c-kit pharmdx Kód K testů pro použití s barvicím automatem Dako Autostainer Použití K diagnostice in vitro.

Transkript

1 c-kit pharmdx Kód K testů pro použití s barvicím automatem Dako Autostainer Použití K diagnostice in vitro. Test c-kit pharmdx je souprava pro kvalitativní imunohistochemické (IHC) testy pro identifikaci exprese proteinu c-kit nebo antigenu CD117 (c-kit protein) v normálních a neoplastických tkáních fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu pro histologické vyšetření. Souprava králičích polyklonálních protilátek c-kit pharmdx specificky detekuje c-kit protein v buňkách exprimujících CD117. Souprava c-kit pharmdx je určena k usnadnění diferenciální diagnostiky gastrointestinálního stromálního tumoru (GIST). Po potvrzení diagnózy GIST, lze výsledky ze soupravy c-kit pharmdx použít jako pomůcku při identifikaci pacientů, kteří jsou vhodní pro léčbu pomocí Gleevec /Glivec (imatinib-mesylát). Výsledky barvení hematoxylinem a eozínem (H&E) a panelem protilátek mohou pomoci v diferenční diagnóze GIST. Interpretaci je nutno provádět v kontextu klinické anamnézy pacienta, řádných kontrol a jiných diagnostických testů provedených kvalifikovaným patologem. Poznámka: Tento test není možno použít jako jediný základ při diagnostifikování GIST a nelze ho použít jako jediný základ při volbě terapie pomocí Gleevec/Glivec. Pacienti s GIST s výsledkem negativní na c-kit léčeni pomocí Gleevec/Glivec nebyly zjišťováni. Negativní výsledek by neměl nutně vylučovat 1, 2, 3 diagnózu GIST, ani by neměl předem vylučovat léčbu pomocí Gleevec/Glivec Všichni jedinci účastnící se klinických zkoušek Novartis Gleevec/Glivec byli vybráni na základě výzkumné metody Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP). Primární králičí polyklonální protilátka anti-c-kit reagens použité ve výzkumu NCTP bylo dodáno společností Dako. Reagens c-kit pharmdx primární polyklonální protilátka bylo vyrobeno stejnou metodou, stejně purifikováno a byla provedena stejná kontrola kvality jako u polyklonálního anti-c-kit reagens ve výzkumu NCTP. Souhrn a vysvětlení Úvod Proto-onkogen c-kit, též známý jako antigen CD117 nebo receptor kmenových buněk, je 145 kd typ III transmembránového receptoru tyrozin-kinázy. Gen c-kit kóduje transmembránový tyrozinkinázový receptor, jehož struktura je podobná receptorům A a B destičkového růstového faktoru, jakož i receptoru kolonie stimulujícího faktoru 1 a jejich prostřednictvím sehrává důležitou úlohu pro hematopoiézu, spermatogenezi a melanogenezi. Protein c-kit obsahuje extracelulární domény s 5 Ig podobnými smyčkami, vysoce hydrofóbní transmembránovou doménu a intracelulární doménu se štěpenou tyrozinkinázovou aktivitou pomocí kinázy v oblasti vazby ATP a ve fosfotransferázové doméně. Aktivace receptoru je provázena receptorem dimerizace, substrátové fosforylace a autofosforylace, receptorovou internalizací, aktivací proteinové kinázy a fosfolipázy a transkripcí různých proto-onkogénů. 4 Ukázalo se, že aktivace c-kit tyrozinázového receptoru je důležitá pro růst a progresi různých karcinomů. 5 Mutace v genu c-kit vede k fosforylaci (aktivaci) nezávislé na ligandu c-kit tyrozínové kinázy a věříme, že sehrává hlavní roli v patogenezi např. v gastrointestinálních stromálních tumorech. 6 Gastrointestinální mezenchymální tumory byly v minulosti těžko rozlišitelné a diagnostikované. Imatinib mesylát (Gleevec, Novartis, Basilej, Švýcarsko) byl v roce 2001 doporučený americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léků pro léčbu gastrointestinálních stromálních tumorů (GIST). Doporučení bylo založeno na klinické studii, do které byli zahrnuti a léčeni imatinib mesylátem dospělí s GIST s expresí proteinu c-kit, potvrzenou imunohistochemicky (Protokol klinické studie společnosti Novartis). 7 Jsou popsány tři morfologické kategorie případů GIST: vřetenovité buňky, epitelioidní a smíšené typy. Bez ohledu na morfologii, většina případů GIST exprimuje protein c-kit v signifikantním zastoupení nádorových buněk Musíme však poznamenat, že malé procento případů GIST protein c-kit neexprimuje. Relativně malá část ostatních nádorů může být pozitivní na protein c-kit. Mezi jinými melanom, angiosarkom, Ewingův sarkom, mastocytom, seminom a malobuněčný karcinom plic. GIST jsou obvykle pozitivní na kaldesmonu s vysokou molekulovou hmotností, často pozitivní na CD34 (60-80%) a obvykle negativní na přítomnost desminu a S100 protein. 12 Specificita Králičí polyklonální c-kit protilátky byly získány podáním subkutánní injekce peptidu složeného ze 14 aminokyselin (pozice intracelulárního C-konce c-kit proteinu) navázaného na tyreoglobulin. Antisérum bylo specificky purifikováno prostřednictvím antigenové vazby aktivované thiol AvidGel F afinitní chromatografií. Rovněž byl nalezen malý počet sarkomů měkké tkáně, které jsou c-kit pozitivní. 6 Některé z těchto vzorků (např. leiomyosarkom) byly testovány na expresi proteinu c-kit. Studie zahrnuje porovnání mezi testem c-kit pharmdx a Protokolem klinické studie společnosti Novartis (NCTP) použitých za účelem výběru pacientů léčených přípravkem Gleevec v klinických zkouškách realizovaných společností Novartis. Dva z celkového počtu dvaceti osmi testovaných vzorků vykazovaly pozitivní zabarvení. Výsledek byl shodný při použití obou protokolů. Všechna pozitivní imunologická zabarvení se zrušila po absorpci primárních protilátek se syntetickým ( ) CZ_001 str. 1/14

2 peptidem (C-konec c-kit proteinu aminokyseliny 16). Z tohoto důvodu primární protilátky použité v testu c-kit pharmdx specificky reagovaly s c-kit proteinem ve dvou pozitivních barveních sarkomů měkké tkáně. Vlastní studie za použití c-kit pharmdx prokázaly expresi na protein c-kit v různých normálních buňkách. Mezi ně patří duktální a myoepiteliální buňkly prsu, výběžky nervových buněk, buňky lamina propria tračníku, tubulární epitel ledviny, melanocyty a myoepiteliální buňky kůže, vmezeřené buňky kajalu a mastocyty tenkého střeva. Cytoplazmatická reaktivita v granulocytech byla způsobena aktivitou endogenní peroxidázy a byla viditelná pomocí reagens pro negativní kontrolu. Reagenty Reagens, kód K1907 je určeno k automatickému barvení pomocí barvicího automatu Dako Autostainer. Materiály uvedené v seznamu postačí na 35 testů (35 podložních skel pacientů a 10 kontrolních skel inkubovaných primární protilátkou na protein c-kit a 35 podložních skel inkubovaných odpovídajícím reagentem pro negativní kontrolu). Počet testů vychází z použití protokolu o automatickém barvení c-kit pharmdx Autostainer s předem připravenými reagenty. Kit obsahuje dostatek materiálů na maximálně 10 samostatných cyklů barvení. Dodané materiály Množství Popis 1x9 ml Protilátka c-kit pharmdx polyklonální králičí IgG Polyklonální králičí anti-lidská protilátka c-kit IgG v Tris-HCl pufru, která obsahuje stabilizující protein a 0,015 mol/l azidu sodného. 1x9 ml Králičí reagens IgG pro negativní kontrolu Polyklonální králičí protilátka IgG ve větší nebo stejné koncentraci jako je koncentrace pozitivní protilátky anti-c-kit v pufru Tris-HCl, která obsahuje stabilizující protein a 0,015 mol/l azidu sodného. 2x5 podložní skla Kontrolní podložní skla c-kit pharmdx Každé podložní sklo obsahuje řezy dvou lisovaných linií myších a lidských buněk fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu, které představují mírnou úroveň exprese proteinu c-kit a žádnou expresi c-kit. Hodnoty IHC zabarvení těchto buněčných pelet jsou 2+ a 0. Princip metody Potřebný materiál, který není součástí dodávky Souprava c-kit pharmdx IHC obsahuje polyklonální protilátky a kontrolní podložní skla požadované pro metodu IHC barvení. Po inkubaci primární polyklonální protilátky proti lidskému proteinu c-kit využívá tato souprava předem připravené vizualizační reagens založené na dextranové technologii. Toto reagens se skládá z molekul sekundární kozí anti-králičí protilátky a molekul křenové peroxidázy, navázaných na společný hlavní řetězec dextranového polymeru, a tak eliminuje nutnost sekvenční aplikace vazby protilátky a konjugátu peroxidázy. Enzymatická přeměna následně přidaného chromogenu vede k vytvoření viditelného reakčního produktu v místě antigenu. Vzorek pak lze obarvit kontrastním barvivem a zakrýt krycím sklíčkem. Výsledky se pak interpretují pomocí světelného mikroskopu. Ke kontrole kvality funkce reagenční soupravy se dodávají kontrolní podložní skla obsahující dvě linie lidských buněk fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 2+ a 0. Protokol c-kit pharmdx IHC byl ověřen použitím následujících barvících reagentů Dako: Wash Buffer (kód S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (kód S2003) Target Retrieval Solution (kódy S1699 nebo S1700) EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (kód K4002 a K4003) DAB+ (kód K3467 a K3468) ( ) CZ_001 str. 2/14

3 Poznámka: K zajištění správných výsledků barvení je třeba používat pro metodu c-kit pharmdx pouze tyto barvící reagenty. Odchylky od tohoto doporučeného protokolu nebyly ověřeny. Další potřebné materiály odpovídající c-kit pharmdx jsou následující: Hematoxylin, na bázi alkoholu nebo vody, například Dako s Hematoxylin (kód S3301 nebo S3302) Krycí sklíčka Vodní lázeň schopná udržovat teplotu C nebo tlakový hrne c, správně kalibrovaný a schopný zahřívat až na 125 C Destilovaná nebo deionizovaná voda (voda reagenční kvality) Sušička, schopná udržovat teplotu C Etanol, bezvodý a 95% Světelný mikroskop (zvětšení objektivu 4x 40x) Montážní médium, například Dako s Faramount (kód S3025) nebo Dako s Glycergel (kód C0563) nebodako s Ultramount (kód S1964) Pozitivní a negativní tkáně k použití pro kontrolu průběhu (viz kapitola Kontrola kvality) Podložní skla, Fisher s SuperFrost Plus, skla potažená poly-l-lysinem, nabitá skla, nebo Dako s Silanized Slides (kód S3003) (viz kapitola Příprava vzorků) Nádoby nebo lázně na barvení Časový spínač (umožňující intervaly 2 30 minut) Xylen, toluen nebo substituty xylenu 1 ml pipeta Dako Autostainer Universal Staining System (kód S3400) nebo Autostainer Plus (kód S3800) s verzí softwaru Dako Autostainer nebo vyšší. (Informace o potřebných součástech naleznete v uživatelské příručce k automatu Dako Autostainer.) Poznámka: Všechny dodané nebo samostatně dodávané reagenty, jako například promývací pufr Dako s Wash Buffer (kód S3006), jsou připraveny speciálně pro použití s tímto testem. Aby test odpovídal uvedené specifikaci, nelze používat žádné substituty. Bezpečnostní opatření 1. Určeno pro profesionální uživatele. K diagnostice in vitro. 2. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN 3), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože koncentrace azidu sodného ve výrobku se neklasifikuje jako nebezpečná, může usazenina NaN 3 reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množství vody, aby nedocházelo k usazování azidů kovů v potrubí. 3. Jako u každého výrobku biologického původu je při manipulaci se vzorky i s reagenty nutno dodržovat řádná bezpečnostní opatření. 4. Nedodržení inkubační doby, teploty nebo metody může vést k chybným výsledkům. 5. Nenahrazujte primární protilátky nebo reagenty pro negativní kontrolu primárními protilátkami a reagenty pro negativní kontrolu z jiných výrobních šarží (čísla šarží jsou uvedena na štítcích lahviček) nebo reagenty od jiných výrobců. To může vést k chybným výsledkům. 6. Reagenty v soupravě jsou pro použití s doporučenými reagenty optimálně naředěny. Další ředění se nedoporučuje a může způsobit ztrátu zabarvení antigenu. Uživatel musí případné změny ověřit. 7. Používejte osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. 8. Nespotřebované roztoky je nutno likvidovat v souladu s místními a celostátními předpisy. 9. Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. Údaje o rizicích a bezpečnosti DAB chromogen R 40 Podezření na karcinogenní účinky. R43 Může vyvolat senzibilizaci při kontaktu s kůží. R68 Možné nebezpečí nevratných účinků. S35 Tento materiál a jeho nádobu je nutno zlikvidovat bezpečným způsobem. S 36/37 Používejte vhodný ochranný oděv a rukavice. Základní pravidlo osoby mladší 18 let nesmí s tímto produktem pracovat. Uživatelé musí být řádně proškoleni co se týče správného pracovního postupu, nebezpečných vlastností produktu a nutných bezpečnostních opatření. (*DAB chromogen je potřebný materiál, který však není součástí dodávky). Skladování Soupravu c-kit pharmdx skladujte při 2 8 C. Podložní skla s kontrolními vzorky je třeba skladovat rovněž při 2 8 C. Nepoužívejte soupravu po datu expirace vytištěném na obalu soupravy. Tento produkt nejeví žádné zjevné známky nestability, a proto by se pozitivní a negativní kontroly měly provádět současně se vzorky pacientů. Pokud se reagenty skladují za jiných podmínek než jaké jsou uvedeny v příbalovém letáku, musí uživatel provést jejich kontrolu. 13 Vyjádření ke kvalitě Reagenty ze soupravy c-kit pharmdx byly kontrolovány na kvalitu pomocí imunohistochemie za použití následujících podmínek: vyhledávání cíle v tlakovém hrnci Pascal pressure cooker (kód S2800) naprogramovaném na 30 sekund při 125 C, ochlazeno na 90 C, potom systémem EnVision + Rabbit, HRP system. ( ) CZ_001 str. 3/14

4 Příprava vzorků Se vzorky pro biopsii je nutno nakládat tak, aby byla zachována tkáň pro IHC barvení. U všech vzorků by se měly používat standardní způsoby zpracování tkáně. 14 Řezy zalité v parafínu K použití jsou vhodné řezy fixované ve formalínu a zalité v parafínu. Jiné fixační prostředky nebyly ověřeny a mohly by vést k nesprávným výsledkům. Vzorky z biopsie by měly být nařezány na části s tloušťkou 3 nebo 4 mm a na příslušnou dobu fixovány vhodným fixačním prostředkem. Tkáně se potom dehydrují a čistí v řadě alkoholů a v xylenu a potom jsou napuštěny rozpuštěným parafínem. Teplota parafínu by neměla překročit 60 C. Řádně fixované a zalité bločky tkáně exprimující protein c-kit vydrží před řezáním a montáží na podložní 14, 15 sklo neurčitou dobu, pokud se skladují na chladném místě (15 25 C). Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce 3 5 µm. Po rozřezání je nutno provést montáž na skla Fisher s SuperFrost Plus, Dako s Silanized (kód S3003), nabitá podložní skla nebo skla potažená poly-llysinem a umístit do sušicího stojanu. Stojany s podložními skly se musí oklepat na savé utěrce, aby se odstranila voda zachycená pod parafínem a na podložním skle a pak se musí hodinu sušit při pokojové teplotě. Potom se musí stojany s podložními skly vložit na jednu hodinu do inkubátoru s teplotou C. Přebytečnou vodu, která může případně zůstat na podložních sklech po vyjmutí z inkubátoru, je nutno odstranit oklepáním podložních skel na utěrku a dalším hodinovým sušením v inkubátoru. Po vyjmutí z inkubátoru se musí řezy skladovat při pokojové teplotě, dokud nezchladnou a dokud parafín neztvrdne. V zájmu zachování antigennosti se musí řezy tkání namontované na podložních sklech barvit do 2 měsíců od řezání, pokud se skladují při pokojové teplotě (20 25 C). Další informace o přípravě vzorků naleznete v příručce Dako: Immunochemical Staining Methods ( Metody imunochemického barvení ) 16 nebo v odkazech 14 a 15. Použití tohoto testu u odvápněných tkání dosud nebylo ověřeno a nedoporučuje se. Podložní skla požadovaná pro vyhodnocení c-kit a ověření přítomnosti nádoru se musí připravovat současně. Doporučuje se vytvořit minimálně 5 podložních skel, 1 sklo pro přítomnost tumoru, 2 skla pro vyhodnocení proteinu c-kit a 2 záložní skla. Příprava reagentu Před barvením je nutno připravit následující reagenty. Target Retrieval Solution (kód S1699) Zředěním Target Retrieval Solution 10x, 1:10 destilovanou nebo deionizovanou vodou (vodou reagenční kvality) připravíte dostatečné množství roztoku Target Retrieval Solution pro jednotlivé kroky promývání. Zlikvidujte Target Retrieval Solution po použití. Poznámka: Při použití Dako s Target Retrieval Solution (kód S1700) není třeba ředit. Wash Buffer Solution (kód S3006) Zředěním promývacího pufru 10x, 1:10 destilovanou nebo deionizovanou vodou (vodou reagenční kvality) připravíte dostatečné množství Wash Buffer pro jednotlivé kroky promývání. Skladujte nespotřebovný roztok při 2 8ºC ne déle než 7 dnů. Pufr zlikvidujte, pokud je zakalený. Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (kód K3467 nebo K3468) Tento roztok je nutno před použitím řádně promíchat. Případná přítomnost sraženiny v roztoku neovlivní kvalitu barvení. Roztok DAB+ Substrate-Chromogen Solution připravíte přidáním 1 kapky Liquid DAB+ Chromogen do jednoho ml DAB+ Substrate Buffer a promícháním. Nevyužitý roztok zlikvidujte. Stabilita připraveného roztoku DAB+ trvá přibližně 5 dnů, je-li skladován při teplotě 2 8 C. Důležitá poznámka: Barva kapalného Liquid DAB+ Chromogen v lahvi se může lišit od čiré až po světle levandulovou. To však funkci tohoto produktu neovlivní. Řeďte podle výše uvedených pokynů. Přidání příliš velkého množství Liquid DAB+ Chromogen do DAB+ Substrate Buffer způsobí poškození pozitivního signálu. Montážní médium Bezvodá permanentní montáž je také vhodná, jako například Dako Ultramount (kód S1964). Pro vodní montáž se doporučují montážní média, jako například Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (kód S3025) nebo Dako Glycergel Mounting Medium (kód C0563). Glycergel před použitím zkapalněte zahříváním na přibližně 40(±5) C. Postup barvení v barvícím automatu Dako Autostainer Poznámky k postupu Uživatel by si měl tyto pokyny pozorně přečíst a před použitím se seznámit se všemi součástmi (viz Bezpečnostní opatření). Přečtěte si informace v Dako Autostainer, Universal Staining System, User Guide (Příručka Univerzální systém barvení v barvicím automatu Dako). Všechny reagenty by měly být před imunologickým barvením vyváženy na pokojovou teplotu (20 25 C). Podobně i všechny inkubace by měly probíhat při pokojové teplotě. Nenechejte řezy tkání při procesu barvení vyschnout. Suché řezy tkání mohou vykazovat zvýšení nespecifického zabarvení. Poznámka: Reagenty a návody dodané v tomto systému byly navrženy pro optimální účinnost, jsou-li používány s doporučenými reagenty a materiály. Další ředění reagentů nebo změna inkubačních dob nebo teplot může vést k nesprávným nebo nesouhlasným výsledkům. ( ) CZ_001 str. 4/14

5 Odstranění parafínu a rehydratace Před barvením musí být podložní skla s tkáněmi zbavena parafínu, aby se odstranilo médium, ve kterém je tkáň zalita, a aby mohla být rehydratována. Zajistěte úplné odstranění parafínu. Přítomnost zbytků zalévacího média způsobí zvýšené nespecifické zabarvení. KROK 1. Vložte podložní skla do xylenové lázně a inkubujte 5 (±1) minut. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. KROK 2. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do bezvodého etanolu na 3 (±1) minuty. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. KROK 3. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do 95% etanolu na 3 (±1) minuty. Vyměňte lázně a jednou zopakujte postup. KROK 4. Odstraňte přebytečnou kapalinu a vložte podložní skla do vody reagenční kvality na 5 (±1) minut. Komerční postup barvení s vyhledávacím roztokem Target Retrieval. Roztoky xylenu a alkoholu je nutno vyměnit po 40 podložních sklech. Místo xylenu lze použít toluen nebo substituty xylenu, například Histoclear. Vyhledávání cíle Doporučený postup: Vodní lázeň KROK 1. Naplňte barvící nádoby, např. nádoby Coplin naředěným roztokem Target Retrieval Solution (viz Příprava reagentů). Vložte nádoby na barvení obsahující roztok Target Retrieval Solution do vodní lázně. Zahřejte vodní lázeň a roztok Target Retrieval Solution na C (nev ařte). Přikryjte nádoby víkem, aby se stabilizovala teplota a zabránilo se odpařování. KROK 2. Ponořte řezy, ze kterých byl odstraněn parafín, při pokojové teplotě do předehřátého roztoku Target Retrieval Solution do barvicích nádob. Dorovnejte teplotu vodní lázně a roztoku Target Retrieval Solution znovu na C. Inkubujte po dobu 20 (±1) minut při C. KROK 3. Vyjměte celou nádobu s podložními skly z vodní lázně. Nechte podložní skla zchladnout v roztoku pro vyhledávání cíle Retrieval Solution po dobu 20 (±1) minut při pokojové teplotě. KROK 4. Slijte roztok Target Retrieval Solution a opláchněte řezy v promývacím pufru Wash Buffer (viz Příprava reagentu). KROK 5. Pro docílení lepšího výsledku máčejte řezy v promývacím pufru Wash Buffer po dobu 5 (±1) minut po chladnutí v roztoku pro vyhledávání cíle a před barvením. Vyhledávání cíle Tlakový hrnec (30 sekund při 125 C) K zajištění reprodukovatelnosti výsledků je třeba zachovat konzistentnost v protokolu pro vyhledávání cíle. Používaný tlakový hrnec musí být schopen dosáhnout a udržet teplotu 125 C a každý cyklus s tlakovým hrncem musí obsahovat stejný obsah všech tekutin (Target Retrieval Solution a voda v míse tlakového hrnce) a také stejný počet podložních skel. Optimální protokol je následující: KROK 1. Pro každý cyklus je třeba přidat do tlakového hrnce konzistentní objem vody reagenční kvality (500 ml nebo podle návodu výrobce). KROK 2. Naplňte vždy dva plastové, horku odolné, barvicí kontejnery, které pojmou stojan s 24 podložními skly s 250 ml připraveného roztoku Target Retrieval Solution (viz Příprava reagentu). KROK 3. Ponořte řezy, ze kterých byl odstraněn parafín při pokojové teplotě do roztoku Target Retrieval Solution v nádobách na barvení. Poznámka: V zájmu konzistentnosti je třeba doplnit barvicí stojany během každého cyklu tlakového hrnce prázdnými sklíčky do počtu 48, je-li zpracováváno méně než 48 skel; v případě, že je zpracováváno méně než 24 podložních skel se vzorky, druhý barvicí kontejner může být naplněn 250mL vody, aby se konzervoval roztok Target Retrieval Solution. KROK 4. Umístěte nádoby na barvení do tlakového hrnce a utáhněte víko. KROK 5. Nastavte tlakový hrnec na zahřívání na teplotu 125 C; inkubujte podložní skla při 125 C po dobu 30 sekund. Před otevřením nechejte tlakový hrnec vychladnout 30 minut, bez upouštění tlaku. KROK 6. Před otevřením tlakového hrnce zkontrolujte, zda tlak poklesl. Vyjměte barvicí nádoby, slijte roztok Target Retrieval Solution a opláchněte řezy v Wash Buffer nebo ve vodě reagenční kvality. KROK 7. Pro docílení lepšího výsledku máčejte řezy v promývacím pufru Wash Buffer po dobu 5 (±1) minut po chladnutí v roztoku pro vyhledávání cíle a před barvením. Poznámka: Roztok Target Retrieval Solution je určen pouze pro jednu aplikaci. Nepoužívejte opakovaně. Protokol automatického barvení Přečtěte si informace v Dako Autostainer, Universal Staining System, User Guide (Příručka Univerzální systém barvení v barvicím automatu Dako). KROK 1. Zvolte protokol a programový barvicí cyklus (Obrázek 1). KROK 2. Pomocí programů Auto nastavte program a spusťte program c-kit pharmdx. KROK 3. Vložte reagenční lahvičky do reagenčního stojanu automatu Dako Autostainer podle reagenční mapy vygenerované počítačem. ( ) CZ_001 str. 5/14

6 KROK 4. Vložte podložní skla do automatu Dako Autostainer podle mapy podložních skel vygenerované počítačem. KROK 5. Začněte cyklus. KROK 6. Vyjměte podložní skla z automatu Dako Autostainer. Odpadní roztok DAB+ Substrate-Chromogen Solution vylijte do nádoby na nebezpečné materiály a poté řádně zlikvidujte. Přejděte ke kontrastnímu barvení a montáži. Poznámka: Po kroku s použitím roztoku DAB+ Substrate-Chromogen opláchněte podložní skla ve vodě reagenční kvality. (Automaty Dako Autostainer s verzemi hardwaru 02 a 03 oplachují podložní skla ve vodě reagenční kvality po kroku s použitím substrát-chromogenu. Automat Dako Autostainer s verzí hardwaru 01 oplachuje podložní skla v pufru. Proto je nutno podložní skla barvená automatem s hardwarem 01 po vyjmutí z automatu Dako Autostainer opláchnout ve vodě reagenční kvality). Obrázek 1. Programovací mřížka automatu Autostainer Znázornění programu spuštěného na automatu Dako Autostainer. Programovací mřížka (nahoře) je šablona hlavního protokolu pharmdx, která obsahuje prvky protokolu pro spuštění testu c-kit pharmdx. V mřížce v tomto příkladu jsou zobrazeny pouze reagenty c-kit. Kontrastní barvení (návod pro Hematoxylin) Zabarvený výsledný produkt barvicí reakce není rozpustný v alkoholu ani ve vodě. Může být použit hematoxylin na bázi alkoholu nebo vody, například Dako s Hematoxylin (kód S3301 nebo S3302). Nepoužívejte agresivní kontrastní barviva. KROK 1. Vyjměte podložní skla z automatu Dako Autostainer a podle následujících pokynů proveďte kontrastní barvení v hematoxylinu. KROK 2. Ponořte podložní skla do hematoxylinové lázně. Inkubujte 2 5 minut, v závislosti na koncentraci použitého hematoxylinu. KROK 3. Opatrně opláchněte ve vodní lázni reagenční kvality. Ujistěte se, že jste odstranili všechny zbytky hematoxylinu. Volitelné: Ponořte podložní skla 10krát do lázně 0,037 mol/l vodného roztoku amoniaku (viz část Příprava reagentu). Poznámka: Důrazně doporučujeme používat Dako s Hematoxylin (kód S3301). Při použití inkubace trvající 3 minuty toto kontrastní barvení vytvoří slabě nachový nebo modrý výsledný produkt, který nezakrývá specifické imunologické zabarvení. Silné kontrastní zabarvení může zamaskovat slabou expresi c-kit. KROK 4. Opatrně oplachujte ve vodní lázni reagenční kvality po dobu 2 5 minut. Montáž Bezvodá permanentní montáž je také vhodná, jako například Dako Ultramount (kód S1964). Pro vodní montáž se doporučují montážní média, jako například Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (kód S3025) nebo Dako Glycergel Mounting Medium (kód C0563). Glycergel před použitím zkapalněte zahříváním na přibližně 40(±5) C. Poznámka: Doporučuje se skla odečítat během šesti týdnů od obarvení. V závislosti na řadě faktorů včetně, nikoli však pouze, kontrastního barvení, montáže materiálu a metody a podmínek skladování podložních skel, může dojít k určitému vyblednutí. Z důvodu minimalizace vyblednutí skladujte podložní skla ve tmě a při pokojové teplotě (20 25 C). Kontrola kvality Odchylky od doporučených postupů fixace tkání, zpracování a zalévání v laboratoři uživatele mohou způsobit výraznou variabilitu výsledků, která si kromě používání podložních skel s kontrolními vzorky dodaných společností Dako navíc vyžádá pravidelné provádění vlastních kontrol. V USA se řiďte směrnicemi pro kontrolu kvality od College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry (Certifikační program Kolegia amerických patologů (CAP) pro imunohistochemii). Další informace naleznete také v NCCLS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline (Schválená směrnice NCCLS pro zajišťování kvality pro imunohistochemii) 17 a dále v odkazech ( ) CZ_001 str. 6/14

7 Kontrolní podložní skla c-kit pharmdx (součást dodávky) Každé dodané podložní sklo s kontrolními vzorky obsahuje dvě slisované linie lidských buněk fixované ve formalínu a zalité v parafínu s hodnotami intenzity zabarvení 2+ a 0. V každém barvícím postupu se má barvit jedno podložní sklo. Hodnocení linií buněk na podložních sklech s kontrolními vzorky dodanými společností Dako rozhoduje o platnosti cyklu barvení. Ty by se neměly používat jako pomůcka při interpretaci výsledků pacientů. Tkáň pro pozitivní kontrolu Kontrolní vzorky by měly být čerstvé fixované vzorky z pitvy/biopsie/operace zpracované a zalité co nejdříve stejným způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta. Pozitivní kontroly tkáně jsou známkou správně připravených tkání a použití správných metod barvení. Pro každou sadu testovacích podmínek by měla být v každém cyklu barvení provedena jedna pozitivní kontrola tkáně. U tkání použitých pro pozitivní kontroly tkáně by se mělo projevit mírné zabarvení, aby mohly tkáně detekovat mírné změny v citlivosti primární protilátky. Podložní skla s kontrolními vzorky dodané s tímto systémem nebo různě zpracované vzorky ze vzorku (vzorků) pacienta ověřují pouze činnost reagentu, ale neověřují přípravu tkáně. Známé pozitivní kontroly tkání by měly být používány pouze ke sledování správné funkce zpracovaných tkání a testových reagentů, NIKOLIV jako pomůcka k formulaci specifické diagnózy vzorků pacientů. Pokud se při pozitivních kontrolách tkáně neprojeví příslušné pozitivní zabarvení, je nutno považovat výsledky testovacích vzorků za neplatné. Normální typy buněk použité jako slabé pozitivní c-kit obsahovaly bazální epidermální melanocyty a glandulární myoepiteliální buňky kůže a i epiteliální a myoepiteliální prsní buňky. Silné interní kontroly mohou být neuronové (vmezeřené buňky kajalu) a mastocyty v tenkém střevu. Tkáň pro negativní kontrolu Při každém barvícím cyklu používejte fixovanou tkáň pro negativní kontrolu (o níž víme, že je protein c-kit negativní) zpracovanou a zalitou identickým způsobem jako vzorek (vzorky) pacienta, aby byla ověřena specificita primární protilátky a aby se projevilo specifické zabarvení pozadí. Rozmanitost různých typů buněk, které se nacházejí ve většině řezů tkání, nabízí vnitřní oblasti pro negativní kontrolu (to by měl ověřit uživatel). Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Mezi prvky tkáně, které lze použít jako negativní kontroly, patří například srdeční myocyty. Sekreční buňky pankreatu jsou také c-kit negativní, zatímco epitel žlučovodu pankreatu způsobuje pozitivní zabarvení. Nespecifické reagens pro negativní kontrolu Použijte dodané reagens pro negativní kontrolu Negative Control Reagent místo primární protilátky s řezem každého vzorku pacienta a vyhodnoťte tak nespecifické zabarvení a umožněte lepší interpretaci specifického zabarvení v oblasti antigenu. Inkubační doba reagentu pro negativní kontrolu Negative Control Reagent by měla odpovídat inkubační době primární protilátky. Pokud se panel protilátek používá se sériovými řezy tkání, mohou oblasti negativního zabarvení na jednom podložním skle sloužit jako negativní kontrola / kontrola nespecifické vazby pozadí pro jiná antiséra. Ověření testu Před prvním použitím protilátky nebo barvicího systému v diagnostické metodě by měl uživatel ověřit specificitu protilátky tak, že ji vyzkouší u několika v laboratoři dostupných tkáních se známou IHC charakteristikou, které představují známé pozitivní a negativní tkáně. Seznamte se s postupy pro kontrolu kvality popsané v této části příbalového letáku a s požadavky pro kontrolu kvality na bázi certifikačního programu CAP pro imunohistochemii nebo NCCLS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (Schválená směrnice NCCLS pro zajišťování kvality pro imunohistochemii). 17 Tyto kontroly kvality musí být opakovány vždy, když je použita nová šarže protilátek a kdykoli se změní parametry testu. Gastrointestinální stromální nádory (GIST) se známými intenzitami barvení proteinu c-kit a negativní tkáně jsou vhodné pro ověření testu. ( ) CZ_001 str. 7/14

8 Tabulka 1: Účel každodenní kontroly kvality Tkáň: Fixována a zpracována jako vzorek pacienta Podložní sklo dodané společností Dako. Pozitivní kontrola: Tkáň nebo buňky obsahující antigen, který je třeba detekovat (může se nacházet ve tkáni pacienta). Ideální kontrola je jednou týdně pozitivní barvení tkáně nejcitlivější na degradaci protilátky nebo antigenu. Negativní kontrola: Tkáně nebo buňky, které by měly být negativní (mohou se nacházet ve tkáni pacienta nebo tkáni pro pozitivní kontrolu). Specifická protilátka a detekční systém Pouze kontrolní barvení. (Hodnocení linií buněk na podložních sklech s kontrolními vzorky dodanými společností Dako rozhoduje o platnosti cyklu barvení.) Řídí všechny kroky analýzy. Ověřuje reagenty a postupy použité pro c-kit barvení. Detekce neplánované křížové reaktivity protilátky s buňkami nebo buněčnými složkami. Pozadí: Dodaná nespecifická protilátka (králičí reagens pro negativní kontrolu) Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Tkáň pacienta. Detekce specifického zabarvení. Detekce nespecifického zabarvení pozadí. Interpretace barvení Vyhodnocení podložních skel by měl provádět patolog pomocí světelného mikroskopu. Veškerá hodnocení se musí provádět v nádorové oblasti vzorku. Pro vyhodnocení imunocytochemického barvení a jeho ohodnocení je vhodné zvětšení 10x nebo 20x. K interpretaci výsledků použijte intaktní buňky; nekrotické a degenerované buňky se často zabarvují nespecificky. 17 Každá souprava c-kit pharmdx obsahuje pozitivní a negativní linie buněk k vyhodnocení barvicích cyklů při každém provedení zkoušky. Odpovídající zabarvení kontrolních linií buněk poskytuje důkaz, že reagenty c-kit pharmdx pracují správně a že protokol byl proveden řádně. zabarvení HT-29 kontrolní linie buněk (0) a mírné, hnědé cytoplazmatické nebo perinukleární zabarvení v P815 kontrolní linii buněk (2+) označuje, že je barvicí cyklus platný. Odchylky od optimální intenzity zabarvení pozitivní kontrolní linie (příliš slabá nebo příliš silná), by mohly mít za následek falešně negativní nebo falešně pozitivní zabarvení, a proto je nutno test zopakovat. Musí být provedeno hodnocení tkáně pro pozitivní kontrolu.. Slabé zabarvení myoepiteliálních buněk kůže indikuje, že reagenty pracují správně. Pokud se u pozitivních kontrolních tkání neprojeví pozitivní zabarvení, je nutno považovat výsledky testovaných vzorků za neplatné. Tkáň pro negativní kontrolu je nutno testovat po tkáni pro pozitivní kontrolu, abychom ověřili specificitu značení antigenu primární látkou. Nepřítomnost specifického zabarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost křížové reaktivity s buňkami / částmi buněk. Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Pokud se vyskytuje nespecifické zabarvení, je většinou difúzní. Sporadické zabarvení pojivové tkáně lze také pozorovat v řezech z tkání příliš fixovaných formalínem. K interpretaci výsledků barvení používejte pouze intaktní buňky. Nekrotické nebo degenerované buňky se často barví nespecificky. 18 Vzorky pacienta musí být hodnoceny jako poslední. Intenzitu pozitivního zabarvení je nutno posuzovat v kontextu jakéhokoli nespecifického zabarvení pozadí reagentem pro negativní kontrolu. Interpretace exprese c-kit musí být prováděna v obecném morfologickém a klinickém kontextu tumoru. Existují tři morfologické kategorie případů GIST: vřetenovité buňky (70%), epitelioidní (20%) nebo smíšený typ. 22 Bez ohledu na morfologii, většina případů GIST exprimuje c-kit v signifikantním zastoupení nádorových buněk. Homogenní imunologické barvení s c-kit pharmdx je nejdříve vidět v cytoplazmě, s nebo bez Golgiho/perinukleáního (tečkovaného) vzoru a v membránách buněk, ať už se jedná o úplné nebo neúplné obvodové zabarvení. Některé případy vykazují heterogenní barvicí vzor (směs silného nebo slabého cytoplazmatického nebo membránového). Zabarvení bylo rovněž pozorováno v extracelulárních prostorách. Výsledky testu c-kit pharmdx by měly být hlášeny jako pozitivní nebo negativní, přičemž jako hodnotící struktura by mělo sloužit zabarvení cytoplazmy a membrány (Tabulka 2). Pozitivita exprese proteinu c-kit je definována jako jakékoli specifické cytoplazmatické nebo membránové zabarvení v nádorových buňkách. Ohnisková pozitivita nebo zabarvení méně než 10% nádorových buněk je třeba intepretovat s obezřetností. 23 Jako u každého imunohistochemického testu, negativní výsledek znamená, že antigen nebyl detekován, nikoli, že antigen není v testovaných buňkách nebo tkáních přítomen. Je třeba také vzít do úvahy, že malé procento případů GIST neexprimuje protein c-kit. Z tohoto důvodu neznamená absence barvení c-kit vyloučení diagnózy GIST. ( ) CZ_001 str. 8/14

9 Tabulka 2: Výsledky barvení testu c-kit pharmdx Hlášení ošetřujícímu lékaři Na protein c-kit negativní Na protein c-kit pozitivní Definice Nepřítomnost zabarvení v nádorových buňkách. Pozitivní zabarvení je definováno jako jakékoli IHC zabarvení cytoplazmy nebo membrán nádorových buněk nad úroveň pozadí. Intenzita zabarvení: 1+, 2+ nebo 3+ V případě potřeby použijte k identifikaci falešně negativních reakcí panel protilátek. Jestliže je zabarvení fokálně pozitivní, je třeba k potvrzení diagnózy GIST provést další testování. Jako pomůcka k diferenciaci mezi GIST a dalšími mezenchymálními sarkomy slouží genetické testování a vzory zabarvení uvedené v tabulce 3. Další informace o imunoreaktivitě naleznete v kapitolách Souhrn a vysvětlení, Omezení a Charakteristiky účinnosti. Tabulka 3. Imunohistochemické schéma pro diferenční diagnózu nádorů vřetenovitých buněk v GI traktu. 8 c-kit CD34 SMA Aktin hladkého svalu S-100 Desmin GIST 95% 60 70% 30 40% 5% 2% Nádor hladkého svalu % + Vzácné + Schwannom - Obvyklé Fibromatóza Sporné* Vzácné + - Vzácné * Téměř všichni autoři uvádějí, že fibromatózy jsou na c-kit negativní. V závislosti na inkubační době a potenci použitého hematoxylinu způsobí kontrastní barvení bleděmodré až tmavomodré zabarvení buněčných jader. Přílišné kontrastní zabarvení může ohrozit interpretaci výsledků. Omezení Všeobecná omezení IHC je diagnostický proces obsahující více kroků, který vyžaduje specializované vyškolení ve výběru vhodných reagentů, výběru tkání, fixaci a zpracování; přípravě IHC podložního skla a interpretaci výsledku zabarvení. Zabarvení tkáně závisí na manipulaci s tkání a na jejím zpracování před barvením. Nesprávná fixace, zmražení, rozmražení, umývání, sušení, zahřívání, řezání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může vést ke vzniku artefaktů, zachycení protilátky nebo falešně negativním výsledkům. Výsledky mohou být nekonzistentní v důsledku použití různých metod fixace a zalití nebo v důsledku vnitřních nepravidelností v tkáni. Klinická interpretace jakéhokoli pozitivního zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být vyhodnocena v kontextu klinického projevu, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoli zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být doplněna morfologickými studiemi a řádnými kontrolami a také dalšími diagnostickými vyšetřeními. Za interpretaci barveného preparátu zodpovídá kvalifikovaný patolog, který zná použité protilátky, reagenty a použité metody. Barvení se musí provádět v certifikované laboratoři s příslušným oprávněním a pod dohledem patologa zodpovědného za hodnocení barvených podložních skel a zaručení adekvátnosti pozitivních a negativních kontrol. Tento výrobek není určen k použití v průtokové cytometrii. Charakteristiky účinnosti pro průtokovou cytometrii nebyly stanoveny. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy B, které obsahující povrchový antigen (HBsAg) hepatitidy B, mohou s křenovou peroxidázou vykazovat nespecifické zabarvení. 24 Reagenty mohou vykazovat neočekávané reakce v dříve netestovaných tkáních. V důsledku biologické variability exprese antigenu v neoplazmě nebo jiných patologických tkáních nelze zcela vyloučit možnost neočekávaných reakcí i v testovaných skupinách tkání. 17 Se zdokumentovanými neočekávanými reakcemi se obraťte na technickou podporu společnosti Dako. Omezení specifická pro tento produkt Malé procento nádorů GIST neexprimuje protein c-kit. Z tohoto důvodu neznamená absence barvení c-kit vyloučení diagnózy GIST. Falešně pozitivní výsledky se mohou vyskytovat v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo produktů reakce se substrátem. Mohou být také způsobeny aktivitou pseudoperoxidázy (erytrocyty) a endogenní aktivitou peroxidázy (cytochrom C). 19 Pro dosažení optimálních a opakovatelných výsledků potřebuje protein c-kit roztok vyhledávání cíle, pokud jsou tkáně běžným způsobem fixovány (neutrální pufrovaný formalín) a zality v parafínu. Dako doporučuje použití c-kit pharmdx na Dako Autostainer nebo Autostainer Plus. Použití c-kit pharmdx na jiných barvicích automatech nebylo ověřeno a může vést k nesprávným výsledkům. ( ) CZ_001 str. 9/14

10 Barvení linií kontrolních buněk by mělo být použito pouze pro ověření postupu barvení a nemělo by se používat pro hodnocení reakce barvení v tkáňových řezech. Vzorky uchovávané běžným způsobem v neutrálním pufrovém formalínu jsou vhodné pro testování s c-kit pharmdx. Tkáně fixované jinými způsoby fixace nebyly ověřeny. Charakteristiky účinnosti Specificita Protilátka c-kit byla testována na reaktivitu s liniemi buněk exprimujících protein c-kit. Při testech metodou Western blot u lyzátů malobuněčného plicního karcinomu linie buněk SY, která příliš exprimuje c-kit mrna, protilátka označuje pruh 145 kd odpovídající proteinu c-kit. Označený pruh je dost zřetelný, od 120 do155 kd. Další pruh 100 kd je také označen. 25 Navíc, při studii používající další protilátku anti-c-kit, byl protein označen podobně,100 kd. Označení bylo zrušeno, když byla inkubována protilátka syntetickým antigenem peptidu c-kit použitého pro imunizaci. 26 Dále byla protilátka c-kit testována při testech metodou Western blot na křížovou reaktivitu s proteiny, sdílející strukturální homologii, jako například receptor destičkového růstového faktoru (PDGFRa), receptor makrofágové kolonie stimulijícího faktoru (c-fms) a FMS podobný tyrozín-kináze 3 (FLT-3). S těmito homologními proteiny nebyla pozorována žádná křížová reaktivita. Dále, při testech metodou Western blot nereagovala protilátka Dako s lyzátem linie adenokarcinogenních buněk HS, která neexprimuje protein c-kit. 25 Srovnávací studie Byla provedena zkouška imunologického barvení pomocí c-kit pharmdx na sarkomech fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu a na více tkáňových skupinách (MTAs) obsahujících řez sarkomu, u něhož byla potvrzena pozitivní a negativní exprese na protein c-kit. Tkáně byly testovány za použití testu c-kit pharmdx po použití dvou doporučených metod tepelně indukovaného vyhledávání epitopu (HIER). Ve stručnosti, jako zdroj zahřívání byla použita vodní lázeň (95 99 C) po dobu 20 minut a tlakový hrnec (121 C) po dobu 5 minut, v obou případech následovalo chlazení po dobu 20 minut. Ostatní kroky postupu barvení byly identické. Tyto zkoušky byly porovnány s konkurenčně simulovaným cyklem výzkumné metody Novartis Clinical Trial Protocol (NCTP), která byla dříve použita pro výběr pacientů pro klinické zkoušky léčby pacientů s diagnózou GIST pomocí Gleevec/Glivec, která byla schválena FDA. NCTP použila 2X vyšší koncentraci protilátky Dako primary polyclonal proti c-kit (A4502) (stejné reagens se použilo při testu c-kit pharmdx) a bez HIER. Výsledky srovnání testu NCTP a testu c-kit pharmdx při použití vodní lázně jako zdroje zahřívání jsou uvedeny v tabulce 4. Podobné výsledky (všeobecná shoda =98,7%) byly pozorovány, když byla použita jako zdroj zahřívání vodní lázeň. Procentuální shody pozitivity a negativity byly v obou srovnáních podobné. Tabulka 4. 2x2 tabulky protokolu o c-kit pharmdx s výsledky testů v tlakovém hrnci v porovnání k výsledkům testu NCTP c-kit pharmdx - výsledky testu TR s tlakovým hrncem Konkurenční NCTP Výsledky testu Pozitivní Negativní n (%) n (%) Celke m Pozitivní 188 (60,8) 3 (0,9) 191 Negativní 1 (0,3) 117 (37,9) 118 Celkem Procento pozitivní shody = 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5% (95% přesně CI: 97,1% - 100%) Procento negativní shody = 117/(117+3); = 0,975 x 100 = 97,5% (95% přesně CI: 92,9% - 99,5%) Všeobecná shoda = ( )/309 = 0,987 x 100 = 98,7% (95% přesně CI: 96,7% - 99,7%) Část těchto vzorků (35 případů) reprezentuje tkáně pacientů, kteří se účastnili klinické zkoušky Novartis Gleevec. 21 z těchto pacientů bylo léčeno přípravkem Gleevec (58,3%). Když byly stejné vzorky testovány NCTP a c-kit pharmdx, 20 bylo pozitivních u všech tří postupů, zatímco 1 vzorek byl negativní. Mezi 147 pacienty, kteří byli léčeni Gleevec v klinické zkoušce Novartis Gleevec byla hlášena u 54% částečná odezva a u 28% pacientů stabilní nemoc. 7 Pro subset 259 vzorků uvedených v tabulce 4, byl výsledek testu c-kit podmíněn časem, kdy byly vzorky dodány do zkoušek MTAs. Třicet pět případů bylo zařazeno do klinické zkoušky s Gleevec (n=35) a ty zbývající byly testovány v laboratořích, které spolupracovaly na zkouškách s Gleevec. Výsledky 179 vzorků (celkem méně než 259 z důvodu ztráty vzorků nebo neprokázání nádoru ve zkouškách MTAs) jsou uvedeny v tabulce 5 níže. Všechny vzorky vykázaly všeobecnou shodu k původnímu stavu c-kit 94,9% (95% přesně CI: 90,7% - 97,7%). ( ) CZ_001 str. 10/14

11 Tabulka 5: 2x2 tabulka s výsledky testů v tlakovém hrnci v porovnání k výsledkům původního testu Stav c-kit původní tkáně Výsledek testu v Pozitivní Negativní Celkem tlakovém hrnci n n n (%) Pozitivní (78%) Negativní (22%) Celkem Procento pozitivní shody= 136 / (136+6); = 0,957 x 100 = 95,7% (95% přesně CI: 91,0.% - 98,4%) Procento negativní shody=34/ (34+3); = 0,919 x 100 = 91,9% (95% přesně CI: 78,1% - 98,3%) Všeobecná shoda=(136+34)/ (179); = 0,949 x 100 = 94,9% (95% přesně CI: 90,7% - 97,7%) Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost inter-run (manuální barvení) Reprodukovatelnost inter-run byla testována manuálně ve třech laboratořích vždy dvěmi techniky po dobu 3 dnů s 5 různými vzorky (4 pozitivní, 1 negativní v každé laboratoři) U 30 testovaných tkání kolísala intenzita zabarvení ne více než +/- jeden stupeň intenzity zabarvení s následujícími výjimkami: U laboratoře 1 a 3 vždy jedno sklíčko se lišilo o dva stupně intenzity. To bylo důsledkem narušení tkáně u čísla 1. Všeobecně vynikající reprodukovatelnost (100%) byla pozorována u pozitivních oproti negativním výsledkům. Reprodukovatelnost mezi laboratořemi (manuální a automatizované barvení na přístroji Dako Autostainer) Imunohistochemické barvení 30 randomizovaných a zaslepených vzorků různé úrovně exprese na c-kit (10 negativních a 20 pozitivních) bylo provedeno ve třech různých geograficky oddělených laboratořích. Řezy byly odeslány do jednotlivých testovacích laboratoří za účelem manuálního a automatického barvení a vyhodnocení patologem. Na dvou místech bylo vyhodnocení exprese na c-kit vynikající u určení pozitivního/negativního (100%) uvnitř i mezi laboratořemi v případě ručních i automatizovaných barvicích postupů. Na místě 2 byla u duplikátních skel dvou tkání, dříve považovaných za negativní, prokázána ve skutečnosti pozitivita. Doplňující studie odhalily, že malá oblast (asi 20% nádorových buněk) byla zabarvena pozitivně. Tato část nádoru nebyla pozorována ve vzorcích testovaných v jiných laboratořích. Reprodukovatelnost intra-run (manuální barvení) V každé laboratoři účastnící se studie bylo zahrnuto 5 podložních skel stejného pozitivního vzorku do sady 30 vzorků barvených manuálně. Byla hodnocena intenzita zabarvení a procento zabarvení nádoru. Výsledek tkáně na všech místech zůstal pozitivní a intenzita zabarvení se pohybovala v rámci +/- 1 stupně intenzity. Imunoreaktivita Souhrn testu imunoreaktivity c-kit pharmdx na doporučeném panelu normálních tkání je uveden v tabulce 6. Všechny tkáně byly fixovány ve formalínu a zality v parafínu. K provedení barvení 30 normálních tkání testovaných na přístrojích DAKO Autostainer byl použit návod uvedený v tomto příbalovém letáků a zde doporučených reagentů. Tabulka 6: Vyhodnocení zabarvení normální tkáně prostřednictvím c-kit pharmdx * Typ tkáně (testovaný počet) Barvící vzor Nadledvina (3) Kostní dřeň (3) Prs (3) Mozek/malý mozek (3) Mozek/malý mozek (3) Děložní hrdlo (3) Tračník (3) Jícen (3) Srdce (3) Ledvina (3) Játra (3) Plíce (3) Mezoteliální buňky (3) Vaječník (3) Slinivka břišní (3) Příštitná tělíska (3) Periferní nervy (3) Vzácné mastocyty (2+): cytoplazmatické Epiteliální buňky (3+): membránové a cytoplazmatické Myoepiteliální buňky: (1+): cytoplazmatické Výběžky nervových buněk (1+): cytoplazmatické Submukosální mastocyty (2+): a Lamina propria (2+) cytoplazmatické Submukosální mastocyty (2+): cytoplazmatické Tubulární epitel (2+): cytoplazmatické Mastocyty a makrofágy (2+): cytoplazmatické Vzácné velké duktální epiteliální buňky (3+): Mastocyty (2+): cytoplazmatické Mastocyty v měkké tkáni (2+): cytoplazmatické ( ) CZ_001 str. 11/14

12 Hypofýza (3) Prostata (3) Slinná žláza (3) Kosterní sval (3) Kůže (3) Tenké střevo (3) Slezina (3) Žaludek (3) Varlata (3) Brzlík (3) Štítná žláza (3) Tonzila (3) Děloha (3) Mastocyty (2+): cytoplazmatické Bazální epidermální melanocyty (1+): cytoplazmatické Glandulární myoepiteliální buňky (1+): cytoplazmatické Neuronové buňky (1+): cytoplazmatické Mastocyty (2+): cytoplazmatické Mastocyty (2+): cytoplazmatické Mastocyty v slizničním vazivu (2+): cytoplazmatické *U většiny testovaných tkání došlo k pozitivnímu zabarvení fibroblastů ve stromální tkáni (1+, fibrózní) stejně jako u mastocytů a makrofágů. Občas bylo pozorováno zabarvení eozinofilů, vyvolané endogenní peroxidázou. Vlastní studie za použití c-kit pharmdx prokázaly expresi na protein c-kit v různých normálních buňkách. Mezi ně patří duktální a myoepiteliální buňkly prsu, výběžky nervových buněk, buňky lamina propria tračníku, tubulární epitel ledviny, melanocyty a myoepiteliální buňky kůže, vmezeřené buňky kajalu a mastocyty tenkého střeva. Cytoplazmatická reaktivita v granulocytech byla způsobena aktivitou endogenní peroxidázy a byla viditelná pomocí reagens pro negativní kontrolu. Řešení problémů Tabulka 7: Řešení problémů Problém Pravděpodobná příčina Doporučený postup 1. Nedochází k barvení podložních skel. 2. Podložní skla jsou slabě zabarvena. 3. Přílišné zabarvení pozadí podložních skel. 1a. Chyba programování. Reagenty nejsou použity ve správném pořadí. 1b. Lahvičky s reagenty nebyly založeny do správných míst v přihrádkách pro reagenty. 1c. Nedostatečné množství reagentu v lahvičce s reagentem. 1d. Azid sodný ve vodní promývací pufrové lázni. 2a. Nepřiměřené inkubační doby reagentů. 2b. Byl použit nevhodný způsob fixace. 2c. Nevhodné vyhledávání cíle pomocí Target Retrieval Solution. 1a. Na programovací mřížce ověřte, zda byl cyklus barvení naprogramován správně. 1b. Na mapě reagentů ověřte správné umístění lahviček s reagenty. 1c. Před začátkem cyklu zkontrolujte, zda je v lahvičkách s reagenty dostatek reagentů. Požadované objemy naleznete v mapě reagentů. 1d. Používejte čerstvý pufr bez azidu. 2a. Přečtěte si pokyny k postupu barvení. 2b. Zkontrolujte, zda není tkáň pacienta příliš fixována nebo zda nebyl použit neschválený fixační prostředek. 2c. Ověřte, zda vodní lázeň nebo tlakový hrnec pracuje správně a zda byl proveden správný postup vyhledávání cíle. (Nízké teploty nebo nesprávné časy zapřičinily slabé zabarvení.) 3a. Parafín není zcela odstraněn. 3a. Použijte čerstvé čisticí roztoky a postupujte podle pokynů naznačených v části Odstranění parafínu a rehydratace. 3b. K montáži řezů na podložní skla byly použity škrobové přísady. 3c. Podložní skla nejsou důkladně opláchnutá. 3d. Při barvení došlo k vysušení řezů. 3b. Pro lepení řezů na podložní skla nepoužívejte žádné přísady. Mnohé z těchto přísad jsou imunoreaktivní. 3c. Před spuštěním cyklu zkontrolujte, zda je automat Autostainer řádně naplněn. Zkontrolujte, zda je k dispozici dostatečné množství pufru pro celý cyklus. V případě potřeby lze za krok Vizualizace vložit další oplachování. 3d. Zkontrolujte, zda se na podložní skla nanáší odpovídající množství reagentu. Zajistěte, aby byl automat Autostainer spouštěn s víkem v uzavřené poloze a aby nebyl vystaven přílišnému teplu nebo průvanu. ( ) CZ_001 str. 12/14

13 4. Tkáň se odděluje od podložních skel. 5. Příliš silné specifické zabarvení. 6. Slabé zabarvení podložního skla s kontrolní linií buněk 2+. 3e. Došlo k vysušení podložních skel při zakládání do automatu Autostainer. 3f. Nespecifická vazba reagentů k řezům tkáně. 4a. Použití nesprávných podložních skel. 5a. Byl použit nevhodný způsob fixace. 5b. Inkubační doby reagentů jsou příliš dlouhé. 5c. Byl použit nevhodný pufrový roztok. 6a. Nepřiměřené vyhledávání cíle. 6b. Nepřiměřené inkubační doby reagentů. 6c. Degradace podložního skla s kontrolním vzorkem. 3e. Zajistěte, aby byla podložní skla při zakládání a před spuštěním cyklu stále navlhčena pufrem. 3f. Zkontrolujte, zda je vzorek dobře fixován a zda se u něj nevyskytuje nekróza. 4a. Používejte nabitá podložní skla (Fisher s SuperFrost Plus) nebo silanizovaná podložní skla, například Dako s Silanized Slides (kód S3003). 5a. Dohlédněte, aby byly použity pouze schválené způsoby fixace. 5b. Přečtěte si Pokyny k postupu barvení. 5c. Používejte pouze pufrový roztok Doporučený pro použití s touto soupravou. 6a. Zkontrolujte, zda postup vyhledávání cíle byl proveden správně. 6b. Ověřte, zda jsou inkubační doby v cyklu programu správné. 6c. Zkontrolujte datum expirace a podmínky pro skladování soupravy vytištěné na štítku na obalu. Poznámka: Další informace o řešení naleznete v části Řešení problémů v publikaci Dako Handbook: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition 16, Atlas of Immunohistology 21 nebo Immunoperoxidase Techniques. Practical Approach to Tumor Diagnosis 18 Obraťte se na technickou podporu společnosti Dako a nahlaste jakékoli neobvyklé zabarvení. Reference 1. Heinrich, M., Corless, C., Duensing, A., McGreevey, L., Chen, C.J., Joseph, N., Singer, S., Griffith, D., Haley, A., Town, A., Demetri, G., Fletcher, C. and Fletcher, J. PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors, Science 229: , Taniguchi, M., Nishida, T., Hirota, S.. Isozaki, K., Ito, T., Nomura, T., Matsuda, and Kitamura, Y. Effect of c-kit mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 59: , Medeiros, F., Codess. C.L., Duensing, A., Homick, J.L., Oliveira, AM., Heinrich, MC., Fletcher, J.A., Fletcher, C.D. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: Proof of concept and therapeutic implications. Am J Surg Pathol. Jul 28(7): Bühring H-J, Ashman LK, Gattei V, Kniep B, Larregina A, Pinto A, et al. CR2.7 Stem-cell factor receptor (p145(c-kit)) summary report (CD117). Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5 th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3 7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press 1995; Smithey BE, Pappo AS, Hill DA. C-kit expression in pediatric tumors: a comparative immunohistochemical study. Am J Surg Pathol 2002; 26: Hornick JL and Fletcher CDM. Immunohistochemical staining for KIT (CD117) in soft tissue sarcomas is very limited in distribution. Am J Pathol 2002; 117: Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD, Van den Abbeele AD, Eisenberg B, Roberts PJ, Heinrich MC, Tuveson DA, Singer S, Janicek M, Fletcher JA, Silverman SG, Silberman SL, Capdeville R, Kiese B, Peng B, Dimitrijevic S, Druker BJ, Corless C, Fletcher CD, Joensuu H. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. NEJM 2002; 347, 7: Fletcher CDM, Berman J, Corless C, Gorstein F, Lasota J, Longley JB, Miettinen M, O Leary TJ, Remotti H, Rubin BP, Shmookler B, Sobin LH, and Weiss SW. Diagnosis of Gastrointestinal Stromal Tumors: A Consensus Approach. Human Pathology May 2002; 33: Dematteo RP, Heinrich MC, El-Rifai WM, Demetri G: Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Human Pathol 2002; 33: Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S: Gastrointestinal stromal tumor: Consistent CD117 immunostaining for diagnostic and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade. Human Pathol 2002; 33: Graadt van Roggen JF, Van Velthuysen MLF, Hogendoorn PCW. The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Pathol 2001; 54: Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, Meis-Kindblom JM. Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal. Am J of Pathol 1998; 152, 5: Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981 ( ) CZ_001 str. 13/14

14 16. Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako CLIS (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS). Quality Assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA Order code MM4-A 18. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special Report: quality control in Immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: Herman GE, Effont EA. The taming of Immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of Immunohistotechnology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; Demtri GD, Benjamin R, Blanke CD, Choi H, Corless C, DeMatteo RP, Eisenberg BL, Fletcher CDM, Maki RG, Rubin BP, Van den Abbeele AD, and Margaret von Mehren. NCCN Task Force Report: Optimal Management of Patients with Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST) Expansion and Update of NCCN Clinical Practice Guideline. Journal of the National Comprehensive Cancer Network 2004, Volume 1: Supplement Berman J, O Leary TJ. Gastrointestinal Stromal Tumor Workshop. Human Pathology 2001; 32(6): Omata M, Liew CT, Ascavali M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemsitry. Amer J Clin Pathol 1980; 73: Tsura Y, Hiraki H, Watanabe K, Igarashi S, Shimamura K, Fukuda T, et al. Preferential localization of c-kit product in tissue mast cells, basal cells of skin, epithelial cells of breast, small cell lung carcinoma and seminoma/dysgerminoma in human: immunohistochemical study on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Virchows Arch 1994; 424: Yardern Y, Kuang W-J, Yang-Feng T, Coussens L, Munemitsu S, Dull TJ, et al. Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand. EMBO J 1987; 6:3341 ( ) CZ_001 str. 14/14