Detekce a typizace bakteriálních původců alimentárních onemocnění. Tereza Gelbíčová

Transkript

1 Detekce a typizace bakteriálních původců alimentárních onemocnění Tereza Gelbíčová gelbicova@vri.cz

2 Alimentární onemocnění Celosvětově trvalý zdravotnický problém Nárůst případů ve vyspělých zemích Příčiny společensko-ekonomické, lidský faktor, vlastnosti mikrobů Riziko závažných stavů včetně úmrtí pro nejmladší a nejstarší věkové skupiny v důsledku dehydratace

3 Alimentární onemocnění onemocnění z potravin Podle charakteru mikroorganismu vyvolávajícího onemocnění a podle mechanismu jeho účinku rozdělujeme onemocnění z potravin na: alimentární infekce S. Typhi, L. monocytogenes otravy z potravin alimentární toxoinfekce vyvolaná uvolněnými endotoxiny z baktérií, jedná se převážně o zoonotická agens vyvolávající průjmová onemocnění, např. kampylobakteriózy alimentární intoxikace S. aureus (enterotoxiny), Bacillus cereus (emetický toxin), Clostridium botulinum (botulotoxin)

4 Alimentární onemocnění v EU v roce 2014

5 Kampylobakteriózy termotolerantní kampylobaktery z čeledi Campylobacteriaceae C. jejuni (drůbež, ptáci) C. coli (prasata) hlavní etiologické agens C. upsaliensis (psi, kočky) C. lari (racci) malá odolnost k podmínkám vnějšího prostředí, nepřežívají v suchém prostředí a v přítomnosti kyslíku možnosti kontaminace potravin fekální cestou - výskyt ve střevním traktu teplokrevných zvířat křížová kontaminace při manipulaci se syrovými potravinami a potravinami k přímé spotřebě vzácně primární kontaminace mléka v důsledku mastitid, nebo fekální kontaminace při dojení nejčastější zdroj onemocnění konzumace nedostatečně tepelně opracované drůbeže ID: Příznaky: horečka, bolesti břicha, průjem, někdy hemoragický

6 Salmonelózy bakterie rodu Salmonella S. enterica - dělí se do 6 poddruhů: S. enterica subsp. enterica (více než 95 % izolovaných kmenů) S. enterica subsp. salamae S. enterica subsp. arizonae S. enterica subsp. diarizonae S. enterica subsp. houtenae S. enterica subsp. indica S. bongori (dříve S. enterica subsp. bongori) více než 2600 serovarů (prevalence může v čase měnit, některé jsou druhově specifické, např. S. Dublin skot, S. Pullorum - drůběž) nejčastější sérovary vyvolávající onemocnění u lidí v EU S. Enteritidis (kontaminované vejce a drůbeží maso) S. Typhimurium (kontaminované vepřové, hovězí a drůbeží maso)

7 Bakterie rodu Salmonella odolné vůči podmínkám vnějšího prostředí, vyschnutí, nedostatku kyslíku, v potravinách se za vhodných podmínek dobře pomnožují primárně se vyskytují ve střevním traktu zvířat a lidí významným rezervoárem je drůbež na šíření onemocnění se mohou podílet rovněž hlodavci, volně žijící ptáci a hmyz přenos zejména konzumace syrového nebo nedostatečně tepelně upraveného masa (drůbežího, vepřového), vajec a mléka ID: baktérii Příznaky: nevolnost, bolesti břicha, teplota kolem 39 C, průjmy

8 Listeriózy Listeria monocytogenes fakultativně intracelulární baktérie ubikvitární výskyt (půda, vegetace, voda, rostliny, faeces zvířat i lidí, potraviny) schopnost růstu při chladírenských teplotách vyskytuje se zejména u rizikových skupin populace vysoká mortalita: % z pohledu potenciální kontaminace potravin je významná schopnost LM perzistovat v prostředí zpracování potravin zdroj onemocnění: zejména potraviny k přímé spotřebě ID: u zdravých jedinců , u rizikových skupin 10 3 klinický obraz: sepse, meningitidy, meningoencefalitdy, u těhotných žen potrat, narození mrtvého dítěte, onemocnění ohrožující život novorozence

9 Stafylokokové enterotoxikózy kmeny S. aureus produkující termostabilní toxiny hojně rozšířen v prostředí běžný komenzál kůže a sliznic lidí i zvířat v současnosti popsáno 21 enterotoxinů alimentární intoxikaci obvykle vyvolávají toxiny A,B,C,D (vzácněji E a H) hlavní zdroj kontaminace suroviny živočišného původu (nejčastější původce mastitid) potravináři s hnisavým onemocněním kůže na rukou a nosiči enterotoxinogenních kmenů prostředí potravinářských provozoven toxická dávka: 0,1 1,0 µg toxinu/kg tělesné hmotnosti (> S. aureus) příznaky: velmi rychlý nástup (příznaky se objeví 1-6 hodin po konzumaci kontaminované potraviny), zvracení, bolesti hlavy, vzácně průjmy

10 Alimentární onemocnění v ČR v letech salmonelóza kampylobakterióza

11 Listeriózy v ČR v letech

12 Vehikula epidemií v EU v roce 2014

13 Místa vzniku epidemií v EU v roce 2014

14 Šetření epidemií Členské země EU jsou povinny dle rozhodnutí 2119/98/EC vykazovat a hlásit zoonózy: - ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control) - sběr, předávání dat v rámci provozování nového informačního systému ECDC (TESSy The European Surveillance System) - EFSA (výroční zpráva EFSA) Směrnice 2003/99/EC stanovuje požadavky na epidemiologické šetření ohnisek choroby, šetření zahrnuje přiměřené epidemiologické a mikrobiologické studie.

15 Šetření epidemií Nařízení rozlišuje hlášení potvrzených a pravděpodobných epidemií v závislosti na (ne)potvrzení vehikula nákazy Nutná spolupráce epidemiologů, hygieny výživy, mikrobiologů a veterinárních lékařů

16 Manuál pro hlášení epidemií potvrzená epidemie definice Za potvrzenou epidemii je možné považovat pouze takovou, u které je laboratorně potvrzeno i vehikulum nákazy.

17 Metody typizace IDENTIFIKACE - zařazení neznámých izolátů (rod, druh, poddruh) TYPIZACE - metoda bližší identifikace baktérií zařazení kmenů pod úroveň druhu (poddruhu) - sérotypizace FINGERPRINTING - vzájemné porovnání kmenů jednoho druhu poddruhu nebo variety - metody na bázi PCR - makrorestrikční analýza bakteriálního genomu

18 Požadované vlastnosti pro typizační metody vhodnost použití pro široký okruh izolátů dobrá rozlišovací účinnost dobrá reprodukovatelnost stabilita rychlost jednoduchost provedení možnost PC analýzy

19 Terminologie Izolát populace buněk odvozená z jedné kolonie na Petriho misce Kmen izolát nebo skupina izolátů s vlastnostmi odlišnými od jiných izolátů téhož druhu Klon populace buněk vzniklých asexuální reprodukcí ze společného předka

20 Fenotypové typizační metody BIOTYPIZACE - zkoumání vlastností kultur na základě biochemických vlastností (API, Enterotest, Stafytest atd.) SÉROTYPIZACE - nejstarší typizační technika, sklíčková, mikrozkumavková, Ag O:H REZISTENCE k AML - zkoumání citlivosti kultur k antimikrobiálním látkám (disková difuzní, metoda MIC) FÁGOVÁ TYPIZACE

21 Serotypizace

22 Serotypizace Listeria monocytogenes Metoda sklíčkové aglutinace Serotyp O-antigen H-antigen 1/2a I, II, (III) AB 1/2b I, II, (III) ABC 1/2c I, II, (III) BD 3a II, (III), IV AB 3b II, (III), IV, (XII), (XIII) ABC 3c II, (III), IV, (XII), (XIII) BD 4a (III), (V), VII, IX ABC 4ab (III), V, VI, VII, IX, X ABC 4b (III), V, VI ABC 4c (III), V, VII ABC 4d (III), (V), VI, VIII ABC 4e (III), V, VI, (VIII), (IX) ABC 7 (III), XII, XIII ABC

23 Serotypizace salmonel - více než 2600 serovarů (prevalence může v čase měnit, některé jsou druhově specifické, např. S. Dublin skot, S. Pullorum - drůběž) Distribuce 10 nejběžnějších serovarů salmonel u lidí v EU v roce 2012

24 Serotypizace Escherichia coli až 250 různých sérotypů klasická aglutinační reakce -založena na detekci somatických O-antigenů (174 typů), bičíkových H-antigenů (53 typů) a kapsulárních K-antigenů (80 typů) Význam séroskupin top five O157, O26, O103, O111, O145 O104 - (významná ve spojitosti s epidemií v roce 2011 v Německu) O45 a O121 - (epidemie v USA vázané zejména na konzumaci hovězího masa) O55, O91, O113, O128 a O146 - (séroskupiny nejčastěji hlášené z humánních případů v Evropě)

25 Rezistence k antimikrobiálním látkám

26 Fágová typizace Jimmy Dunbar v roce 1947 vyvinul metodu fágové typizace pro baktérie Salmonella Typhi.

27 Fágová typizace Pracovní postup: pomnožení testované bakteriální kultury v živném médiu 37 C 1-2 hodiny přelití pomnožené mladé kultury na povrch předsušených agarových ploten po odsátí přebytečné suspenze a vsáknutí kultury do média se aplikují specifické fágy inkubace přes noc při 37 C odečtení lytických reakcí a jejich vyhodnocení pomocí příslušného schématu.

28 Fágová typizace

29 Fágová typizace

30 Genotypové typizační metody analýza plazmidové DNA chromozomální DNA bez amplifikace cílové sekvence vyžadují velké množství cílových NK hybridizace - metoda specifické komplementace mezi hledaným jednovláknovým úsekem DNA a sondou značenou např. chemiluminiscenční značkou amplifikační vysoká senzitivita a specifita metody na bázi PCR(např. RAPD, REP PCR) qrt (real time)-pcr - využívá fluorescenčně značené sondy umožňující sledovat průběh reakce v každém kroku, kvalitativní i kvantitativní metoda restrikční analýza využití restrikčních endonukleáz ribotypizace RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů) PFGE (pulzní gelová elektroforéza) tzv. zlatý standard typizačních metod DNA sekvenování

31 Plazmidy a jejich analýza Bakteriální plazmidy jsou extrachromozomální kovalentní vazbou uzavřené cirkulární molekuly DNA schopné samostatné replikace. Mohou obsahovat geny, charakterizující fenotypový projev (rezistenci k antibiotikům, virulenci, metabolickou aktivitu). Některé plazmidy (konjugativní) mají schopnost přenášet své vlastní kopie na další druhy baktérií.

32 Analýza plazmidové DNA izolace plazmidové DNA (alkalická lýza, kolonky) rozdělení DNA v elektrickém poli vizualizace a určení velikosti a počtu plazmidů porovnání shodnosti plazmidů (o stejné velikosti) po restrikčním štěpení

33 Metody na principu PCR Druhová identifikace kampylobakterů

34 Metody na principu PCR Sledování faktorů virulence Escherichia coli - detekce stx1a, stx2a, stx2c, stx2d - detekce genů eae, aaic, aggr, popř. dalších ISO TS (2012) Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing E. coli (STEC) and determination of O157, O111, O26, O103 a O145 serogroups - kombinace RT-PCR a klasické kultivace - cílené vyhledávání kmenů nesoucích geny stx1,2

35 1. část screening faktorů virulence testovaný vzorek v g nebo ml + 9 x ml mtsb + N/A nebo BPW pomnožení h 37 C izolace DNA z 1 ml pomnoženého vzorku detekce genů stx a eae, popř. sérospecifických genů RT-PCR detekce genů stx negativní výsledek do 24 h kultivace

36 2. část kultivace vzorků pozitivních na přítomnost genů stx pomnožený vzorek vyočkování na TBX a další půdy dle výběru výběr 50 typických kolonií detekce genů stx (48h) průkaz genů stx u izolátu (72 h) negativní výsledek konfirmace a typizace izolátu (4. den)

37 Metody na principu PCR Serotypizace L. monocytogenes Metoda multiplex PCR (Doumith et al., 2004) Amplifikace fragmentů Serotyp lmo1118 (906 bp) lmo0737 (691 bp) ORF2110 (597 bp) ORF2819 (471 bp) prs (370 bp) 1/2a, 3a /2b, 3b, /2c, 3c b, 4d, 4e a, 4c bp 1/2a, 3a 155 bp 1/2b, 3b, 7 1/2c, 3c 4b, 4d, 4e

38 Metody na principu PCR LIPI-1 (Listeria pathogenicity island 1) Gen Protein Funkce Sledování virulence L. monocytogenes prfa pozitivně regulační faktor A (PrfA) regulace transkripce hlya listeriolysin O (LLO) porušení membrány fagosomů plca fosfatidylinositol fofolipáza C (PI-PLC) porušení membrány fagosomů plcb fosfatidylcholin fosfolipáza C (PC-PLC) porušení membrány fagosomů mpl zinek dependentní metaloproteáza (MPL) štěpení proenzymu PC-PLC acta aktin polymerizující protein (ActA) intracelulární motilita Internaliny A (inla) a B (inlb) zajišťují penetraci do hostitelských buněk různá buněčná specifita PCR-RFLP genu inla (Rousseaux et al., 2004) - detekce potenciálně invazivních kmenů L. monocytogenes RFLP profil 2, 3, 5 potenciálně invazivní kmeny RFLP profil 1, 4 potenciálně neinvazivní kmeny

39 Metody na principu PCR Detekce stafylokokových enterotoxinů -nepřímá PCR, RT-PCR citlivá, rychlá, ale poskytuje pouze informace o přítomnosti genů u izolátů S. aureus zatím jediná možnost jak stanovit nové toxiny Detekce genů virulence u S.aureus - např. gen pvl, tsst1,.. Detekce genů kódujících rezistenci k AML - např. detekce MRSA, ESBL

40 DNA sekvenování

41 Multilocus sequence typing (MLST) metoda využívající sekvenčních polymorfismů několika lokusů, vychází z produktu získaného pomocí PCR, je založena na sekvenování úseků několika vybraných klíčových (housekeeping) genů (6-7), konzervativní sekvence výsledkem sekvenace je alelický profil, který slouží jako nástroj pro porovnávání izolátů mezi sebou

42 Multiple-locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) Analýza přirozeně se vyskytujících rozdílů v počtech vybraných tandemových repetic Základem je PCR sledovaných úseků a následná sekvenace Rychlé změny v počtech repetic porovnávání kmenů v rámci suspektní epidemie

43 spa typizace typizace S. aureus jedná se o analýzu krátkých repetitivních sekvencí (21 až 27 bp) v polymorfní oblasti X genu pro stafylokokový protein A (spa)

44

45 WGS whole genome sequencing Kompletní informace o kmeni: geny rezistence, virulence, změny v genomu. Velké množství údajů k porovnání Odpadá nutnost vyhledávání vhodného cíle analýzy

46 Pulzní gelová elektroforéza (PFGE) Makrorestrikční analýza bakteriálního genomu, technika určená pro separaci molekul DNA o velikosti až 12 Mb. Zapínání a vypínání protilehlých hexagonálně rozmístěných elektrod umožňuje pohyb a dobré rozdělení velkých částí DNA v gelu. Molekuly DNA putují pohybem cik-cak v závislosti na pulzním čase a napětí.

47 PFGE endonukleázy vzácně štěpící rozpoznávají a štěpí sekvence, které se v genomové DNA vyskytují zřídka a vytváří dlouhé restrikční fragmenty (XbaI, SpeI, SmaI, NotI) Počet fragmentů o velikosti kb

48 Pulzní gelová elektroforéza

49 Pulsenet International The International Molecular Subtyping Network for Foodborne Disease Surveillance umožňuje mezilaboratorní i mezinárodní srovnání PFGE protokoly pro vybrané původce alimentárních onemocnění: Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Escherichia coli (O157:H7 and non O157), Salmonella, Shigella sonnei and Shigella flexneri Listeria monocytogenes Vibrio cholerae and Vibrio parahemolyticus Yersinia pestis MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem repeat Analysis) protokoly E. coli O157 (STEC), S. Typhimurium S. Enteritidis Informace k práci s databází BioNumerics

50 Vyhodnocení PFGE Vizuální analýza dat Numerická analýza profilů Výpočet podobnosti Shluková analýza Archivace dat (elektronická) Porovnávání profilů mezilaboratorně (mezinárodně)

51

52 Využití typizačních metod A. Epidemiologické účely - sledování zdrojů a cest šíření agens v humánní populaci. B. Epizootologické účely - sledování zdrojů a cest šíření agens v animální populaci. C. Environmentální účely Potravinářské výrobny - sledování šíření agens v potravinářském průmyslu. Prodej potravin sledování a hodnocení hygieny prodeje nebalených výrobků.

53 Epidemiologické případy listerióz v ČR Epidemie I Období: květen 2006 březen 2007 Lokalita:Čechy i Morava Počet potvrzených případů: 85 Počet úmrtí: 15 Zdroj: zrající sýr Sérotyp/pulzotyp: 1/2a/700

54 Epidemiologické případy listerióz v ČR Epidemie II Období: červenec 2008 únor 2009 Lokalita: 2 oblasti (Jihočeský kraj) Počet potvrzených případů: 9 Počet úmrtí: 4 Zdroj: vakuově balená dušená šunka Sérotyp/pulzotyp: 1/2a/733 a 735

55 Analýza zdrojů a cest šíření L. monocytogenes v prostředí mlékárenského podniku vyrábějícího zrající sýry LM serotyp 1/2a; pulzotyp 713

56 Výsledky typizace S.aureus izolovaných z masných výrobků zakoupených v jednom supermarketu Místo Potravina Výrobce Prodejna Genotyp Žďár nad Sázavou Ústí nad Labem salám šunkový A I A, I, G salám gothajský B I A, I, G párky B I A, I, G klobásy B I A, I, G šunka vepřová C I A, I, G tlačenka vepřová D I A, I, G salám vysočina E II C salám turistický E II C salám šunkový F II C salám gothajský F II C šunka vepřová F II C jelita F II C

57 Výsledky typizace L. monocytogenes izolovaných z masných výrobků zakoupených v jednom supermarketu Místo Potravina Výrobce Prodejna Sérotyp Pulzotyp salám vysočina A I 1/2a 713 salám herkules A I 1/2a 713 Jablonec nad Nisou salám turistický B I 1/2a 713 salám gothajský C I 1/2b 505 šunka vepřová D I 1/2b 505

58 Děkuji za pozornost