+ bakterie, též Salmonella Typhi a rod Shigella, 0,2 % deoxycholátu sodného inhibice plazivosti kolonií rodu Proteus Diagnostický systém: zkvašování laktózy je indikováno zežloutnutím acidobazického indikátoru fenolové červeně z červené na žlutou (v alkalickém prostředí tmavě červený) Vzhled kolonií Světle růžové, průsvitné, obklopené červenými zónami Žlutozelené, neprůsvitné, obklopené žlutozelenými zónami Mikroorganismy Laktóza-negativní: Salmonella, výjimečně Proteus a Citrobacter Laktóza-pozitivní: E. coli, Enterobacter, Klebsiella. Ostatní jsou převážně inhibovány. Salmonella typhimurium ATCC 14028

34 Konfirmace rodu Salmonella TSI agar (očkovat na povrch šikmé části a vpichem do svislé části u dna) Agar s močovinou (na povrch šikmé části) Dekarboxylace L-lyzinu (tekutá půda těsně pod hladinu) tvorba kyseliny z glukózy (+ žlutá u dna/-červená u dna) tvorba plynu z glukózy (+ trhliny nebo bubliny u dna) tvorby kyseliny z laktózy a/nebo sacharózy (+ žlutý povrch) tvorba sirovodíku (+ zčernání u dna) Štěpení močoviny vzniká amoniak fenolová červeň se zbarví do růžova a později na temně třešňově červenou + zákal a fialové zbarvení - žluté zbarvení TSI = Triple Sugar Iron Agar agar s glukózou, laktózou, sacharózou a citranem železitým

35 Konfirmace rodu Salmonella β-galaktosidáza (ONPG) - štěpí laktózu -supenze ve fyz. roztoku + toluen + substrát ONPG o-nitrophenyl-beta- D-galaktopyranoside + ONPG je hydrolyzován na o- nitrofenol (žlutý) a galaktózu VP test (Voges-Proskauerův test) - schopnost produkce acetoinu z glukózy + růžové/červené zbarvení po přidání reagencií Tvorba indolu - Agar s tryptonem a tryptofanem - Detekce vzniklého indolu Kovácsovým činidlem + utvoření červeného prstence - žlutohnědý prstenec

36 Konfirmace rodu Salmonella Kmeny Salmonella spp. TSI: tvorba kyseliny z glukózy TSI: tvorba plynu z glukózy TSI: tvorby kyseliny z laktózy TSI: tvorba kyseliny ze sacharózy TSI: tvorba sirovodíku Štěpení močoviny Dekarboxylace lyzinu Tvorba β-galaktozidázy Voges-Proskauerova reakce Tvorba indolu %...vyjadřuje procento kmenů s pozitivní reakcí

37 Sérologická konfirmace Salmonella spp. Sérotypizace - Kaufmann-Whiteovo schéma salmonely rozděluje podle antigenních vlastností a jejich kombinací, čímž je pro každý sérotyp vytvořena specifická antigenní formule. Antigeny se nacházejí v buněčné stěně (somatické O-Antigeny), v bičících (flagelární H-antigeny) a v kapsulích (Vi Antigeny). Somatické O-Antigeny jsou endotoxickou součástí lipopolysacharidových struktur, které se nachází na vnější straně buněčné stěny. Vyvolávají specifickou imunitní reakci systému a zároveň jsou faktory patogenity, neboť chrání bakterie před bakteriolytickým účinkem komplementu. Podjednotky O-antigenu jsou tvořeny několika sacharidovými zbytky, jejich pořadí pak určuje variabilnost O-antigenu. Jeho variabilita nám umožňuje rozlišovat až 67 séroskupin, které značíme písmeny nebo číslicemi. Bičíkové H-antigeny se vyskytují u pohybu schopných salmonel, tento antigen je tvořen z bílkovin, převážně flagelinem. Bičíkové H-antigeny mají dvě rozdílné antigenní fáze (první specifická fáze H1 a druhá nespecifická fáze H2). Odlišují se primární strukturou, která je způsobena střídavou expresí jednotlivých genů řídících tvorbu bičíků. Můžeme se setkat i s monofázními izoláty, u nichž se vyskytuje pouze jeden typ bičíkového H-antigenu. Rozlišujeme celkem 89 typů H-antigenu. Kapsulární Vi antigeny jsou složeny z pouzderných povrchových polysacharidů a jsou zodpovědné za virulenci. Jsou charakteristické pro sérovary S. Typhi, S. Dublin a S. Hirschfeldii.

38 Sérologická konfirmace Salmonella spp. Druh Poddruh Počet sérovarů Salmonella enterica 2557 enterica I 1531 salamae II 505 arizonae IIIa 99 diarizonae IIIb 336 houtenae IV 73 indica VI 13 Salmonella bongori V 22 Sérovar = specifická kombinace jednotlivých antigenů Antigenní formule O-antigeny (písmena, číslice) : fáze H1 antigenů (a-z): fáze H2 antigenu (1-12). Salmonely izolované z člověka a zvířat nejčastěji Salmonella enterica poddruh I enterica sérovary značeny jmény ve spojitosti s jejich rolí v medicíně a veterinářství -Salmonella Typhi původce tyfu, Salmonella Abortusovis potraty u ovcí dle místa první izolace, pokud není onemocnění hostitelsky specifické např. Salmonella Panama. Sérovary poddruhů IIIa a IIIb (arizonae a diarizonae) a sérovary poddruhů II, IV, V a VI popsané po roce 1966 jsou značeny pouze antigenní formulí. Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium je např. 4,5,12:i:2.

39 Sérologická konfirmace Salmonella spp. určení poddruhu (biochemické testy kmeny různých podruhů mohou mít stejné antigeny) rozlišení O, H a Vi antigenů aglutinačními testy za použití antisér Rozlišení izolátů s jednou antigenní H fází a s dvěma fázemi inokulace na médium, které obsahuje antisérum k určitému H-antigenu. Výsledkem je, že bakterie, které mají pouze tento určitý H-antigen, budou imobilizované antisérem, kdežto bakterie syntetizující také druhý H-antigen, budou pohybu schopné a tak porostou v celém médiu. Sklíčková aglutinace: Někteří bakteriální původci infekčních chorob uvolňují při svém množení v tekutém prostředí nadbytek svých pouzderných antigenů. Antigeny lze prokazovat např. pomocí latexových mikročástic pokrytých protilátkou proti příslušnému antigenu - částice výrazně aglutinují. Identifikace na základě aglutinace s omnivalentními, polyvalentními, monovalentní O, H a Vi antiséry.

40 ENTEROTEST 24 Souprava ENTEROtest 24 je určena pro rutinní identifikaci významných druhů střevních bakterií z čeledi Enterobacteriaceae pomocí 24 biochemických testů. Pro přípravu testu: zákalu, který odpovídá stupni 1 McFarlandovy zákalové stupnice, tj. cca 3 x 10 8 buněk v ml (zákal stupně 1 je definován zákalem, který vytvoří sraženina BaSO 4 při smíchání 0,1 ml roztoku 1 % bezvodého BaCl 2 a 9,9 ml 1 % H 2 SO 4 )

41 ENTEROTEST 24 dekarboxylace Schopnost růst na citrátu jako jediném zdroji C (půda: Simonsův citrát) utilizace malonátu deaminace Zkvašování cukrů Hydrolýza eskulinu Zkvašování cukrů

42 Biochemické testy Erba Lachema ANAEROtest 23 - anaerobní bakterie, vyskytujících se nejčastěji v klinickém materiálu a v potravinách. NEFERMtest 24 - gramnegativní nefermentující bakterie a čeleď Vibrionaceae, Aeromonadaceae a druhu Plesiomonas shigelloides. STAPHYtest 24 - rod Staphylococcus a další grampozitivní kataláza pozitivní koky. STREPTOtest 24 - rody Streptococcus a Enterococcus a další grampozitivních kataláza negativní koky. CANDIDA-Screen je určena pro screeningové rozlišení nejčastěji se vyskytujících klinicky významných druhů kvasinek, CANDIDAtest 21 - rutinní identifikace kvasinek převážně z klinického materiálu Biomérieux API Gram negative Identification (např. API Listeria 24-hour identification of all Listeria species), API Gram positive Identification, API Anaerobe Identification a další. API 20E Enterobacteriacae a další nenáročné gramnegativní bakterie Microgen Microgen Bacillus identifikace mezofilních druhů rodu Bacillus

43 Horizontální metoda stanovení počtu Stanovení počtu kolonie tvořících jednotek v testované potravině, obvykle 25 g (dáno Nařízením č. 2073/2005) Kultivační metoda stanovení: Získání cílového mikroorganismu jako jednotlivě rostoucích kolonií, které lze dále identifikovat 1. KROK PŘÍPRAVA SÉRIE DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ TESTOVANÉ POTRAVINY První ředění: X g, ml potraviny + 9X ml ředícího média Druhé a další ředění: 1 ml předchozího ředění + 9 ml ředícího média 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z JEDNOTLIVÝCH DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ Roztěr určitého objemu suspenze na povrch selektivního média (0,1 ml/0,2 ml na plotnu ve dvou paralelách nebo 1 ml celkově na tři plotny) pro aerobní mikroorganismy Přeliv 1 ml suspenze temperovaným selektivním médiem v paralele pro fakultativně anaerobní či anaerobní mikroorganismy 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ, STANOVENÍ POČTU KTJ A VÝPOČET KTJ/G NEBO KTJ/ML Vyočkování 5 typických a/nebo atypických kolonií na neselektivní kultivační médium a provedení příslušných biochemických testů Přímé provedení biochemických testů nemusí poskytovat spolehlivé reakce

44 Desítkové ředění Mikrobiální suspenze o neznáme koncentraci KTJ/ml (CFU/ml) výsev na plotny roztěrem Rozsah kolonií počitatelných na plotnách: obvykle KTJ/plotna (případně KTJ/plotna) Cíl: naředit suspenzi na takovou koncentraci, aby při výsevu na plotny bylo získáno požadované množství kolonií Koncentrace mikrobiálních suspenzí se uvažuje v řádech desítek např. 5,5*10 5 KTJ/ml Jak odhadnotu kolikrát výchozí suspenzi ředit? V závislosti na aplikaci Např. počítání buněk v Burkerově komůrce 44

45 Přeliv a roztěr al%20growth%20ss5.htm

46 ČSN ISO (560096) Enterobacteriaceae Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metody pro průkaz a stanovení počtu bakterií čeledi Enterobacteriaceae - Část 2: Technika počítání kolonií definice dle ČSN ISO : Enterobacteriaceae - mikroorganismy, které tvoří charakteristické kolonie (růžové až červené nebo fialové se zónou nebo bez zóny precipitace) na půdě s violetovou červení, žlučí a glukózou (VČŽG) a které fermentují glukózu a mají negativní oxidázovou reakci 1. KROK PŘÍPRAVA SÉRIE DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ TESTOVANÉ POTRAVINY Ředící médium: pufrovaná peptonová voda 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z JEDNOTLIVÝCH DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ Přeliv 1 ml suspenze půdou VČŽG za vytvoření semianaerobního prostředí (nejdříve 10 ml, po úplném zatuhnutí převrstvit dalšími 15 ml) Kultivace: 37 C, 24 h±2 h 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ, STANOVENÍ POČTU KTJ A VÝPOČET KTJ/G NEBO KTJ/ML Vybrat plotny z dvou po sobě jdoucích ředění vhodné k výpočtu a z nich náhodně vybrat 5 kolonií pro konfirmaci a přeočkovat na živný agar Kultivace: 37 C, 24 h±2 h Konfirmace: test na oxidázu a fermentaci glukózy (u oxidáza negativních)

47 Enterobacteriaceae Průkaz oxidázy/cytochromoxidázy Průkaz enzymů (testy zaměnitelné) přítomných u všech aerobních bakterií s respiračním metabolismem Podstata testu: reakce derivátů p-fenylendiaminu se železem obsaženým v cytochromových respiračních komlexech barevná reakce. Používáno hlavně pro identifikaci G- tyčinek Oxidáza pozitivní G- bakterie (OXI +) Pseudomonas sp., Aeromonas sp. Oxidáza negativní G- bakterie (OXI -) Čeleď Enterobacteriaceae, Acinetobacter sp. Fermentace glukózy (za tvorby kyseliny) Glukózový agar: pepton, 1% testovaného cukru (glukóza), indikátor bromthymolová modř, agar. Při zaočkování vpichem probíhá utilizace glukózy v anaerobním prostředí = fermentace, průběh fermentace je indikován změnou barvy (zežloutnutí). Modifikace: Glukózový bujón anaerobní prostředí zajištěno převrstvením parafínovým olejem: Test OF oxidace (zežloutnutí pouze při přístupu vzduchu bez převrstvení par. olejem)/fermentace (bez přítomnosti kyslíku) glukózy Fermentace glukózy za vzniku plynu: vložena plynovka (Durhamova zkumavka)

48 Dle ČSN EN ISO 7218 a ČSN ISO Plotny dvou po sobě jdoucích ředění v paralele, pro které platí méně jak 150 presumptivních kolonií na plotně a méně jak 300 všech kolonií více jak 15 presumptivních kolonií alespoň na jedné plotně Pro výpočet se dále uvažují počty konfirmovaných kolonií (a) na každé plotně a b A * C a N V ( n1 0,1n 2 ). d Enterobacteriaceae- výpočet C..počet presumptivních kolonií, A...počet presumptivních kolonií vzatých pro konfirmaci, z toho b kolonií konfirmaci potvrzeno, a..počet konfirmovaných kolonií na misce Σa..počet konfirmovaných kolonií ze všech ploten zvolených k výpočtu V..objem inokula v ml očkovaného na každou z ploten n 1 počet ploten zvolených k výpočtu z prvního vybraného ředění n 2 počet ploten zvolených k výpočtu z druhého vybraného ředění d.ředící faktor odpovídající prvnímu ředění, které bylo vybráno k výpočtu > 150 presumptivních kolonií na všech plotnách naočkovanými všemi použitými ředěními (d 1 nejvyšší ředění/d 2...nejnižší ředění) Žádné konfirmované kolonie: méně než 150/(d 2 x V) Enterobacteriaceae v ml/g Některé kolonie konfirmované: více než 150x(b/A)/(d 1 x V) Enterobacteriaceae v ml/g 0 konfirmovaných kolonií na obou plotnách nejvyššího ředění Méně než 1/(d x V) Enterobacteriaceae v mililitru nebo gramu d.ředící faktor výchozí suspenze nebo prvního z použitých ředění zvoleného k výpočtu 1-15 presumptivních kolonií (a > 0 konfirmovaných) na obou plotnách nejvyššího ředění = odhad nízkých počtů a konfidenční meze Příloha A ČSN ISO (použit odhad více než méně než )

49 E. coli ČSN ISO (560079) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu betaglukuronidázopozitivních Escherichia coli - Část 2: Technika počítání kolonií vykultivovaných při 44 C s použitím 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-d-glukuronidu 1. KROK PŘÍPRAVA SÉRIE DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ TESTOVANÉ POTRAVINY Ředící médium: pufrovaná peptonová voda 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z JEDNOTLIVÝCH DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ 1 ml testované suspenze přelít asi 15 ml půdy TBX temperované na 44 C 47 C Doba od zaočkování inokula a přelití inokula půdou nesmí přesáhnout 15 minut Kultivace: 44 C, hodin 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ, STANOVENÍ POČTU KTJ A VÝPOČET KTJ/G NEBO KTJ/ML Odečet kolonií dle ČSN ISO (560079) Konfirmace není prováděna vzhledem k selektivitě agaru a podmínkám kultivace

50 Bacillus cereus ČSN EN ISO 7932 (560092) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu presumptivního Bacillus cereus - Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 C Presumptivní= touto metodou nelze odlišit B. cereus a další blízce příbuzné, ale řidčeji se vyskytující druhy (B. anthracis, B. thuringensis, B. weihenstephanensis, B. mycoides) 1. KROK PŘÍPRAVA SÉRIE DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ TESTOVANÉ POTRAVINY Ředící médium: pufrovaná peptonová voda 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z JEDNOTLIVÝCH DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ 0,2 ml testované suspenze rozetřít na plotnu MYP, po rozetření se inokulum nechá vsáknout 15 minut Kultivace: 30 C, 18±4 hodin, případně až 48 hodin, pokud nejsou kolonie viditelné 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ, STANOVENÍ POČTU KTJ A VÝPOČET KTJ/G NEBO KTJ/ML Vybrat plotny z dvou po sobě jdoucích ředění vhodné k výpočtu a z nich náhodně vybrat 5 kolonií pro konfirmaci a přeočkovat na krevní agar Kultivace: 30 C, 24±2 hodin Konfirmace: pozitivní test na katalázu a průkaz β hemolýzy Pokud souvislý nárůst a typické kolonie nejsou dobře izolované- nejdříve je subkultivovat na plotně kompletního agaru (18-24 h) a teprve poté konfirmovat dobře izolované kolonie.

51 Bacillus cereus MYP agar Bacillus cereus ATCC MYP (mannitol, egg yolk, polymyxine agar) Složení média (l): masový extrakt 1 g, pepton 10 g, D-mannitol 10 g, chlorid sodný 10 g, fenolová červeň 0,025 g. Přidává se emulze polymyxinu a žloutková emulze. Polymyxin inhibuje růst doprovodné mikroflóry. B. cereus je manitol-negativní (manitol-pozitivní doprovodná mikroflóra se zbarví žlutě díky indikátoru fenolová červeň) a tvoří lecitinázu (zóna precipitace). Typické kolonie B. cereus velké růžové obvykle se zónou precipitace (některé kmeny mohou vytvářet lecitinázy málo či vůbec). Staphylococcus aureus ATCC 6538

52 Bacillus cereus β hemolýza β hemolýza Bacillus cereus γ hemolýza α hemolýza Blood Agar Base No. 2 základ pro krevní agar č. 2 Složení (g/l): živné substráty 23,0 (kvasničný extrakt 5,0; proteose pepton nebo ekvivalentní pepton 15,0; hydrolyzát jater - 2,5) chlorid sodný 5,0; agar-agar 12,0. Po zklávování a zchlazení na C je přidáno 5-8% ovčí nebo koňské defibrinované krve (v závislosti na účelu). Pro ČSN EN ISO 7932 : 5-7 ml na 1000 ml základní půdy. Konfirmace: pozitivní test na katalázu a průkaz β hemolýzy

53 Koagulázapozitivní stafylokoky ČSN EN ISO (560092) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu koagulázapozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy)-část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera 1. KROK PŘÍPRAVA SÉRIE DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ TESTOVANÉ POTRAVINY Ředící médium: pufrovaná peptonová voda 2. KROK IZOLACE CÍLOVÉHO MIKROORGANISMU Z JEDNOTLIVÝCH DESÍTKOVÝCH ŘEDĚNÍ 0,2 ml testované suspenze rozetřít na plotnu Baird-Parkerova agaru, po rozetření se inokulum nechá vsáknout 15 minut Kultivace: 37 C, 48 hodin 3. KROK KONFIRMACE A IDENTIFIKACE ZÍSKANÝCH TYPICKÝCH KOLONIÍ, STANOVENÍ POČTU KTJ A VÝPOČET KTJ/G NEBO KTJ/ML Vybrat plotny z dvou po sobě jdoucích ředění vhodné k výpočtu a z nich náhodně vybrat 5 kolonií pro konfirmaci a přeočkovat na a) krevní agar kultivace: 30 C, 24 hodin - průkaz β hemolýzy b) BHI (brain-heart infusion, mozkosrdcová infúze) kultivace: 37 C, 24 hodin - průkaz přítomnosti plazmakoagulázy

54

55

56

57

58 Stanovení počtu metodou filtrace 1. KROK FILTRACE TEKUTINY (OBVYKLE 100 ML) 2. KROK PŘENOS FILTRU SE ZACHYCENÝMI MIKROORGANISMY NA SELEKTIVNÍ MÉDIUM 3. KROK KONFIRMACE TYPICKÝCH KOLONIÍ

59 Stanovení počtu metodou MPN 1. KROK PŘÍPRAVA VÝCHOZÍ SUSPENZE TESTOVANÉ POTRAVINY První ředění: X g, ml potraviny + 9X ml ředícího média (pokud se jedná o tekutinu je tato tekutina použita přímo jako výchozí suspenze) 2. KROK INOKULACE VÝCHOZÍ SUSPENZE DO SÉRIE PO 3 NEBO 5 ZKUMAVKÁCH SE SELEKTIVNÍ POMNOŽOVACÍ PŮDOU (SPP) 10 ml 2X SPP + 10 ml výchozí suspenze = 1 g/ zkumavka 10 ml 1X SPP + 1 ml výchozí suspenze=0.1 g/ zkumavka 10 ml 1X SPP + 1 ml 2.ředění výchozí suspenze =0.01 g/ zkumavka 10 ml 1X SPP + 1 ml 3.ředění výchozí suspenze=0.001 g/zkumavka etc. 3. KROK KONFIRMACE VYBRANÉ SÉRIE PO 3 NEBO 5 ZKUMAVKÁCH SE ZÍSKANOU POZITIVNÍ REAKCÍ

60 Stanovení počtu metodou MPN Platná norma ČSN P ISO/TS (560079) Mikrobiologie potravin a krmiv - Horizontální metoda stanovení počtu beta-glukuronidázopozitivních Escherichia coli - Část 3: Technika nejvýše pravděpodobného počtu s použitím 5-bromo-4-chloro-3- indolyl beta-d-glukuronidu (MPN most probable number) 1. KROK PŘÍPRAVA VÝCHOZÍ SUSPENZE TESTOVANÉ POTRAVINY První ředění: X g, ml potraviny + 9X ml pufrované peptonové vody (pokud se jedná o tekutinu, je tato tekutina použita přímo jako výchozí suspenze) 2. KROK INOKULACE VÝCHOZÍ SUSPENZE DO SÉRIE PO 3 NEBO 5 ZKUMAVKÁCH SE SELEKTIVNÍM TEKUTÝM MÉDIEM (modifikovaná glutamanová půdy s minerální složkou) 10 ml 2X SPP + 10 ml výchozí suspenze = 1 g/ zkumavka 10 ml 1X SPP + 1 ml výchozí suspenze=0.1 g/ zkumavka 10 ml 1X SPP + 1 ml 2.ředění výchozí suspenze =0.01 g/ zkumavka 10 ml 1X SPP + 1 ml 3.ředění výchozí suspenze=0.001 g/zkumavka etc. Kultivace: 37 C, 24±2 hodiny 3. KROK KONFIRMACE POZITIVNÍCH ZKUMAVEK (ZEŽLOUTNUTÍ JAKO DŮKAZ FERMENTACE LAKTÓZY) Pozitivní reakce- zežloutnutí jako důkaz fermentace laktózy vyočkování na TBX kultivace: 44 C, hodin pozitivní výsledek: nárůst sytě modrých či modrozelených kolonií Získán číselný kód počtu pozitivních zkumavek pro jednotlivá ředění

61 Stanovení počtu metodou MPN Odhad nejvýše pravděpodobného počtu 1) Výpočet dle vzorce IS0 7218: ) Software programy 3) Použití MPN tabulek B.5 ISO 7218:2007 MPN indexy pro 3 následující ředění se 3 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (4 3 možností) B.7 ISO 7218:2007/ Tabulka A.1 ISO 7251:2005(E) MPN index pro 3 následující ředění s 5 zkumavkami, kdy první zkumavka obsahuje 1 g vzorku (6 3 možností).) Počet pozitivních výsledků Index MPN Kategorie Hranice spolehlivosti (95%) Dolní limit Horní limit Kategorie: Pokud je analýza provedena přesně, poté 95 % kombinací spadá do kategorie 1; 1.4% do kategorie 2; 0.9 % do kategorie 3 and 0.1 % do kategorie 0.

62 Stanovení počtu metodou MPN Výběr série zkumavek pro výpočet Vzor ek Tekutý vzorek 10 ml 1 ml 10-1 ml 10-2 ml 10-3 ml MPN Ostatní vzorky 1 g 10-1 g 10-2 g 10-3 g 10-4 g Tek. vzorek (ml -1 ) Ost. vzorky (g -1 ) x x10 2 Dolní limit 0.2x x10 2 Horní limit 4.0x x10 2 Pokud x gramů vzorku v první zkumavce, násobit výsledek 1/x) např. pro 10 g násobit 0.1, pro 0.1 g = násobit 10 Počet pozitivních výsledků Index MPN Kat ego rie Hranice spolehlivosti (95%) Dolní limit Horní limit 1 lepší kategorie 3-3-2: vyšší celkový počet pozitivních zkumavek

63 GLP příprava médií ISO/TS :2009, ISO/TS :2003 Pokyny pro přípravu a výrobu kultivačních médií TESTOVÁNÍ MÉDIA - PRODUKTIVITA, SELEKTIVITA A SPECIFITA - Možné přístupy: kvantitativně, semikvantitativně, kvalitativně Testovací kultury kontrolní kmeny ze sbírek mikroorganismů (dodávány lyofilizované či na želatinových discích) - Stabilní charakteristika, v případě testování médií hlavně kmeny izolované z potravin a vody dobře rostoucí kmeny s typickou charakteristikou, slabě rostoucí kmeny, kmeny s negativní charakteristikou, plně či částečně inhibované

64 Produktivita Produktivita (P R productivity ratio) vyjadřuje schopnost růstu mikroorganismu v testovaném médiu ve srovnání se schopností růstu na referenčním médiu Pro kvantitativní vyjádření je definována následně: P R =N S / N O N S - celkový počet KTJ na testovaném médiu N O celkový počet KTJ na příslušném referenčním médiu (min. 100 KTJ) Hodnoty P R neselektivní média..min. 0,7 selektivní média min. 0,1 Semi-kvantitativní růstový index - (inokulum KTJ/ml) Kvalitativní: vizuální kontrola

65 Selektivita Selektivita (S F ) demonstruje, že médium je schopno potlačit růst nežádoucích mikroorganismů vyjádřena v jednotkách log 10 units S F = D O - D S D O..difference between the highest dilution showing growth of at least 10 colonies of the reference medium. D S.. highest dilution showing comparable growth on the test medium. Hodnota S F necílový (tj. inhibovaný mikroorganismus) min. 2 Pro semikvantitativní a kvalitativní metody by měl být růst nežádoucích mikroorganismů inhibován částečně nebo zcela (pro inokulum KTJ/ml)

66 Specifita Specificita (fyziologická charakteristika) Specifita kultivačního média označuje jeho schopnost rozlišit příbuzné organismy na základ přítomnosti/nepřítomnosti nebo míry biochemické odpovědi a velikosti kolonií a jejich morfologii. Cílový mikroorganismus roste na daném médiu ve shodě se specifikací.

67 Metody pro testování médií Ztužená média: kvantitativní: P R a S F (roztěr a výpočet, counting) semi-kvantitativní: G I (maximu 16; přijatelné G I = 6; sleduje se růst) kvalitativní: 0, 1, 2 (intenzita růstu).cílový mikroorganismus(2) Tekutá média: cílový mikroorganismus: 10 KTJ 100 KTJ necílový mikroorganismus: > 1000 KTJ směs kultur

68 Baird-Parker agar Baird-Parker agar pro stanovení počtu koaguláza-pozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další) dle EN ISO Inkubace Referenční kmen Ref. médium h, 37 C S. aureus ATCC 6538 S. aureus ATCC h, 37 C E. coli ATCC nebo h, 37 C S. epidermidis ATCC Produktivita TSA Selektivita Metoda kontroly Kvantitativ ní Kritérium P R 0,5 - Kvalitativní inhibová no Specifita Charakteristi cká reakce Černé nebo šedivé kolonie s jasnou zónou - Kvalitativní - Černé nebo šedé bez jasné zóny -

69