Pufrovaný roztok obsahující peroxid vodíku, detergent a 0,015 mol/l azidu sodného.

Transkript

1 PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK testů pro použití s přístrojem Autostainer Link 48 Použití k určenému účelu Pro diagnostiku in vitro. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx je kvantitativní imunohistochemický test využívající monoklonální myší protilátku Anti-PD-L1, klon 22C3 k detekci proteinu PD-L1 v řezech tkání s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC), fixovaných ve formalinu a zalitých v parafínu (FFPE), pomocí vizualizačního systému EnVision FLEX na přístroji Autostainer Link 48. Exprese proteinu PD-L1 se stanovuje za použití skóre pro vyjádření procentuálního podílu nádorových buněk (Tumor Proportion Score, TPS), což je procento životaschopných nádorových buněk, které vykazují částečné nebo kompletní zbarvení membrány jakékoli intenzity. Test PD-L1 IHC 22C3 pharmdx slouží jako pomůcka k identifikaci pacientů s NSCLC vhodných k léčbě přípravkem KEYTRUDA (pembrolizumab). Vyjádření mezních hodnot směrodatných pro vedení terapie ve specifických klinických podmínkách uvádí štítek produktu KEYTRUDA. Souhrn a výklad Vazba ligandů PD-1, PD-L1 a PD-L2 k receptoru PD-1 na T-buňkách inhibuje proliferaci T-buněk a produkci cytokinů. Up regulace ligandů PD-1 se vyskytuje u některých nádorů a signalizuje, že prostřednictvím této dráhy lze přispět k inhibici aktivních T-buněk imunitního dozoru nádorů. Přípravek KEYTRUDA je humanizovaná monoklonální protilátka, která se váže na receptor PD-1 a blokuje jeho interakci s PD-L1 a PD-L2, uvolňuje inhibici imunitní odpovědi, zprostředkovanou po dráze PD-1, včetně protinádorové imunitní odpovědi. Na modelech syngenních myších nádorů vedlo blokování aktivity PD-1 ke snížení růstu nádoru (1). Princip metody Test PD-L1 IHC 22C3 pharmdx obsahuje optimalizovaná činidla a protokol nutný k dokončení postupu IHC barvení vzorků FFPE pomocí přístroje Autostainer Link 48. Po inkubaci s primární monoklonální protilátkou proti PD-L1 nebo činidlem pro negativní kontrolu (Negative Control Reagent, NCR) se vzorky inkubují se specifickou protilátkou proti hostitelskému druhu primární protilátky, a pak se vzorky inkubují s vizualizačním činidlem připraveným k okamžitému použití, které obsahuje molekuly sekundárních protilátek a molekuly křenové peroxidázy navázané na společný hlavní řetězec dextranového polymeru. Enzymatická přeměna následně přidaného chromogenu vede k vytvoření viditelného reakčního produktu v místě protilátky. Barva chromogenní reakce je zesílena chromogenním činidlem. Vzorek může být poté kontrastně podbarven a překryt krycím sklíčkem. Výsledky se interpretují pomocí světelného mikroskopu. Dodané materiály Každá souprava obsahuje 19,5 ml primární protilátky proti PD-L1 (přibližně 3 µg/ml proteinové koncentrace) a obsahuje činidla nezbytná pro 50 testů v až 15 samostatných sériích. Materiály uvedené níže vystačí pro 50 testů (50 sklíček inkubovaných s primární protilátkou proti PD-L1 a 50 sklíček inkubovaných s odpovídajícím činidlem pro negativní kontrolu, celkem 100 sklíček). Počet testů vychází z použití µl každého činidla na sklíčko s výjimkou DAB+ a roztoku Target Retrieval Solution. Souprava obsahuje dostatečné množství materiálů pro až 15 samostatných sérií barvení. Množství Popis 1 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Pufrovaný roztok obsahující peroxid vodíku, detergent a 0,015 mol/l azidu sodného. 1 19,5 ml Primary Antibody: Monoklonální myší Anti-PD-L1, klon 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Monoklonální myší (IgG 1 ) anti-pd-l1 v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku s 0,015 mol/l azidu sodného ml Činidlo pro negativní kontrolu NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonální myší kontrolní IgG protilátka v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku s 0,015 mol/l azidu sodného. 1 34,5 ml Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE Králičí sekundární protilátka proti myším imunoglobulinům v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku s 0,015 mol/l azidu sodného. P03928CZ_04/SK / str. 1/16

2 1 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextran spolu s molekulami peroxidázy a molekulami kozích sekundárních protilátek proti králičím a myších imunoglobulinům v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku a antimikrobiální látce. 15 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Pufrovaný roztok obsahující peroxid vodíku a antimikrobiální látku. 1 5 ml Chromogen DAB+ DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidin tetrahydrochlorid v organickém rozpouštědle. 1 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Síran měďnatý ve vodě ml Roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Pufrovaný roztok, ph 6,1, obsahující detergent a antimikrobiální látku. 15 sklíček Kontrolní sklíčka PD-L1 IHC 22C3 pharmdx CONTROL SLIDES Na každém sklíčku jsou části dvou peletovaných buněčných linií fixovaných ve formalinu a zalitých v parafínu: NCI-H226* se střední expresí PD-L1 a MCF-7 s negativní expresí PD-L1. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1 negativní NCI-H226: PD-L1 pozitivní *Dr. AF Gazdarovi a Dr. JD Minnovi z NIH za jejich přínos ve vývoji NCI-H226 (číslo ATCC: CRL-5826 ) (2). Poznámka: Všechna obsažená činidla jsou vytvořena speciálně pro použití s touto soupravou. Aby bylo možné test provést podle uvedeného postupu, nelze používat žádné náhrady kromě roztoku EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (kód K8005). PD-L1 IHC 22C3 pharmdx byl uzpůsoben pro použití s přístrojem Autostainer Link 48. Podrobnější informace viz návod k použití přístroje Autostainer Link 48 a PT Link. Další potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Modul pro předběžné zpracování vzorků PT Link Pre-treatment Module (kód PT100/PT101/PT200) Přístroj Autostainer Link 48 (kód AS480) Pufr EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kód K8007) Hematoxylin (kód K8008) Destilovaná nebo deionizovaná voda (v kvalitě činidla) Časovač Pozitivní a negativní tkáně pro kontrolu zpracování (viz část Kontrola kvality) Mikroskopická sklíčka: Sklíčka Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód K8020) nebo kontrolní sklíčka Fisherbrand Superfrost Plus Krycí sklíčka Trvalé uzavírací médium a pomocná činidla potřebná pro vytvoření mikroskopického preparátu pod krycími sklíčky Světelný mikroskop (zvětšení objektivu 4x 40x) Bezpečnostní opatření 1. Pro diagnostiku in vitro. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN3), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože koncentrace azidu sodného ve výrobku se neklasifikuje jako nebezpečná, může usazenina NaN3 reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množstvím vody, aby nedocházelo k usazování azidů kovů v potrubí (3). 4. Primární protilátka, činidlo pro negativní kontrolu, Linker a vizualizační činidlo obsahuje materiál zvířecího původu. P03928CZ_04/SK / str. 2/16

3 5. Vzorky před a po fixaci a všechny jim vystavené materiály by měly být považovány za potenciálně infekční a mělo by se s nimi nakládat s náležitou opatrností (4). 6. Inkubační časy, teploty nebo metody jiné než ty uvedené, mohou vést k chybným výsledkům. 7. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může vést ke ztrátě barvení protilátky. 8. Vizualizační činidlo, tekutý chromogen DAB+ a připravený roztok substrát-chromogen DAB+ mohou být negativně ovlivněny, pokud jsou vystaveny intenzivnímu světlu. Neuchovávejte komponenty systému a neprovádějte barvení za silného světla, jako je například přímé sluneční světlo. 9. Rezidua parafínu mohou vést k falešně negativním výsledkům. 10. Použití objemů činidel jiných než doporučených může vést ke ztrátě viditelné imunoreaktivity PD-L Výsledky z malých studií prokázaly stejný dynamický rozsah exprese PD-L1 u párů vzorků primárního i metastázujícího NSCLC. Je možné, že exprese PD-L1 u primárních nádorů v porovnání s metastázujícími oblastmi se může u stejného pacienta lišit. 12. Velké řezy tkání mohou vyžadovat µl činidla. 13. Obecně platí, že osoby mladší 18 let s tímto přípravkem nesmějí pracovat. Uživatelé musí být pečlivě proškoleni ve správných pracovních postupech, seznámeni s nebezpečnými vlastnostmi přípravku a nezbytnými bezpečnostními pokyny. Další informace viz bezpečnostní list (Safety Data Sheet, SDS). 14. Používejte odpovídající osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. 15. Nespotřebované roztoky je nutno likvidovat v souladu s místními a celostátními předpisy. 16. Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. Nebezpečí Chromogen DAB+: 1 5% bifenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium-tetrachlorid H350 Může vyvolat rakovinu. H341 Podezření na genetické poškození. P201 Před použitím si obstarejte speciální instrukce. P202 Nepoužívejte, dokud jste si nepřečetli všechny pokyny pro bezpečné zacházení a neporozuměli jim. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranu očí a obličeje. obličejový štít. P308 + P313 PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc. P405 Skladujte uzamčené. P501 Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy. Výstraha Roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1 5% kyselina citronová H319 Způsobuje vážné podráždění očí. H411 Toxický pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. P280 Používejte ochranu očí a obličeje. P273 Zabraňte úniku do životního prostředí. P264 Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. P305 + P351 + P338 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. P337 + P313 Přetrvává-li podráždění očí: Vyhledejte lékařskou pomoc. P501 Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy. Uchovávání Všechny komponenty PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, včetně kontrolních sklíček, uchovávejte v temnu při teplotě 2 8 C, pokud je nepoužíváte s přístrojem Autostainer Link 48. Nepoužívejte soupravu po uplynutí doby exspirace vytištěné na vnějším obalu soupravy. Pokud se činidla skladují za jakýchkoli jiných podmínek než uvedených v příbalovém letáku, musí uživatel tyto podmínky ověřit. Nestabilita přípravku se neprojevuje žádnými výraznými známkami, proto by vzorky pozitivní a negativní kontroly měly být vždy zpracovávány spolu se vzorky pacienta. Příprava vzorku Se vzorky se musí manipulovat tak, aby tkáň pro IHC barvení zůstala chráněna. Všechny vzorky tkání by se měly zpracovávat podle standardních metod. Řezy zalité v parafínu Tkáně fixované ve formalinu a zalité v parafínu jsou vhodné pro použití. Alternativní fixativa nebyla validována a mohou vést k nesprávným výsledkům. Doporučuje se vzorek fixovat po dobu hodin v 10% neutrálním pufrovaném formalinu (neutral buffered formalin, NBF), nicméně studie s omezeným počtem vzorků prokázala, že fixace po dobu hodin v 10% NBF detekci PD-L1 systematicky neovlivňuje. Fixační časy 3 hodiny mohou vést k proměnlivé detekci PD-L1. Vzorky by měly mít tloušťku 3 nebo 4 mm, měly by být fixované ve formalinu, dehydrované a vyčištěné v sérii alkoholů a xylenu, po kterém následuje infiltrace s roztaveným parafínem. Teplota parafínu by neměla překročit 60 C. Tkáňové bločky FFPE staré 5 let a více mohou ztratit schopnost imunoreaktivity PD-L1. Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce přibližně 4 5 µm. Po vytvoření řezů by tkáň měla být připevněna na mikroskopická sklíčka Dako FLEX IHC (kód K8020) nebo sklíčka Fisherbrand Superfrost Plus a potom vložena na 1 hodinu do pece při teplotě 58 ± 2 C. Chcete-li zachovat antigenicitu měly by se tkáňové řezy, jakmile jsou umístěny na sklíčka, uchovávat v temnu při teplotě 2 8 C (preferováno), nebo při pokojové teplotě do 25 C, a barveny do 6 měsíců po nařezání. Teplota při skladování nebo manipulaci by nikdy překročit 25 C, a to v žádném okamžiku po umístění na sklíčka, aby se zajistila integrita a antigenicita tkáně. Použití PD-L1 IHC 22C3 pharmdx na dekalcifikovaných tkáních nebylo validováno a nedoporučuje se. P03928CZ_04/SK / str. 3/16

4 Příprava činidla Před barvením je třeba připravit následující činidla: Roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Připravte si dostatečné množství roztoku 1x Target Retrieval Solution, Low ph (50x) jeho rozředěním destilovanou nebo deionizovanou vodou (v kvalitě činidla) v poměru 1:50; ph roztoku 1x Target Retrieval Solution musí být 6,1 ± 0,2. Roztok 1x Target Retrieval Solution s ph pod 5,9 může způsobovat chybné výsledky. Jedna 30 ml lahvička roztoku Target Retrieval Solution, Low ph (50x), rozředěného v poměru 1:50 poskytne 1,5 l 1x činidla, což stačí na naplnění jedné nádržky přístroje PT Link a ošetření až 24 sklíček na jedno použití. Roztok 1x Target Retrieval Solution zlikvidujte po třech použitích a nepoužívejte jej po 5 dnech po rozředění. V případě potřeby je k dispozici další roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), pod kódem K8005. Pufr EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Připravte si dostatečné množství pufru Wash Buffer rozředěním pufru Wash Buffer (20x) v poměru 1:20 destilovanou nebo deionizovanou vodou (v kvalitě činidla) pro mytí. Nespotřebovaný roztok činidla 1x skladujte při teplotě 2 8 C ne déle než jeden měsíc. Čidlo zlikvidujte, pokud je zakalené. Podrobnější informace viz návod k použití přístroje Autostainer Link 48. Pufr EnVision FLEX Wash Buffer (20x) je k dispozici pod kódem K8007. Roztok substrát-chromogen DAB+ Tento roztok by měl být před použitím důkladně promíchán. Jakékoliv sraženina v roztoku nemá vliv na kvalitu barvení. Pro přípravu roztoku substrát-chromogen DAB+ přidejte 1 kapku chromogenu Liquid DAB+ Chromogen na ml pufru DAB+ Substrate Buffer a promíchejte. Připravený substrát-chromogen je stabilní po dobu 5 dnů, pokud je uchováván v temnu při teplotě 2 8 C. Důležitá upozornění: Pokud použijete celou lahev pufru DAB+ Substrate Buffer, přidejte 9 kapek chromogenu DAB+. Ačkoli na štítku je uvedeno 7,2 ml, jedná se o použitelné množství, ale není připočten mrtvý objem v lahvi. Barva chromogenu Liquid DAB+ Chromogen v lahvi se může lišit, od bezbarvé po fialově-hnědou. Tím není ovlivněna výkonnost přípravku. Ředění provádějte podle pokynů výše. Nadměrné přidání chromogenu Liquid DAB+ Chromogen do pufru DAB+ Substrate Buffer povede ke zhoršení pozitivního signálu. Postup barvení roztokem Autostainer Link 48 Solution Poznámky k postupu Uživatel by si měl před použitím pečlivě přečíst tyto pokyny a seznámit se se všemi komponenty a vybavením (viz Bezpečnostní opatření). Všechna činidla musí být před imunologickým barvením ekvilibrována na pokojovou teplotu (20 25 C). Stejně tak by se všechny kroky inkubace měly provádět za pokojové teploty. Řezy tkání nesmí během barvení uschnout. Řezy suché tkáně mohou zvýraznit nespecifické barvení. Všechny požadované kroky a časy inkubace jsou naprogramovány v softwaru Dako Link. Podrobnější informace o programování protokolů a vkládání sklíček a činidel viz návod k použití přístroje Autostainer Link 48 a PT. Poznámka: Činidla a pokyny dodávané s tímto systémem byla vytvořena za účelem optimálního výkonu při použití s doporučenými činidly a materiály. Další ředění činidel nebo pozměnění časů inkubace nebo teplot může vést k chybným nebo nesouhlasným výsledkům. Protokol barvení V možnostech rozevírací nabídky softwaru Dako Link vyberte protokol barvení PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Všechny požadované kroky a časy inkubace jsou naprogramovány v přístroji Autostainer Link 48. Pokud na vašem serveru nejsou příslušné protokoly PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, kontaktujte zástupce technické služby, aby vám protokoly poskytl. Krok 1: Postup deparafinizace, rehydratace a vyhledání cíle (3 v 1) Podrobné informace viz návod k použití přístroje PT. Nastavte funkci Preheat and Cool (Předehřátí a ochlazování) v přístroji PT Link (kód PT100/PT101/PT200) na 65 C. Funkci Heat (Ohřev) nastavte na 97 C po dobu 20 minut. Naplňte každou nádrž přístroje PT Link 1,5 l pracovního roztoku Target Retrieval Solution, Low ph, 1x pro pokrytí řezů tkáně. Předehřejte roztok Target Retrieval Solution na 65 C. Ponořte stojánky Autostainer s řezy tkáně FFPE na sklíčkách do předehřátého roztoku Target Retrieval Solution, Low ph, (1x pracovní roztok) v nádržce přístroje PT Link. Inkubujte 20 minut při teplotě 97 C. Po dokončení inkubace pro vyhledání cíle a poklesu teploty na 65 C vyjměte každý stojan se sklíčky Autostainer z nádržky přístroje PT Link a ihned přemístěte stojan Autostainer se sklíčky do nádržky (např. PT Link Rinse Station, kód PT109) s rozředěným pufrem Wash Buffer o pokojové teplotě (kód K8007). Ponechte sklíčka inkubovat v rozředěném pufru Wash Buffer zahřátém na pokojovou teplotu po dobu 5 minut. Krok 2: Postup barvení Po deparafinaci, rehydrataci a vyhledání cíle (3 v 1) se stojánky Autostainer se sklíčky vloží do přístroje Autostainer Link 48. Přístroj provede proces barvení, tj. aplikuje příslušné činidlo, monitoruje časy inkubace a opláchne sklíčka mezi jednotlivými činidly. Časy pro jednotlivá činidla jsou naprogramovány v softwaru Dako Link. Krok 3: Kontrastní barvivo Sklíčka by měla být kontrastně podbarvována po dobu 5 minut hematoxylinem (Link) (kód K8008). Inkubační doba hematoxylinu je předprogramována v protokolu. Krok 4: Montáž Je vyžadováno bezvodé permanentní uzavírací médium. P03928CZ_04/SK / str. 4/16

5 Poznámka: U některých obarvených sklíček se může vyskytnout blednutí v závislosti na několika faktorech, včetně mimo jiné na kontrastním podbarvení, uzavíracích materiálech a metodách a na podmínkách uchovávání sklíček. Pro minimalizaci vyblednutí uchovávejte sklíčka v temnu při pokojové teplotě (20 25 C). Kontrola kvality Činidla PD-L1 IHC 22C3 pharmdx byla z hlediska kvality kontrolována imunohistochemicky za použití vyhledávání cíle a postupů barvení uvedených výše. Odchylky od doporučených postupů pro fixaci tkání, zpracování a zalití může vést ke značné variabilitě výsledků získaných v laboratoři uživatele. Každá série barvení by měla být podrobena kontrolám kvality. Tyto kontroly kvality jsou uvedeny v tabulce 1 a obsahují: vzorky tkáně pacienta obarvené hematoxylinem a eosinem (H & E); laboratoří dodané pozitivní a negativní kontrolní tkáně; a kontrolní sklíčko s buněčnými liniemi dodané společností Dako (5). V USA prostudujte zásady kontroly kvality patologů z College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry (certifikační program pro imunohistochemii), další informace viz též zajištění kvality CLSI pro imunocytochemii, schválené pokyny (5, 6, 7). Ověření stanovení Před prvním použitím barvicího systému v rámci diagnostického postupu by měl uživatel ověřit provedení rozboru tak, že jej otestuje na sérii laboratoří dodaných pozitivních a negativní tkáních se známými IHC charakteristikami. Viz postupy kontroly kvality uvedené v části o kontrole kvality výše. Tyto postupy kontroly kvality by se měly opakovat pro každou novou šarži protilátky, nebo kdykoli dojde ke změně v testovacích parametrech. Možnosti řešení potenciálních problémů, jejich příčiny a navrhovaná nápravná opatření jsou uvedeny v tabulce 12. Interpretace exprese NSCLC Všechny životaschopné nádorové buňky na celém sklíčku musí být vyhodnoceny a zahrnuty do interpretace exprese PD-L1. Ve vzorku na obarveném sklíčku PD-L1 považovaném za adekvátní pro hodnocení exprese PD-L1 musí být přítomno minimálně 100 životaschopných nádorových buněk. Pro úspěšnou interpretaci obarvených vzorků PD-L1 IHC 22C3 pharmdx je zcela zásadní, aby byly hodnoceny vhodné buňky, identifikována správná buněčná lokalizace a správně interpretována intenzita barvení. Sklíčka by měl vyhodnotit patolog za použití světelného mikroskopu. Pro vyhodnocení imunohistochemického barvení a interpretaci je vhodný objektiv se zvětšením 10 40x. Každé znatelné barvení buněčné membrány nádorových buněk by mělo být zahrnuto do interpretace. Interpretace částečného nebo úplného barvení buněčné membrány ( 1+), které je znatelně odlišné od cytoplazmatického barvení. Cytoplazmatické barvení se považuje za nespecifické barvení a je z hodnocení intenzity barvení vyloučeno. Normální buňky a s nádorem asociované imunitní buňky, jako jsou infiltrující lymfocyty nebo makrofágy, se nezahrnují do interpretace za účelem určení pozitivity PD-L1. Vzorky nádoru s NCR musí mít 0 specifické barvení a <1+ barvení pozadí. Skóre pro vyjádření procentuálního podílu nádorových buněk (Tumor Proportion Score, TPS) je procento životaschopných nádorových buněk, které vykazují částečné nebo kompletní zbarvení membrány ( 1+). Vzorky mají expresi PD-L1, pokud TPS 1 % životaschopných nádorových buněk vykazuje zbarvení membrány jakékoli intenzity. Vzorky mají vysokou expresi PD-L1, pokud TPS 50 % životaschopných nádorových buněk vykazuje zbarvení membrány jakékoli intenzity. Každá série barvení sklíček by měla být vyšetřena v pořadí uvedeném v tabulce 1 pro určení platnosti barvení série a možnosti posouzení barvení vzorku tkáně. Další pokyny viz příručka interpretací PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Další doporučení pro interpretaci barvení PD-L1 IHC 22C3 pharmdx 1. Pro ověření barvení buněčné membrány použijte objektiv se zvětšením 10 40x. 2. Různé necílové prvky, jako jsou s nádorem asociované imunitní buňky (například makrofágy) a stroma mohou také barvit pozitivně pro PD-L1, avšak neměly by být zahrnuty do interpretace. Tabulka 1. Doporučené pořadí hodnocení sklíček Vzorky Zdůvodnění Požadavky 1. H&E (dodaná laboratoří) Barvení vzorku tkáně hematoxylinem a eosinem (H&E) se hodnotí jako první pro posouzení histologické a konzervační kvality tkáně. Test PD-L1 IHC 22C3 pharmdx a barvení H & E by se měly provádět na sériových řezech ze stejného parafínového bločku vzorku. Tkáňové vzorky by měly být neporušené, dobře zachovalé a měly by potvrdit indikaci nádoru. 2. Kontrolní sklíčka s buněčnými liniemi (dodává spol. Dako) Kontrolní sklíčko s buněčnými liniemi barvené primární protilátkou PD-L1 od PD-L1 IHC 22C3 pharmdx by mělo být vyšetřeno kvůli ujištění, zda všechna činidla fungují správně. Kontrolní sklíčko obsahuje peletu s PD-L1-pozitivními buněčnými liniemi a peletu s PD-L1- negativními buněčnými liniemi. Kontrolní sklíčko s buněčnými liniemi se obarví primární protilátkou proti PD-L1 v každé sérii barvení. Kritéria přijatelnosti NCI-H226 (PD-L1-pozitivní kontrolní buněčná linie): Barvení buněčné membrány u 70 % buněk o průměrné intenzitě barvení 2+. Nespecifické barvení o intenzitě < 1+. Kritéria přijatelnosti MCF-7 (PD-L1-negativní kontrolní buněčná linie): Nespecifické barvení. Nespecifické barvení o intenzitě < 1+. Poznámka: někdy lze u buněčné pelety MCF-7 pozorovat barvení několika buněk. Platí následující kritéria přijatelnosti: přítomnost 10 buněk celkem se zřetelným zbarvením plazmatické membrány, nebo s cytoplazmatickým barvením s intenzitou 1+ uvnitř hranic buněčné pelety MCF-7 je přijatelná. Pokud žádná z kontrolních buněčných linií toto kritérium nesplní, budou výsledky testů vzorků pacienta považovány za neplatné. P03928CZ_04/SK / str. 5/16

6 3. Sklíčka s pozitivní kontrolní tkání (dodaná laboratoří) 4. Sklíčka s negativní kontrolní tkání (dodaná laboratoří) 5. Kontrolní tkáň mandlí (volitelně) (dodaná laboratoří) 6 Sklíčko s tkání pacienta obarvenou činidlem pro negativní kontrolu 7 Sklíčko s tkání pacienta obarvenou primární protilátkou proti PD-L1. Poté by měla být vyšetřena sklíčka s pozitivní kontrolní tkání obarvenou primární protilátkou proti PD-L1 a činidlem pro negativní kontrolu. Tato sklíčka ověřují účinnost metody fixace a procesu vyhledání epitopu. Známé kontrolní vzorky pozitivní tkáně by se měly používat pouze ke sledování správného zpracování tkáně a testovacích činidel, NE jako pomůcka pro diagnostiku vzorků pacienta. Poté by měla být vyšetřena sklíčka s negativní kontrolní tkání (o známé PD-L1 negativitě) obarvenou primární protilátkou proti PD-L1 a činidlem pro negativní kontrolu, a to za účelem ověření specificity značení cílového antigenu primární protilátkou. Alternativně mohou negativní části pozitivní kontrolní tkáně sloužit jako negativní kontrolní tkáň, ale to by mělo být ověřeno uživatelem. Použijte lidskou tkáň mandlí fixovanou, zpracovanou a zalitou podobným způsobem jako pacientovy vzorky jako další kontrolní materiál pro ověření citlivosti, specificity a nespecifického barvení pozadí testu. Vyšetřete vzorky pacienta ošetřené činidlem pro negativní kontrolu od PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Činidlo pro negativní kontrolu se používá namísto primární protilátky a pomůcek pro interpretaci specifického barvení v místě protilátky. Nakonec vyšetřete celé sklíčko se vzorky pacienta obarvené primární protilátkou proti PD-L1 z testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Konkrétní informace ohledně imunoreaktivity PD-L1 IHC 22C3 pharmdx viz Souhrn a výklad, Omezení a Charakteristiky účinnosti. Kontrolními vzorky by měly být biopticky nebo chirurgicky odebrané vzorky stejného nádoru jako pacientův vzorek, které jsou co nejrychleji fixovány, zpracovány a zality stejným způsobem, jako pacientovy vzorky. Pro interpretaci výsledků použijte intaktní vzorky, protože nekrotické nebo degenerované buňky se často barví nespecificky. Tkáně vybrané jako kontrolní vzorky pozitivní tkáně by měly při barvení PD-L1 vykazovat slabé až středně pozitivní barvení, aby pomohly odhalit jemné změny v citlivosti testu. Do každé série barvení by se měla přidat dvě sklíčka s pozitivní kontrolní tkání. Sklíčko obarvené PD-L1: Měla by být pozorována přítomnost hnědého zabarvení plazmatické membrány. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Sklíčko obarvené činidlem pro negativní kontrolu: Žádné barvení membrány. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Pokud kontrolní vzorky pozitivní tkáně selžou v demonstraci příslušného pozitivního barvení, budou výsledky testů vzorků považovány za neplatné. Kontrolními vzorky by měly být biopticky nebo chirurgicky odebrané vzorky stejného nádoru jako pacientův vzorek, které jsou co nejrychleji fixovány, zpracovány a zality stejným způsobem, jako pacientovy vzorky. Do každé série barvení by se měla přidat dvě sklíčka s negativní kontrolní tkání. Sklíčko obarvené PD-L1: Žádné barvení membrány u nádorových buněk. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Sklíčko obarvené činidlem pro negativní kontrolu: Žádné barvení membrány. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Pokud na sklíčkách s negativní kontrolní tkání dojde ke specifickému zbarvení plazmatické membrány, budou výsledky testů vzorků pacienta považovány za neplatné. Silné pozitivní zabarvení by mělo být zjištěno u částí epitelu krypty a slabé až střední zabarvení u folikulárních makrofágů v zárodečných centrech mandlí. Negativní zabarvení by mělo být pozorováno u endotelia, fibroblastů a povrchového epitelu. Absence zbarvení buněčné membrány ověřuje specifické značení cílového antigenu primární protilátkou. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Pozitivní intenzitu barvení je třeba posuzovat v kontextu jakéhokoliv nespecifického zbarvení pozadí zaznamenaného na sklíčku pacienta s činidlem pro negativní kontrolu ve stejné sérii. U každého imunohistochemického testu negativní výsledek znamená, že protilátka nebyla detekována, ale nutně to neznamená, že protilátka nebyla v analyzovaných buňkách/tkáních přítomna. Všechny životaschopné nádorové buňky na celém obarveném sklíčku pacienta musí být vyhodnoceny a zahrnuty do interpretace exprese PD-L1. Ve vzorku považovaném za adekvátní pro hodnocení exprese PD-L1 musí být přítomno minimálně 100 životaschopných nádorových buněk. Všeobecná omezení 1. Imunohistochemie je vícekrokový diagnostický postup, který vyžaduje specializované zaškolení ve výběru vhodných činidel a tkáně, fixaci a zpracování; přípravě imunohistochemických sklíček a interpretaci výsledků barvení. 2. Barvení tkání závisí na manipulaci a zpracování tkáně před barvením. Nesprávná fixace, zmrazení, rozmrazování, mytí, sušení, zahřívání, řezání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může způsobovat artefakty, zachycení protilátky nebo falešně negativní výsledky. Nekonzistentní výsledky mohou vzniknout kvůli odchylkám v metodách fixace a zalití nebo v důsledku skrytých nepravidelností tkání. 3. Nadměrné nebo neúplné kontrastní podbarvení může ohrozit správnou interpretaci výsledků. 4. Klinická interpretace pozitivního barvení, nebo jeho nepřítomnosti, musí být vyhodnocena v kontextu klinických projevů, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoli barvení, nebo jeho nepřítomnosti, musí být doplněna morfologickými studiemi, řádnými kontrolami a dalšími diagnostickými testy. Za interpretaci barveného preparátu zodpovídá kvalifikovaný patolog, který zná použité protilátky, činidla a použité metody. Barvení se musí provádět v certifikované laboratoři s příslušným oprávněním a pod dohledem kvalifikovaného patologa zodpovědného za hodnocení barvených sklíček a zaručení adekvátnosti pozitivních a negativních kontrol. P03928CZ_04/SK / str. 6/16

7 5. U tkání osob infikovaných virem hepatitidy B a s povrchovým antigenem hepatitidy B (HBsAg) se může projevovat nespecifické barevní křenovou peroxidázou (7). 6. Činidla mohou u dříve neošetřených typů tkání vykazovat neočekávané reakce. Možnost neočekávané reakce nemůže být zcela vyloučena ani u testovaných typů tkání, a to v důsledku biologické variability exprese antigenu v novotvarech nebo jiných patologických tkáních. Pokud zdokumentujete neočekávané reakce, kontaktujte technickou podporu společnosti Dako. 7. K falešně pozitivním výsledkům může docházet v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo substrátu reakčních produktů. Mohou být také způsobeny pseudoperoxidázovou aktivitou (erytrocyty) a aktivitou endogenní peroxidázy (cytochrom C) (7). 8. Činidla a pokyny dodávané s tímto systémem byla vytvořena za účelem optimálního výkonu. Další ředění činidel nebo pozměnění časů inkubace nebo teplot může vést k chybným nebo nesouhlasným výsledkům. Omezení specifická pro tento produkt 1. Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny degradací antigenu v tkáních, ke které může po určité době docházet. Vzorky je nutné barvit během šesti měsíců od upevnění tkání na sklíčka, pokud jsou skladována v temnu při teplotě 2 8 C (preferováno), nebo při pokojové teplotě do 25 C. 2. Abyste dosáhli optimálních a reprodukovatelných výsledků, je třeba vyhledat cíl u proteinu PD-L1 před ošetřením, kdy jsou tkáně běžným postupem fixovány (neutrální pufrovaný formalin) a zality v parafínu. 3. Nezaměňujte činidla jiných čísel šarže tohoto přípravku nebo souprav od jiných výrobců. Jedinou výjimkou je roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), který je v případě potřeby k dispozici pod kódem K Obarvené linie kontrolních buněk by se měly použít pouze pro validaci barvení série, ale neměly by se používat pro interpretaci barevné reakce v řezech tkání. 5. Použití testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx s jinými fixativy než formalinem nebylo validováno. 6. Použití testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx pro aspiraci tenkou jehlou nebylo validováno. Klinické hodnocení výkonnosti KEYNOTE-024: Kontrolovaná studie pro pacienty s NSCLC bez předchozí léčby Bezpečností a účinností přípravku pembrolizumab se zabývala studie KEYNOTE-024, multicentrická, kontrolovaná studie pro léčbu dříve neléčených metastatických NSCLC. Pacienti měli expresi PD-L1 s 50% skóre pro vyjádření procentuálního podílu nádorových buněk (Tumor Proportion Score, TPS) dle testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx (9). Pacienti byli randomizováni (1:1) pro podávání dávky pembrolizumabu 200 mg každé 3 týdny (n=154) nebo zadavatelem vybranou chemoterapii s platinou (n=151; zahrnující pemetrexed+carboplatin, pemetrexed+cisplatin, gemcitabin+cisplatin, gemcitabin+carboplatin, nebo paclitaxel+carboplatin. Neskvamózní pacienti mohli dostávat udržovací dávky pemetrexedu). Pacienti byli léčeni pembrolizumabem až do přijatelné toxicity nebo progrese choroby. Léčba mohla pokračovat i přes progresi choroby, pokud byl pacient klinicky stabilní a představoval možnost klinického přínosu pro zadavatele. Studie vylučovala pacienty s aberací genu EGFR nebo ALK v tumoru; trpící autoimunitním onemocněním, které vyžaduje systémovou terapii v rámci 2leté léčby; se zdravotním stavem vyžadujícím imunosupresi; nebo kteří dostali dávku více než 30 Gy ozáření hrudníku během předchozích 26 týdnů. Hodnocení stavu nádoru se provádělo každých 9 týdnů. Pacienti na chemoterapii, kteří prodělali nezávisle ověřenou progresi choroby, mohli přejít a dostávat pembrolizumab. U 305 pacientů ve studii KEYNOTE-024 byly takovéto výchozí charakteristiky: střední věk 65 let (54 % bylo ve věku 65 let nebo starší); 61 % mužů; 82 % bělochů a 15 % Asiatů; a výkonnostní stav ECOG 0 a 1 u 35 % a 65 %, v tomto pořadí. Charakteristiky onemocnění byly skvamózní (18 %) a neskvamózní (82 %); M1 (99 %); a metastázy v mozku (9 %). Měřítko výsledku primární účinnost bylo přežití bez progrese (PFS) dle vyhodnocení zaslepenou nezávislou centrální revizí (BICR) s použitím kritérií hodnocené odezvy pevných nádorů, verze 1.1 (RECIST 1.1). Měřítka výsledku sekundární účinnosti byla celkové přežití (OS) a míra objektivní odpovědi (ORR) dle vyhodnocení BICR s použitím RECIST 1.1. Tabulka 2 sumarizuje klíčová měřítka účinnosti pro celkový význam při léčbě populace (ITT). P03928CZ_04/SK / str. 7/16

8 Tabulka 2: Výsledky účinnosti ve studii KEYNOTE-024 Cílový ukazatel KEYTRUDA 200 mg každé 3 týdny n=154 Chemoterapie n=151 PFS* Počet (%) pacientů s příhodou 73 (47 %) 116 (77 %) Míra rizika 0,50 (0,37; 0,68) --- Hodnota p <0, Medián v měsících 10,3 (6,7, NA) 6,0 (4,2; 6,2) OS Počet (%) pacientů s příhodou 44 (29 %) 64 (42 %) Míra rizika 0,60 (0,41; 0,89) --- Hodnota p 0, Medián v měsících Nedosaženo (NA, NA) Nedosaženo (9,4; NA) Míra objektivní odpovědi* ORR % 45 % (37, 53) 28 % (21, 36) Celková odpověď v % 4 % 1 % Částečná odpověď v % 41 % 27 % Trvání odpovědi Medián v měsících (rozsah) Nedosaženo (1,9+, 14,5+) % s trváním > 6 měsíců 88 % 59 %# 6,3 (2,1+, 12,6+) * Posouzeno BICR pomocí RECIST 1.1 Míra rizika (KEYTRUDA ve srovnání s chemoterapií) založená na stratifikovaném Coxově modelu proporčních rizik Podle stratifikovaného testu Log rank test Podle pacientů s nejlepší celkovou odpovědí jako potvrzenou dokončenou nebo částečnou odpovědí Podle Kaplan-Meierova odhadu; zahrnuje 43 pacientů s odpovědí 6 měsíců nebo delší # Podle Kaplan-Meierova odhadu; zahrnuje 16 pacientů s odpovědí 6 měsíců nebo delší NA = není k dispozici Obrázek 1: Kaplan-Meierova křivka pro celkové přežití ve studii KEYNOTE Overall Celkové Survival přežití (%) Treatment Léčebné rameno arm KEYTRUDA Chemotherapy Chemoterapie Počet Doba Time v in měsících Months v Number ohrožení at Risk KEYTRUDA: Chemoterapie: Chemotherapy: KEYNOTE-010: Kontrolovaná studie pro pacienty s NSCLC s předchozí chemoterapií Klinický přínos testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx byl hodnocen v multicentrické, otevřené, randomizované klinické studii KEYNOTE-010 hodnotící bezpečnost a účinnost přípravku KEYTRUDA u pacientů s pokročilým NSCLC, kteří dříve prodělali chemoterapii s platinou (10) (9). Pacienti měli expresi PD-L1 s 1% skóre TPS podle testu klinické studie (CTA) verze PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Pacienti s aktivační mutací genu EGFR nebo translokací genu ALK prodělali také progresi choroby při schválené terapii pro tyto mutace před obdržením přípravku pembrolizumab. Pacienti byli randomizováni (1:1:1) pro užívání přípravku pembrolizumab v dávce 2 (n=344) nebo P03928CZ_04/SK / str. 8/16

9 10 mg/kg (n=346) každé 3 týdny nebo docetaxel v dávce 75 mg/m 2 každé 3 týdny (n=343) až do progrese choroby nebo nepřijatelné toxicity. Studie vylučovala pacienty s autoimunitním onemocněním; se zdravotním stavem vyžadujícím imunosupresi; nebo kteří dostali dávku více než 30 Gy ozáření hrudníku během předchozích 26 týdnů. Hodnocení stavu nádoru se provádělo každých 9 týdnů. Měřítka výsledku sekundární účinnosti byla OS a PFS dle vyhodnocení BICR s použitím RECIST 1.1. Na základě tohoto CTA bylo do studie randomizováno celkem pacientů s NSCLC. Klinická prospěšnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx byla hodnocena na archivovaných vzorcích z klinické studie, které byly retrospektivně testovány v referenční laboratoři v USA testem PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Z pacientů byla testem PD-L1 IHC 22C3 pharmdx retrospektivně testována nádorová tkáň 529 pacientů. Vzorky 413 pacientů měly expresi PD-L1 ( 1 % životaschopných nádorových buněk vykazovalo membránové barvení jakékoli intenzity) a vzorky od 94 pacientů neměly expresi PD-L1 (< 1 % životaschopných nádorových buněk vykazovalo membránové barvení jakékoli intenzity). Mezi těmito 413 pacienty s expresí PD-L1 měly vzorky od 163 pacientů vysokou expresi PD-L1 ( 50 % životaschopných nádorových buněk vykazovalo membránové barvení jakékoli intenzity). Úroveň shody dosažené mezi CTA a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx je uvedena v Tabulce 3. Tabulka 3: Shoda CTA a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Míra shody PD-L1 Mez Negativní procentuální shoda (95% interval spolehlivosti (CI)) Pozitivní procentuální shoda (95% interval spolehlivosti (CI)) CTA v porovnání s PD-L1 IHC TPS 1 % 94,5 % [91,4 % 96,6 %] 80,0% [76,9%-82,8%] 22C3 pharmdx TPS 50 % 98,3% [97,1%-99,0%] 73,2% [67,9%-77,9%] Mezi randomizovanými pacienty s expresí PD-L1 podle PD-L1 IHC 22C3 pharmdx byly demografické a jiné výchozí charakteristiky mezi léčebnými rameny dobře vyvážené. Průměrný věk byl 63 let (44 % ve věku 65 a starší). Většina pacientů patřila k bílé rase (77%) a byli to muži (58%); základní výkonnostní stav byl ECOG 0 (29%), nebo 1 (71%). Sedmdesát osm procent (78 %) pacientů byli bývalí/aktivní kuřáci. Dvacet dva procent (22 %) pacientů mělo skvamózní histologii a 69 % mělo neskvamózní histologii. Výchozí a demografické charakteristiky byly v rámci celé klinické studie podobně dobře vyvážené napříč rameny s pembrolizumabem a docetaxelem. Výsledky účinnosti jsou shrnuty v tabulce 4 a 5. Přípravek KEYTRUDA prokázal trvalý klinický přínos u pacientů s NSCLC, s expresí PD-L1 (TPS 1 %), což bylo vylepšeno u pacientů s vysokou expresí PD-L1, (TPS 50 %), jak bylo stanoveno testem PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Závažnost přínosu byla porovnatelná v rámci celého klinického hodnocení. Níže uvedené tabulky shrnují klíčová měřítka účinnosti u celkové populace s expresí PD-L1 (TPS 1%) a u subsetu s vysokou expresí PD-L1 (TPS 50 %) pro celou klinickou studii (TPS 1 % dle CTA) a u populace s expresí PD-L1 dle PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Kaplan-Meierova křivka pro OS (TPS 1 %, dle stanovení testem PD-L1 IHC 22C3 pharmdx) je na obrázku 2. Výsledky účinnosti byly podobné u ramen se 2 mg/kg a 10 mg/kg přípravku KEYTRUDA. Tabulka 4: Odpověď na přípravek KEYTRUDA u dříve léčených pacientů: Celá klinická studie a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Pozitivní pacienti: PD-L1 TPS 1 % KEYTRUDA KEYTRUDA Docetaxel Cílový ukazatel 2 mg/kg každé 3 týdny 10 mg/kg každé 3 týdny 75 mg/m 2 každé 3 týdny Klinické hodnocení PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinické hodnocení PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinické hodnocení PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Počet pacientů OS Úmrtí (%) 172 (50 %) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Míra rizika* 0,71 (0,58; 0,88) 0,54 (0,37; 0,78) 0,61 (0,49; 0,75) 0,57 (0,39; 0,82) Hodnota p <0,001 <0,001 <0,001 0, Medián v měsících PFS 10,4 (9,4; 11,9) 11,8 (9,6; NA) 12,7 (10,0; 17,3) 12,0 (8,7; NA) 8,5 (7,5; 9,8) 7,5 (6,3; 9,9) Případy (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Míra rizika* 0,88 (0,73; 1,04) 0,68 (0,50; 0,92) 0,79 (0,66; 0,94) 0,79 (0,59; 1,06) Hodnota p 0,068 0, ,005 0, Medián v měsících Celková míra odpovědi ORR v % 3,9 (3,1; 4,1) 18% (14; 23) 4,9 (4,1; 6,2) 24% (17; 32) 4,0 (2,6; 4,3) 18% (15; 23) 4,0 (2,2; 4,6) 20% (14; 28) 4,0 (3,1; 4,2) 9% (7; 13) * Míra rizika (KEYTRUDA ve srovnání s docetaxelem) založená na stratifikovaném Coxově modelu proporčních rizik Podle stratifikovaného testu Log rank test Posouzeno BICR pomocí RECIST 1.1 Všechny odpovědi byly částečné 3,8 (2,2; 4,2) 5% (2; 11) P03928CZ_04/SK / str. 9/16

10 Tabulka 5: Odpověď na přípravek KEYTRUDA u dříve léčených pacientů: Celá klinická studie a PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Pozitivní pacienti: PD-L1 TPS 50 % Cílový ukazatel KEYTRUDA 2 mg/kg každé 3 týdny KEYTRUDA 10 mg/kg každé 3 týdny Docetaxel 75 mg/m 2 každé 3 týdny Klinické hodnocení PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinické hodnocení PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinické hodnocení Počet pacientů OS PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Úmrtí (%) 58 (42 %) 18 (32 %) 60 (40 %) 19 (32 %) 86 (57 %) 25 (53 %) Míra rizika* 0,54 0,45 0,50 0,29 (0,38; 0,77) (0,24; 0,84) (0,36; 0,70) (0,15; 0,56) Hodnota p <0,001 0,00541 <0,001 <0, Medián v měsících 14,9 (10,4; NA) Nedosažen (9,3; NA) 17,3 (11,8; NA) Nedosažen (8,3; NA) 8,2 (6,4; 10,7) 7,2 (4,4; 8,3) PFS Případy (%) 89 (64 %) 33 (59 %) 97 (64 %) 34 (57 %) 118 (78 %) 33 (70 %) Míra rizika* 0,58 0,47 0,59 0,41 (0,24; (0,43; 0,77) (0,28; 0,80) (0,45; 0,78) 0,70) Hodnota p <0,001 0,00221 <0,001 <0, Medián v měsících 5,2 (4,0; 6,5) 5,9 (4,2; 9,0) 5,2 (4,1; 8,1) 4,8 (2,8; NA) 4,1 (3,6; 4,3) 3,9 (2,0; 4,3) Celková míra odpovědi ORR v % 30 % (23; 39) 37 % (25; 52) 29 % (22; 37) 28 % (18; 41) 8 % (4; 13) 4 % (1; 15) * Míra rizika (KEYTRUDA ve srovnání s docetaxelem) založená na stratifikovaném Coxově modelu proporčních rizik Podle stratifikovaného testu Log rank test Posouzeno BICR pomocí RECIST 1.1 Všechny odpovědi byly částečné Obrázek 2: Kaplan-Meierova křivka pro celkové přežití podle léčebného ramene (TPS 1 % dle PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, populace s léčebným cílem) Celkové přežití (%) Docetaxel 75 mg/m 2 Q3W MK mg/kg Q3W MK mg/kg Q3W n při riziku Docetaxel 75 mg/m 2 Q3W 131 Doba v měsících MK mg/kg Q3W 140 MK mg/kg Q3W 142 Další analýzy odolnosti posuzovaly možný vliv chybějících údajů pocházejících od pacientů s expresí PD-L1 (TPS 1 %) dle testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, ale kteří nemuseli mít expresi PD-L1 (TPS <1 %) podle CTA. Pacienti s takovými výsledky testu jsou součástí populace PD-L1 IHC 22C3 pharmdx / se zamýšleným použitím / zamýšlenou diagnózou (ITD), byli však z klinického hodnocení vyloučeni kvůli nepřítomnosti exprese PD-L1 při skríningu CTA. Aby mohly být tyto chybějící údaje vzaty v úvahu, byla provedena analýza citlivosti, aby se vyjasnil hodnověrný rozsah pro míru rizika (HR) s odhadem založeným na subpopulacích PD-L1 IHC 22C3 pharmdx s TPS 1 % a TPS 50 % v rámci ITD pro ověření konzistence se zjištěným HR založeným na zařazení do CTA. Výsledky analýzy citlivosti HR ukázaly, odhady HR jsou robustní vůči jakémukoli předpokládanému oslabení účinku léčby v rámci ITD. P03928CZ_04/SK / str. 10/16

11 Neklinické hodnocení výkonnosti Analytická citlivost/specificita Analytická citlivost PD-L1 IHC 22C3 pharmdx byla testována na 127 unikátních případech vzorků FFPE nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC) ve stádiu I až IV za použití výrobní šarže. Hodnocení exprese PD-L1 prokázalo barvení v rozsahu % pozitivních nádorových buněk a intenzitou barvení 0 3. Normální tkáně: V tabulce 6 je uveden souhrnný přehled imunoreaktivity myší monoklonální Anti-PD-L1, klonu 22C3 na doporučeném panelu normálních tkání. Na imunitních buňkách a buňkách epiteliálního původu bylo pozorováno zbarvení plazmatické membrány. Na některých typech buněk bylo pozorováno cytoplazmatické zbarvení, ale nebylo zaznamenáno jako pozitivní zbarvení. Všechny tkáně byly fixovány formalinem a zality v parafínu a obarveny PD-L1 IHC 22C3 pharmdx podle pokynů na příbalovém letáku. Na testovaných typech buněk nebo tkání nebyly pozorovány žádné neočekávané výsledky. Pozorované zbarvení bylo konzistentní s uvedenou literaturou pro expresi PD-L1 IHC v normálních tkáních (11, 12). Tabulka 6: Souhrn reaktivity normální tkáně v testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Typ tkáně (počet testovaných) Pozitivní barvení plazmatické membrány: Prvky tkáně Pozitivní barvení cytoplazmy: Prvky tkáně Nespecifické barvení Brzlík (3) 3/3 medulární epitel 0/3 0/3 Děloha (3) 0/3 0/3 0/3 Děložní hrdlo (3) 1/3 epitel 0/3 0/3 Hypofýza (3) 1/3 přední hypofýza 1/3 přední hypofýza 0/3 1/3 zadní hypofýza 1/3 zadní hypofýza Játra (3) 1/3 makrofágy 0/3 0/3 1/3 hepatocyty Jícen (3) 0/3 0/3 0/3 Kostní dřeň (3) 3/3 megakaryocyty 3/3 megakaryocyty 0/3 Kůže (3) 0/3 0/3 0/3 Ledvina (3) 1/3 tubulární epitel 0/3 0/3 Malý mozek (3) 0/3 0/3 0/3 Mandle (3) 3/3 epitel krypty 0/3 0/3 2/3 germinální centrum (makrofágy) Mezoteliální buňky (2) 0/2 0/2 0/2 Mozek (3) 0/3 0/3 0/3 Nadledvina (3) 0/3 1/3 medulární buňky 0/3 Nerv periferní (3) 0/3 1/3 pojivová tkáň /cévy 0/3 Pankreas (3) 0/3 0/3 0/3 Plíce (3) 3/3 alveolární makrofágy 0/3 0/3 Prostata (2) 2/2 epitel 0/2 0/2 Prs (3) 0/3 0/3 0/3 Příštítná tělíska (3) 1/3 glandulární epitel 0/3 0/3 Slezina (3) 2/3 makrofágy 0/3 0/3 Slinná žláza (3) 0/3 0/3 0/3 Sval srdeční (3) 0/3 0/3 0/3 Sval, kosterní (3) 0/2 0/2 0/2 Štítná žláza (3) 0/3 0/3 0/3 Tenké střevo (3) 0/3 0/3 0/3 Tračník (3) 2/3 makrofágy 0/3 0/3 Vaječník (3) 0/3 0/3 0/3 Varlata (3) 0/3 0/3 0/3 Žaludek (3) 2/3 lymfocyty 1/3 žlázový epitel 1/3 žlázový epitel 0/3 Neoplastické tkáně: V tabulce 7 je uveden souhrnný přehled imunoreaktivity myší monoklonální Anti-PD-L1, klonu 22C3 na panelu neoplastických tkání. Na imunitních buňkách a buňkách epiteliálního původu bylo pozorováno zbarvení plazmatické membrány. Na některých typech buněk bylo pozorováno cytoplazmatické zbarvení, ale nebylo zaznamenáno jako pozitivní zbarvení. Všechny tkáně byly fixovány formalinem a zality v parafínu a obarveny PD-L1 IHC 22C3 pharmdx podle pokynů na příbalovém letáku. Na testovaných vzorcích tumoru nebyly pozorovány žádné neočekávané výsledky. Pozorované zbarvení bylo konzistentní s uvedenou literaturou pro expresi PD-L1 IHC v neoplastických tkáních (11-14). Tabulka 7: Souhrn reaktivity neoplastické tkáně v testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Typ tumoru Místo PD-L1 pozitivní/celkem N=159 Adenokarcinom Děloha, endometrium 0/3 Děloha, z jasných buněk 0/1 Děložní čípek, endocervikální typ 0/1 GI, metastázující do plic 0/1 Hlava a krk, tvrdé patro 0/1 Jícen 0/1 Konečník 0/4 Plíce 1/4 Prostata 0/5 Prs, DCIS 0/2 Prs, invazivní duktální 0/7 Prs, invazivní duktální metastázující do lymfatické uzliny 0/1 P03928CZ_04/SK / str. 11/16

12 Typ tumoru Místo PD-L1 pozitivní/celkem N=159 Příloha 0/1 Slinivka břišní 0/2 Slinivka břišní, duktální 0/3 Slinné/příušní žlázy 0/2 Štítná žláza, folikulární 0/1 Štítná žláza, folikulární-papilární 0/1 Štítná žláza, papilární 0/3 Tenké střevo 0/2 Tlusté střevo, metastázující do jater 0/1 Tlusté střevo, mucinózní 0/1 Tračník 0/5 Vaječník 0/1 Vaječník, endometrioid 0/1 Vaječník, mucinózní 0/1 Vaječník, sérový 0/1 Žaludek 0/6 Žaludek, mucinózní 0/1 Žlučník 1/5 Adrenokortikální karcinom Nadledvinka 0/1 Astrocytom Přední mozek 0/3 Embryonální karcinom Varle 0/1 Ependymom Mozek 0/1 Feochromocytom Nadledvinka 0/1 Glioblastom Mozek 0/1 Hepatoblastom Játra 0/1 Hepatocelulární karcinom Játra 0/5 Chondrosarkom Kost 0/1 Chordom Pánevní dno 0/1 Konečník 0/1 Intersticiální karcinom Tenké střevo 0/1 Tračník 0/1 Karcinom Nosohltan, NPC 0/1 Karcinom bazálních buněk Kůže 0/1 Karcinom ledviny Papilární Ledvina 0/1 Z jasných buněk Ledvina 0/6 Karcinom z buněk tvaru pečetního prstenu Karcinom z přechodných buněk P03928CZ_04/SK / str. 12/16 Metastázující karcinom tlustého střeva z buněk tvaru pečetního prstenu do 0/1 vaječníku Tračník 0/1 Ledvina 0/1 Močový měchýř 0/6 Měkká tkáň, hrudní stěna 0/1 Leiomyosarkom Močový měchýř 0/1 Lymfom Anaplastický velkobuněčný Lymfatické uzliny 0/1 Difuzní B-buněk Lymfatické uzliny 0/4 Hodgkin Lymfatické uzliny 2/2 Non-Hodgkin Lymfatické uzliny 1/1 Malobuněčný karcinom Plíce 0/1 Medulární karcinom Štítná žláza 0/1 Meduloblastom Mozek 0/1 Melanom Konečník 0/1 Nosní dutina 0/1 Meningiom Mozek 0/2 Mesotheliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Měkká tkáň, bedra 0/1 Osteosarkom Kost 0/2 Primitivní neuroektodermální tumor (PNET) Retroperitoneum 0/1 Měkká tkáň, embryonální 0/1 Rhabdomyosarkom Prostata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Seminom Varle 0/2 Spermatocytom Varle 0/2 Děloha 0/1 Děložní čípek 2/5 Hlava a krk 0/2 Spinocelulární karcinom Jícen 0/7 Kůže 0/2 Metastázující esofageální spinocelulární karcinom do lymfatických uzlin 0/1 Plíce 1/2

13 Typ tumoru Místo PD-L1 pozitivní/celkem N=159 Synoviální sarkom Pánevní dno 0/1 Thymom Mediastinum 1/1 Tumor z ostrůvkových buněk Slinivka břišní 0/1 Přesnost Přesnost testu of PD-L1 IHC 22C3 pharmdx u vzorků NSCLC byla hodnocena ve společnosti Dako. Výkonové parametry jsou uvedeny v tabulkách 8 až 9. Ve studiích přesnosti provedených ve společnosti Dako byla stanovena negativní procentuální shoda (NPA) / průměrná negativní shoda (ANA), pozitivní procentuální shoda (PPA) / průměrná pozitivní shoda a celková shoda (OA) pro mez 1 % a mez 50 %, jak je uvedeno v tabulkách 8 a 9. Studie přesnosti byly vyhodnocovány percentilovou metodou bootstrap pro výpočet intervalu spolehlivosti pro průměrné shody. Ve studiích s výsledkem 100% shody, byly intervaly spolehlivosti vypočítány za použití metody Wilsonova skóre, na základě počtu nezávislých párových srovnání (efektivní stupně volnosti). Tabulka 8: Přesnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testovaná na jednom pracovišti ( 1 %) Studie přesnosti Diagnostická mez Plán studie % shoda Mezi přístroji 1 % Každý ze 24 vzorků NSCLC (12 PD-L1- expresí PD-L1 byl testován na každém ze šesti přístrojů Autostainer Link 48. Mezi analytiky 1 % Každý ze 24 vzorků NSCLC (12 PD-L1- expresí PD-L1 byl testován šesti analytiky na jednom přístroji Autostainer Link 48. Mezi dny 1 % Každý ze 24 vzorků NSCLC (12 PD-L1- expresí PD-L1 byl testován šest dní za sebou na přístroji Autostainer Link 48. Mezi šaržemi 1 % Každý ze 24 vzorků NSCLC (13 PD-L1- negativních a 11 PD-L1-pozitivních) s různou IHC expresí PD-L1 byl testován ve třech opakováních a s každou ze tří šarží činidla na přístroji Autostainer Link 48. Opakovatelnost intra-run 1 % ANA=Průměrná negativní shoda; APA=Průměrná pozitivní shoda Každý ze 24 vzorků NSCLC (12 PD-L1- expresí PD-L1 byl testován v šesti opakováních v jedné sérii na přístroji Autostainer Link 48. NPA 100 % (94,0 100 %) PPA 100 % (94,0 100 %) OA 100 % (96,9-100 %) NPA 100 % (93,9 100 %) PPA 100 % (94,0 100 %) OA 100 % (96,9-100 %) NPA 100 % (94,0 100 %) PPA 100 % (94,0 100 %) OA 100 % (96,9-100 %) ANA 98,3% (95,9-100%) APA 97,9% (94,6-100%) OA 98,1% (95,3-100 %) NPA 100 % (94,0 100 %) PPA 100 % (93,8 100 %) OA 100 % (96,8-100 %) Tabulka 9: Přesnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testovaná na jednom pracovišti ( 50 %) Studie přesnosti Diagnostická mez Plán studie % shoda Mezi přístroji 50 % Každý ze 24 vzorků NSCLC (12 PD-L1- expresí PD-L1 byl testován na každém ze šesti přístrojů Autostainer Link 48. Mezi analytiky 50 % Každý ze 24 vzorků NSCLC (12 PD-L1- expresí PD-L1 byl testován šesti analytiky na jednom přístroji Autostainer Link 48. Mezi dny 50 % Každý ze 24 vzorků NSCLC (12 PD-L1- expresí PD-L1 byl testován šest dní za sebou na přístroji Autostainer Link 48. Mezi šaržemi 50 % Každý ze 24 vzorků NSCLC (12 PD-L1- expresí PD-L1 byl testován ve třech opakováních a s každou ze tří šarží činidla na přístroji Autostainer Link 48. Opakovatelnost intra-run 50 % Každý ze 24 vzorků NSCLC (12 PD-L1- expresí PD-L1 byl testován v šesti opakováních v jedné sérii na přístroji Autostainer Link 48. NPA= Negativní procentuální shoda; PPA= Pozitivní procentuální shoda; OA=Celková shoda ANA=Průměrná negativní shoda; APA=Průměrná pozitivní shoda; OA=Celková shoda NPA 100 % (94,9 100 %) PPA 100 % (94,9 100 %) OA 100 % (97,4-100 %) ANA 94,0% (89,3-98,6%) APA 93,1% (85,8-98,6%) OA 93,6% (87,8-98,6%) NPA 100 % (94,9 100 %) PPA 100 % (94,9 100 %) OA 100 % (97,4-100 %) ANA 93,3% (88,5-97,1%) APA 93,7% (88,7-97,4%) OA 93,5% (88,9-97,2%) NPA 100 % (94,0 100 %) PPA 100 % (95,6 100 %) OA 100 % (97,4-100 %) Externí reprodukovatelnost Reprodukovatelnost testu PD-L1 IHC 22C3 pharmdx byla hodnocena na třech externích testovacích pracovištích. Výkonové parametry jsou uvedeny v tabulkách P03928CZ_04/SK / str. 13/16