Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta. Studijní program: Biologie Studijní obor: Botanika. Bc. Jana Kreidlová

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Botanika Bc. Jana Kreidlová Synura echinulata (Synurales) tvarová variabilita křemičitých šupin přírodních populací závislá na faktorech prostředí; doprovodné druhy křemičitých chrysomonád Synura echinulata (Synurales) - silica scale plasticity in natural populations influenced by environmental factors; accompanying scaled chrysophytes Diplomová práce Školitelka: RNDr. Yvonne Němcová, Ph.D. Praha 2012

2 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, dne Bc. Jana Kreidlová

3 Poděkování Na tomto místě bych velice ráda poděkovala všem, kteří mi jakkoli pomohli při zpracování této práce. Hlavní dík za konzultace, cenné rady, ale hlavně za ochotu patří RNDr. Yvonne Němcové, Ph.D., která moji práci vedla. Dále bych chtěla poděkovat všem členům algologického pracoviště za vytvoření příjemného pracovního prostředí a Martinovi Pusztaiovi za skvělý typ na lokality. Mimořádný dík patří celé mé rodině a Josefovi Arnoštovi za všestrannou podporu během celé doby studia a Michaele Pokorné za duševní oporu. Práce byla financována granty GAČR 206/08/P281 a MŠMT

4 OBSAH 1. Úvod Obecná charakteristika křemičitých chrysomonád Charakteristika modelového organismu Synura echinulata Morfologická plasticita křemičitých šupin Charakteristika lokalit Česká republika Francie, Akvitánie Materiál a metody Odběrová místa Odběry vzorků Příprava vzorků pro transmisní a skenovací elektronovou mikroskopii Výběr tělových šupin pro geometrickou morfometriku Geometrická morfometrika (GM) Symetrizace Statistické analýzy Partial least squares analysis (PLS) Mnohorozměrná regrese Permutační MANOVA Mantelův test Míra tvarové variability (morfologická disparita) Výsledky a diskuse Výsledky geometrické morfometriky Celková tvarová variabilita Partial least squares analysis (PLS) Regrese tvaru na ph a nadmořskou výšku Rozklad tvarové variability mezi studované proměnné Výsledky Mantelova testu Míra tvarové variability (morfologická disparita) Diskuse geometrické morfometriky Celková variabilita Vliv proměnných prostředí na tvar šupin - srovnání jednotlivých analýz Tvarová variabilita šupin závislá na ph v přírodních a v laboratorních podmínkách Morfologické trendy spojené s ph Míra tvarové variability (morfologická disparita) Výsledky a diskuse floristické části Česká republika Francie, Akvitánie Charakteristika vybraných zástupců křemičitých chrysomonád Popis nového druhu Mallomonas decora sp. nov Závěr Seznam literatury... 61

5 1. Úvod Výzkum chrysomonád a jejich křemičitých šupin se ve větší míře začal rozvíjet po nástupu transmisního elektronového mikroskopu v 60. letech minulého století. Na základě morfologie šupin bylo snadné zařadit daný organismus do určitého druhu. S postupem doby se neustále vyvíjejí další metody, které vědcům pomáhají zodpovídat otázky, které se týkají taxonomie i ekologie těchto organismů. Tvar a jeho změnu v závislosti na podmínkách prostředí lze sledovat u šupin a buněk pomocí metod geometrické morfometriky, která v posledních letech pomáhá rozluštit otázky týkající se změny tvaru vybraných struktur křemičitých chrysomonád. Pro svou studii jsem si vybrala druh Synura echinulata (Korshikov 1929). Zkoumání tvarové variability křemičitých šupin tohoto druhu bylo prováděno doposud pouze v laboratorních podmínkách (Němcová et al. 2010, Němcová & Pichrtová 2012). Cílem této diplomové práce bylo zjistit, jaká je celková variabilita šupin v přírodě a jaké environmentální parametry ovlivňují tvar těchto šupin v přírodních populacích. Také jsem chtěla zjistit, zda se liší tvarová variabilita závislá na ph v přírodních a v experimentálních podmínkách. Tvarovou variabilitu šupin v přírodních podmínkách a závislost změny tvaru šupin na environmentálních faktorech jsem zkoumala pomocí landmarkových metod geometrické morfometriky. Morfologická variabilita roste v podmínkách, které jsou pro organismus stresové (Gavrilova et al. 2005). V přírodních podmínkách může působit mnoho stresových faktorů, byla proto také sledována morfologická disparita tvaru šupin. Díky hledání živých populací druhu Synura echinulata jsem objevila v ČR lokality s velice bohatou diverzitou zlativek. Cílem této práce se proto stal rovněž průzkum diverzity křemičitých chrysomonád. Vzorky jsem odebírala na lokalitách, kde výzkum křemičitých chrysomonád v minulosti již proběhl (např. Němcová et al. 2000, 2003a, Kalina et al. 2000, Janatková & Němcová 2009), ale i na lokalitách, kde se křemičité chrysomonády dosud nezkoumaly. V České republice má výzkum křemičitých chrysomonád dlouholetou tradici. Již v roce 1955 byly publikovány výsledky práce Fotta (Fott 1955), který se zabýval křemičitými chrysomonádami, v roce 2003 byly shrnuty výsledky zkoumání těchto organismů z let (Němcová et al. 2003b). Lze říci, že ČR patří k relativně dobře prozkoumaným územím ve střední Evropě (Kalina et al. 2000, Němcová et al. 2001, 2003a, Neustupa et al. 2001, 7

6 Nováková et al. 2004, Pichrtová et al. 2007, Pichrtová & Veselá 2009, Janatková & Němcová 2009, Němcová 2010). Stále jsou objevovány druhy nové pro Českou republiku (např. Němcová et al. 2000, Neustupa et al. 2000, Řezáčová et al. 2004, Němcová & Pichrtová 2009, Němcová 2010). Řezáčová (2006) popsala z rašelinné tůně v severních Čechách nový druh Mallomonas kalinae. Cíle práce lze tedy shrnout do několika bodů: zjistit, jaká je celková tvarová variabilita šupin Synura echinulata v přírodě zjistit, jaké podmínky nejvíce ovlivňují variabilitu šupin S. echinulata v přírodním prostředí porovnat tvarovou variabilitu šupin závislou na ph v přírodních a v experimentálních populacích S. echinulata porovnat disparitu (míru variability) ve tvaru šupin v přírodních populacích z různých lokalit charakterizovat vzácné a zajímavé druhy chrysofyt doprovázející S. echinulata upozornit na lokality v České republice s bohatým výskytem křemičitých chrysomonád ( hotspots ) 1.1 Obecná charakteristika křemičitých chrysomonád Andersen (1987) rozdělil chrysomonády na základě biochemických a ultrastrukturálních znaků na dvě samostatné třídy skupiny Heterokontophyta, na Chrysophyceae a Synurophyceae. Pozdější molekulární analýzy nepřinesly jednoznačné výsledky a rozdělení těchto organismů na 2 třídy nepodpořily (Andersen et al. 1999, Andersen 2007). Cavalier-Smith (1993) snížil třídu Synurophyceae na pozici podtřídy v rámci Chrysophyceae. Cavalier-Smith & Chao (2006) charakterizují řády Synurales a Paraphysomonadales jako odlišné linie v rámci třídy Chrysophyceae. Synurales Do této skupiny patří jednobuněčné nebo koloniální organismy s dvěma nestejně dlouhými bičíky, delší pokrývají tripartitní mastigonemy, kratší je hladký. Vyskytují se téměř výhradně ve sladkých vodách. Chloroplasty obsahují chlorofyly a + c 1 8

7 a xantofyly (nejvýznamnější je fukoxantin, který způsobuje typicky zlatavě hnědou barvu, od toho vznikl český název zlativky). Hlavní zásobní látkou je chrysolaminaran. Charakteristické jsou pro Synurales křemičité struktury na povrchu buňky (tvořené z polymeru SiO 2, podobný opálu), které zahrnují šupiny a u rodu Mallomonas i ostny. Tvoří se endogenně v SDV (silikon-depozitních) váčcích, které jsou připojené k periplastidiálnímu endoplasmatickému retikulu. Stále není jednoznačné vysvětlení, jak jsou šupiny umísťovány na povrch buňky. Existují dvě hypotézy, které se snaží vysvětlit tvorbu zapojené schránky. První teorie udává, že jsou hotové šupiny ještě uvnitř buňky nasměrovány na přesné místo a následně vyloučeny na povrch. Druhá teorie tvrdí, že se šupiny nejprve dostávají na povrch, po kterém následně kloužou na své určité místo (Siver & Glew 1990). Na povrchu buňky jsou šupiny uspořádány do speciálního vzoru, vzájemně se překrývají ve spirálních řadách (Siver & Glew 1990, Leadbeater & Barker 1995). Šupiny a ostny jsou rozhodující pro determinaci jednotlivých druhů. Pro jejich určování se v současnosti používá transmisní nebo skenovací elektronový mikroskop. V minulosti se používal k popisu druhů světelný mikroskop (Korshikov 1927, 1929). Popis byl založen hlavně na tvaru buněk, délce a počtu viditelných bičíků. Pro pozorování šupin bylo nutné vysušit kolonie na krycím sklíčku a po rozpadu protoplastu následně sledovat jednotlivé šupiny. Počátek éry transmisního elektronového mikroskopu (TEM) spadá do 60. let, kdy vznikaly první fotografie křemičitých šupin (př. Asmund 1955, 1956, Fott 1955, Harris 1958, Harris & Bradley 1957, 1958, 1960). Před nástupem skenovacího elektronového mikroskopu (SEM) se využívaly pro zkoumání křemičitých struktur tzv. carbon replicas. Podrobný popis této metodiky zkoumání křemičitých struktur uvádí např. Harris & Bradley (1957). Povrch síťky se vzorkem byl pokryt vrstvou uhlíku, který se ve vakuu odpařil a zkondenzoval na snímek. Vznikla tak replika exponovaného povrchu šupin. Později se začal využívat ke studiu povrchu šupin a celých buněk skenovací elektronový mikroskop (SEM) (Kristiansen 1971, Cronberg 1972). Od té doby bylo publikováno nespočetné množství článků z různých koutů světa, které se zabývají ultrastrukturou, biogeografií či ekologií těchto organismů. Některé druhy se vyskytují pouze v úzkých ekologických podmínkách, lze je tedy využívat jako bioindikátory (Siver 1995). Jelikož se křemičité struktury a cysty, které se tvoří v nepříznivých podmínkách či jsou výsledkem pohlavního rozmnožování, zachovávají v sedimentech jezer, bylo publikováno také množství paleolimnologických studií (př. Munch 1980, Siver 1995, Smol 1995, 9

8 Kodama et al. 1997). Křemičité šupiny jsou však lépe rozlišitelné než stomatocysty, většinou se dají jednoduše a spolehlivě určit do druhu, u kterého jsou známé ekologické parametry. Proto jsou pro paleolimnologické rekonstrukce vhodnější (Kristiansen 2005). Cysty se však lépe zachovávají v sedimentech, určují se do tzv. morfotypu, který je označený číslem (Duff et al. 1995, Wilkinson et al. 2001) a pro paleoekologické rekonstrukce se používají častěji než šupiny. Na základě četných studií je rozšíření této skupiny relativně dobře známé. Zhruba polovina druhů je kosmopolitních a široce rozšířených. Chrysomonády dále zahrnují druhy, které mají hlavní rozšíření v temperátní oblasti severní polokoule nebo bipolární či tropické rozšíření. Některé druhy se vyskytují pouze zřídka nebo jsou endemické (Kristiansen 2001). Podle Kristiansena (2008) je zhruba jedna třetina endemických, např. u rodu Mallomonas 69 ze 172 taxonů. Některé druhy byly nalezeny v rámci jednoho kontinentu nebo menší geografické jednotky, některé druhy byly dosud nalezeny pouze na typové lokalitě nebo v jejím okolí. Kristiansen & Lind (2005) se ve své studii o endemicitě chrysomonád zaměřili na rod Mallomonas. Podle popisu na základě identifikace šupin v elektronovém mikroskopu vytvořili chronologický soupis dosud popsaných druhů tohoto rodu. Jsou zde zaznamenané údaje, jak dlouho zůstal určitý druh endemický, dokud nebyl nalezen na jiném místě (jiném kontinentu), dále jsou zde uvedené záznamy o druzích, které jsou stále za endemické považované. Díky šíření těchto organismů a díky stále dalším studiím, které se zabývají průzkumem nových lokalit, některé druhy svůj status endemita již ztratily (př. Němcová et al. 2012). Ubikvitní teorie rozšíření mikroorganismů tvrdí, že všechno je všude, limitující je pouze prostředí (Finlay & Clarke 1999, Finlay 2002). Tato teorie vysvětluje náhodné rozšiřování díky velikosti organismů, které jsou menší než 1 mm a díky velké absolutní velikosti populace. Zároveň musí být pro aktivní populaci splněné vhodné podmínky pro růst a rozmnožování (limitace prostředím). Podle této teorie by měly být křemičité chrysomonády globálně rozšířené a postrádat tudíž určitý biogeografický pattern. Siver & Lott (2012) ve své studii nalezli signifikantní rozdíly ve složení křemičitých chrysomonád podél východního pobřeží Severní Ameriky. Rozdíly byly i na lokalitách situovaných v různých regionech, kde byly naměřeny podobné chemickofyzikální parametry vody. Distribuce křemičitých chrysomonád na zkoumaném území nebyla homogenní a vykazovala biogeografický pattern navzdory mechanismům, které zapřičiňují šíření organismů. Počáteční hypotéza, že křemičité chrysomonády budou na lokalitách homogenní a budou postrádat biogeografii, tedy nebyla podpořena. Siver & 10

9 Lott (2012) diskutují, proč i přes tyto výsledky nezavrhují ubikvitní teorii. Jeden z důvodů je například velice vzácný výskyt druhu na dané lokalitě, a tudíž není během odběru a při následném zpracování vzorků zaznamenaný. Je známo jen málo informací o šíření chrysomonád (Kristiansen 2001), problémem šíření těchto organismů z jedné lokality do druhé je nedostatečná tolerance k vysychání. Přemístění z jedné lokality na druhou obnáší změny prostředí, a proto je schopnost vyhnout se vyschnutí během transportu pro tyto organismy rozhodující. Šíření je také limitováno křehkou konstrukcí buněk (Kristiansen 2008). Wee et al. (2005), kteří se zabývali ve své studii palmelovými stádii Synurales, usuzují, že by mohly k šíření druhů na nové lokality sloužit právě tato palmelová stádia. Z druhů, které jsem na vybraných lokalitách nalezla, patří do Synurales rody Mallomonas, Synura a Chrysodidymus. Paraphysomonadales Patří sem jednotlivě žijící nebo koloniální bičíkovci, vyskytují se hlavně ve sladkých vodách, ale často jsou přítomny i v brakických vodách a v mořích. Buňky této skupiny jsou pokryty křemičitými šupinami tvořícími se v SDV váčcích, které na rozdíl od Synurales nejsou připojeny k periplastidiálnímu endoplasmatickému retikulu. Šupiny se rozdělují na několik typů: bazální, ostnové a korunkové. Buňky mohou být pokryty jedním nebo několika typy výše uvedených šupin. V minulosti byly nesrovnalosti se zařazením do rodu Chrysosphaerella a Spiniferomonas. Nicholls (1984b) navrhl, aby byly solitérní druhy přiřazovány k rodu Spiniferomonas, zatímco koloniální bičíkovci k rodu Chrysosphaerella. Za vyšší taxonomický stupeň je však uznávána stavba ostnové šupiny (Kristiansen & Tong 1989). Ačkoli je tedy např. Chrysosphaerella coronacircumspina jednobuněčný organismus, je přiřazen do tohoto rodu. Na rozdíl od rodu Spiniferomonas, který má jednoduchou bázi ostnové šupiny, vlastní rod Chrysosphaerella ostnové šupiny s dvojitým bazálním diskem. Mezi druhy, které jsem na lokalitách determinovala, patří do této skupiny rody Chrysosphaerella, Paraphysomonas a Spiniferomonas. 11

10 1.2 Charakteristika modelového organismu Synura echinulata Synura echinulata byla popsána Korshikovem na základě pozorování ve světelném mikroskopu (Korshikov 1929). Kolonie mají v průměru 50 µm a skládají se obvykle z buněk, které jsou uprostřed kolonie srostlé (Příloha 3, obr. 80). Buňky obsahují dva chloroplasty, které jsou oddělené jádrem (Kristiansen & Preisig 2007). Křemičité šupiny, které vytvářejí schránku na povrchu buňky, mají různý tvar v závislosti na umístění na buňce. Rozlišují se tělové, kaudální a apikální šupiny. Tělové šupiny jsou kulaté až oválné, jejich bazální deska je perforovaná. V proximální části šupiny se nachází přehnutý okraj, který je na buňce překryt další šupinou (Příloha 3, obr. 81, 83). Distální část šupiny je zpevněna sekundární vrstvou, tzv. labyrintózní strukturou. Tenký okraj v distální části šupiny má žebra, která jsou oddělena jednotlivými póry. Popis morfologie tělové šupiny je uveden na obr Kaudální šupiny vyskytující se na protáhlém konci buňky, kde je bičíkovec připojen k ostatním členům kolonie, jsou prodloužené a užší. Nejzadnější extrémně kaudální šupiny jsou velice malé, bez ornamentace se širokým přehnutým okrajem. Osténky nacházející se v distální části šupiny jsou lehce zakřivené, na konci náhle zúžené. U anteriorních šupin v blízkosti bičíků dosahují velikosti do 2,5 µm, zatímco posteriorní šupiny mají velice malý ostének připomínající hrot. Extrémně kaudální šupiny mohou ostének úplně postrádat (Siver 1987). Byly také pozorovány tubulární šupiny, které jsou připojené k apikálním šupinám blízko bičíků a představují zřejmě homologní útvary k ostnům malomonád (Kristiansen & Preisig 2007). Obr. 1.1: Tělová šupina Synura echinulata s vyznačenými základními morfologickými strukturami. PO: přehnutý okraj, Š: štít, LS: labyrintózní struktura, Ot: otvor v bazální desce, Os: ostének. Měřítko 0,5 µm. 12

11 Tento koloniální bičíkovec je jeden z nejčastěji se vyskytujících druhů (Siver 1987, Siver 1988a, Ikävalko 1994, Hansen 1996, Siver & Lott 2010, Pichrtová et al. 2011). Jedná se o monofyletický druh (obr 1.2, Škaloud et al. nepublikováno), proto byl vybrán pro tuto morfometrickou studii. Synura echinulata má širokou ekologickou valenci ve vztahu k ph. Např. Kristiansen (1975) zaznamenal výskyt druhu v rozmezí ph 4 9. Nejčastěji je však tento druh nacházen v kyselých vodách (Smol et al. 1984, Roijackers & Kessels 1986, Siver 1988a, Hartmann & Steinberg 1989, Siver & Hamer 1989, Hartmann-Zahn 1991, Siver & Smol 1993). Podle Sivera (1989) byl nejčastější výskyt zaznamenán z acidických habitatů s průměrným ph 6; 5,9 a 5,7, byl tedy zařazen mezi acidofilní/acidobiontní druhy. S. echinulata je nalézána v oligotrofních vodách, ale může se vyskytovat i v mezotrofních aluviálních tůních nebo v eutrofních rybníkách (Kristiansen 1975, Němcová et al. 2003). Na základě pětiletého sledování sezónní distribuce chrysomonád v malém oligotrofním dimiktickém rybníku zařadili Siver & Hammer (1992) 51 druhů do pěti kategorií. V první kategorii se vyskytují druhy, které začínají růst na jaře, jejich maximum je v létě a na podzim mizí. Pro druhou kategorii je charakteristický začátek růstu na pozdní podzim, perzistence přes zimu a následné zmizení krátce po roztátí ledu na jaře. Do třetí skupiny patří druhy, které začínají růst v létě, přetrvají přes podzim a v zimě zmizí. Ve čtvrté kategorii lze nalézt druhy, jejichž růst začíná podobně jako u třetí kategorie v pozdním létě. Přežijí však zimu a zmizí po roztátí sněhu na jaře. Pátá kategorie je charakteristická výskytem druhů během celého roku, často však pouze sporadicky. Synura echinulata spadá podle této studie do čtvrté kategorie. Výskyt v chladnějších vodách uvádí např Roijackers & Kessels (1986), Siver & Hamer (1989). Podle Kristiansena (1986) S. echinulata nemá žádné jasné teplotní preference. 13

12 Obr. 1.2: Neighbor-joining tree based on ITS sequences (Škaloud et al. nepublikováno) 1.3 Morfologická plasticita křemičitých šupin Křemičité struktury jsou anorganické struktury, které se po exocytóze na povrch buňky již tvarově nemění. Změna tvaru je tedy míněna ve smyslu biomineralizace v odlišných podmínkách prostředí (např. různé hodnoty ph apod.). Za těchto různých podmínek vznikají šupiny, které mají průměrně jiný tvar. Morfologii křemičitých šupin lze studovat odlišnými metodami. V minulosti někteří autoři používali kvalitativní hodnocení, zkoumali pouze přítomnost či nepřítomnost určitých znaků na křemičitých strukturách (shrnuto v Pichrtová 2007). Tradiční morfometrika, která se zabývá měřením kvantitativních proměnných (např. lineární vzdálenosti délka, šířka) apod., má řadu nevýhod. Například různé naměřené vzdálenosti nejsou často navzájem nezávislé a proto se stávají měření nadbytečná. Velikost objektů je vždy dominantní složkou vysvětlené variability, je potřeba proto 14

13 vždy vliv velikosti odfiltrovat (Zelditch et al. 2004). Tradiční morfometriku používali ve svých studiích např. Martin-Wagenmann & Gutowski (1995), Gutowski (1996), Gavrilova et al. (2005). Geometrická morfometrika se zabývá celkovou geometrií morfologických struktur. Pomocí jejích metod se zachovává kompletní informace o relativním prostorovém rozložení dat (Adams et al. 2004). Podrobnější informace o této metodě jsou v kapitole 2.5. Šupiny mají různý tvar podle umístění na buňce. Tvarovou plasticitu v závislosti na pozici na buňce studovali u druhu Mallomonas kalinae Neustupa et al. (2010). Pomocí metod geometrické morfometriky zjistili, že hlavní tvarový trend je spojen s pozicí šupin na buňce a s jejich velikostí. Nebyl prokázán žádný signifikantní lineární vztah mezi velikostí a polohou. Větší šupiny se vyskytovaly v centrální části buňky, zatímco menší šupiny na apikální a kaudální části. V přírodě působí na tvar křemičitých struktur velké množství různých environmentálních faktorů. Z různých studií vyplývá, že k nejvýznamnějším faktorům, které ovlivňují výskyt a abundanci chrysomonád, patří teplota, ph a konduktivita (Siver 1991, 1995, Kim et al. 2008). Vliv teploty na tvar šupin zkoumali v minulosti např. Siver & Skogstad (1988), Martin-Wagenmann & Gutowski (1995), Gutowski (1996), Řezáčová et al. (2010) či Pichrtová & Němcová (2011). Siver & Skogstad (1988) nalezli během roku v různé časové době populace buněk M. crassisquama s různými typy ostnů. Na základě lineárního měření křemičitých struktur zjistili, že kratší serátní ostny se objevovaly v chladné vodě (teplota menší než 12 C), zatímco delší helmicovité ostny byly nalezeny pouze, když teplota vody přesáhla 15 C. Buňky s oběma typy ostnů se vyskytovaly v teplotě 9-20 C. Možným vysvětlením produkce delších helmicovitých ostnů během teplých měsíců je přizpůsobení buněk k menší viskozitě vody. Delší helmicovité ostny snižovaly v teplejší vodě rychlost klesání buněk ke dnu (Siver & Skogstad 1988). Gutowski (1996) zjistila na základě měření různých kvantitativních proměnných na šupinách M. tonsurata, že se zvyšující se teplotou dochází k redukci velikosti šupin. Nicméně, pouze jednomu ze tří studovaných kmenů Synura petersenii se velikost šupin při vyšší teplotě zmenšila (Martin-Wagenmann & Gutowski 1995). Řezáčová et al. (2010) studovali v laboratorních podmínkách vliv teploty na změnu tvaru šupin Mallomonas kalinae a Synura curtispina pomocí metod geometrické morfometriky. Tyto dva druhy pěstovali v různých teplotách (5, 10, 15, 20, 25 a 30 C). V závislosti na teplotě byly nalezeny určité tvarové trendy, značná tvarová variabilita 15

14 však byla spojena s pozicí šupin na buňce. S. curtispina měla za nízkých teplot šupiny nejširší a ve vyšších teplotách užší, zatímco šupiny M. kalinae byly nejužší v prostřední pokusné teplotě 20 C. Pichrtová & Němcová (2011) sledovaly změnu tvaru šupin Mallomonas tonsurata a Synura petersenii kultivovaných v pěti různých úrovních teploty (5, 10, 15, 20 a 25 C). Tvar šupin byl kultivační teplotou signifikantně ovlivněn, s jejím vzrůstem se tvar šupin měnil od zakulacených po oválné až protažené. Jedná se tedy zřejmě o obecnější trend v rámci chrysomonád, který může být považovaný za důsledek zvyšující se teploty (Pichrtová & Němcová 2011). Řada studií se v minulosti zabývala v laboratorních podmínkách vlivem ph na růstovou rychlost chrysomonád (Wee et al. 1991, Saxby-Rouen et al. 1998, Gavrilova et al. 2005, Lee et al. 2007, Lee & Kim 2007, Kim et al. 2008). Vlivem ph na velikost křemičitých šupin dvou kmenů Synura petersenii se zabývali Gavrilova et al. (2005). Při pěstování kmenů v různém ph docházelo ke změně morfologie šupin, která byla kmenově specifická. V kulturách se objevily také teratogenní šupiny, morfogeneze těchto šupin byla zřejmě narušena extrémně kyselým a zásaditým prostředím. Poškození šupin se projevovalo slabou silifikací, různými nepravidelnostmi, kýl byl zmnožený nebo jinak deformovaný. Tvarovou variabilitu křemičitých šupin dvou druhů chrysomonád v závislosti na ph sledovaly Němcová & Pichrtová (2012). Druhy byly kultivované na gradientu ph (Mallomonas striata- ph 4,5; 5,5; 6,5; 7,5; 8,3; 8,7; Synura echinulata- ph 3,5; 4,5; 5,5; 6,5; 7,5). Autoři ve studii diskutují, do jaké míry je tvar ovlivněn vysokým ph a do jaké míry nedostupností křemíku v tomto vysokém ph. Šupiny druhu M. striata byly v rozmezí ph 4,5-7,5 širší, s dobře vyvinutým V-žebrem, zatímco šupiny pěstované ve vyšším ph 8,3 a 8,7 byly užší se značně redukovaným V-žebrem. Druh S. echinulata měl v nízkém ph oválné šupiny s redukovaným štítem a rozšířenou labyrintózní strukturou. Se vzrůstajícím ph byly šupiny zaoblenější, v nejvyšším ph 7,5 širší s rozvinutým štítem a redukovanou sekundární labyrintózní strukturou. Přehnutý okraj byl v tomto ph také značně redukovaný. Vliv environmentálních parametrů (křemík, fosfor a dusík) na tvarovou variabilitu křemičitých šupin M. tonsurata zkoumali Hahn et al. (1996). Živiny vyskytující se v médiu výrazně ovlivňovaly tvar křemičitých struktur. Změna tvaru šupiny je omezena konstrukčním uspořádáním na buňce. Může se tedy měnit pouze do té míry, aby z těchto šupin mohla být utvořena funkční schránka. 16

15 Zároveň si musí šupina také udržet svou pevnost (Němcová et al. 2010). Při laboratorních pokusech na zkříženém gradientu světla/tepla zaznamenali Němcová et al. (2010) redukci labyrintózní struktury u druhu Synura echinulata (tma/zima), redukce byla vykompenzována rozšířením přehnutého okraje. Posteriorní část šupiny, která je překrytá vždy sousedními šupinami se jeví méně variabilní než anteriorní část. Autoři se domnívají, že díky překryvu šupin v této oblasti je posteriorní část šupiny tvarově více stabilní. 1.4 Charakteristika lokalit Česká republika Borkovická blata (3 vzorky) Přírodní rezervace rašeliniště Borkovická blata se nachází cca 5 km jihozápadně od Soběslavi nedaleko obce Borkovice. Rašelinné ložisko se zde začalo vytvářet před více než lety ( Od 50. do 70. let 20. století zde probíhala velkoplošná průmyslová těžba. Nejzachovalejší část blat, která má rozlohu zhruba 55 ha, byla v roce 1980 vyhlášena chráněným územím. Tři vzorky jsem odebrala v jezírkách, která vznikla při předchozí těžbě rašeliny (Příloha 2, obr. a) Brdy (6 vzorků) Padrťské rybníky je souhrnné označení pro dvojici rybníků, Hořejší padrťský a Dolejší padrťský rybník. Leží v kotlině dlouhé přes 10 km, která je součástí vojenského újezdu Brdy. Brdská vrchovina slouží k vojenským účelům již od roku Rybníky byly založeny v 16. století jako vodní rezervoár pro plavení dřeva pro hutě, rozložené na Padrťském potoce. V současnosti je hlavním využitím rybníků chov ryb. Hořejší padrťský rybník má výměru 115 ha, je napájen řadou drobných lesních přítoků a obklopen převážně smrkovými porosty. Dolejší padrťský rybník (Příloha 2, obr. j) má rozlohu 65 ha, je napájen výtokem z Hořejšího rybníku. V jeho okolí se nachází převážně louky a bezlesí. Vzorky planktonu jsem odebrala z obou Padrťských rybníků. 17

16 Dále jsem odebrala vzorek ze soustavy mělkých tůněk zastíněných smrky nacházejících se západně od Dolejšího padrťského potoka. Hloubka odebírané tůňky byla cca 30 cm. Dalším odběrovým místem nacházejícím se v Brdech byl malý rybník severovýchodně od Dolejšího padrťského rybníka, bez žádné litorální makrovegetace s nově upraveným břehem (Příloha 2, obr. h). Plankton jsem také odebrala z malé zarostlé tůně u cesty severně od Padrťských rybníků. Pilská nádrž, kde jsem provedla další odběr, se nachází cca 2,6 km severozápadně od obce Bohutín. Byla vybudována na Pilském potoce v Brdech v letech původně jako zásobárna vody potřebné pro příbramské doly a hutě, v současnosti představuje největší rezervoár pitné vody pro Příbramsko. Voda v nádrži je typická svou vysokou kyselostí. Zatopená plocha je 20,79 ha. Podrobná mapa odebíraných lokalit v Brdech je v Příloze 1. Černé jezero Rozloha činí 18,4 ha, jedná se o největší karové ledovcové jezero na Šumavě (Příloha 2, obr. i). Vzniklo v poslední době ledové. Od roku 1933 je společně s Čertovým jezerem součástí Národní přírodní rezervace o rozloze 174,86 ha. Hřensko Bezejmenný rybník nacházející se severovýchodně od Hřenska v lese na potoce Suchá Bělá (Příloha 2, obr. d). V okolí se nacházejí jehličnaté stromy. Krušné hory Podlouhlá louže vzniklá pravděpodobně po průjezdu těžké techniky hluboká cca 1 m. Nachází se na louce západně od kopce Nejdecký Špičák v Krušných horách. Liberecko (8 vzorků) V jihovýchodní části města Liberec se vyskytuje hojné množství vodních ploch. Plankton jsem odebrala z Pekelských (3) a Kunratických (3) rybníků, z malé tůňky vyskytující se pod nádrží u kravína, který se nachází mezi těmito dvěma soustavami rybníků a z mokřadu vyskytujícího se na přítoku jednoho z Pekelských rybníků. Odběrová místa jsou detailně vyznačena na mapě v Příloze 1. 18

17 Mechové jezírko, Krkonoše Mechové jezírko se nachází v moréně údolí Kotelského potoka v Krkonošském národním parku (Příloha 2, obr. j). Je to jediné ledovcové jezero na české straně Krkonoš, leží 1 km severozápadně od osady Dolní Mísečky. Jezírko má rozlohu zhruba 464 m² a dosahuje hloubky přibližně 0,8 až 1,2 m (Engel et al. 2003). Leží v nadmořské výšce 935 m n. m. Na dně i na hladině jezírka se hojně vyskytuje rašeliník Dusénův (Sphagnum dusenii). Rybníčky u Podbořánek Přírodní rezervace Rybníčky u Podbořánek nacházející se 1,2 km jihozápadně od Podbořánek byla vyhlášena roku Zahrnuje dva rybníky na Mladotickém potoce (Horní rybník a Dolní rybník) a přilehlé podmáčené pozemky. Vzorek planktonu jsem odebrala z Horního rybníka (Příloha 2, obr. b), na jehož hladině se vyskytují vysazené lekníny (Nymphaea spp.), rdest vzplývavý (Potamogeton natans), bublinatka jižní (Utricularia australis), šejdračka bahenní (Zannichellia palustris), dále zde roste ďáblík bahenní (Calla palustris), vachta trojlistá (Menyanthes trifoliata) nebo šípatka vodní (Sagittaria sagittifolia) (Ložek et al. 2005). Swamp Rašeliniště Swamp se nachází na jihovýchodním břehu Máchova jezera přibližně 2,8 km severně od Doks (Příloha 2, obr. c). Výskyt vody v rašeliništi se odvíjí od vodní hladiny Máchova jezera, se kterým je rašeliniště spojené písčitým propustným podložím. Rašeliniště se skládá ze dvou částí, vzorek planktonu jsem odebrala z místa nacházejícím se v severní části Swampu, která zahrnuje 1,45 ha. Tato část se stala Národní přírodní památkou v roce Od jezera je oddělena úzkou hrází, která byla ve 2. polovině 20. století zpevněna, aby nedocházelo k naplavování vody z jezera do rašeliniště a nedocházelo tak k eutrofizaci (Svátková 2007). Vizír Rybník Vizír je součástí Národní přírodní památky Vizír, která byla vyhlášena v roce 1987 na ploše 10,22 ha. Leží 3 km západně od Chlumu u Třeboně. 19

18 Na Plachtě (9 vzorků) Přírodní památka Na Plachtě se rozkládá na jihovýchodním okraji města Hradec Králové. Skládá se ze dvou zvláště chráněných území. Přírodní památka Na Plachtě 1 byla zřízena roku 1998 a činí 10 ha. Přírodní památka Na Plachtě 2 byla zřízena na pozemcích sloužících obraně státu roku Tato část má výměru 29 ha. Na obnažených plochách v centrální části Na Plachtě 2 jsou terénní deprese vzniklé těžbou stavebního materiálu. Vzorky jsem odebrala z některých těchto prohlubní, které jsou zaplněné vodou (Příloha 2, obr. f). Na mapě v Příloze 1 je vyznačeno 9 odběrových míst Francie, Akvitánie Akvitánie se nachází v jihozápadní části Francie (mapa, Příloha 1). Vzorky jsem odebírala v západní části tohoto regionu, který přiléhá k Atlantskému oceánu. Vyskytuje se zde mírné klima, zasahují sem subtropické mediteránní cévnaté rostliny jako např. Arbutus unedo, Quercus suber, Ruscus aculeatus, Smilax aspera nebo Viburnum tinus. Průměrná lednová teplota zde obvykle překračuje 5 C, v jižní části regionu dosahuje až 7,5 C. V zimě zde téměř nemrzne, lokality proto nejsou vystaveny dlouhodobému zmrznutí (Němcová et al. 2012). Vzorky jsem získala z malých tůní a mokřadů (lokality 34-37, Příloha 2, obr. k, l) a z Étang de Hardy, který slouží k lovu ryb. 20

19 2. Materiál a metody 2.1 Odběrová místa Vzorky jsem odebrala v České republice a v Akvitánii (jihozápad Francie) během let 2010 a V České republice jsem odebrala vzorky ze 33 míst. Pro analýzu tvaru šupin pomocí geometrické morfometriky jsem využila 24 vzorků, ve kterých se živé kolonie Synura echinulata vyskytovaly v dostatečném množství pro nafocení šupin. Na devíti odběrových místech nacházejících se na jihovýchodním okraji u Hradce Králové v přírodní památce Na Plachtě jsem studovala pouze diverzitu křemičitých chrysomonád. Jelikož se zde šupiny druhu Synura echinulata vyskytovaly pouze ve velmi malém počtu, nezahrnula jsem je do morfometrických analýz. Pro analýzu šupin z Akvitánie jsem odebrala 4 vzorky z lokalit, kde se Synura echinulata vyskytovala v planktonu v dostatečné abundanci pro focení šupin. Vzorek z mokřadu severně od Hostens byl odebrán dvakrát, v únoru a v květnu Mapa lokalit je znázorněna v Příloze 1, jednotlivé lokality jsou popsány v tabulce v Příloze Odběry vzorků Vzorky planktonu jsem odebírala planktonní sítí s rozměry ok 20 µm. Na některých místech jsem odebrala pomocí injekční stříkačky povrchový sediment pro studium diverzity křemičitých chrysomonád (Příloha 4). Při každém odběru jsem měřila na lokalitě hodnoty ph, konduktivity a teploty pomocí kombinovaného phkonduktometru WTW 340. Odebrala jsem také větší objem (0,5 l) čisté vody pro měření dalších parametrů vody (celkový dusík, cekový fosfor, amoniak). Hodnoty jsem měřila v laboratoři za využití spektrofotometru DR/890 Colorimetr (Hach). Na meteorologickém serveru jsem pak zjistila na nejbližší stanici vyskytující se u lokality průměrnou měsíční teplotu před daným odběrem. Teploty vody, které jsem naměřila na lokalitách, jsem do analýz nepoužila kvůli jejich velkým výkyvům v závislosti na počasí a intenzitě slunečního záření. 21

20 Všechny naměřené hodnoty, nadmořská výška lokalit a GPS souřadnice jsou uvedené v tabulce v Příloze Příprava vzorků pro transmisní a skenovací elektronovou mikroskopii Vzorky jsem v laboratoři prohlédla pomocí světelného mikroskopu a v případě výskytu živých zástupců rodu Synura jsem je nakapala na předem připravené měděné síťky potažené formvarovou blankou. Po zaschnutí jsem síťky promyla v 5 kapkách destilované vody na parafilmovém pásku, aby se vzorek zbavil nečistot, které vznikly vysrážením solí. Pro determinaci Synura echinulata jsem použila transmisní elektronové mikroskopy (TEM) Philips 300 a JOEL Pokud se tato zlativka ve vzorcích vyskytovala, nakapala jsem další formvarové síťky (5-8) pro použití na TEM. Vzorky planktonu jsem fixovala Lugolovým roztokem a uschovala je ve tmě pro případnou potřebu dalších šupin Synura echinulata. Pro pozorování buněk ve skenovacím elektronovém mikroskopu (SEM) jsem vypěstovala několik monoklonálních kultur. Z přírodního vzorku jsem skleněnou mikropipetou vyizolovala vždy jednu kolonii, kterou jsem promyla v sérii kapek sterilního živného média a nechala jsem ji cca 14 dní růst v komůrce serologické destičky. Poté jsem kultury přemístila do Erlenmeyerových baněk (objem 50 ml) s modifikovaným médiem DY IV s pufrem MES (C 6 H 13 NO 4 S) (Řezáčová 2003). Pro pozorování v SEM jsem připravila dva vzorky, první jsem nafixovala 2% glutaraldehydem a nechala fixovat přes noc, druhý vzorek jsem ponechala bez fixace. Na krycí sklíčka (průměr 12 mm), která jsem umístila na varnou desku zahřátou na 60 C, jsem kápla třikrát roztok poly-l-lysinu (SIGMA-ALDRICH, St. Louis, USA, poměr 1:10 s destilovanou vodou) a nechala zaschnout. Vzniklý film zajišťuje lepší přilnavost buněk. Na vystydlá sklíčka jsem kápla fixovaný a čerstvý vzorek. Nechala jsem buňky sedimentovat, než kapka na třívrstevném povlaku poly-l-lysinu téměř vyschla. Následně jsem vzorky odvodnila v acetonové řadě (30, 50, 70, 90, 95% po 10 min., 99, 100% po 20 min.). Sklíčka jsem poté nalepila oboustrannou lepící vodivou páskou na bločky, které pak byly pokryty vrstvou 3 nm zlata (Bal-Tec SCD 050). Vzorky jsem pozorovala pomocí skenovacího elektronového mikroskopu 22

21 JOEL 6380 LV. Buňky fixované glutaraldehydem se držely více v koloniích než buňky z nakapaného vzorku bez fixace. 2.4 Výběr tělových šupin pro geometrickou morfometriku Šupiny nacházející se na anteriorním konci buňky mají nejdelší osténky, směrem k posteriornímu konci buňky se velikost osténků zmenšuje (Siver 1999). Změnu délky osténků v závislosti na pozici na buňce jsem využila pro spolehlivé určení tělových šupin, které jsem pro studium tvarové variability potřebovala. Nafotila jsem několik desítek buněk na SEM a rozdělila je na 3 části (obr 2.1). Na šupinách jsem téměř po celé délce buňky změřila osténky, osténky u kaudálních šupin jsem do analýzy nezahrnula (obr 2.2). V každé části buňky jsem v programu AnalySIS 3.2 (Soft Imaging System ) náhodně změřila 100 šupin, celkem bylo tedy proměřeno 300 osténků. Na základě párového t-testu (PAST, ver. 2.14; Hammer et al. 2001) jsem následně naměřené hodnoty statisticky vyhodnotila. Všechny tři skupiny se od sebe na 5% hladině spolehlivosti (α=0,05) signifikantně lišily (1. a 2. skupina: p= 1,184E -18, 2. a 3. skupina: p= 1,755E -22, 1. a 3. skupina: p=5,629e -42 ). Průměrná délka osténků u 1. skupiny byla 1,13 µm, u 2. skupiny 1,37 µm a u 3. skupiny 1,56 µm. Obr. 2.1: Rozdělení buňky na 3 skupiny. 1. sk. kaudální část s posteriorními šupinami, 2. sk. prostřední část s tělovými šupinami, 3. sk. apikální část s anteriorními šupinami. U každé skupiny je zaznamenaná průměrná velikost osténků. 23

22 Obr. 2.2: Měření osténků na buňce S. echinulata. Na TEM jsem následně fotila 45 náhodně vybraných šupin při stejném zvětšení krát. Při pořizování fotografií jsem v programu item 5.1 (Olympus Soft Imaging Solutions GmbH) ihned osténky měřila. Jelikož jsou pro morfometrické analýzy potřebné pouze tělové šupiny daného druhu, zaznamenala jsem v programu Microsoft Office Excel 2003 údaje o měření a vybrala jsem prostřední skupinu šupin s určitým intervalem rozměrů osténku. Poté jsem fotografovala potřebné množství šupin, jejichž osténky spadaly do daného intervalu, aby byl výsledný počet tělových šupin 30. Jelikož se na některých místech vyskytovaly velice zajímavé druhy křemičitých chrysomonád, začala jsem studovat i diverzitu této skupiny na jednotlivých lokalitách. Při mikroskopování jsem fotografovala kromě šupin Synura echinulata i šupiny ostatních zástupců krěmičitých chrysomonád vyskytujících se na síťkách. 2.5 Geometrická morfometrika (GM) GM se zabývá popisem a statistickou analýzou tvaru a jeho proměnlivosti za využití landmarkových metod. V současné době téměř všechny morfometrické studie založené na landmarkových metodách analyzují tvar s postupy založenými na 24

23 Kendalově tvaroprostoru a Prokrustovské vzdálenosti nebo na jejich aproximaci tangenciálním prostorem (Adams et al. 2004). Tvarové změny lze pak na původních objektech zrekonstruovat a biologicky interpretovat. Metody GM jsou pevně zakotvené ve statistické teorii o tom, jak je definován tvar. Kendall (1977) ho definuje jako veškerou geometrickou informaci, která zůstává v uspořádání landmarků po odstranění vlivů, které se týkají pozice, velikosti a rotace objektu. Důležitou součástí analýz GM je Prokrustovská superimpozice, při které dochází k přeložení jednotlivých objektů přes sebe tak, aby se vyloučila variabilita, která je způsobená rotací a velikostí a zůstaly tak pouze rozdíly týkající se pouze tvaru (Zelditch et al. 2004). Superimpozici jsem provedla za pomoci programu tpsrelw 1.45 (Rohlf 2007b), který dále spočítá z matice deformační energie hlavní warpy, na které je každý objekt poté projektován. Tím se pak získají parciální warpy (Rohlf 2007b). Po superimpozici lze tvarové změny popsat pomocí metody ohebných pásků (tzv. thin-plate spline). Dokáže vizualizovat změny, ke kterým dochází v oblastech mezi landmarky (Zelditch et al. 2004). V této práci jsem zvolila stejně jako Pichrtová (2009) landmarkové metody, které jsou založené na definování homologických bodů na význačných místech studovaných struktur. Fotografie šupin jsem pomocí programu tpsutil 1.38 (Rohlf 2006a) převedla do formátu tps, následně jsem v programu tpsdig 2.12 (Rohlf 2008) umístila landmarky. Jejich poloha na šupině je znázorněna na obr Celkově je na tělové šupině umístěno 32 homologických bodů, z toho je 7 pevně daných landmarků a 25 semilandmarků, jejichž umístění není pevné. Poloha semilandmarků je dána dvěma sousedními body, mezi nimiž kloužou v průběhu superimpozice (Bookstein 1997). Obr. 2.3: Umístění pevných landmarků (modře) a semilandmarků (červeně) na šupině. 25

24 V minulosti byla použita geometrická morfometrika např. k analyzování tvarové variability v závislosti na různých environmentálních parametrech (př. Neustupa & Hodač 2005, Neustupa et al. 2008). Pomocí metod geometrické morfometriky se podařilo McManus et al. (2011) odlišit jednu linii Pediastrum duplex od ostatních dvou skupin. Na základě molekulární fylogenetické analýzy a SEM se rozděluje Pediastrum duplex na tři fylogenetické linie. Autoři se snažili docílit toho, aby se jednotlivé linie rozlišily na základě morfologie. Studium tvaru potvrdilo molekulární fylogenetická data a oddělilo skupinu, která obsahovala izoláty s Pediastrum duplex var. gracillimum, jako samostatnou taxonomickou jednotku. Morfologií křemičitých šupin za pomoci GM se v minulosti zabývali například Řezáčová & Škaloud (2005), Neustupa & Němcová (2007), Pichrtová & Němcová (2008), Neustupa et al. (2010), Němcová et al. (2010), Řezáčová-Škaloudová et al. (2010) či Pichrtová & Němcová (2011) Symetrizace Při pozorování šupin v SEM lze snadno zjistit, kde je levá a pravá strana šupiny, jelikož strana šupiny přiléhající k plazmatické membráně je hladká (Příloha 3, obr. 82). V TEM, kde je šupina prozářena, ale nebylo možné odhadnout, kde se nachází levá a pravá strana, i když jsou šupiny v důsledku fluktuační asymetrie mírně nesouměrné (Pichrtová 2009). Provedla jsem proto symetrizaci šupin podle Klingenberga et al. (2002). Zkopírovala jsem souřadnice všech landmarků a v novém datovém souboru jsem jejich x-ové souřadnice vynásobila (-1). Pak jsem v programu PAST ver (Hammer et al. 2001) přeznačila čísla landmarků tak, aby si navzájem odpovídaly jako dvojice podle symetrie na podélné ose šupiny. Poté byla provedena Prokrustovská superimpozice původních a nových objektů a následně jsem ze získaných Prokrustovských souřadnic vypočítala průměr odpovídající bilaterálně symetrickým šupinám (Klingenberg et al. 2002). Kromě programu PAST ver jsem využila u tohoto postupu ještě WordPad a Microsoft Office Excel

25 2.6 Statistické analýzy Partial least squares analysis (PLS) Jedná se o relativně novou statistickou metodu GM, která se používá ke studování kovariance mezi dvěma bloky dat, kdy oba bloky mohou zahrnovat tvar nebo se analyzuje vztah mezi tvarem a jinou proměnnou (př. morfometrické proměnné) nebo vztah mezi tvarem a měřením biomechanických či ekologických faktorů (Zelditch et al. 2004, Rohlf & Corti 2000, Rüber & Adams 2001). Výsledkem analýzy je soubor vektorů, které jsou lineární kombinací dat. Vektory jsou párovány tak, že první vektor proměnné je párován s vektorem prvního parciálního warpu, druhý s druhým atd. Zatímco párované vektory spolu korelují, ostatní korelované nejsou. Lineární kombinace jsou tvořené tak, aby nové proměnné maximalizovaly kovarianci mezi dvěma původními soubory dat (Tabachnick & Bookstein 1990). I když je počítaná korelace mezi vektory poměrně vysoká, musí se zkontrolovat, kolik procent kovariance je párovým vektorem vysvětleno. Vysoká korelace totiž nemusí být důležitá, pokud vysvětluje nízké procento kovariance (Rohlf 2006b). Tato metoda byla v minulosti použita v několika studiích, kdy autoři zjišťovali kovarianci mezi tvarem a trofickými proměnnými (Adams & Rohlf 2000), mezi tvarem a proměnnými prostředí (Corti et al.1996, Viscosi et al. 2009) nebo mezi dvěma bloky které zahrnovaly tvar (Rohlf a Corti, 2000; Arnqvist a Rowe 2002, Navarro et al. 2004). PLS analýza je známá nejen v oblasti biologie, ale je rozsáhle využívána např. v sociálních nebo klinických studiích (Zelditch et al. 2004). V případě této práce jsem využila PLS analýzu pro studium kovariance, kdy jeden blok zahrnuje tvar (vstupní data pro analýzu jsou skóry na parciálních warpech) a druhý data o prostředí. Nicméně, přírodní podmínky reprezentují multifaktoriální prostředí, kde působí na organismy velké množství různých proměnných. Změřit všechny faktory je nereálné, vybrala jsem pro tuto práci proměnné, jejichž měření pro mě bylo dostupné, a u kterých lze předpokládat, že budou nejvíce ovlivňovat tvar šupin. Naměřené hodnoty environmentálních proměnných (ph, konduktivita, průměrná měsíční teplota, celkový dusík TN, celkový fosfor TP, amoniak NH 3 ) a nadmořská výška s GPS koordinátami jsou uvedeny v tabulce v Příloze 5. Pro analýzu jsem proměnné standardizovala podle vzorce Z=(x-µ)/σ, kde x reprezentují původní surová 27

26 data, µ je průměr ze skupiny a σ směrodatná odchylka. Pro zhodnocení dat jsem využila program tpspls 1.18 (Rohlf 2006b) Mnohorozměrná regrese Touto analýzou jsem testovala vztah mezi tvarem šupin a parametry prostředí, které vysvětlovaly nejvíce variability (regrese tvaru na ph a nadmořskou výšku). Jako závislé proměnné jsem použila Prokrustovské souřadnice. Mnohorozměrnou regresi jsem provedla v programu tpsregr 1.34 (Rohlf 2007a). Výsledkem této analýzy je procento variability vysvětlené daným regresním modelem. Pomocí permutačních testů (1000 permutací) na hodnotách statistik Wilksovo λ a Goodallovo F byla testovaná signifikance těchto modelů Permutační MANOVA Tato neparametrická forma mnohorozměrné analýzy variance (implementovaná funkcí adonis) umožňuje rozklad variability dat, v tomto případě rozklad tvarové variability mezi studované proměnné. Je součástí statistického balíku vegan, R- project (R Development Core Team 2011, Oksanen et al. 2011). Do analýzy vstupovaly 2 soubory dat. První datový soubor obsahoval tvarové proměnné (RW skóry na prvních 15 osách), druhý soubor představoval proměnné prostředí (ph, vodivost, průměrná teplota, TN, TP, NH 3, nadmořská výška). Provedla jsem čtyři analýzy dat: i) první soubor obsahoval tvarové proměnné pro všechny studované šupiny (celkem 870 šupin z 29 lokalit), ve druhém souboru představovala každá šupina jeden řádek, šupiny ze stejné lokality měly stejné environmentální proměnné, každá z 29 lokalit byla kódována odlišným písmenem. ii) soubory dat podobné jako i), jen lokality byly kódovány na základě jejich GPS koordinát. Vznikla tak prostorová proměnná spatial, díky níž lze zjistit, jaký vliv mají vzdálenosti lokalit na tvar šupin. iii) první soubor obsahoval průměrné tvary pro jednotlivé lokality (tj. 29 průměrných tvarů), ve druhém souboru představoval každý průměrný tvar dané lokality jeden řádek s jedinečnými proměnnými prostředí, lokality byly kódovány na základě jejich GPS koordinát. iv) viz iii) lokality jsem zde kódovala pouze do dvou skupin české a a akvitánské b. 28

27 2.6.4 Mantelův test Mantelovým testem (Mantel 1967) jsem testovala, zda jsou si šupiny z bližších lokalit tvarově podobnější. Tento test umožňuje zjistit, jestli existuje korelace mezi dvěma určitými maticemi dat. První matice zahrnovala euklidovské vzdálenosti mezi skóry na RW osách, druhá matice představovala geografické vzdálenosti jednotlivých lokalit. Mantelův test jsem provedla v programu PAST (Hammer et al. 2001). Signifikance byla posouzena na základě permutačního testu (5 000 permutací). 2.7 Míra tvarové variability (morfologická disparita) Pro kvantifikování rozdílů ve tvarové variabilitě křemičitých šupin mezi jednotlivými lokalitami jsem použila vzorec pro výpočet morfologické disparity (Zelditch et al. 2004): kde Di je Prokrustovská vzdálenost mezi jednotlivými objekty (šupiny) a průměrným (konsensuálním) tvarem celé skupiny. N je počet objektů. Pro kvantifikování přínosu každé jednotlivé šupiny k celkové morfologické disparitě souboru se počítá částečná morfologická disparita: Prokrustovské vzdálenosti jsem spočítala pomocí programů tpssmall 1.20 (Rohlf 2003) a Microsoft Office Excel

28 3. Výsledky a diskuse 3.1 Výsledky geometrické morfometriky Celková tvarová variabilita Celkovou tvarovou variabilitu jsem popsala pomocí analýzy relativních warpů. Analýza ukázala základní trendy v morfologické variabilitě celého souboru 870 šupin z 29 lokalit. První tři osy vysvětlily 74,2 % celkové variability. První relativní warp (RW1) popisuje 37,45 % celkové variability, druhý RW2 21,72 % a třetí RW3 15,03 % variability. Deformační mřížky zobrazují příslušné trendy v extrémních hodnotách jednotlivých os (obr. 3.1). Podél první a druhé osy dochází ke změně tvaru od prodlouženého po zakulacený. Mění se také rozložení sekundární labyrintózní struktury. Dochází též ke zvětšování štítu. Třetí relativní warp je spojený s velikostí štítu a šířkou přehnutého okraje. Obr. 3.1: Deformační mřížky znázorňující trendy morfologické variability přírodních populací S. echinulata na 29 lokalitách v extrémních hodnotách prvních třech RW os. 30

29 3.1.2 Partial least squares analysis (PLS) Dvoublokovou metodou PLS jsem zjišťovala kovarianci mezi tvarem šupin a environmentálními proměnnými. Byly zvoleny čtyři dimenze, první osa vysvětlila 49,9 % kovariance, druhá osa vysvětlila 39,1 % kovariance. Korelace byly u první osy 0,532, u druhé osy 0,449. S první osou korelují ph a nadmořská výška, lze tedy vyvodit, že v přírodních podmínkách mají největší vliv na tvar křemičitých šupin právě tyto dva parametry. Výsledkem této analýzy je ordinační diagram s vektory jednotlivých proměnných (obr. 3.2). Na deformačních mřížkách jsou znázorněny tvarové trendy přírodních populací S. echinulata v závislosti na ph a nadmořské výšce. Z obr. 3.2 lze vyvodit celkový trend morfologické změny. Se zvyšujícím se ph se zesiluje přehnutý okraj, rozšiřuje se labyrintózní sekundární struktura a dochází k redukci štítu šupiny. Trend změny tvaru v závislosti na rostoucí nadmořské výšce ukazuje na zmenšování labyrintózní sekundární struktury, expanzi štítu šupiny a tendenci mít užší přehnutý okraj. Obr. 3.2: Ordinační diagram PLS analýzy. Lokality jsou označené čísly, jejich název je v tabulce v Příloze 6. Pro větší názornost je míra deformace na mřížkách zvýrazněna dvakrát oproti skutečnosti. 31

30 3.1.3 Regrese tvaru na ph a nadmořskou výšku Regresní model závislosti tvaru šupin na ph v přírodních podmínkách vysvětlil 3,4 % variability (Wilksovo λ = 0,45, permutační p = 0,001; Goodallovo F = 30,33, permutační p = 0,001). Celkový trend morfologické změny se zvyšujícím se ph ukazuje na zesílení přehnutého okraje, rozšiřování labyrintózní sekundární struktury a redukci štítu šupiny (obr. 3.3). ph 4,6 ph 8,7 Obr. 3.3: Deformační mřížky znázorňující trendy morfologické změny se zvyšujícím se ph. Pro větší názornost je míra deformace zvýrazněna třikrát oproti skutečnosti. Regresní model závislosti tvaru na nadmořské výšce vysvětlil 5,8 % variability ve tvaru (Wilksovo λ = 0,30, permutační p = 0,001; Goodallovo F = 53,13, permutační p = 0,001). Celkový trend morfologické změny s rostoucí nadmořskou výškou ukazuje na zmenšování labyrintózní sekundární struktury a expanzi štítu šupiny (obr. 3.4). Ve vyšších nadmořských výškách mají šupiny tendenci mít užší přehnutý okraj. 19 m n. m m n. m. Obr. 3.4: Deformační mřížky znázorňující trendy morfologické změny s rostoucí nadmořskou výškou. Pro větší názornost je míra deformace zvýrazněna třikrát oproti skutečnosti. 32

31 3.1.4 Rozklad tvarové variability mezi studované proměnné Na rozklad tvarové variability mezi studované proměnné jsem použila analýzu permutační MANOVA (implementovanou funkcí adonis - package vegan, R-project (R Development Core Team 2011, Oksanen et al. 2011). V tabulkách je znázorněn celkový vliv daných proměnných, resp. kolik procent variability vysvětlují. Čistý efekt udává čistě daný vliv proměnné po odečtení vlivu všech ostatních faktorů. Nejvíce variability ve tvaru šupin (u celkového souboru 870 šupin) vysvětlila překvapivě lokalita (10,77 %), i čistý vliv této proměnné (7,26 %) vyšel signifikantně (p<0,001). Z environmentálních proměnných nejvíce variability vysvětlily ph, průměrná teplota a nadmořská výška (hodnoty jsou ale pouze necelá procenta viz tab. 3.1). Všechny sledované proměnné z tab. 3.1 vysvětlily celkem 11,57 % variability. Díky prostorové proměnné spatial, která zohledňuje lokality na základě GPS koordinát (tab. 3.2), lze zjistit, jakou část variability ve tvaru šupin lze vysvětlit vzájemnou vzdáleností lokalit. Čistý vliv této proměnné vysvětlil 4,7 % tvarové variability (p<0,001). Proměnné z tab. 3.2 vysvětlily celkem 9,03 % variability. proměnná celkový vliv čistý efekt % p % p ph 0,9 0,001 *** 0,17 0,065. cond 0,74 0,001 *** 0,07 0,782 avrt 0,88 0,001 *** 0,11 0,377 TN 0,71 0,001 *** 0,11 0,402 TP 0,76 0,001 *** 0,09 0,672 NH 3 0,27 0,001 *** 0,08 0,678 altitu 0,77 0,001 *** 0,18 0,051. lok 10,77 0,001 *** 7,26 0,001 *** Tab. 3.1: Výsledky analýzy adonis na celkovém souboru 870 šupin. avrt = průměrná teplota, TN = totální dusík, TP = totální fosfor, NH 3 = amoniak, altitu = nadmořská výška, lok = lokality kódovány pomocí písmen. Každá lokalita je jedinečná. Každá od každé se liší stejnou měrou. (znázorněná hladina signifikance: 0 *** 0,001 ** 0,01 * 0,05. 0,1 1) 33

32 proměnná celkový vliv čistý efekt % p % p ph 0,9 0,001 *** 0,26 0,002 ** cond 0,74 0,001 *** 0,26 0,002 ** avrt 0,88 0,001 *** 0,33 0,001 *** TN 0,71 0,001 *** 0,35 0,001 *** TP 0,76 0,001 *** 0,6 0,001 *** NH3 0,27 0,001 *** 0,43 0,001 *** altitu 0,77 0,001 *** 0,44 0,001 *** spatial 6,1 0,001 *** 4,7 0,001 *** Tab. 3.2: Výsledky analýzy adonis na celkovém souboru 870 šupin. avrt = průměrná teplota, TN = totální dusík, TP = totální fosfor, NH 3 = amoniak, altitu = nadmořská výška, spatial = lokality na základě GPS koordinát. Lokality se liší na základě vzájemné geografické vzdálenosti. (znázorněná hladina signifikance: 0 *** 0,001 ** 0,01 * 0,05. 0,1 1) Proměnné z tab. 3.3, kdy byly do envir zahrnuty všechny měřené environmentální proměnné, vysvětlily celkem 8,7 % variability. Čistý efekt u každé proměnné vyšel signifikantně (p<0,001). proměnná celkový vliv čistý efekt % p % p envir 2,99 0,001 *** 2,08 0,001 *** altitu 0,77 0,001 *** 0,44 0,001 *** spatial 6,08 0,001 *** 5,09 0,001 *** Tab. 3.3: Výsledky analýzy adonis na celkovém souboru 870 šupin. envir = ph + cond + TN + TP + NH 3 ), altitu = nadmořská výška, spatial = lokality na základě GPS koordinát. (znázorněná hladina signifikance: 0 *** 0,001 ** 0,01 * 0,05. 0,1 1) Nejvíce variability ve tvaru šupin (u průměrných tvarů pro jednotlivé lokality) vysvětlila konduktivita (14,5 %, p = 0,004). Čistý efekt této proměnné ale nevyšel signifikantně. Z dalších environmentálních proměnných nejvíce variability vysvětlily nadmořská výška (12,6 %, p = 0,006) a ph (10,8 %, p = 0,012). Lokalita vysvětlila 34

33 10,4 % variability (p = 0,013). Proměnné z tab. 3.4 vysvětlily celkem 44,8 % variability, u žádné z nich však čisté efekty nevyšly signifikantně. Nejvíce variability ve tvaru šupin vysvětlila překvapivě proměnná spatial (65,2 %, p = 0,046). Celkem vysvětlily proměnné z tab ,8 % variability, čistý vliv u žádné proměnné však také nevyšel signifikantně. Proměnné z tab. 3.6 vysvětlily celkem 85,5 % variability, čistý efekt u žádné proměnné nevyšel signifikantně. Procenta vysvětlené variability rozdělené do tří parametrů lze znázornit pomocí Vennova diagramu (obr. 3.5). proměnná celkový vliv čistý efekt % p % p ph 10,8 0,012 * 4,1 0,218 cond 14,5 0,004 ** 5,2 0,15 avrt 6,6 0,066. 1,7 0,635 TN 4,4 0,191 1,2 0,760 TP 7,5 0,047 * 2,1 0,513 NH 3 2,1 0,516 2,2 0,466 altitu 12,6 0,006 ** 4,8 0,173 lok 10,4 0,013 * 2 0,543 Tab. 3.4: Výsledky analýzy adonis na průměrném tvaru šupin. avrt = průměrná teplota, TN = totální dusík, TP = totální fosfor, NH 3 = amoniak, altitu = nadmořská výška, lok = lokality kódovány a české, b akvitánské. (znázorněná hladina signifikance: 0 *** 0,001 ** 0,01 * 0,05. 0,1 1) proměnná celkový vliv čistý efekt % p % p ph 10,8 0,016 * 1,4 0,605 cond 14,5 0,002 ** 3 0,286 avrt 6,6 0,054. 1,2 0,682 TN 4,4 0,144 0,4 0,977 TP 7,5 0,031 * 1,3 0,663 NH 3 2,1 0,451 2,3 0,407 altitu 12,6 0,003 ** 5,1 0,115 spatial 65,2 0,046 * 44 0,245 Tab. 3.5: Výsledky analýzy adonis na průměrném tvaru šupin. avrt = průměrná teplota, TN = totální dusík, TP = totální fosfor, NH 3 = amoniak, altitu = nadmořská výška, spatial = lokality na základě GPS koordinát. (znázorněná hladina signifikance: 0 *** 0,001 ** 0,01 * 0,05. 0,1 1) 35

34 proměnná celkový vliv čistý efekt % p % p envir 29,7 0,008 ** 15,2 0,2 altitu 12,6 0,001 *** 5 0,097. spatial 65,2 0,025 * 45,7 0,142 Tab. 3.6: Výsledky analýzy adonis na průměrném tvaru šupin. envir = ph + cond + TN + TP + NH 3 ), altitu = nadmořská výška, spatial = lokality na základě GPS koordinát. (znázorněná hladina signifikance: 0 *** 0,001 ** 0,01 * 0,05. 0,1 1) Obr. 3.5: Vennův diagram ukazující procenta vysvětlené variability rozdělené do tří parametrů: envir (ph + cond + TN + TP + NH 3 ), altitu = nadmořská výška, spatial = lokality Výsledky Mantelova testu Mantelovým testem jsem zjišťovala, zda mají bližší lokality tvarově podobnější šupiny. Byla prokázána signifikantní korelace (p hodnota = 0), avšak změna tvaru šupin v závislosti na vzdálenosti lokalit byla pouze nepatrná (r = 0,08161) Míra tvarové variability (morfologická disparita) Největší variabilitu ve tvaru jsem zaznamenala na lokalitě 9 v Brdech (6,30E -3, Příoha 7). Vysoké hodnoty se vyskytovaly i na lokalitách 3 (Marais du Cla; 4,32E -3 ), 13 (Brdy, mělká tůň; 4,80E -3 ) a 28 (Swamp; 4,72E -3 ). Na lokalitě v Brdech s největší morfologickou disparitou jsem zaznamenala výskyt teratogenních šupin. Malformace 36

35 jsou vidět na obr vznik částečné labyrintózní struktury s otvorem v bazální desce na proximální části šupiny (a) či různé částečné zdvojení šupin (b). Obr. 3.6: Teratogenní šupiny Synura echinulata nalezené v Brdech (lok. 9). Měřítko = 0,5 µm. 37

36 3.2 Diskuse geometrické morfometriky Analyzování šupin přírodních populací Synura echinulata pomocí metod geometrické morfometriky umožňuje nahlédnout do vztahů mezi tvarem šupin a proměnnými prostředí. Jelikož křemičité šupiny patří mezi důležité mikrofosilie, výsledky této práce by mohly pomoci hodnotit tvar šupin v paleoekologických rekonstrukcích. Pokud by měly totiž šupiny v určitých podmínkách prostředí určitý charakteristický tvar, daly by se z průměrného tvaru šupin odhadovat podmínky již zaniklých prostředí (př. teplota, ph, obsah živin). Nicméně, ukázalo se, že změny ve tvaru šupin u druhu S. echinulata závisí převážně na příslušnosti populace k dané lokalitě. Čím byly lokality vzdálenější, tím si byly šupiny S. echinulata méně podobné. To by mohlo poukazovat na geneticky podmíněnou variabilitu v rámci populací S. echinulata a stále tedy zůstává otázkou, jaké morfologické trendy jsou v přírodě spjaté s vlivem environmentálních podmínek na biogenezi šupin Celková variabilita Hlavní morfologické trendy u křemičitých chrysomonád mohou být spojovány s polohou šupin na buňce (Neustupa & Němcová 2007, Neustupa et al. 2010). Pichrtová (2009) eliminovala variabilitu na buňce Mallomonas tonsurata výběrem šupin s dómem, které se vyskytují pouze v apikální části buňky. Při hodnocení tvaru šupin se v této studii podařilo eliminovat šupiny z jiných částí buňky na základě metodiky popsané v kapitole 2.4. Pro analýzy jsem vybírala pouze tělové šupiny s určitou délkou osténku. Tento postup by mohl mít za důsledek například snížení morfologické disparity v porovnání se šupinami, které byly zkoumané v laboratorních podmínkách Vliv proměnných prostředí na tvar šupin - srovnání jednotlivých analýz Analýzou PLS bylo zjištěno, že v přírodě ovlivňuje tvar šupin Synura echinulata nejvíce ph a nadmořská výška. Nejvíce variability ve tvaru při jejím rozkladu mezi studované proměnné vysvětlila lokalita, která do analýzy PLS nebyla zahrnuta. 38

37 Metoda PLS umožňuje vizualizovat korelaci změny tvaru a změny proměnných prostředí. S první osou, která vysvětlila 49,9 % kovariance, byly korelovány parametry ph a nadmořské výšky. Z deformačních mřížek, které jsou výsledkem dvoublokové metody PLS, lze vyvodit celkový trend morfologické změny v závislosti na těchto dvou parametrech. Se zvyšujícím se ph se zesiluje přehnutý okraj, rozšiřuje se labyrintózní sekundární struktura a dochází k redukci štítu šupiny. Se zvyšující se nadmořskou výškou dochází k opačnému morfologickému trendu zužuje se přehnutý okraj, zmenšuje se labyrintózní sekundární struktura a zvětšuje se část štítu. Regresní model závislosti tvaru šupin na ph a nadmořské výšce ukazuje na stejné morfologické změny jako analýza PLS. Při rozkladu variability mezi studované proměnné jsem zjistila, jaký je celkový vliv daných proměnných. Při analýze všech 870 šupin nejvíce variability ve tvaru vysvětlila překvapivě lokalita (téměř 11 %). Z environmentálních proměnných nejvíce variability vysvětlily ph, průměrná teplota a nadmořská výška (hodnoty vyšly signifikantně, variabilita vysvětluje ale pouze necelá procenta). Míra vysvětlené tvarové variability je v tomto souboru dat nižší, protože změny tvaru u jednotlivých šupin jsou menší než změny tvaru u průměrů skupin. Tyto výsledky se dají vysvětlit buď tím, že jsem neměřila nějaký významný environmentální faktor, nebo tím, že populace na jednotlivých lokalitách jsou geneticky variabilní (zřejmě se u druhu vyskytuje určitá vnitropopulační variabilita, která není bezvýznamná). Jelikož podle mnohých předešlých pokusů představují ph, konduktivita, teplota a živiny nejvýznamnější faktory prostředí, je více pravděpodobná genetická vnitropopulační variabilita. V jednotlivých lokalitách zřejmě existují tvarově odlišené populace Synura echinulata. Čím jsou od sebe lokality vzdálenější, tím méně podobné jsou si šupiny S. echinulata svým tvarem (viz výsledky Mantelova testu). Při analýze průměrů šupin z jednotlivých lokalit vysvětlila lokalita 65,2 %, hladina signifikance ale nebyla tak vysoká (p = 0,0417). Z environmentálních proměnných nejvíce variability vysvětlily ph (10,8 %, p = 0,0095), konduktivita (14,5 %, p = 0,002) a nadmořská výška (12,6 %, p = 0,0031). Oproti analýze všech 870 šupin však čisté vlivy variability nebyly signifikantní, přesto se ale domnívám, že použití průměrného tvaru šupin v analýze lépe vystihuje realitu. Každému průměrnému tvaru odpovídá jedinečná série proměnných prostředí, zatímco při použití tvaru jednotlivých šupin sdílejí šupiny ze stejné lokality (celkem 30) stejné proměnné prostředí. 39

38 Původně jsme očekávali výrazný vliv teploty na tvar šupin Synura echinulata. Teplota prokazatelně ovlivnila morfologii křemičitých struktur u druhu Mallomonas crassisquama (Siver & Skogstad 1988). Byl také zjištěn vliv teploty na šupiny Mallomonas tonsurata, kdy se vzrůstající teplotou docházelo ke zkracování šupin, zatímco šířka se nezměnila, zároveň docházelo ke zvětšení plochy dómu (Gutowski 1996). Při studování tvarové variability Synura echinulata byl tento druh kultivován na zkříženém gradientu osvětlení a teploty (Němcová et al. 2010). Pomocí metod geometrické morfometriky byly od sebe čtyři studované skupiny signifikantně odlišeny. Skupina kultivovaná při dlouhodobém působení chladu a nízké světelné intenzity byla tvarově nejodlišnější, došlo k redukci labyrintózní struktury, která byla vykompenzována rozšířením přehnutého okraje. Pomocí metod geometrické morfometriky studovali v laboratorních podmínkách vliv teploty na změnu tvaru šupin Mallomonas kalinae a Synura curtispina také Řezáčová-Škaloudová et al. (2010). V závislosti na teplotě byly nalezeny určité tvarové trendy, značná tvarová variabilita však byla spojena s pozicí šupin na buňce. Pichrtová & Němcová (2011) zjistily obecný trend změny tvaru experimentálních populací Synura petersenii a Mallomonas tonsurata v závislosti na teplotě. Se zvyšující se teplotou došlo ke změně tvaru z okrouhlého na protáhlý. Zajímavým zjištěním tedy je neprokázaný vliv průměrné měsíční teploty na morfologii šupin Synura echinulata v přírodních podmínkách. Otázkou ale je, do jaké míry se liší vliv průměrné měsíční teploty a teploty v experimentálních podmínkách Tvarová variabilita šupin závislá na ph v přírodních a v laboratorních podmínkách Němcová & Pichrtová (2012) ve své studii sledovaly tvarovou variabilitu šupin S. echinulata na gradientu ph (3,5; 4,5; 5,5; 6,5; 7,5), v krajních hodnotách ph (3,5; 7,5) byl zaznamenán redukovaný růst. Byl zjištěn signifikantní vliv ph na tvar šupin (Wilksovo λ = 0,013, permutační p = 0,001; Goodallovo F = 30,0, permutační p = 0,001), regresní model vysvětlil 8,0 % variability. V této studii přírodních populací vysvětlil regresní model závislosti tvaru šupin na ph pouze 3,4 % variability (Wilksovo λ = 0,45, permutační p = 0,001; Goodallovo F = 30,33, permutační p = 0,001). Krajní 40

39 hodnoty ph zde byly 4,6 a 8,7. V laboratorní studii měl druh S. echinulata v nízkém ph (3,5) oválné šupiny s redukovaným štítem a rozšířenou labyrintózní strukturou. Šupiny kultivované v ph 4,5; 5,5 a 6,5 měly relativně stejný tvar, se vzrůstajícím ph byly zaoblenější. V nejvyšším ph 7,5 se šupiny odlišovaly od ostatních skupin svou větší šířkou, měly rozvinutý štít a redukovanou sekundární labyrintózní strukturu. Z deformačních mřížek regresního modelu závislosti tvaru šupin na ph v přírodních podmínkách lze vyvodit celkový trend morfologické změny se zvyšujícím se ph se zesiluje přehnutý okraj, rozšiřuje se labyrintózní sekundární struktura a dochází k redukci štítu šupiny. Srovnání deformačních mřížek z regresního modelu závislosti tvaru šupin na ph v laboratorních a přírodních podmínkách je vidět na obr V ph 4,5 je tvar šupin podobný, v přírodních podmínkách je však štít více rozvinutý. Morfologické trendy změny tvaru šupin v závislosti na ph se se vzrůstajícím ph v laboratorních a přírodních podmínkách liší v laboratorních podmínkách (na rozdíl od přírodních) dochází k redukci přehnutého okraje, redukci labyrintózní sekundární struktury a rozvinutí štítu. Mírně se lišící morfologické trendy v laboratorních podmínkách by mohly být zapříčiněné např. odstíněním vlivu jiných faktorů, které na šupiny v přírodních podmínkách působí. Obr. 3.6: Srovnání deformačních mřížek z laboratorních (A) a přírodních (B) podmínek (A - převzato z Němcová & Pichrtová 2012). Pro větší názornost je míra deformace zvýrazněna třikrát oproti skutečnosti. 41

40 3.2.4 Morfologické trendy spojené s ph Různé hodnoty ph ovlivňují morfologii organismů. Např. Neustupa & Hodač (2005) zjistili, že v zásaditějším médiu mají laloky okrajových buněk řasy Pediastrum duplex užší báze a svírají ostřejší úhel. U řasy Mougeotia byla v experimentálních podmínkách také prokázána rozdílná morfologie při jejím pěstování v odlišném ph (Arancibia-Avila et al. 2000). Hodnota ph je také jedním ze základních faktorů, které ovlivňují distribuci chrysomonád (Siver 1991, Siver 1995). Wee et al. (1991) studovali v laboratorních podmínkách vliv ph na růstovou rychlost u druhu Synura petersenii. Odlišné kmeny kultivovali v ph 5,5 8,5, všechny kmeny vykazovaly pozitivní růst, nejvyšší růstová rychlost byla u každého kmenu dosažena v jiném ph. Navíc se u zkoumaných šupin objevovaly zjevné morfologické rozdíly, které byly prokazatelné při kultivování v různých experimentálních podmínkách (Wee et al. 1991). Vlivem ph na velikost křemičitých šupin dvou kmenů Synura petersenii se zabývali Gavrilova et al. (2005) na základě metod tradiční morfometriky. Při pěstování kmenů v různém ph se měnila morfologie šupin, která byla kmenově specifická. U kmenu 960/3c došlo při kultivování v nízkém ph ke zmenšování šupin, zatímco u kmenu 960/1c se zmenšila velikost šupin v zásaditém médiu. Nelze tedy zobecnit, jakými změnami šupina prochází v závislosti na ph, jelikož změny závisí spíše na příslušnosti ke kmenu. Kynčlová et al. (2010) zkoumali kryptické linie Synura petersenii a zjistili, že se jedná o komplex druhů, který je odlišitelný molekulárně a současně i na základě unikátních kombinacích morfologických znaků šupin. Lze tedy předpokládat, že řada ekofyziologických studií ve skutečnosti patřila geneticky odlišným populacím a je třeba brát na tyto výsledky při různých interpretacích ohled (Pichrtová 2009). Na rozdíl od druhového komplexu S. petersenii je však S. echinulata monofyletická, všechny dosud sekvenované populace přísluší k témuž druhu. Pichrtová (2009) se ve své diplomové práci mimo jiné zabývala pěstováním dvou různých druhů chrysomonád (S. petersenii a M. tonsurata) v různém ph. Jeho vliv na tvar šupin při kultivaci S. petersenii ve 4 různých médiích (ph 5,5; 6,5; 7,5 a 8,5) nebyl tak výrazný (nebyly pozorovány žádné výrazné tvarové trendy). V nejvyšších hodnotách ph došlo ke zkrácení distální části šupiny a k posunutí póru zleva doprostřed 42

41 kýlu. U M. tonsurata (pěstovaný navíc v ph 4,5) se projevila míra deformace nejvíce v ph 8,5 kápě se v tomto ph již v podstatě nevytvářela a celé V-žebro bylo velice tenké. S rostoucím ph se šupiny rozšiřovaly, ramena V-žebra svíraly tudíž větší úhel. U křemičitých chrysomonád se v laboratorních podmínkách zdá být jako jeden z klíčových faktorů ovlivňujících tvar šupin ph, avšak nenalezla jsem žádný výrazný obecný morfologický trend, který by měly křemičité chrysomonády pěstované v experimentálních podmínkách v závislosti na ph s přírodními populacemi chrysomonád společný Míra tvarové variability (morfologická disparita) Větší morfologická disparita bývá pozorována u šupin chrysomonád ve stresových podmínkách (Pichrtová 2009, Němcová et al. 2010). Ve své práci zaznamenala Pichrtová (2009) při kultivaci chrysomonád v laboratorních podmínkách vzrůst tvarové variability ve vysoké teplotě u šupin M. tonsurata, S. sphagnicola a S. petersenii. U šupin S. echinulata se projevil vzrůst disparity při nízkých i vysokých teplotách. V suboptimálních podmínkách ph byl také zaznamenán nárůst tvarové variability. Ve studii Němcové et al se projevil nárůst morfologické disparity šupin S. echinulata, které byly pěstovány při stresových podmínkách při nízké intenzitě světla a chladu. Větší morfologická plasticita ve stresových podmínkách je pravděpodobně neadaptivním důsledkem narušení důležitých buněčných funkcí, které stojí za komplexním procesem biogeneze šupin (Pichrtová 2009). V této studii se vysoké hodnoty morfologické disparity vyskytovaly na lokalitách 3 (Marais du Cla), 13 (Brdy, mělká tůň) a 28 (Swamp). Zvýšenou morfologickou plasticitu zde mohou způsobovat např. nízké ph (Swamp), vysychavost lokality (Marais du Cla) či jiné stresové faktory vyskytující se v přírodních podmínkách. Největší variabilitu ve tvaru jsem zaznamenala na lokalitě 9 v Brdech, kde jsem nalezla i různě deformované šupiny. Gavrilova et al. (2005) zaznamenali teratogenní šupiny při kultivování S. petersenii v médiích s extrémními hodnotami ph. Abnormality mohou být výsledkem spojení několika templátů během procesu formování šupiny. Morfologické změny na šupinách odrážely reakci na stres, který byl způsobený extrémní kyselostí a zásaditostí média. Podobné teratogenní šupiny S. petersenii byly nalezeny na antropogenně znečištěných lokalitách (Gutowski 1989). 43

42 Na lokalitě v Brdech jsem nezaznamenala z naměřených environmentálních faktorů žádné stresové podmínky, které by nasvědčovaly vysoké morfologické disparitě a vytváření abnormálních šupin. Nicméně, přírodní podmínky jsou multifaktoriální prostředí, proto jsem stresové faktory, které na šupiny na této lokalitě působí, nemusela při měření postihnout. Brdy slouží jako vojenský prostor, kde využívají vojáci při svých cvičeních těžkou techniku. Navíc, lokalita 9 se vyskytuje v těsné blízkosti cesty, je tedy pravděpodobné, že přítomnost teratogenních šupin je ovlivněna antropogenním znečištěním. Ve své studii Němcová & Pichrtová (2012) diskutují, že zvyšující se tvarová plasticita Synurales v podmínkách, které se přibližují ph 9, není spojena se stresem, ale se snižující se dostupností rozpuštěného reaktivního křemíku. Křemík je pro chrysomonády využitelný ve formě slabé kyseliny monokřemičité (H 4 SiO 4 ) v podmínkách, kdy ph nepřekračuje hodnotu 9 (Reynolds 2006). Zvýšená tvarová variabilita spojená se stresovými podmínkami ph prostředí nebo redukovanou dostupností slabé kyseliny monokřemičité může snížit schopnost buněk vytvářet dokonale funkční křemičitou schránku. Buňky s nedokonalou křemičitou schránkou tak mohou být náchylnější k různým infekcím a parazitům a mohou být snadnější kořistí pro predátory (Němcová & Pichrtová 2012). Naměřené hodnoty ph se na lokalitách v této studii pohybovaly v rozmezí 4,6-7,0. Pouze na jedné lokalitě (Étang de Hardy) bylo naměřené ph 8,7. Za těchto podmínek, kdy se ph přibližovalo hodnotě 9 pouze na jedné lokalitě, nebyla předpokládána limitace rozpuštěným reaktivním křemíkem. Proto jsem tento environmentální faktor nezahrnula mezi měřené proměnné prostředí. Navíc, morfologická disparita na lokalitě Étang de Hardy (3,90E -3 ) nebyla tak vysoká, jako na některých jiných lokalitách s výrazně nižším ph. Ani vizuálně nebyla znát na šupinách S. echinulata z této lokality slabá silifikace, která by mohla být zapříčiněna sníženou dostupností rozpustné formy kyseliny monokřemičité ve vysokém ph (Reynolds 2006). Rozdílné výsledky pozorovala ve své práci Pichrtová (2009), kdy v laboratorních podmínkách při kultivaci v ph 8,5 docházelo u šupin Mallomonas tonsurata k slabé silifikaci. 44

43 3.3 Výsledky a diskuse floristické části Vzorky byly odebrány ze 37 lokalit (33 z ČR, 4 Akvitánie, Francie), které byly primárně určené k výzkumu křemičitých šupin Synura echinulata (mapa lokalit vyobrazena v Příloze 1, názvy lokalit jsou shrnuty v Příloze 5). Celkem jsem určila 84 druhů, které jsou zaznamenané v tabulce v Příloze Česká republika Celkem jsem determinovala 74 druhů křemičitých chrysomonád, z toho 54 Mallomonas, 7 Synura, 4 Spiniferomonas, 6 Paraphysomonas, 2 Chrysosphaerella, 1 Chrysodidymus. Nejméně druhů jsem nalezla v louži v Krušných horách, vyskytovaly se zde pouze 4 druhy (M. calceolus, S. echinulata, S. petersenii, Paraphysomonas vestita). Obdobně také na Swampu jsem určila jen 4 druhy (M. multisetigera, M. ouradion, M. papillosa, S. echinulata). Malé množství chrysomonád jsem zaznamenala také z lokalit Mechové jezírko, Černé jezero, lesní rybník na potoce Suchá Bělá, Pilská nádrž, tůň v Borkovických blatech 3, Vizír a Brdy (zarostlá tůň u cesty severně od Padrťských rybníků). Počet druhů na těchto místech nepřesáhl deset. Malý počet zástupců byl s největší pravděpodobností způsobený také tím, že na těchto místech byl odebírán pouze plankton. Při studiu šupin ze sedimentu by byl konečný výsledek počtu druhů na lokalitách jistě vyšší. Mě ale primárně zajímaly šupiny živých populací druhu Synura echinulata, proto jsem na těchto místech sediment neodebírala. Mechové jezírko v Krkonoších bylo již v minulosti zkoumáno v rámci výskytu křemičitých chrysomonád (Němcová et al. 2001). Byl zde nalezen pouze 1 druh (S. echinulata), naměřené ph bylo 5,4 a konduktivita měla hodnotu 35,5 µs.cm -1. Při mém odběru jsem na lokalitě determinovala 6 druhů (M. calceolus, M. flora, M. papillosa, M. striata, S. echinulata, S. petersenii). Hodnoty ph a konduktivity naměřené na lokalitě byly podobné jako v předešlé studii (ph 5,3; konduktivita 30 µs.cm -1 ). V Černém jezeru byly ve studii Němcové et al. (2003) nalezeny pouze 4 chrysomonády (M. caudata, S. echinulata, S. uvella, Ch. brevispina), při odebrání vzorku pro studium tvarové variability šupin S. echinulata jsem kromě tohoto zde již dříve nalezeného druhu nalezla pouze jiné zástupce (M. crassisquama, M. matvienkoae, 45

44 M. papillosa, S. echinulata, S. petersenii, S. sphagnicola). Naměřené hodnoty v minulé studii (ph 4,6; kond. 27 µs.cm -1 ) byly téměř totožné s hodnotami, které jsem zaznamenala v rámci této studie (ph 4,6; kond. 22 µs.cm -1 ). V tomto glaciálním oligotrofním jezeře s kyselým ph je výskyt M. crassisquama trochu neobvyklý, jelikož při ph menším než 5 se téměř nevyskytuje (Siver & Skogstad 1988). V minulosti byl také v rámci zkoumání křemičitých chrysomonád v Národním parku České Švýcarsko odebrán vzorek z lesního rybníku na potoce Suchá Bělá (Pichrtová & Veselá 2009). Pouze na této lokalitě bylo v minulosti nalezeno více zástupců (10) než při současné studii (7). Jelikož jsem odebírala pouze plankton na rozdíl od Pichrtové & Veselé (2009), které odebraly plankton i horní vrstvu sedimentu, mohl způsob odběru zapříčinit menší počet šupin ve vzorku. Naměřila jsem podobné hodnoty ph i konduktivity (současná studie ph 6,2; kond. 66 µs.cm -1, předešlá studie ph 5,8; kond. 64 µs.cm -1 ). Janatková & Němcová (2009) při průzkumu chrysomonád na Borkovických blatech odebraly vzorky ze 3 míst, kde determinovaly 14 zástupců včetně vzácných druhů M. conspersa, S. mollispina a M. retifera. Tyto druhy jsem na Borkovických blatech také nalezla, navíc jsem determinovala M. labyrinthina, který byl dosud známý pouze ze severoamerického kontinentu (Nicholls 1984a, Wujek & Wee 2006, Wujek & Wright 2006). Tento nález je první pro ČR. Dále jsem zde určila druh Paraphysomonas poteriophora, který byl v ČR nalezen také poprvé. Na Liberecku jsem odebrala vzorky celkem z 8 vodních ploch, kde jsem určila celkem 55 druhů křemičitých chrysomonád, v Kunratickém rybníku (lokalita č. 23) jsem nalezla celkem 41 druhů. Na Borkovických blatech jsem určila 37 druhů, Na Plachtě 33 druhů. Celkem bylo v těchto 3 oblastech na území ČR určeno 72 druhů křemičitých chrysomonád, proto se tato místa mohou přiřadit k tzv. hotspots, tzn. k lokalitám s mimořádně vysokým poměrem lokální ku globální diverzitě (Foissner 2006). Samozřejmě neexistují data, která by postihla celosvětovou diverzitu volně žijících sladkovodních protist, celkové druhové bohatství těchto organismů je neznámé, proto je velice těžké odhadnout poměr lokální ku globální diverzitě (Foissner 2006). V rámci chrysomonád lze ale říci, že se v České republice vyskytují místa, která reprezentují vysoké druhové bohatství těchto organismů. Z množství vzorků odebraných v Brdech se vyskytovala S. echinulata v 6 z nich, proto byl výzkum diverzity chrysomonád zaměřen na těchto 6 lokalit (Příloha 1, lokality 4-9). Bylo zde nalezeno celkem 32 taxonů, jejich počet se pohyboval od 7 do 20. Z řádu 46

45 Synurales bylo nalezeno 27 druhů: 22 Mallomonas, 5 Synura a z řádu Paraphysomonadales 5 druhů: 2 Paraphysomonas, 2 Spiniferomonas a jeden druh Chrysosphaerella. Nejméně druhů (7) bylo určeno z Pilské přehrady (M. calceolus, M. crassisquama, M. multisetigera, M. papillosa, S. echinulata, S. sphagnicola, Paraphysomonas vestita). Nejvíce zde byly zastoupeny druhy S. echinulata a S. sphagnicola, které preferují kyselé ph. Bylo zde nalezeno také několik šupin M. crassisquama, který je považován za jednoho z nejrozšířenějších zástupců chrysomonád a má svůj nejčastější výskyt v ph 6,6-6,9 (Siver 1989). Hodnota ph naměřená na této lokalitě však byla výrazně nižší (4,9). To svědčí o široké ekologické valenci tohoto druhu ve vztahu k ph. V Pilské přehradě převažují křemičité chrysomonády, které se řadí podle dosud publikovaných autekologických údajů mezi acidofilní až acidobiontní druhy (S. sphagnicola, M. calceolus, M. multisetigera). Nejvíce druhů (20) se vyskytovalo v Horním padrťském rybníku, který byl v minulosti již studován. Kalina et al. (2000) zde objevili celkem 5 druhů, kromě S. uvella jsem všech těchto 5 taxonů také znovu nalezla. Determinovala jsem však čtyřikrát větší množství šupin (20). Na lokalitě č. 4 jsem určila několik šupin M. kalinae, který byl popsán z malé rašelinné tůně Ostrov v národním parku České Švýcarsko (Řezáčová 2006). Oba dva odběry byly provedeny v dubnu, v časovém rozmezí jedenácti let. Velice hojné zastoupení zde měly druhy S. petersenii a S. echinulata, která v předešlé studii na lokalitě nebyla vůbec nalezena. Příčinou jejího výskytu by mohla být snížená hodnota ph. Kalina et al. (2000) zaznamenali ph 7, zatímco ph naměřené v současnosti mělo hodnotu 6,2. Údaj o konduktivitě z odběru Kaliny et al. (2000) bohužel není k dispozici. Nejčastěji se ve vzorkách na území České republiky vyskytovaly S. echinulata (32 vzorků), Synura petersenii (30 vzorků), M. papillosa (27 vzorků), Chrysosphaerella brevispina (22 vzorků), Mallomonas heterospina (21 vzorků) a Paraphysomonas vestita (21 vzorků). Naopak k nejméně často nacházeným druhům, které jsem ve vzorkách určila pouze jednou, patří Mallomonas clavus, Synura mollispina, Spiniferomonas cornuta, Paraphysomonas butcheri, Paraphysomonas gladiata, Paraphysomonas poteriophora a Paraphysomonas takahashii. Mezi druhy nalezené v České republice poprvé patří Mallomonas cf. jejuensis, Mallomonas labyrinthina, Mallomonas madagascariensis, Mallomonas palaestrica, Chrysosphaerella coronacircumspina a Paraphysomonas poteriophora. Mallomonas cf. 47

46 jejuensis, Mallomonas labyrinthina a Mallomonas madagascariensis tímto nálezem ztratily status asijského, severoamerického a afrického endemita. V Pekelských rybníkách v jihovýchodní části Liberce jsem objevila nový druh Mallomonas decora sp. nov. Chemicko-fyzikální parametry měřené na lokalitách, nadmořská výška a GPS souřadnice lokalit jsou shrnuty v tabulce v Příloze 5. Nejnižší hodnotu ph jsem naměřila na Swampu (lokalita č. 23; 4,6), zatímco nejvyšší hodnota ph byla zaznamenaná Na Plachtě v tůni č. 9 (lokalita č. 33; 6,8). Nejnižší hodnotu konduktivity (22 µs.cm -1 ) jsem naměřila v Černém jezeru (lokalita č. 10), nejvyšší hodnotu 420 µs.cm -1 v Kunratickém rybníku (lokalita č. 18) Francie, Akvitánie V Akvitánii jsem odebrala vzorky ze 4 lokalit, v mokřadu východně od Lac du Bourg jsem provedla odběr dvakrát, v únoru a v květnu Celkem jsem determinovala 44 druhů křemičitých chrysomonád (35 Mallomonas, 6 Synura, 1 Paraphysomonas, 1 Chrysosphaerella, 1 Chrysodidymus). Počet zástupců v tůních se pohyboval v rozmezí druhů. Druhy M. multisetigera, M. papillosa, S. echinulata, S. mamillosa a S. uvella jsem nalezla ve všech pěti odebraných vzorcích. Naměřené chemicko-fyzikální parametry prostředí jsou zaznamenány v tabulce v Příloze Charakteristika vybraných zástupců křemičitých chrysomonád Chrysodidymus synuroideus Prowse Příloha 2, obr. 45 Kosmopolitní druh, který se skládá z dvoubuněčných kolonií, vyskytuje se pouze roztroušeně (Kristiansen & Preisig 2007). Výskytem tvarové různorodosti papil na základní desce se zabývají ve své studii Wee et al. (1993). Šupiny mohou obsahovat na svém přehnutém okraji velké díry (Siver & Lott 2000). Jedná se o acidobiontní druh, na Floridě byl nalezen na lokalitách s ph menším než 5,4 (Siver & Lott 2006). Výskyt druhu: lokality č. 27, 30, 35 48

47 Chrysosphaerella coronacircumspina Wujek & Kristiansen Příloha 2, obr Šupiny tohoto druhu jsem determinovala na několika lokalitách na Liberecku. Jedná se o široce rozšířený druh, jeho výskyt byl zaznamenán na mnoha místech na Zemi (př. Nicholls 1981, Siver 1988a, Kristiansen et al. 1990, Vyverman & Cronberg 1993, Siver et al. 2005, Řezáčová & Škaloud 2005, Wujek & Bicudo 2004, Sueldo et al. 2010). V ČR byl však nalezen poprvé. Siver (1988b) zaznamenal výskyt tohoto druhu v širokém rozmezí ph (5,6 9,1). Výskyt druhu: lokality č. 14, 15, 19 Mallomonas alphaphora Preisig Příloha 2, obr. 3 Několik šupin jsem determinovala ze tří vzorků z Akvitánie. Naměřené ph na lokalitách se pohybovalo v rozmezí 6,9 8,7, konduktivita µs.cm -1. První nález tohoto druhu byl zaznamenán ze západní Austrálie (Preisig 1989), dále byl nalezen v jihovýchodní Austrálii (Furlotte et al. 2000). Díky nálezu z Akvitánie (Němcová et al. 2012), kde byl zaznamenán jeho častý výskyt, ztratil status australského endemita. Výskyt druhu: lokality č. 34, 35, 38 Mallomonas conspersa Dürrschmidt Příloha 2, obr. 6 M. conspersa byl popsán z lokality poblíž jezera Whapo na Novém Zélandu (Dürrschmidt 1986). Tento druh byl v ČR nalezen na Borkovických blatech (Janatková & Němcová 2009), ve dvou tůních na této lokalitě jsem M. conspersa znovu determinovala. Dále jsem nalezla šupiny v Pekelských rybníkách na Liberecku. Janatková & Němcová (2009) diskutují rozdíly mezi tímto druhem a M. retifera, jehož šupiny jsou velice podobné. Podobnost mezi druhy zmiňuje již Siver (1991). Výskyt druhu: lokality č. 1, 2, 13, 14, 15, 16 Mallomonas crassisquama (Asmund) Fott Patří mezi nejrozšířenější a nejčastěji nalézané druhy. Výskyt tohoto druhu v závislosti na ph se pohybuje v rozmezí 5,5 9,3, je proto charakterizován jako ph 49

48 indiferentní, při ph menším než 5 se téměř nevyskytuje (Siver & Skogstad 1988). Optimální ph pro výskyt tohoto druhu je 6,6 a 6,9 (Siver 1989). V experimentálních podmínkách měl M. crassisquama optimální růst v ph 4 6 (Lee et al. 2007). Ekologii M. crassisquama shrnuje ve své studii Siver Druh se na sledovaných lokalitách vyskytoval v rozmezí ph 4,6 6,9. Nejnižší ph jsem naměřila na lokalitě č. 10, nejvyšší na lokalitě č. 35. Častý výskyt tohoto druhu jsem zaznamenala v rybníkách na Liberecku a na lokalitách v Brdech. Spolu s tělovými šupinami jsem nalezla i posteriorní šupiny s osténkem, typické pro M. crassisquama. Determinace tohoto druhu je však často obtížná, šupiny jsou podobné silně silifikovanému M. acaroides. Jedná se pravděpodobně o komplex druhů. Výskyt druhu: lokality č. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 22, 35 Mallomonas eoa Takahashi in Asmund & Takahashi Příloha 2, obr. 9 Nález jsem zaznamenala ve třech vzorkách z Brd a v jednom vzorku z Akvitánie. Naměřené rozmezí ph bylo 5,6 6,3; hodnoty konduktivity se pohybovaly mezi µs.cm -1. Patří mezi široce rozšířené druhy, vyskytuje se v Evropě, Severní, Střední a Jižní Americe, Asii a Austrálii (Kristiansen a Preisig 2007). Výskyt druhu: lokality č. 6, 7, 8, 36 Mallomonas guttata Wujek Příloha 2, obr. 11 Je široce rozšířený druh, nejčastěji nalézán v tropických oblastech (Cronberg 1989, Kristiansen 2002, Menezes et al. 2005, Vigna et al. 2005, Siver & Lott 2006). V Akvitánii se šupiny vyskytovaly hojně na lokalitě 35. Nálezy na dalších lokalitách z této oblasti jsou zaznamenané ve studii Němcová et al. (2012). Výskyt druhu: lokality č. 35, 38 Mallomonas cf. jejuensis Kim & Kim Příloha 2, obr Tento druh byl popsán v roce 2010 ze 2 bezejmenných rybníků na Jeju Island v Jižní Korei (Kim & Kim, 2010). Do této doby byl značen jako endemický druh. V ČR jsem velice podobné šupiny M. jejuensis nalezla v hojném množství na Liberecku na 50

49 lokalitách 15 a 16. Několik šupin bylo určeno i z nejjižnějšího Kunratického rybníku (lokalita č. 20). Mallomonas jejuensis patří do serie Mangoferae (sekce Torquatae). Na štítu tělních šupin z lokalit na ostrově Jeju je patrná ornamentace tvořená malými papilami. Okraj štítu je lemován několika kruhovými až elongátními depresemi (1-6). V rybníkách na Liberecku je patrný rozdíl v počtu děr na štítu tělních šupin. Deprese jsou tvarově, velikostně i početně velice různorodé. Variabilitu struktur na štítu lze přisuzovat rozdílným ekologickým parametrům na dvou od sebe velice vzdálených odběrových místech. Naměřené ph v ČR bylo nižší (6,0 6,2) než na lokalitách ostrova Jeju (6,6 7,9), na rozdíl od konduktivity, která byla v rybníkách na Liberecku výrazně vyšší ( µs.cm -1 ) než na lokalitách na ostrově (37,4 90,6 µs.cm -1 ). Límcové šupiny (collar scales) jsou totožné. Ve studii Neustupy a Řezáčové (2007) byla nalezena šupina, která byla určena jako M. mangofera var. sulcata (obr. 6 ve zmiňované studii). Tato šupina je však shodná se šupinami, které jsem determinovala jako Mallomonas cf. jejuensis (Příloha 2, obr. 72). M. mangofera var. sulcata je charakteristický přítomností rýžek, které se táhnou podél okraje štítu šupiny (Kristiansen 2002). Je tedy možné, že se jedná o shodné druhy, které bych určila na základě morfologie ostatních šupin nalezených v ČR jako M. cf. jejuensis. Tento druh byl v ČR nalezen poprvé. Výskyt druhu: lokality č. 15, 16, 20 Mallomonas kalinae Řezáčová Příloha 2, obr. 15 Nalezla jsem několik šupin v tůni Borkovických blat, v zarostlé tůni u Padrťských rybníků v Brdech a v Kunratickém rybníku na Liberecku. Naměřené ph bylo v rozmezí 6,2 6,6; konduktivita měla široké rozpětí mezi µs.cm -1. Tento druh byl nově popsán z malé rašelinné tůně Ostrov v Národním parku České Švýcarsko (Řezáčová 2006). V minulosti byl nalezen také např. v Huťském rybníku v Novohradských horách (Janatková & Němcová 2009), v této studii byly provedeny odběry i z tůní Borkovických blat, M. kalinae zde však nebyl zaznamenán. Výskyt druhu: lokality č. 2, 4, 18 51

50 Mallomonas labyrinthina Nicholls Příloha 2, obr. 16 Poprvé byl popsán z Ontaria, Kanada (Nicholls 1984a), dosud byl známý pouze ze severoamerického kontinentu (Wujek & Wee 2006, Wujek & Wright 2006). Několik šupin jsem objevila na dvou lokalitách na Borkovických blatech, tudíž tento druh ztrácí status severoamerického endemita. Naměřené ph zde bylo 6,5 a 6,6; konduktivita 162 a 143 µs.cm -1. Výskyt druhu: lokality č. 1, 2 Mallomonas lelymene K. Harris & D. E. Bradley Příloha 2, obr. 17 Široce rozšířený druh s roztroušeným výskytem, je zaznamenaný z Evropy, Severní a Jižní Ameriky, východní Asie (Kristiansen & Preisig 2007). Calado & Craveiro (1995) zaznamenali výskyt druhu v eutrofních vodách bohatých na organické látky. Řezáčová (2005) uvádí ve své diplomové práci výskyt tohoto druhu nově pro ČR z tůně v okolí horního toku Lužnice (ph 6,7; vodivost 207 µs.cm -1 ). Naměřené ph na lokalitách s výskytem tohoto druhu se pohybovalo v rozmezí 5,6 6,6. Výskyt druhu: lokality č. 1, 2, 25, 27, 30, 31, 32, 36 Mallomonas madagascariensis Hansen & Kristiansen Příloha 2, obr Poprvé byl objeven na ostrově Madagaskar (Hansen & Kristiansen, 1995). Nálezem šupin, které byly v ČR určené poprvé, ztrácí status afrického endemita. Tento druh jsem nalezla v pěti zatopených depresích na lokalitě Na Plachtě v Hradci Králové. Nejpočetnější zastoupení šupin bylo v tůni č. 27. Ve zbylých jsem determinovala pouze jednu nebo dvě šupiny. Naměřené ph v těchto tůních bylo nižší (5,6 6,3) než na lokalitách na Madagaskaru (6,5 8,3). Také konduktivita byla nižší (32 68 µs.cm -1 ). Na madagaskarských lokalitách se pohybovala v rozmezí µs.cm -1. Výskyt druhu: lokality č. 25, 27, 28, 30, 31 Mallomonas mangofera K. Harris & D. E. Bradley Příloha 2, obr Jedná se o druh s kosmopolitním rozšířením (Kristiansen & Preisig 2007). Ve studii Kima & Kima (2011) se ve vzorcích vyskytoval v jarních, letních i podzimních 52

51 odběrech. Šupiny jsem nalezla ve dvou vzorkách z Liberecka, kde bylo naměřeno v obou případech ph 6,2 a konduktivita 400 a 420 µs.cm -1. Taxonomií skupiny Mallomonas mangofera z lokality v Chile se ve své studii zabývá Dürrschmidt (1983). Výskyt druhu: lokality č. 18, 19 Mallomonas mangofera var. reticulata (Cronberg) Kristiansen Příloha 2, obr. 22 Tento druh jsem nalezla ve dvou akvitánských tůních s naměřeným ph 5,6 a 6,9 a konduktivitou 126, 224 µs.cm -1. Na štítu jsou papily spojeny krátkými žebry a tvoří retikulátní strukturu. Tím se odlišuje var. reticulata od nominální variety Mallomonas mangofera var. mangofera (Cronberg 1989). Hlavní rozšíření se nachází v tropech a subtropech (Cronberg 1989, Siver & Vigna 1997, Hansen 1996, Neustupa & Řezáčová 2007, Saha & Wujek 1990, Vigna & Escobar 1999, Couté & Franceschini 1998). První nález z temperátní oblasti z Akvitánie zaznemenali Němcová et al. (2012). Výskyt druhu: lokality č. 35, 36 Mallomonas palaestrica Hansen, Johansen & Skovgaard Příloha 2, obr Jedná se o evropského endemita, nálezy jsou uvedené ze severozápadní Evropy (Kristiansen 2002). Druh poprvé nalezený v mělkém rybníku severně od Copenhagenu (Hansen et al. 1993) jsem determinovala na několika lokalitách na Liberecku. Tento zaznamenaný nález je první pro Českou republiku. Naměřené ph se zde pohybovalo v rozmezí 6,01 6,3; konduktivita µs.cm -1. Výskyt druhu: lokality č. 13, 14, 15, 16, 18, 19 Mallomonas phasma K. Harris & D. E. Bradley Příloha 2, obr. 29 Několik šupin jsem nalezla v Akvitánii v mokřadu východně od Lac du Bourg. Naměřené ph zde bylo 7,0; konduktivita 189 µs.cm -1. Jedná se o vzácného evropského endemita. První nález pochází z jihovýchodní Anglie, kde byl nalezen v mělkých rašelinných tůních (Harris & Bradley 1960), podruhé byly šupiny nalezeny po více než 50 letech z lokalit nacházejících se v Akvitánii, kde byly nalezeny a popsány posteriorní šupiny (Němcová et al. 2012, tato práce). 53

52 Výskyt druhu: lokalita č. 34 Mallomonas prora Dürrschmidt Příloha 2, obr. 33 Šupiny tohoto druhu jsem nalezla na 6 lokalitách v rozmezí ph 5,6 6,8 a konduktivity µs.cm -1. Jedná se o druh s bipolárním rozšířením, výskyt je zaznamenán z Evropy, Severní a Jižní Ameriky a z východní Asie (Kristiansen & Preisig 2007). První záznam z České republiky pochází z aluviální tůně horní Lužnice (Řezáčová et al. 2004). Výskyt druhu: lokality č. 13, 14, 18, 25, 27, 33 Mallomonas tubulosa Barreto Příloha 2, obr. 39 Poprvé byl popsán z malého rybníku ze severního Maďarska (Barreto 2001). V ČR byl nalezen v malé tůni na Swampu (Němcová 2010). Tento druh jsem v ČR zaznamenala na dvou lokalitách, v Akvitánii na třech místech. Celkové rozpětí ph bylo 5,6 7,0 a konduktivity µs.cm -1. Němcová et al. (2012) determinovali v Akvitánii šupiny ve čtyřech vzorcích, byla nalezena dokonce celá buňka. Anteriorní a posteriorní konce buňky jsou pokryté šupinami nesoucími dóm (umístěné subapikálně) a šupinami s dómem na kterých je výrazné křídlo (umístěné apikálně). Dómové šupiny nesou osten. Výskyt druhu: lokality č. 11, 22, 34, 35, 36 Synura echinulata Korshikov Příloha 2, obr. 40, Jedná se o široce rozšířený druh. Kromě lokality 33 jsem tento druh nalezla ve všech odběrových místech. Rozpětí ph na lokalitách s výskytem tohoto druhu bylo 4,6 8,7, naměřená konduktivita se pohybovala mezi µs.cm -1. Výskyt druhu: lokality č. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38 Synura mamillosa Takahashi Příloha 2, obr. 41 Široce rozšířený druh, výskyt je znám z Evropy, Severní a jižní Ameriky, východní Asie a Austrálie (Kristiansen & Preisig 2007). Zaznamenané jsou nálezy 54

53 z tropů (př. Cronberg 1989, Menezes et al. 2005, Vigna et al. 2005), Řezáčová & Škaloud (2005) udávají častý výskyt tohoto druhu spolu se S. sphagnicola. Tento druh jsem zaznamenala ve všech odebraných vzorkách z Akvitánie v širokém rozpětí ph (5,6 8,7) a konduktivity ( µs.cm -1 ). Výskyt druhu: lokality č. 34, 35, 36, 37, 38 Synura mollispina (J.B.Petersen et J.B.Hansen) L. S. Péterfi & Momeu Příloha 2, obr. 42 Jedná se o široce rozšířený, ale roztroušeně se vyskytující druh, který byl již v minulosti nalezen na Borkovických blatech (Janatková & Němcová 2009). Několik šupin jsem na lokalitě č. 2 na Borkovických blatech také zaznamenala. Naměřené ph bylo 6,6; konduktivita 143 µs.cm -1. Výskyt tohoto druhu je zaznamenán ze Severní a Jižní Ameriky a z Evropy (Kristiansen & Preisig 2007). Gretz et al. (1983) determinovali šupiny z Rogers Lake a Marshall lake (ph 8,1 a 7,5; kond. 110 µs.cm -1 ) v Arizoně, Barreto (2005) nalezla tento druh v malém lesním rybníku (ph 6,6; kond. 150 µs.cm -1 ) v Maďarsku. Výskyt druhu: lokalita č. 2 Paraphysomonas poteriophora (Moestrup & Kristiansen) Vørs Dřívější nálezy jsou zaznamenané např. z Německa (Hickel & Maaβ 1989), z Anglie (Finlay & Clarke 1999). V jednom vzorku z tůně Borkovických blat jsem objevila jednu šupinu. Naměřené ph mělo hodnotu 6,6, konduktivita 143 µs.cm -1. Jedná se o první zaznamenaný nález pro ČR. Výskyt druhu: lokalita č. 2 55

54 3.3.4 Popis nového druhu Mallomonas decora sp. nov. Mallomonas decora Kreidlová & Němcová sp. nov. Příloha 2, obr series Doignonianae, section Torquatae typová lokalita: Pekelské rybníky (50 44'21.0"N, 15 6'38.4"E), lokalita č. 15 (Příloha 2, obr. e) etymologie: druhové jméno decora vyjadřuje krásný, skvělý, půvabný, zdobený a vztahuje se k výrazné ornamentaci šupiny V Pekelských rybníkách jsem nalezla šupiny rodu Mallomonas, které jsem definovala jako nový druh. V Pekelském rybníku (lokalita č. 15) bylo nalezeno nejvíce šupin této malomonády, na EM síťce jsem pozorovala dokonce rozpadlou buňku s ostny (Příloha 3, obr. 63), kde je vidět uspořádání jednotlivých typů šupin tvořících schránku. Na lokalitách č. 14 a 16 jsem nalezla pouze několik šupin v sedimentu. Na typové lokalitě jsem naměřila ph 6,0 a konduktivitu 203 µs.cm -1. Hodnoty ph na lokalitách s výskytem M. decora se pohybovaly v rozmezí 6,0-6,2, hodnoty konduktivity mezi µs.cm -1. Kromě typové lokality byl tento druh nalezen na území Portugalska (Calado & Craviero 1995) a určen jako M. pumilio var. pumilio (obr. 3.7). Mallomonas decora sp. nov. patří do sect. Torquatae, pro kterou jsou charakteristické tripartitní šupiny (collar, body a rear scales). Buňky jsou malé (16 8,2 µm), protáhle elipsoidního tvaru. Límcové šupiny - collar scales (3,2 3,7 2,1 2,3 µm) jsou lichoběžníkového tvaru (Příloha 3, obr ) s dobře vyvinutým kulovitým dómem, který je zakončený silným, zašpičatělým vrcholem. Na povrchu dómu jsou patrná žebra, která vytvářejí retikulární strukturu. Vrchol dómu je ornamentován několika žebry, někdy jsou zde rozpoznatelné malé papily uspořádané do řady (Příloha 3, obr. 57). Štít je pokrytý žebry, které jsou na dorzální straně podobně jako u tělových šupin příčně orientované, směrem k centrální části se žebra větví a vytvářejí retikulární strukturu. Někdy je tato retikulární síť vyvinutá na celém štítu šupiny a vytváří komůrky, jejichž počet je velmi variabilní. Na bazální desce jsou dobře rozeznatelné póry. Na štítu šupiny v blízkosti submarginálního žebra je rozmístěno 7-16 zřetelných pórů, které nejsou na SEM fotografiích rozpoznatelné. Submarginální žebro je dobře vyvinuté na dorzální straně, na ventrální straně chybí. Přehnutý okraj je hladký, 56

55 v proximální části na ventrálním okraji přechází v sérii krátkých vzpěr. Na dorzální straně těsně pod dómem tvoří přehnutý okraj nápadný zaoblený výčnělek. Tělové šupiny - body scales (2,6 3,4 1,0 2,2 µm) jsou kosodelníkové, bez dómu, lehce asymetrické (jeden anteriorní okraj je delší než druhý). Centrální část šupin má 9-12 rovnoměrně rozmístěných příčných žeber, které mohou vytvářet jednoduše se větvící strukturu. Bazální deska obsahuje malé póry, které jsou mezi jednotlivými žebry viditelné vždy ve dvou řadách. Na bazální desce se podél posteriorního submarginálního žebra vyskytuje 7-10 zřetelných pórů (Příloha 3, obr 54). Na anteriorním okraji šupiny se nachází nápadných žeber, která navazují na některá žebra z centrální oblasti šupiny (štítu). Žebra anteriorního okraje šupiny jsou umístěna blíže u sebe než žebra na štítu. Posteriorní okraj šupiny je úzký a hladký. Posteriorní šupiny - rear scales (1,5 2,6 1,1 1,6 µm) jsou více asymetrické a menší než tělové šupiny, je na nich patrná stejná ornamentace (Příloha 3, obr. 59,60). Na anteriorním konci mají krátký ostének (délka vždy menší než 0,2 µm). Ostny (3,6 3,8 µm) jsou hladké, lehce zakřivené (Příloha 3, obr. 63). Mallomonas decora se nejvíce podobá druhu Mallomonas dickii (Nicholls 1982). Oba dva tyto druhy mají na štítu tělových šupin patrná příčná žebra, která se mohou větvit. U M. dickii však dosahuje počet žeber vyšších hodnot (12-22). U M. decora se pohybuje v rozmezí U obou druhů jsou na anteriorním okraji šupiny výrazná žebra. Na rozdíl od M. dickii se u M. decora mezi těmito žebry nevyskytují póry. Límcové šupiny (collar scales) M. decora mají na rozdíl od M. dickii nápadný dóm, na štítu žebra splývají v nápadnou retikulaci, zatímco u M. dickii jsou žebra příčně orientovaná v horní části šupiny a šikmo paralelně ve spodní části. Tyto dva druhy se od sebe liší také velikostí, buňky i šupiny M. decora dosahují větších rozměrů. Podle délky osténků posteriorních šupin se řadí zástupci sekce Torquate do dvou skupin, osténky z první skupiny dosahují velikosti do 16 µm, zatímco druhá skupina má velikost osténků kratší než 3 µm (Harris 1970, Asmund & Cronberg 1979). Osténky posteriorních šupin (rear scales) M. decora měří méně než 0,2 µm, proto se řadí do 2. skupiny stejně jako M. dickii s rozměry menšími než 1 µm (Nicholls 1982). M. decora je také podobný M. ocalensis (Siver 2002), oba dva druhy mají malé elipsoidní buňky. Na štítu tělových šupin se vyskytují příčná žebra, délka osténku u posteriorních šupin je v obou případech vždy menší než 0,2 µm. 57

56 Tělové šupiny M. decora se odlišují od M. ocalensis hlavně tloušťkou příčných žeber. M. decora obsahuje příčná žebra stejné tloušťky, zatímco M. ocalensis obvykle vytváří strukturu, kde se silné žebro postupně ztenčuje nebo se střídají silná a tenká příčná žebra. Rozdíl je také v počtu žeber, u M. ocalensis je jich více (15-19). M. ocalensis má na rozdíl od M. decora dobře vyvinuté anteriorní submarginální žebro, které je ornamentováno řadami malých papil. Anteriorní okraj i žebro M. decora překrývají nápadné vzpěry (žebra) navazující na některá žebra z bazální desky. Obr. 3.7: Mallomonas decora určený jako M. pumilio var. pumilio (převzato z Calado & Craviero 1995). 58