Infekce krevního řečiště

Transkript

1 Infekce krevního řečiště Absolventská práce Iveta Šátková Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: MUDr. Jan Kubele Datum odevzdání práce: 19. dubna 2013 Datum obhajoby: Praha 2013

2 Prohlašuji, že jsem tuto absolventskou práci vypracovala samostatně a všechny použité zdroje jsem uvedla podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů informací. Praha 19. dubna 2013 Podpis

3 Ráda bych poděkovala MUDr. J. Kubele za odborné vedení mé absolventské práce, za cenné rady, podporu a čas, který mi věnoval při jejím zpracování. Také bych ráda poděkovala všem laborantům oddělení klinické mikrobiologie v Nemocnici Na Homolce za ochotný a vstřícný přístup během odborné praxe na tomto oddělení.

4 Souhlasím, aby má absolventská práce byla půjčována v knihovně Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis

5 Abstrakt Šátková Iveta Infekce krevního řečiště Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: MUDr. Jan Kubele Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 63 stran Infekce krevního řečiště jsou charakterizovány přítomností mikrobů v krvi s celkovými projevy infekce. Jedná se o vážný stav, který často ohrožuje život pacienta. Tato práce je zaměřena na mikrobiologickou laboratorní diagnostiku infekcí krevního řečiště. Při podezření na infekci se odebírá krev na kultivační vyšetření neboli hemokultura. Krev se inokuluje do hemokultivačních lahviček, které obsahují tekuté kultivační médium. Předpokladem pro správný výsledek laboratorního vyšetření je vhodně načasovaný a asepticky provedený odběr vzorku krve. Případné porušení zásad preanalytické fáze vede k falešně negativnímu nebo falešně pozitivnímu výsledku vyšetření. Mikrobiologická laboratorní diagnostika má zásadní význam pro potvrzení infekce. Inkubace hemokultivačních lahviček probíhá v automatizovaných přístrojích, které udržují optimální kultivační podmínky a detekují biochemickou aktivitu mikrobů. Další zpracování vzorků zahrnuje kultivaci původců na pevných půdách a následnou identifikaci biochemickými a imunochemickými metodami. Stanovení citlivosti k antibiotikům umožňuje cílenou antibiotickou léčbu. Dodržení zásad antibiotické politiky pomáhá předcházet vzniku a šíření rezistentních druhů mikrobů. Většina infekcí, které je možné detekovat kultivačně, je bakteriálního původu. Mohou se uplatnit i mykotické organismy, především kvasinky. Nejčastějšími původci jsou koagulasanegativní stafylokoky, Staphylococcus aureus, enterobakterie a enterokoky. Zejména u hospitalizovaných pacientů jsou často zachyceny potenciálně patogenní mikroby, což souvisí s oslabeným stavem imunitního systému pacientů. Součástí této práce je vyhodnocení výsledků hemokultur zpracovaných na oddělení klinické mikrobiologie v Nemocnici Na Homolce za rok Klíčová slova: infekce krevního řečiště, hemokultivace, bakterie, antibiotika

6 Abstract Šátková Iveta Infekce krevního řečiště The Bloodstream Infection Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: MUDr. Jan Kubele Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2013, 63 stran The bloodstream infections are characterized by the presence of microorganisms in blood associated with general infection. This condition is often life threatening. I focused on microbiological laboratory diagnostics of the bloodstream infections. If there was suspicion of the bloodstream infection blood sample was taken and inoculated to special bottles with liquid culture medium. Good timing and aseptic collection of blood sample is necessary condition to obtain relevant results of further examination. Procedural errors can originate in false negative or false positive results. Microbiological identification of infective agent in laboratory is important step that confirms the bloodstream infection. Incubation of blood culture bottles takes place inside the device for automated detection. Presence of microorganisms is detected by measuring CO 2 levels as a result of their biochemical activity. Positive samples are inoculated on plates. Following cultivation microorganisms are identified by biochemical and immunochemical tests. Antibiotic susceptibility is tested in order to set appropriate therapy and to detect mechanisms of resistance. Microbial detection using a bacterial culture is typical for most of the pathogenic bacteria and fungi. The most frequently detected bacteria are coagulase-negative staphylococci, Staphylococcus aureus, Enterobacteriacae and Enterococci. The most important fungi are Candidae. Potentially pathogenic microorganisms are often found in immunocompromised patients. I performed an analysis of retrospectively collected results of blood cultures from Na Homolce Hospital throughout the year Keywords: bloodstream infection, blood culture, bacteria, antibiotics

7 Obsah Obsah... 7 Úvod... 9 Cíl práce Základní pojmy Bakteriémie Infekce krevního řečiště Sepse a SIRS Původci infekcí krevního řečiště Grampozitivní bakterie Rod Staphylococcus Koagulasanegativní stafylokoky Staphylococcus aureus Rod Streptococcus Beta-hemolytické streptokoky Viridující streptokoky Rod Enterococcus Gramnegativní bakterie Čeleď Enterobacteriacae Ostatní gramnegativní bakterie Fungi Preanalytická fáze vyšetření Načasování odběru Odběr krve na hemokultivaci Transport a uchování vzorků Příjem vzorků... 24

8 4 Mikrobiologická laboratorní diagnostika Hemokultivační systém a lahvičky BactAlert Zpracování pozitivní hemokultury Identifikace původců Barvení podle Grama Kultivace na pevných půdách Identifikace stafylokoků Identifikace streptokoků a enterokoků Identifikace enterobakterií Identifikace kvasinek Stanovení citlivosti na antibiotika Disková difúzní metoda Difúzní agarová metoda s použitím E-testu Výsledky Závěr Seznam použitých zkratek Seznam literatury a zdrojů informací Seznam obrázků Seznam tabulek Seznam grafů Seznam příloh Přílohy... 59

9 Úvod Infekce krevního řečiště jsou charakterizovány přítomností mikrobů v krvi s celkovými projevy infekčního procesu. Při podezření na infekci se odebírá krev na kultivační vyšetření neboli hemokultura. Pro zachycení původců v krvi je nezbytné odběr správně načasovat. Zároveň je třeba dodržet aseptické podmínky odběru, aby se zabránilo kontaminaci vzorku kožní mikroflórou. Dodržení podmínek preanalytické fáze laboratorní diagnostiky zásadně ovlivňuje výsledek vyšetření. Odebraná krev se dnes typicky inokuluje do komerčně dodávaných hemokultivačních lahviček obsahujících tekuté kultivační médium. Standardně se používá sada aerobní a anaerobní lahvičky pro zachycení nejširšího možného spektra původců. Lahvičky se téměř výhradně inkubují v automatických detekčních přístrojích, které udržují optimální podmínky inkubace a pozitivní nález vyhodnotí na základě biochemické aktivity mikrobů. Další zpracování spočívá v kultivaci původců na pevných půdách a identifikaci biochemickými a imunochemickými metodami. Nezbytnou součástí je stanovení citlivosti na antimikrobiální látky, které umožňuje cílenou léčbu. Kultivačním vyšetřením lze prokázat bakteriální a mykotické infekce. Většinu zachycených původců tvoří bakterie, nejčastější jsou koagulasanegativní stafylokoky, Staphylococcus aureus, enterobakterie a enterokoky. Mykotické organismy se uplatní méně, nejvýznamnější skupinou jsou kvasinky. Často jsou izolovány potenciálně patogenní mikroby, což souvisí s oslabeným stavem imunitního systému pacienta. 9

10 Cíl práce Cílem této absolventské práce je shrnutí mikrobiologické laboratorní diagnostiky infekcí krevního řečiště se zaměřením na metody používané na oddělení klinické mikrobiologie (KMAS) v Nemocnici Na Homolce a srovnání nejčastějších původců udávaných v literatuře s výsledky hemokultur zpracovaných v této laboratoři za sledované období až V průzkumu se zaměřuji na nejčastější původce zachycené v hemokulturách v rámci celé nemocnice a na porovnání četnosti jejich výskytu na vybraných odděleních s předpokladem, že se sledované druhy uplatní na různých odděleních v odlišném procentuálním zastoupení v závislosti na mnoha faktorech (např. druh poskytované diagnostické péče a provedené terapeutické výkony, délka hospitalizace, skladba pacientů a rozdílnost jejich základních onemocnění). Nemocnice Na Homolce je specializované pracoviště zaměřené na léčbu kardiovaskulárních a neurologických onemocnění. Ročně je v nemocnici ambulantně ošetřeno přes milion pacientů a přes 19 tisíc je hospitalizováno. Léčeni jsou pouze dospělí pacienti, typicky trpící větším počtem základních chorob. Pro porovnání původců jsem zvolila tři skupiny oddělení se srovnatelnými celkovými počty vyšetřených pacientů i nálezů, anesteziologickoresuscitační oddělení, interní oddělení a kardiologická oddělení. 10

11 1 Základní pojmy V současné době je k dispozici více zdrojů zabývajících se problematikou infekcí krevního řečiště, ne všechny je však možné považovat za aktuální a přesné. Ve své práci se snažím o stručné vysvětlení souvisejících pojmů v kontextu dnešních poznatků. 1.1 Bakteriémie Krev je za fyziologických podmínek sterilní tekutina. Bakteriémie značí přítomnost bakterií v krvi. Ke krátkodobé přechodné bakteriémii dochází při průniku bakterií do krve z míst osídlených normální mikroflórou (např. po invazivním vyšetření tlustého střeva, drobném chirurgickém zákroku v dutině ústní, při poranění kůže, ale i při běžných každodenních činnostech jako je čištění zubů nebo defekace). Tato krátkodobá bakteriémie je běžný jev a pro zdravého člověka s normální funkcí imunitního systému obvykle nepředstavuje riziko. Bakterie jsou zlikvidovány fagocyty a nedochází k rozvoji patologického procesu. Množství bakterií pronikajících do krve je malé a vzniklá přechodná bakteriémie trvá jen asi 15 minut, přesto však mohou být bakterie zaneseny do různých orgánů a osídlit je. V případě jejich poškození nebo oslabení imunitních mechanismů mohou vyvolat lokální nebo systémové záněty. Nejčastěji je takto postiženo srdce, bakteriální endokarditida je až v 50 % případů vyvolána ústními viridujícími streptokoky. (5) Kromě bakterií se mohou v krevním řečišti vyskytovat i mikroskopické houby (mykotické organismy, fungi). Přítomnost hub v krvi se označuje termínem fungémie, konkrétně pro kvasinky lze použít kandidémie. 1.2 Infekce krevního řečiště Infekcí obecně rozumíme průnik a škodlivé působení mikroorganismů v těle, typicky jejich invazi do normálně sterilních tkání nebo přemnožení v místech fyziologicky osídlených normální mikroflórou. Následně se rozvíjí zánětlivá odpověď organismu. Infekce krevního řečiště značí přítomnost mikrobů v krvi provázenou celkovými známkami infekčního procesu. Infekci krevního řečiště potvrzuje alespoň jeden nález patogenního mikroorganismu v hemokultuře nebo nález bakterií, které jsou považovány za možné kožní kontaminanty 11

12 ve dvou různých hemokulturách, pokud pacient současně vykazuje alespoň jeden z následujících symptomů: horečka nad 38 C, zimnice, hypotenze (13). Infekce se šíří z ložiska různé lokalizace, mikroorganismy se vyplavují do krve občas nebo trvale. Kontinuální bakteriémie se vyskytuje u primárních infekcí krevního řečiště. Zdroj infekce je lokalizovaný přímo v krevním řečišti (infekční endokarditida, infekční onemocnění velkých cév, infikovaný katétr nebo jiný implantovaný cizorodý materiál). Za primární infekce se také považují infekce neznámého původu. V případě sekundární infekce krevního řečiště se původce šíří s primárního ložiska lokalizovaného periferně. Zdrojem jsou močové a respirační infekce, infekce žlučových cest, gynekologické infekce, dekubity, infikované popáleniny, operační rány a další. Charakteristická je intermitentní bakteriémie, z primárního zdroje dochází k občasnému uvolňování bakterií do krve. Infekce krevního řečiště mají často nosokomiální charakter, tvoří asi 10 % nosokomiálních nákaz (23). Tyto infekce vznikají v důsledku pobytu ve zdravotnickém zařízení (dnes se spíše používá infekce spojené s nemocniční péčí). Za nosokomiální se považují ty infekce, u kterých se první známky onemocnění projeví minimálně 48 hodin po přijetí do zdravotnického zařízení (za předpokladu, že v době přijetí již neprobíhala inkubační doba onemocnění). Původ infekce může být endogenní, kdy dochází k invazi bakterií z vlastní kůže a sliznic na místo, kde se normálně nevyskytují. Endogenní infekce vzniká zavlečením infekčního agens z kolonizovaného místa do jiného systému téhož organismu (10). Exogenní infekce znamená osídlení bakteriemi jiné osoby (ošetřující personál, jiný pacient, návštěva). Exogenní infekce jsou zprostředkovány mikroby, které před vznikem infekce pacienta nekolonizovaly, vznikají zanesením infekčního agens zvnějšku do tkání a orgánů vnímavého jedince (10). Kmeny způsobující nemocniční nákazy vykazují často širokou rezistenci (multirezistenci) k antibiotikům a jejich terapie je proto obtížná. 1.3 Sepse a SIRS Sepse je systémová zánětlivá odpověď organismu na infekci. Je provázena celkovými projevy zánětu. Podle závažnosti klinických příznaků lze rozlišit tři stádia: sepse, těžká sepse a septický šok. Hodnotí se stupeň vědomí, krevní tlak a funkce orgánů. Septický šok je 12

13 nejzávažnější stádium sepse, dochází k těžkému narušení cirkulace, kritickému snížení prokrvení a okysličení tkání a následnému multiorgánovému selhání. Mikroorganismy mohou také poškozovat lidské tělo produkcí toxinů a nepřímo vlastními imunitními reakcemi organismu. Rozvoj příznaků sepse je výsledkem složitých reakcí a jejich velká část je důsledkem vlastních obranných mechanismů nemocného. Imunitní systém reaguje na průnik mikrobů do krevního řečiště aktivací fagocytů. Fagocyty jsou přilákány chemotaktickými látkami a pohlcují buňky opsonizované složkami komplementu a protilátkami. Pohlcené bakterie jsou intracelulárně likvidovány mikrobicidními systémy. Zpět do krve jsou uvolňovány látky, které vyvolávají klinické příznaky, například tzv. endotoxiny. Buňky imunitního systému jsou pak stimulovány k produkci cytokinů. Prozánětlivé cytokiny (interleukin 1, interleukin 6, interleukin 12, TNF a interferon gama) aktivují systémovou zánětlivou odpověď organismu, s horečkou jako charakteristickým projevem zánětu, a dále syntézu proteinů akutní fáze (C reaktivní protein, složky komplementu C3 a C4). Následně dochází k dalšímu rozvoji zánětlivých reakcí a ke generalizaci procesu. (Popsaná reakce je jen obecným popisem mnohem více komplexního procesu.) Vyplavení zánětlivých působků z infekčního ložiska může vést k rozvoji sepse bez průniku bakterií do krevního řečiště, obdobně může dojít k přetrvání nebo zhoršení příznaků i po likvidaci bakterií imunitním systémem nebo antibiotiky. SIRS (z angl. Systemic Inflammatory Response Syndrome) je systémová zánětlivá odpověď organismu vznikající z různých příčin, je infekčního i neinfekčního původu. Jde o nespecifickou reakci organismu s aktivací cytokinů, hemodynamickými a metabolickými změnami (8). Sepsi lze považovat za podskupinu SIRS. K diagnostice SIRS musí být splněny nejméně dvě z následujících kritérií: tělesná teplota vyšší než 38 C nebo nižší než 36 C, srdeční frekvence vyšší než 90 za minutu (tachykardie), dechová frekvence vyšší než 20 za minutu (tachypnoe), leukocytóza nad v mm 3 nebo leukopenie pod v mm 3 krve (1). 13

14 2 Původci infekcí krevního řečiště Standardními kultivačními metodami lze detekovat bakteriální a mykotické infekce krevního řečiště. Většinu původců tvoří bakterie, mykotické organismy jsou méně časté. Klinický význam konkrétního druhu však nemusí nutně odpovídat četnosti jeho nálezu. Významná část koagulasanegativních stafylokoků, které tvoří až třetinu zachycených původců, může být pouze kontaminací vzorku (1). Naopak záchyt kvasinek, které tvoří početně slabší skupinu, je obvykle klinicky významný. Procentuální zastoupení původců se v dostupných zdrojích značně liší. Hodnoty jsou ovlivněny řadou faktorů. Některé studie jsou např. zaměřeny na konkrétní nemocniční oddělení nebo skupinu pacientů se společným znakem apod. Z grampozitivních bakterií jsou nejčastěji zachyceny koagulasanegativní stafylokoky, Staphylococcus aureus a enterokoky (1,12,19). Koagulasanegativní stafylokoky tvoří 19 až 36 % původců (1,11,12,17,19,20), nejčastějšími druhy z této skupiny jsou Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus a Staphylococcus hominis (1). Staphylococcus aureus tvoří 8 až 30 % všech zachycených původců (1,11,17,19,20,22). Rod Enterococcus se uplatní v 6 až 13 % (1,11,19), Enterococcus faecalis je výrazně častější než druhý vyskytující se zástupce Enterococcus faecium (1). Ze skupiny streptokoků mohou být zachyceny ústní viridující streptokoky, Streptococcus pneumoniae a beta-hemolytické streptokoky, nejčastěji Streptococcus pyogenes a Streptococcus agalactiae (1). Další grampozitivní bakterie jsou obvykle kožní kontaminující flórou, nejběžnější jsou Micrococcus spp., Propionibacterium acnes, Bacillus spp. a Corynebacterium spp. (13). Z gramnegativních bakterií jsou nejčastěji zachyceny Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae a Pseudomonas aeruginosa (1,11,19,20). Escherichia coli tvoří 6 až 13 % původců (1,11,19,20,22), Klebsiella pneumoniae 3 až 11 % (1,11,19,20). Dalšími významnými zástupci ze skupiny enterobakterií jsou Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia marcescens a Proteus mirabilis (1). Pseudomonas aeroginosa je nejvýznamnější zástupce gramnegativních nefermentujících tyček, tvoří 4 až 8 % (1,11,19,20). Dalšími možnými původci z této skupiny jsou tyčky běžně se vyskytující v prostředí Acinetobacter spp., Burkholderia spp. a Stenotrophomonas spp. 14

15 Fungi se vyskytují s četností do 10 % (18,19). Nejvýznamnější jsou kvasinky Candida albicans a Candida tropicalis, Cryptococcus spp. a další. Klinický význam této skupiny se stále zvyšuje (21). Infekce krevního řečiště jsou v některých případech způsobeny podmíněně patogenními mikroorganismy. Tyto mikroorganismy u zdravých (imunokompetentních) osob obvykle nevyvolávají zdravotní potíže, uplatní se ale u jedinců oslabených dlouhou nebo vážnou nemocí, antibiotickou léčbou nebo podáváním imunosupresiv. Některé druhy jsou součástí běžné lidské mikroflóry. Lidské tělo je od narození fyziologicky kolonizováno mikroorganismy. Normální stálá (rezidentní) flóra s hostitelem koexistuje, aniž by ho poškozovala. Stimuluje imunitní systém a brání invazi patogenů. Složení mikroflóry je individuální, závisí na prostředí, stravě a dalších faktorech, pro různé části těla jsou typické jiné bakterie. Dlouhodobě hospitalizovaní pacienti mají často odlišné složení kolonizující mikrobiální flóry v porovnání se zdravým jedincem. Predispozičním faktorem infekcí krevního řečiště jsou zavedené cévní i močové katétry nebo jiné cizorodé materiály. Některé mikroorganismy mají značně vyvinutou schopnost adherence na povrch pevných těles (organických i anorganických) a tvorby biofilmu. Jedná se o mikrobiální společenství se specifickým uspořádáním. Poskytuje mikrobům ochranu před imunitním systémem organismu i antimikrobiální léčbou. Za určitých okolností může docházet k jejich uvolňování a vyplavování do krevního řečiště. Tvorba biofilmu je typická např. pro koagulasanegativní stafylokoky, ústní viridující streptokoky i kvasinky. Léčba infekcí krevního řečiště je často ztížena rezistencí původců k antibiotikům. Nemocniční kmeny vykazují obvykle širší rezistenci než divoké populace kmenů vyskytující se mimo nemocniční prostředí. Rezistence může být přirozená (primární), tento typ rezistence vychází ze struktury bakteriální buňky a schopnosti produkce enzymů. Získaná rezistence vzniká náhodnou změnou genetické výbavy (např. mutací) nebo různými přenosy mezi mikroorganismy. Rezistence mikroorganismy nejčastěji dosahují rozkladem antibiotika vlastními enzymy, zábranou průniku antibiotika do bakteriální buňky nebo modifikací místa působení antibiotika (5). Klinicky významné způsoby rezistence jsou přenosné na další buňky. Vertikální přenos (přenos na potomstvo) se uplatní u rezistence vzniklé mutací genů na chromozomu. Horizontální přenos (v jedné generaci buněk) je přenos zprostředkovaný 15

16 tzv. plazmidy. Geny rezistence mohou být přeneseny také virem tzv. bakteriofágem. Bakterie mohou být rezistentní k více antibiotikům současně, tyto kmeny se označují jako multirezistentní. K omezení vzniku rezistentních kmenů je třeba dodržovat antibiotickou politiku a zásady racionální léčby. Současně je nezbytné v nemocnicích dbát na preventivní opatření, především zásady asepse a mytí rukou personálu. V následujících kapitolách jsou popsáni nejčastější původci infekcí krevního řečiště podle literárních zdrojů se zaměřením na jejich morfologii, výskyt a onemocnění, která způsobují. Některé vlastnosti související s identifikací jsou uvedeny v kapitole zabývající se mikrobiologickou laboratorní diagnostikou. 2.1 Grampozitivní bakterie Rod Staphylococcus Stafylokoky jsou grampozitivní koky typicky mikroskopicky uspořádané do shluků. Jsou fakultativně anaerobní, katalasapozitivní, nepohyblivé, netvoří spory ani pouzdra (nebo jen výjimečně). Rozdělují se do dvou skupin podle schopnosti koagulovat plazmu na koagulasapozitivní a koagulasanegativní stafylokoky Koagulasanegativní stafylokoky Koagulasanegativní stafylokoky jsou významnou součástí normální kožní a slizniční mikroflóry. Vyvolávají infekce u predisponovaných jedinců (osoby s nezralým imunitním systémem nebo imunodeficity, osoby se zavedenými implantáty a katétry a další). Jsou častými původci katétrových infekcí krevního řečiště, infekcí v místě chirurgického výkonu a endokarditid. Koagulasanegativní stafylokoky se běžně vyskytují hlavně na kůži (obličej, axily, končetiny) a na sliznici nosohltanu. Jde o typické oportunní patogeny. Za hlavní faktor virulence je považována jejich schopnost tvorby biofilmu a vzhledem k tomu je hlavním predisponujícím faktorem infekce zavedené cizí těleso (katétr, cévní náhrady, umělé chlopně, kardiostimulátory apod.). Staphylococcus epidermidis se uplatní také u oslabených pacientů 16

17 s popáleninami, po těžkých úrazech a chirurgických zákrocích, zvláštní skupinu tvoří intravenózní narkomani (chlopeň poškozená krystalky drogy je k infekci náchylnější). Vzhledem k tomu, že jsou koagulasanegativní stafylokoky typickou kožní mikroflórou, je třeba při jejich zachycení odlišit kontaminaci vzorku při nesprávně provedeném odběru. V některých případech toto rozlišení není jednoznačně možné Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus je koagulasapozitivní druh stafylokoka, který je významným patogenem pro člověka. Asi u třetiny populace tvoří součást normální flóry kůže a sliznic (5). S. aureus je vybaven mnoha faktory virulence. Způsobuje širokou škálu infekcí od lehkých hnisavých kožních onemocnění po závažné septické stavy, vyvolává také toxikózy. Hnisavé kožní infekce neboli pyodermie jsou časté, mohou probíhat i opakovaně nebo chronicky. Nejběžnější jsou ječné zrno, folikulitida, furunkl, karbunkl a impetigo. S. aureus způsobuje hnisání ran a popálenin, k infekci přispívá nedodržení zásad asepse nebo přítomnost cizího tělesa v ráně. Charakteristická je tvorba abscesů, dutin vyplněných hnisem, který je tvořený odumřelými leukocyty a bakteriemi. Predisponujícím faktorem stafylokokových infekcí jsou např. cukrovka (diabetes mellitus), maligní onemocnění, imunodeficity a virová infekce probíhající v dýchacích cestách. U disponovaných osob způsobuje závažné infekce jako endokarditidu, osteomyelitidu, sekundární pneumonii a bronchopneumonii. Kmeny produkující enterotoxin vyvolávají alimentární stafylokokovou enterotoxikózu, kmeny produkující toxin syndromu toxického šoku stafylokokový syndrom toxického šoku. Dnes je již většina kmenů S. aureus rezistentní k penicilinu. Podkladem rezistence je plasmid kódující penicilinasu (beta-laktamasu), která antibiotikum štěpí. Především v nemocničním prostředí se z důvodu používání širokospektrálních antibiotik objevily kmeny MRSA, z angl. Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, tedy kmeny S. aureus rezistentní k methicillinu (v České republice se používá obdoba oxacilin, jde o polosyntetická penicilinová antibiotika, na která penicilinasa neúčinkuje). Rezistence je založena na přítomnosti genu meca, který kóduje pozměněný penicilin vázající protein, který v důsledku modifikace penicilin neváže. 17

18 2.1.2 Rod Streptococcus Streptokoky jsou grampozitivní koky uspořádané do dvojic až řetízků. Jsou fakultativně anaerobní, katalasanegativní a nepohyblivé. Rozdělují se do skupin podle schopnosti hemolýzy na krevním agaru nebo podle antigenních vlastností buněčné stěny (dle Lancefieldové) Beta-hemolytické streptokoky Streptococcus pyogenes je klinicky nejvýznamnějším zástupcem, vyvolává řadu různých onemocnění. Způsobuje typicky angínu (akutní tonsilofaryngitida), zánět vedlejších nosních dutin (sinusitida) a zánět středního ucha (otitida). Mezi kožní hnisavé infekce patří impetigo, celulitida a růže (erysipel), závažné jsou hluboké infekce zahrnující nekrotizující fasciitidu nebo myonekrózu. S. pyogenes může infikovat rány za vzniku hnisavých komplikací. Kmeny produkující erytrogenní toxin způsobují spálu. Rizikem infekcí způsobených pyogenním streptokokem je vznik pozdních následků, revmatické horečky a akutní glomerulonefritidy. Kmeny produkující exotoxiny vyvolávají syndrom toxického šoku. Závažné, avšak málo časté, jsou pneumonie, osteomyelitidy, artritidy, endokarditidy nebo meningitidy. Streptococcus agalactiae může být izolován z horních dýchacích cest, trávicího traktu nebo pochvy, aniž by vyvolával onemocnění. Způsobuje infekce močového traktu, může infikovat operační rány. U oslabených jedinců a novorozenců může být původcem celkových infekcí se sepsí. Bezpříznakové nosičství S. agalactiae se předpokládá nejméně u 10 % rodiček, k infekci plodu dochází asi v 1 % případů (5) Viridující streptokoky Významným patogenním zástupcem je Streptococcus pneumoniae tvořící typické dvojice (diplokoky). Zatímco neopouzdřené kmeny mohou být součástí běžné flóry horních dýchacích cest, opouzdřené kmeny jsou často původci onemocnění. Pneumokok je nejčastěji původcem komunitní pneumonie, sinusitid, otitid i závažných onemocnění jako je např. meningitida. Skupina ústních viridujících streptokoků zahrnuje mnoho různých druhů (např. Streptococcus oralis, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius). Jsou běžnou součástí flóry dutiny 18

19 ústní a střeva. Charakteristická schopnost mnoha zástupců je tvorba biofilmu, na povrchu zubů tvoří zubní plak. S. mutans je považován za hlavního původce zubního kazu. Přechodná bakteriémie způsobená ústními viridujícími streptokoky je častá a obvykle neškodná, přesto mohou tyto bakterie způsobovat závažné infekce jako endokarditidy nebo mozkový absces Rod Enterococcus Enterokoky jsou grampozitivní oválné koky uspořádané do dvojic, shluků nebo krátkých řetízků. Jsou fakultativně anaerobní, neprodukují katalasu. Nejvýznamnějšími zástupci jsou Enteroccocus faecalis a Enterococcus faecium. Enterokoky tvoří součást normální střevní flóry. Způsobují infekce močových cest, gynekologické záněty, mohou být také původcem endokarditidy, meningitidy, katétrových infekcí krevního řečiště a septických stavů. Častěji se uplatní u pacientů dlouhodobě hospitalizovaných se zavedenými katétry a u pacientů léčených širokospektrými antibiotiky. 2.2 Gramnegativní bakterie Čeleď Enterobacteriacae Enterobakterie jsou fakultativně anaerobní tyčky, netvoří spory, často jsou pohyblivé. Pro většinu enterobakterií je přirozeným životním prostředím střevo. Některé jsou součástí střevní mikroflóry, jiné jsou přizpůsobeny na život mimo střevo i ve vnějším prostředí. Escherichia coli je součástí běžné střevní flóry. Svými produkty brání uplatnění patogenních bakterií, podílí se na tvorbě vitamínu K. Ve střevě působí patogenně kmeny E. coli enteropatogenní (EPEC), enterotoxigenní (ETEC), enteroinvazivní (EIEC) a kmeny produkující toxin podobný shigelovému (STEC). Klinický obraz obtíží je od lehkých cestovatelských průjmů po těžké invazivní střevní infekce s celkovými projevy i mimo střevo jako následek působení toxinů. Mimo střevo je E. coli patogenní téměř vždy, typicky je nejčastějším původcem infekcí močových cest (kmeny UPEC), u hospitalizovaných pacientů způsobuje infekce dýchacích cest a operačních ran, je původcem novorozeneckých sepsí a meningitid. Infekce E. coli jsou většinou endogenního původu. 19

20 Klebsiella je dobře přizpůsobená životu mimo střevo, tvoří polysacharidové pouzdro a často je bíle pigmentovaná. Není pohyblivá. Je významným původcem nosokomiálních nákaz, nejčastěji způsobuje infekce močových cest a respiračního traktu. Nejvýznamnějšími zástupci jsou Klebsiella pneumoniae a Klebsiella oxytoca. Další druhy enterobakterií (Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia marcescens a Proteus mirabilis) způsobují zejména nemocniční nákazy Ostatní gramnegativní bakterie Z ostatních gramnegativních bakterií je nejčastěji zachycen rod Pseudomonas. Je to nefermentující aerobní tyčka, je pohyblivá, netvoří pouzdro. Je odolná, přežívá i ve zředěných desinfekčních roztocích. Kmeny jsou také rezistentní k mnoha používaným antibiotikům. Charakteristická je produkce modrozeleného pigmentu pyocyaninu (některé kmeny produkují i jiné pigmenty). Pseudomonas se často vyskytuje v přírodě (v půdě, ve vodě, na rostlinách i potravinách), může být součástí střevní flóry. Je typickým a závažným původcem nemocničních nákaz. U zdravých jedinců může působit závažné infekce zevního ucha. U hospitalizovaných pacientů P. aeruginosa často způsobuje infekce urogenitálního a respiračního traktu, komplikuje hojení ran, infikuje popáleniny a dekubity. Může vyvolávat i spondylodiscitidy nebo závažné infekce centrální nervové soustavy. 2.3 Fungi Mikroskopické houby jsou eukaryotní aerobní organismy. Zahrnují řadu podmíněně patogenních druhů, které způsobují povrchová i systémová onemocnění. Celkové infekce vyvolávají u oslabených jedinců. Nejvýznamnějším mykotickým původcem je rod Candida. Kvasinky se vyskytují v dutině ústní a ve stolici, infekce jsou obvykle endogenní. Nejběžnější druh Candida albicans způsobuje povrchové kandidózy na kůži a na sliznicích (v dutině ústní obraz moučnivky). Častým následkem potlačení běžné bakteriální flóry antibiotickou léčbou je přemnožení kvasinek, takto často vzniká např. vulvovaginitida. Systémové kandidózy se vyskytují 20

21 u pacientů s cizorodými materiály v krevním řečišti, imunodeficity, maligními tumory, metabolickými poruchami a AIDS. Nejčastější jsou infekce cévních katétrů, při rozšíření procesu mohou být postiženy ledviny, játra, srdce i další orgány. 21

22 3 Preanalytická fáze vyšetření Předpokladem pro správný výsledek laboratorního vyšetření je vhodně načasovaný a asepticky provedený odběr vzorku krve. Nedodržení těchto zásad vede k falešné negativitě nebo pozitivitě hemokultury. Falešně negativní výsledek kultivace může vycházet z nevhodného načasování odběru v době, kdy v krvi již nejsou přítomny životaschopné mikroby. Falešně pozitivní výsledek může způsobit i stopová kontaminace kožní flórou při nesprávně provedené dezinfekci místa odběru. Tento jev se označuje pseudobakteriémie neboli nepravá bakteriémie. Hemokultivace je pozitivní, přestože bakterie v krvi ve skutečnosti nebyly přítomny. 3.1 Načasování odběru V době manifestace klinických příznaků je bakteriémie obvykle nízká, protože je značná část bakteriálních buněk z krve již eliminována. S tím souvisí obtížnost správného načasování odběru krve na mikrobiologické kultivační vyšetření. Optimální načasování odběru je na počátku typických klinických příznaků (horečka, třesavka, zimnice a další). Odběr by měl být proveden před zahájením léčby antibiotiky, případně v době jejich krátkodobého vysazení z důvodu odběru nebo před podáním další dávky. Pokud již byla zahájena antibiotická léčba, je možné použít hemokultivační nádoby s obsahem látek inhibujících účinek antibiotik. Charakter horečky (febrilie) se liší podle lokalizace zdroje infekce. Kontinuální horečka je typická pro zdroj lokalizovaný centrálně, přímo v krevním řečišti. Vzhledem k trvalé přítomnosti mikrobů v krvi nevyžaduje odběr zvláštní načasování. Odebírají se ideálně tři hemokultury v časovém odstupu 30 až 60 minut. Pro periferně lokalizovaný zdroj infekce je typická intermitentní horečka. Mikroby se do krve vyplavují občasně a vhodné načasování odběru je rozhodující pro zachycení původců. První odběr se provede na začátku klinických příznaků, kdy se předpokládá nejvyšší bakteriémie. Další jeden až dva odběry se provedou v časovém odstupu 20 až 30 minut, v závislosti na průběhu klinických příznaků. Při podezření na katétrovou infekci krevního řečiště se odebírá jedna až dvě hemokultury venepunkcí z periferní žíly za současného odběru z podezřelého cévního katétru. První odběr 22

23 z periferní žíly se provede na začátku klinických příznaků, současně se odebírá vzorek krve z katétru. 20 až 30 minut po prvním odběru se provede druhý odběr ze žíly, v závislosti na průběhu klinických příznaků. 3.2 Odběr krve na hemokultivaci Dodržení zásad aseptického odběru je nezbytné pro zabránění kontaminace vzorku kožní flórou. Důležité je zvolit vhodný dezinfekční prostředek a dodržet čas působení. Odběr se provádí ve sterilních rukavicích po předchozí dezinfekci rukou. Vzhledem k tomu, že krev vždy považujeme za potenciálně infekční, je třeba dodržet zásady bezpečnosti práce zdravotnického personálu. Odběr krve venepunkcí z periferní žíly se provádí zpravidla z kubitální žíly, při opakovaném odběru je vhodné střídat místa odběru (levá/pravá ruka). Po zaškrcení končetiny se palpuje vhodná žíla. Místo odběru se očistí 70% izopropylalkoholem a následně se dezinfikuje jodovým preparátem do zaschnutí. Vlastní odběr krve se provádí sterilní odběrovou sadou. Odebraná krev se inokuluje do hemokultivační lahvičky přes propichovací zátku po předchozí dezinfekci zátky 70% izopropylalkoholem. Lahvičky se skladují při pokojové teplotě. Odběr z cévního katétru se provádí u pacientů se zavedeným centrálním venózním nebo periferním arteriálním katétrem, periferní venózní katétr není pro odběr vhodný. Odběrový vstup se očistí 70% izopropylalkoholem a následně se dezinfikuje jodovým preparátem do zaschnutí. Krev se odebírá do sterilní injekční stříkačky. Další postup je shodný s odběrem venepunkcí. Množství odebrané krve je standardně 10 ml, 5 ml se aplikuje do aerobní a 5 ml do anaerobní lahvičky. U dětí se obvykle odebírá množství menší. Dříve se doporučovalo provést z místa odběru před a po dezinfekci stěr sterilním vatovým tampónem. Stěry se zaslaly ke kultivaci do laboratoře společně s lahvičkami. Účelem bylo vyloučit kontaminaci vzorku kožní flórou při nesprávně provedeném odběru. Dnes je již tento způsob považován za nákladově neefektivní a neprovádí se. 23

24 3.3 Transport a uchování vzorků Vzorky se neprodleně transportují do laboratoře, nejlépe do dvou hodin. Pokud není rychlý transport lahviček možný (např. pokud laboratoř nemá nepřetržitý provoz), lze je uchovat při pokojové teplotě nebo ideálně v termostatu. Lahvičky se nikdy neskladují v lednici. 3.4 Příjem vzorků Pro hemokultivační vyšetření se používá v Nemocnici Na Homolce standardní žádanka na mikrobiologické vyšetření. (Žádanka viz Příloha 1) Žádanka obsahuje standardní údaje (osobní údaje pacienta, požadavek na vyšetření, údaje o oddělení a lékaři zadávajícím vyšetření), tělesnou teplotu pacienta při odběru, přesný čas a místo odběru. Laborant na příjmu zkontroluje kompletnost údajů na žádance a přidělí vzorkům laboratorní identifikační číslo (obě lahvičky jsou vedeny pod jedním číslem). Současně se kontroluje kvalita vzorku. Informace ze žádanky se zadají do laboratorního informačního systému, vyplní se požadovaná vyšetření a případné doplňující informace se uvedou do poznámky. Hemokultura je urgentní vyšetření. 24

25 4 Mikrobiologická laboratorní diagnostika Diagnostika infekcí krevního řečiště je založena na zhodnocení klinických příznaků nemocného a výsledků mikrobiologického, hematologického a biochemického laboratorního vyšetření. Tato práce se zabývá mikrobiologickou laboratorní diagnostiku se zaměřením na metody používané na oddělení klinické mikrobiologie (KMAS) v Nemocnici Na Homolce. Průkaz a identifikace původce významně přispívá ke včasné diagnostice a správné léčbě těchto infekcí. Základem mikrobiologické diagnostiky je kultivační vyšetření krve neboli hemokultura. Jedná se o pomnožení bakterií a mykotických původců z odebrané krve v kultivačním médiu. V dnešní době jsou pro hemokultivační vyšetření používány téměř výhradně komerční automatické systémy detekující biochemickou aktivitu přítomných mikroorganismů. 4.1 Hemokultivační systém a lahvičky BactAlert Používané lahvičky BactAlert (BioMerieux) obsahují tekuté živné médium vhodné pro pomnožení širokého spektra bakterií a hub z odebrané krve. Některé typy obsahují také látky neutralizující antibiotika, proto je jejich použití vhodné i u pacientů se zahájenou antibiotickou terapií. Standardně se pro jeden odběr (jednu hemokulturu) používá kombinace dvou lahviček (jedna pro aerobní a jedna pro anaerobní kultivaci). V indikovaných případech je možné použít i další typy lahviček určené pro specifické původce (mykobakteria, mykotické původce). Lahvičky BactAlert se používají výhradně v kombinaci s hemokultivačním detekčním systémem BactAlert. 25

26 Obrázek 1 Hemokultivační lahvičky (zelená lahvička FA pro aerobní kultivaci s přídavkem inhibitorů antibiotik; fialová lahvička SN pro anaerobní kultivaci standardní) Lahvičky se vkládají do přístroje pro automatickou hemokultivaci BactAlert (BioMerieux) Inkubace lahviček probíhá v pracovním prostoru přístroje, kde jsou udržovány optimální kultivační podmínky. Průběžně (v intervalu 10 minut) dochází k automatickému fotometrickému odečítání změny vlastností senzoru na dně lahvičky. Senzor obsahuje barevný indikátor reagující na přítomnost oxidu uhličitého v lahvičce, který vzniká jako produkt metabolismu kultivovaných mikrobů. V přístroji se lahvičky inkubují standardně po dobu 5 až 7 dní při teplotě 36 C (v některých případech je třeba pro záchyt původců dobu kultivace prodloužit). U lahviček s negativním výsledkem se inkubace po 7 dnech ukončí a lahvičky se vyřadí, obsah se dále nezpracovává. Pokud systém zaznamená barevnou změnu, automaticky signalizuje pozitivní nález. Do laboratorního protokolu v laboratorního informačním systém (LIS) se zaznamená den, kdy přístroj pozitivitu signalizuje. Obrázek 2 Hemokultivační systém BactAlert 26

27 4.2 Zpracování pozitivní hemokultury Zpracování pozitivních hemokultur se provádí v laminárním boxu ve sterilních rukavicích. Obsah lahvičky se promíchá a po dezinfekci propichovací zátky se sterilní injekční stříkačkou s jehlou odebere 1 až 2 ml vzorku. Obsah se vyočkuje na krevní agar s čárou Staphylococcus aureus, Endovu půdu, Sabouraudův agar a v případě pozitivity anaerobní lahvičky na selektivní kultivační půdu pro anaerobní kultivaci. 1 až 2 kapky vzorku se rozočkují jednorázovými mikrobiologickými kličkami standardním křížovým roztěrem, Sabouraudova půda masivně. Současně se připraví mikroskopický preparát barvený podle Grama, který se ihned odečítá. Podle výsledku mikroskopie se ve většině případů, po zhodnocení významnosti nálezu, stanoví předběžná citlivost k antibiotikům. Vyočkovaná lahvička se uchovává při pokojové teplotě na určeném místě do úplného ukončení kultivačního vyšetření. Krevní agar a Endova půda se kultivuje standardně 24 hodin v termostatu při teplotě 37 C, Sabouraudův agar 48 hodin a půda pro anaerobní kultivaci 48 hodin za anaerobních podmínek v anaerostatu (viz obr. 3). Poté je nárůst na půdách hodnocen a dle potřeby je kultivace v indikovaných případech prodloužena. Obrázek 3 Anaerostat Concept 400 Narostlé mikrobiální kolonie se izolují, provádí se standardní identifikace mikrobů dle doporučných postupů a cílené stanovení citlivosti na antibiotika. 27

28 4.3 Identifikace původců Mikrobiologické laboratorní metody se rozdělují na přímé a nepřímé. Přímé metody prokazují mikroba, jeho části nebo produkty (antigeny, nukleové kyseliny, toxiny). Zahrnují mikroskopii, kultivaci, biochemické a imunochemické metody a genetické metody. Biochemické testy jsou založeny na schopnosti mikrobů metabolizovat různé substráty. Imunochemické testy využívají specifické reakce antigenu s protilátkou. Lze použít aglutinační testy, imunofluorescenční metody, ELISA a další. Genetické metody (např. PCR neboli polymerázová řetězová reakce) se používají k průkazu nukleových kyselin. Nepřímé metody jsou metody sérologické. Jedná se o průkaz specifických protilátek produkovaných organismem jako reakci na přítomnost mikrobů. Sérologické metody se obvykle využívají v případě obtížného nebo nemožného přímého průkazu mikroba. Na základě mikroskopického preparátu barveného podle Grama lze původce zařadit do skupiny gramnegativních nebo grampozitivních bakterií, umožňuje také pozorovat tvar buněk, případně uspořádání do dvojic, řetízků nebo shluků. Podle růstu na sestavě pevných půd je možné některé bakterie blíže specifikovat. K podrobnější identifikaci se obvykle používají biochemické a imunochemické testy, k jejich provedení je třeba nejprve získat čistou kulturu izolovaného kmene. Některé rychlé testy se odečítají ihned nebo jen několik minut po provedení testu (aglutinační texty, testy na diagnostických proužcích, test rozpustnosti ve žluči a další), jiné se inkubují standardně 24 hodin (testy prováděné na pevných půdách, zkumavkové testy a další), testy k identifikaci kvasinek se inkubují 48 hodin. Spektrum používaných metod se v různých laboratořích liší, v dalších kapitolách jsou uvedeny metody používané v laboratoři klinické mikrobiologie v Nemocnici Na Homolce. Všechny níže zmíněné půdy se v laboratoři připravují z komerčně dodávaných surovin Barvení podle Grama Barvení mikroskopického preparátu podle Grama je diagnostická barvící metoda. Využívá odlišné barvitelnosti grampozitivních a gramnegativních bakterií na základě rozdílné struktury buněčné stěny. 28

29 Fixovaný nátěr se obarví roztokem krystalové violeti a následně se přelije Lugolovým roztokem obsahujícím jod. Violeť tvoří s jodem v buňce komplexní sloučeninu fialové barvy. Buněčná stěna grampozitivních bakterií zabraní následnému odbarvení acetonem, bakterie zůstávají fialové. Gramnegativní bakterie se rychle odbarví a po dobarvení roztokem karbolfuchsinu získají růžovou barvu. Preparát se usuší a hodnotí pod mikroskopem. Bakterie tvořící mikroskopicky grampozitivní koky jsou např. zástupci rodů Staphylococcus, Streptococcus a Enterococcus. Stafylokoky jsou typicky uspořádané do shluků, streptokoky a enterokoky do řetízků, Streptococcus pneumoniae tvoří charakteristicky uspořádané dvojice koků (diplokoky). Typickými zástupci gramnegativních bakterií jsou tyčky ze skupiny enterobakterií a nefermentující tyčky zahrnující rod Pseudomonas. Kvasinky se podle Grama barví fialově (grampozitivně). Obrázek 4 Mikroskopický preparát barvený podle Grama Kultivace na pevných půdách Kultivace původců na pevných půdách je základem mikrobiologické laboratorní diagnostiky. Cílem je získat čistou bakteriální kulturu, kterou lze následně použít v identifikačních testech. U některých bakterií je možná i částečná identifikace např. podle typického vzhledu kolonií (hodnotí se velikost, tvar, typ růstu a barva kolonií při produkci pigmentů), hemolýzy na krevním agaru apod. 29

30 Obrázek 5 Křížový roztěr Kultivační půdy lze rozdělit podle různých hledisek. Obvykle se používá dělení podle konzistence na tekuté půdy (bujony) a pevné agarové půdy. Podle účelu se půdy rozdělují na základní (např. masopeptonový agar), obohacené (např. krevní agar), selektivní (např. Sabouraudův agar), diagnostické (např. chromogenní půdy), popřípadě selektivně diagnostické (např. Endův agar). Krevní agar je nejběžnější kultivační půda, obsahuje přídavek 5 až 10 % ovčích erytrocytů. Je vhodný pro kultivaci většiny významných grampozitivních i gramnegativních bakterií. Některé bakterie jsou schopné krevní agar hemolyzovat. Jedním z hodnocených typů hemolýzy je tzv. beta-hemolýza značící rozklad erytrocytů, může být úplná (agar se v okolí kolonií zcela odbarví) nebo neúplná (agar zůstává zakalený). Beta-hemolýzu vykazuje např. Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae a Pseudomonas aeruginosa. Dalším typem hemolýzy je alfa-hemolýza neboli viridace, kdy dochází k přeměně hemoglobinu na zelený verdoglobin (agar má v okolí kolonií zelenou barvu). Se zónou viridace rostou typicky kmeny Streptococcus pneumoniae a podle typu hemolýzy pojmenovaná skupina viridujících streptokoků. Některé bakterie (např. Klebsiella) krevní agar nemění, některé (např. Escherichia coli) zahrnují kmeny, které krevní agar nemění i kmeny hemolytické. 30

31 Obrázek 6 Typy hemolýzy na krevním agaru (vlevo beta-hemolýza Streptococcus agalactiae; vpravo viridace Streptococcus pneumoniae) Z dalších významných charakteristik růstu lze hodnotit tvorbu hlenovitého pouzdra, tyto kmeny (např. Streptococcus pneumoniae a Klebsiella) rostou v mukózních koloniích. Pro bakterie rodu Proteus je typický plazivý růst po povrchu půdy. Pro záchyt bakterií zejména rodu Hemophilus se na krevní agar očkuje čára Staphylococcus aureus. Hemophilus roste pouze v blízkosti nárůstu kolonií stafylokoka (tzv. satelitismus). Na krevním agaru se také provádí CAMP test, který slouží k identifikaci některých bakteriálních druhů, nejčastěji Streptococcus agalactiae. Endova půda je selektivně diagnostická půda, na které rostou typicky gramnegativní tyčky. Růst grampozitivních bakterií je potlačen přídavkem bazického fuchsinu. Bakterie fermentující laktosu rostou v červených koloniích, laktosapozitivní jsou např. Escherichia coli a zástupci rodu Klebsiella. Obrázek 7 Endova půda (vlevo Escherichia coli, vpravo Klebsiella pneumoniae) 31

32 Sabouraudův agar je selektivní půda, obsahuje antibiotika potlačující růst většiny bakterií. Na půdě rostou kvasinky a plísně. Candida albicans tvoří bílé kolonie charakteristického zápachu. Obrázek 8 Sabouraudův agar (Candida albicans) Agar pro anaerobní kultivaci obsahuje redukující látky (hemin a vitamín K). Kultivační půdy se inkubují v anaerostatu v anaerobní atmosféře tvořené dusíkem, oxidem uhličitým a vodíkem Identifikace stafylokoků Na základě schopnosti koagulovat plasmu lze stafylokoky rozdělit na koagulasapozitivní (nejdůležitější zástupce Staphyloccocus aureus) a koagulasanegativní. Základní aglutinační testy se provádí na sklíčku, jedná se o průkaz vázané plazmakoagulasy neboli Clumping factoru. Do kapky králičí plazmy se rozmíchá několik kolonií zkoumaného kmene. K vyloučení autoaglutinace se současně provede kontrolní test v kapce fyziologického roztoku. Pokud dochází k aglutinaci pouze v plazmě, jedná se o koagulasapozitivního stafylokoka. Pokud aglutinuje plazma i fyziologický roztok, dochází k autoaglutinaci a provede se test na volnou plasmakoagulasu. Stejně se postupuje v případě, že k aglutinaci nedochází vůbec. Přesnější jsou latexové aglutinační testy (viz obr. 9), např. lze použít test Pastorex Staph (BioRad). 32

33 Obrázek 9 Latex aglutinační test Volná plazmakoagulasa se prokazuje zkumavkovou metodou. Do zkumavek obsahujících králičí plazmu se přidá několik kolonií zkoumaného kmene. Pozitivní test se projeví tvorbou sraženiny nebo koaguluje celý obsah zkumavky. Vzhledem k tomu, že některé kmeny produkují fibrinolyzin, který koagulum opět rozkládá, je třeba dodržet čas prvního odečítání po 3 hodinách. Současně se provádí pozitivní kontrola s kmenem S. aureus a negativní se S. epidermidis. Podrobná identifikace stafylokoků je založena na biochemických testech. V laboratoři se používá Staphy test 16 (Lachema). Mikrotitrační destička obsahuje 16 testů, na základě kterých je možné stafylokoka identifikovat. Do jamek s dehydrovaným médiem se pipetuje předepsaný objem suspenze zkoumaného kmene. Testy se vyhodnotí na základě barevné změny přítomného indikátoru. Dle potřeby lze doplnit další testy ve formě diagnostických proužků. Voges-Proskauer test (VP test) se používá k detekci produkce acetoinu, oxidázový test k průkazu cytochromoxidázy. Obrázek 10 Staphy test 16 33

34 4.3.4 Identifikace streptokoků a enterokoků Identifikační sada PathoDxtra (Oxoid) umožňuje zařazení některých beta-hemolytických streptokoků do skupin A, B, C, D, F a G (podle Lancefieldové) aglutinačními testy. Skupinově specifický polysacharid C reaguje s protilátkou navázanou na latexových částicích (po předchozím uvolnění antigenů z buněčné stěny extrakčními činidly). Streptococcus pyogenes patří do skupiny A, Streptococcus agalactiae do skupiny B. Různé druhy streptokoků mohou mít stejný antigen. Většina zástupců rodu Enterococcus tvoří skupinu D. Obrázek 11 Sada k identifikaci streptokoků CAMP test se používá především k identifikaci Streptococcus agalactiae. Test se provádí na krevním agaru, kolmo se naočkuje zkoumaný bakteriální kmen a kmen koagulasapozitivního stafylokoka (v laboratoři se používá Staphylococcus intermedius). Pozitivní test se projeví typickým tvarem zóny hemolýzy. Příčinou zesílení hemolýzy v místě křížení naočkovaných čar je synergické působení hemolysinů S. agalactiae a S. intermedius. Test je možné použít i k identifikaci dalších bakteriálních druhů, např. reverzním testem lze prokázat Arcanobacterium haemolyticum nebo Corynebacterium ulcerans. 34

35 Obrázek 12 CAMP test Streptococcus pneumoniae lze prokázat testem rozpustnosti ve žluči (deoxycholát sodný). Pneumokok se v deoxycholátu rozpouští (roztok se vyčeří), ostatní viridující streptokoky charakter zákalu nemění. V laboratoři se používá zkumavková metoda. K podrobné identifikaci streptokoků a příbuzných bakterií se používá komerční test API 20 Strep (BioMerieux), umožňuje také identifikovat zástupce enterokoků. Identifikační strip se skládá z dvaceti mikrozkumavek s dehydrovaným substrátem, v každé zkumavce se testuje jedna biochemická vlastnost. Do jamek se pipetuje suspenze zkoumaného kmene, některé jamky je třeba převrstvit olejem pro vytvoření anaerobních podmínek. Po uplynutí stanovené inkubační doby se odečítá barevná změna, případně se přidá činidlo, které změnu vyvolá. Počítačový program na základě výsledků vyhodnotí pravděpodobnou identifikaci původce (včetně procentuálního vyjádření a případných dalších diagnostických testů). Dalším testem používaným nejčastěji k identifikaci enterokoků je tzv. PYR test (pyrrolidonylpeptidasa). Nejčastější druhy enterokoků mají PYR test pozitivní, což umožní jejich odlišení od viridujících streptokoků. Test se provádí na disku, pozitivní reakce se projeví barevnou změnou po přidání kapky barevné vývojky. K vzájemnému odlišení dvou nejběžnějších druhů enterokoků se jako základní test používá test štěpení arabinózy ve zkumavce, Enterococcus faecalis je negativní, Enterococcus faecium pozitivní. 35

36 4.3.5 Identifikace enterobakterií Švejcarova plotna je diagnostická pevná půda, která umožňuje testovat sedm biochemických vlastností enterobakterií. Plotna je tvořena vlastním biochemickým klínem (testuje se štěpení glukózy a urey, produkce plynu a sirovodíku) a Endovou půdou (testuje se štěpení laktosy, sacharózy a manitolu). Sterilní bakteriologickou kličkou se na půdu naočkuje zkoumaná bakteriální kolonie. Klín se naočkuje hustě, kolmo na klín do středu Endovy půdy se očkuje zóna široká cca 2 cm, po stranách zóny se naočkují čáry a nakonec se udělá několik vpichů kličkou do klínu. Do středu klínu se položí sklíčko, na zónu na Endově půdě tableta sacharózy a manitolu. Obrázek 13 Očkování Švejcarovy plotny V případě potřeby bližší identifikace enterobakterií se provádí zkumavkové testy, tzv. pestrá řada. Jedná se o testování dalších biochemických vlastností v tekutých nebo na pevných diagnostických půdách připravených ve zkumavkách. Reakce se projeví barevnou změnou (případně se změna vyvolá přidáním činidla). Příkladem zkumavkových testů je průkaz indolu (využívá schopnosti některých bakterií tvořit indol z tryptofanu) a průkaz dekarboxyláz (využívá schopnost některých bakterií štěpit lyzin, ornitin, arginin). Tyto vlastnosti se testují v tekutých diagnostických půdách s indikátorem, půda pro testování lysinu je převrstvená parafínovým olejem. Test Simmons citrát se provádí 36

37 na pevné diagnostické půdě (Simmons citrátový agar) nalitém šikmo ve zkumavce. Je založen na schopnosti bakterií štěpit citrát sodný. Escherichia coli je indol pozitivní, lysin pozitivní a Simmons citrát negativní. K odlišení zástupců rodu Klebsiella stačí typicky použít indolovou reakci, Klebsiella pneumoniae je negativní, Klebsiella oxytoca pozitivní. Indolová reakce umožní také rozlišení zástupců rodů Proteus, Proteus mirabilis je negativní, Proteus vulgaris pozitivní. Obrázek 14 Zkumavkové testy (vlevo Simmons citrát test, pozitivní reakce se projeví modrou barvou; vpravo indolová reakce, pozitivní reakce se projeví červenou barvou) K podrobnější identifikaci gramnegativních bakterií a nefermentujících tyček, včetně pseudomonád, lze také použít komerčně dodávané testy API 20 E a API 20 NE (BioMerieux). Princip provedení i odečtu je obdobný výše popsanému testu API 20 Strep. Obrázek 15 API 20 E Identifikace kvasinek K identifikaci nejběžnějších druhů kvasinek se používá selektivní chromogenní půda Colorex Candida (Trios). Jednotlivé druhy rostou v různě barevných koloniích, což umožňuje jejich rychlé odlišení. Půdu je možné použít i pro získání čistých kolonií ze směsi. 37

38 Obrázek 16 Chromogenní agar (Candida albicans roste v zelených koloniích) Podrobnější identifikace je založená na testech asimilace cukrů a enzymových testech. V laboratoři se používá komerční test Auxacolor 2 (BioRad) zahrnující 16 testů v mikrotitrační destičce. Do jamek s dehydrovaným médiem se pipetuje definované množství suspenze zkoumaného původce. Destička se přelepí fólií a inkubuje 48 hodin (předběžné zhodnocení výsledku je možné již za 24 hodin), následně se odečítá barevná změna. 38