POSTUP ELEKTROFORÉZY LIPOPROTEINŮ PRO : Interlab G26

Transkript

1 POSTUP ELEKTROFORÉZY LIPOPROTEINŮ PRO : Interlab G26 Kit Ref.: SRE 606K- SRE 621K Účel použití Kity na elektroforézu lipoproteinů SRE606K a SRE621K jsou určeny pro separaci lipoproteinů v lidském séru pomocí elektroforézy na deskách s agarózovým gelem. Vizuálním prohlížením paternu se detekují abnormality, včetně odchylek proužků nebo výskytu zvláštních proužků. Densitometrie paternu umožňuje relativní kvantifikaci zón lipoproteinů. Kit je určen pro použití na plně automatickém přístroji Interlab G26. Shrnutí Lipoproteiny jsou oběhové makromolekulární komplexy, které transportují lipidy do různých tkání, kde vykonávají své metabolické funkce. Lipoproteiny mají kulovitý tvar a obsahují triglyceridy a estery cholesterolu v obalu molekuly, na povrchu s fosfolipidy a volným cholesterolem. Na povrchu se také nacházejí specifické proteiny nazývané apolipoproteiny (např. Apo A, Apo B, Apo C), které vážou lipidy. Lipoproteiny byly klasifikovány podle svých fyzikálních a chemických vlastností. Ultracentrifugace umožňuje separovat lipoproteiny na různé frakce, podle jejich měrné hmotnosti, nazývané chylomikrony, lipoproteiny s vysokou desitou (high density lipoproteins -HDL), lipoproteiny se střední densitou (intermediate density lipoproteins- IDL), lipoproteiny s nízkou densitou (low density lipoproteins -LDL), lipoproteiny s velmi nízkou densitou (very low density lipoproteins -VLDL). Kromě LDL lipoproteinů, které obsahují pouze jeden typ apolipoproteinu, obsahují další třídy lipoproteinů více než jeden typ apolipoproteinů, jejichž procentuální zastoupení se liší podle třídy lipoproteinu. Elektroforéza lipoproteinových frakcí, na deskách s agarózovým gelem při alkalickém ph, vede k tomu, že po aplikaci zůstanou čtyři proužky, označované: alfa (anoda), prebeta, beta a chylomikrony (na aplikačním bodu). Každá frakce obsahuje různou kombinaci cholesterolu, glyceridů, esterů cholesterolu a proteinů 2-3, jak ukazuje následující tabulka: Anoda (+) Komponenta ELEKTROFORETICKÁ MOBILITA (densita) Katoda (-) Alfa (HDL) Pre-Beta (LDL) Beta (LDL) Chylomikrony aplikační bod Cholesterol 20 % % 45 % 2 5 % Triglyceridy 1 5 % % % % Fosfolipidy 26 % 22 % 22 % 2 5 % Proteiny % 10 5 % 10 5 % 1 2 % Tato distribuce lipoproteinů odráží interakce mezi plazmatickými lipidy a lipoproteiny. Poruchy metabolizmu lipidů se označují dyslipoproteinémie a zahrnují hypercholesterolémii nebo zvýšené plazmatické triglyceridy a/nebo cholesterol. Tyto odchylky jsou spojeny s modifikovaným paternem lipoproteinů při elektroforéze a za určitých patologických podmínek mohou poskytovat důležité klinické informace, jelikož mnoho poruch lipoproteinů vede ke stejnému profilu koncentrací lipidů. Klasifikace podle Fredricksona a Leese 1 popisuje typy dyslipoproteinémie, které jsou uvedené v tabulce níže, a jejichž paterny zobrazují různé profily ve vztahu ke zvýšeným triglyceridům a cholesterolu. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 1 / 14

2 Typ dislipoproteinémie Typ I Typ IIa Typ IIb Typ III Typ IV Typ V Hlavní zvýšená frakce Chylomikrony Beta Beta a Pre-Beta IDL, Pre-Beta Pre-Beta, slabě chylomikrony Chylomikrony, Pre-Beta Při elektroforéze lipoproteinů je pozornost také namířena na souvislost dyslipoproteinémie a aterosklerózy a jejich spojení s metabolizmem karbohydrátů. Princip Elektroforéza separuje různé třídy lipoproteinů podle jejich specifické mobility v elektrickém poli. S tímto postupem firmy Interlab jsou lipoproteiny separovány, v alkalickém ph elektroforézou na desce s agarózovým gelem, do zón. Po ukončení elektroforetické separace proužků se deska s agarózovým gelem denaturuje, barví pomocí Sudan Black, odbarvuje a vysušuje. Paterny jsou pak skenovány a densitometrický výsledek se uloží společně s grafem. DODÁVANÝ MATERIÁL Kit Ref.: SRE606K 130testů, 13vzorků na gel Kit Ref.: SRE621K 260 testů, 26 vzorků na gel Ref. Popis Ks SFE 168M Agarózový gel na desce 10 SCE 155M Houbičky s pufrem (2 ks) 10 SRE 606A Barvivo Sudanova čerň (30ml) 1 SAE 606M jednorázové držáky na vzorek (10 ks) 1 SCE 602C Blotery C (10 ks) 1 CD CD s návody 1 Ref. Popis Ks SFE 200M Agarózový gel na desce 10 SCE 161M Houbičky s pufrem (3 ks) 10 SRE 606A barvivo Sudanova čerň (30ml) 1 SAE 606M jednorázové držáky na vzorek (10 ks) 1 SCE 602C Blotery C (10 ks) 1 CD CD s návody 1 Varování: Tyto soupravy jsou určeny pouze na diagnostiku in vitro! Pro dosažení dobrých výsledků používejte vždy všechny reagencie ze stejné soupravy a držte se přesně instrukcí v pracovním postupu. Další materiál nutný, ale nedodaný Ref. Popis Množství SRE201M Destain Solution Pack 6X100 ml SRE150M Promývací roztok pro aplikátory (80ml) pro Interlab G26 série 33 a Microgel 1 Mikropipety pro objemy 100 l, 1000 l; pipety pro objem 10 ml. Destilovaná voda. Fyziologický roztok (0.9% váh.obj., NaCl) Etylalkohol (je doporučen roztok o koncentraci 99% obj. ) Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 2 / 14

3 POPIS 1. Agarózové desky Složení: Každá deska obsahuje agarózu v Tris-Barbital pufru s konzervantem a stabilizátorem. Tento produkt není klasifikován jako nebezpečný podle direktiv 67/548/CEE a 1999/45/CE a/nebo EC Regulation/1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Příprava k použití: Jednotlivě zabalené desky jsou připraveny k přímému použití. Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). Desky nezchlazujte ani nezmrazujte! DŮLEŽITÉ: desky skladujte v horizontální pozici Desky jsou stabilní do data expirace uvedeného na štítku. Nepoužívejte desky po jejich datu expirace Známky znehodnocení: Přítomnost kapaliny v obalu s gelem. Nestejnoměrná tloušťka gelu znamenající dehydrataci. Kontaminace bakteriemi či houbami. 2. Houbičky nasycené pufrem Složení: Alkalický barbital -Tris pufr se stabilizátorem a konzervačním činidlem, alkalickým ph. Tento produkt není klasifikován jako nebezpečný podle direktiv 67/548/CEE a 1999/45/CE a/nebo EC Regulation/1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Příprava k použití: Určeno k přímému použití. Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). Houbičky jsou stabilní do data expirace uvedeného na štítku. Nepoužívejte po datu expirace Známky znehodnocení: Nepoužívejte, pokud je balení otevřeno nebo pokud jsou houbičky vysušené. POZN. Občas se mohou vyskytnout černé nebo hnědé skvrny na houbičkách; jejich přítomnost nemá vliv na kvalitu výsledků 3. Roztok barviva sudanová čerň Složení: Koncentrovaný alkoholový roztok černi Sudan Black. Tento produkt je klasifikován jako nebezpečný podle direktiv EC Regulation 1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Výrobek proto vyžaduje bezpečnostní list, který je v souladu s ustanoveními nařízení ES 1907/2006 a následnými změnami. Veškeré dodatečné informace týkající se rizika pro zdraví a / nebo životní prostředí jsou uvedeny v bodech 11 a 12 tohoto listu. H302 Zdraví škodlivý při požití Příprava k použití: Těsně před započetím analýzy si připravte pro každý držák gelu 250 ml roztoku barviva Sudan Black k přímému použití Objem 250 ml pracovního roztoku Sudan Black umožní obarvit jednu gelovou desku. Není doporučeno použít stejný roztok pro použití na více než jedné gelové desce. Důležité: Dobře protřepejte koncentrovaný roztok černi Sudan Black před použitím. Je doporučeno přidávat složky přesně v tomto pořadí: 125 ml etylalkoholu s 1,25 ml roztoku černi Sudan Black, 120 ml destilované vody a 5 ml fyziologického roztoku (0.9 % NaCl). Míchejte roztok, pokud přidáváte složky. Po přidání poslední složky míchejte 10 minut. Roztokem sudanové černi připraveným k použití naplňte tank na barvení č. 3. Uchovávání a stabilita: Uchovávejte za pokojové teploty (15 až 30 C). Koncentrovaný roztok je stabilní do data expirace na štítku. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 3 / 14

4 DŮLEŽITÉ: pracovní roztok je stabilní až 12 hodin za pokojové teploty (15 C až 30 C). Nepoužitý roztok na konci dne zlikvidujte. Známky zkažení: Žádné 4. Roztok k promývání aplikátorů vzorků (nepoužívá se u Interlab G26 nové série) Složení: Vodný roztok detergentu s obsahem konzervantu. Tento produkt není klasifikován jako nebezpečný podle direktiv 67/548/CEE a 1999/45/CE a/nebo EC Regulation/1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Příprava k použití: Určeno k přímému použití Známky znehodnocení: Přítomnost zakaleného precipitátu. Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). Roztok je stabilní do data expirace. 5. Jednorázový zásobník na vzorky Složení: Jednorázové plastikové destičky s jamkami pro vzorky. Příprava k použití: destičky jsou připraveny k přímému použití. Skladování: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). 6. Blotovací papíry Složení: Tenké listy blotovacího papíru, pro odstranění nadbytečného roztoku pufru z agarózové desky. Příprava k použití: Blotovací papír je určen k přímému použití Skladování: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). 7. Odbarvovací roztok (Kód.: SRE201M; NENÍ OBSAŽEN V SOUPRAVĚ) Složení: Koncentrovaný vodný roztok kyseliny citronové. Tento produkt je klasifikován jako nebezpečný podle direktiv EC Regulation 1272/2008 (CLP) (a následných předpisů a dodatků). Výrobek proto vyžaduje bezpečnostní list, který je v souladu s ustanoveními nařízení ES 1907/2006 a následnými změnami. Veškeré dodatečné informace týkající se rizika pro zdraví a / nebo životní prostředí jsou uvedeny v bodech 11 a 12 tohoto listu. H319: Způsobuje vážné podráždění očí. P264: umyjte.,, důkladně po manipulaci. P280: Používejte ochranné rukavice / ochranné brýle / obličejový štít. P305 + P351 + P338: PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: opatrně promyjte vodou po dobu několika minut. Pokud máte kontaktní čočky a lze s nimi jednoduše manipulovat, vyndejte je. Pokračujte ve vyplachování. P337 + P313: Jsou-li oči podrážděny: Vyhledejte lékařskou pomoc / ošetření. Příprava k použití: 1ml SRE201A zřeďte do 1l destilované vody. Skladování a stabilita: Skladujte za pokojové teploty (15 až 30 C). Roztok je stabilní do data expirace uvedeného na štítku. Zředěný odbarvovací roztok je stabilní 2 týdny při pokojové teplotě. Známky znehodnocení: Přítomnost zakalení a černých oxidativních skvrn. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 4 / 14

5 Způsob likvidace a zvláštní rizika K zajištění bezpečné likvidace postupujte podle místních předpisů, berte však v úvahu i všechny informace o bezpečné likvidaci použitého materiálu uvedené v Reagents Safety Sheet (bezpečnostní list), který je k dispozici u servisního technika. Další upozornění na zvláštní rizika ve vztahu k použití a likvidaci prostředku, včetně zvláštních ochranných opatření, poskytuje materiál Reagents Safety Sheet (bezpečnostní list), který je k dispozici u servisního technika. Odběr vzorků, ošetření a uchovávání Vzorky by měly být odebrány za použití laboratorní techniky v souladu se správnou laboratorní praxí (GLP). Pro testování by měla být použity čerstvé vzorky séra. Vzorky by měly být stanoveny ve stejný den jako je odběr. Vzorky je možno uchovávat při 2 až 8 C až po 48 hodin po odběru. Vzorky nedoporučené k použití Nepoužívejte hemolyzované vzorky séra. Nepoužívejte staré vzorky séra. Delší skladování zvyšuje podíl migrace frakce pre-beta. INTERLAB G26 série 33 Jak spustit analýzu Interlab G26 automaticky provede všechny kroky analytického procesu: aplikaci vzorků na agarózovu desku, elektroforetickou migraci, denaturaci gelu, barvení a odbarvování gelu, koncové sušení gelu a densitometrické odečítání. Pro start analýzy použijte Elfolab/Interlab G26 software. Pozorně si přečtěte manuál k přístroji Interlab G26 před startem analýzy. I. Nastavení elektroforetické analýzy 1. Naplňte nádoby odpovídajícími roztoky a objemy: Tank Roztok Objem (l) Destain Pracovní odbarvovací roztok 5 STAIN 3 Naředěný Roztok Sudan Black 0,21 2. Zapněte Interlab G Použijte Elfolab/Interlab G26 program pro zvolení typu elektroforetické analýzy. 4. Zkontrolujte, že aplikátory jsou ve správných pozicích. (Obr.1) 5. Naneste 6 ml destilované vody do kontejneru WASHING - DISTILLED WATER Obr Naneste 6 ml roztoku pro promývání aplikátorů (SRE150M) do příslušného kontejneru WASHING Obr. 2 DŮLEŽITÉ: Před startem nové analýzy vždy naplňte promývací kontejnery čerstvými tekutinami! 7. Umístěte jeden či dva jednorázové zásobníky na vzorky (Kód. SAE606M) do pozice SAMPLE. (Obr.3) 8. Na každý zásobník umístěte kovový rámeček (Obr.3) 9. Naneste vzorky dle návodu: (Obr.3) Kit Ref. SRE606K: Naneste 30 l od každého vzorku do jamek na pozici 1 až 13. Kit Ref. SRE621K: Naneste 30 l od každého vzorku do jamek v obou řadách od pozice 1 až 26. Poznámka: V každém testu je doporučeno nanést také kontrolní roztok séra. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 5 / 14

6 II. Příprava migrační komory (Obr. 4) 1. Vyjměte migrační komoru z přístroje. 2. Otevřete hliníkovou folii, která obsahuje houbičky nasycené pufrem. DŮLEŽITÉ: S houbičkami manipulujte pomocí čisté pinzety či v čistých rukavicích. Při používání soupravy SRE606K, vložte dvě houbičky nasycené pufrem do okrajových slotů. Nevkládejte houbičky do centrálních slotů. Při používání soupravy SRE621K, vložte tři houbičky nasycené pufrem do všech tří slotů. 3. Vložte držák s houbičkami dovnitř přístroje a lehce zatlačte, zajistíte tak správné spojení komory s přístrojem. DŮLEŽITÉ: Po každém běhu přístroje houbičky vždy odstraňte! III. Příprava agarózové desky (Obr. 5) 1. Položte 1 blotovací papír C (Kód.:SCE602C) na povrch agarózové desky pro odstranění nadbytečného pufru, ujistěte se, že papír dobře přilnul k povrchu gelu a pak jej rychle odstraňte. DŮLEŽITÉ: Nenechávejte blotovací papír na gelu příliš dlouho, vyhnete se tak dehydraci (Obr.6) 2. Umístěte gel(y) do držáku. (Obr. 6) 3. Ujistěte se, že jsou gely správně umístěny. 4. Vložte držák gelu rukojetí nahoru do příslušného slotu v parkovací oblasti (Obr. 7) IV. Spuštění elektroforetické analýzy Použijte program Elfolab/Interlab G26 k nastartování procesu, vyberte číslo a pozici držáku gelu a pozici gelu či gelů v příslušném držáku. Před startem nového běhu zkontrolujte následující: Promývací kontejnery jsou naplněny příslušnými tekutinami (pouze G26 série 33) Barvicí tank č. 3 pro Sudan Black naplňte mezi rysky MIN a MAX Odbarvovací tank obsahuje nejméně 3l odbarvovacího roztoku Hladinu tekutiny v odpadním tanku DŮLEŽITÉ: Před konečným densitometrickým odečtem dojde k přestávce přístroje, během které je držák gelu v parkovací části: vezměte gelovou desku z držáku, očistěte zadní stranu pomocí vatového tamponu namočeného v etylalkoholu a vložte ji zpět do držáku gelu. Držák vložte do příslušného slotu v parkovací části a stiskněte tlačítko restart v softwaru Interlab G26, aby se postup dokončil. Operace po analýze Po dokončení procedury doporučujeme provést tyto procesy: Odstraňte usušený gel z držáku. Odstraňte houbičky nasycené pufrem z migrační komory, vyčistěte každý slot pomocí měkkého papírového ubrousku namočeného v destilované vodě a pak sloty vysušte. Odstraňte kapaliny z pozic WASHING Jednorázové zásobníky vyhoďte. Poznámka: Přečtěte si kapitolu Denní údržba v manuálu. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 6 / 14

7 INTERLAB G26 nové série Jak spustit analýzu Interlab G26 nové série automaticky provede všechny kroky analytického procesu: aplikaci vzorků na agarózovu desku, elektroforetickou migraci, denaturaci gelu, barvení a odbarvování gelu, koncové sušení gelu a denzitometrické odečítání. Pro start analýzy použijte Elfolab/Interlab G26 software. Pozorně si přečtěte manuál k přístroji Interlab G26 před startem analýzy. I. Nastavení elektroforetické analýzy 1. Naplňte nádoby odpovídajícími roztoky a objemy: Nádoba Roztok Objem (l) Destain Pracovní odbarvovací roztok 5 STAIN 3 Naředěný Roztok Sudan Black 0,21l 2. Zapněte Interlab G Použijte Elfolab/Interlab G26 program pro zvolení typu elektroforetické analýzy. 4. Zkontrolujte, že aplikátory jsou ve správných pozicích. (Obr.1) 5. Umístěte jednorázový zásobník na vzorky (Kód. SAE606M) do pozice SAMPLE. (Obr.3) 6. Na zásobník umístěte kovový rámeček (Obr.3) Poznámka: Je doporučeno zařadit kontrolní sérum do každého testu. II. Příprava migrační komory (Obr. 4) 1. Vyjměte migrační komoru z přístroje. 2. Odstraňte hliníkovou folii z boxu, který obsahuje houbičky nasycené pufrem. DŮLEŽITÉ: S houbičkami manipulujte pomocí čisté pinzety či v čistých rukavicích. Při používání soupravy SRE606K, vložte dvě houbičky nasycené pufrem do okrajových slotů. Nevkládejte houbičky do centrálních slotů. Při používání soupravy SRE621K, vložte tři houbičky nasycené pufrem do všech tří slotů. 3. Vložte držák s houbičkami dovnitř přístroje Interlab G26 a lehce zatlačte, zajistíte tak správné spojení komory s přístrojem. DŮLEŽITÉ: Po každém běhu přístroje houbičky vždy odstraňte! III. Příprava agarózové desky (Obr. 5) 1. Položte 1 blotovací papír C (Kód.: SCE602C) na povrch agarózové desky pro odstranění nadbytečného pufru, ujistěte se, že papír dobře přilnul k povrchu gelu a pak jej rychle odstraňte. DŮLEŽITÉ: Nenechávejte blotovací papír na gelu příliš dlouho, vyhnete se tak dehydraci. 2. Umístěte gel(y) do držáku. (Obr. 6) 3. Ujistěte se, že jsou gely správně umístěny. 4. Vložte držák gelu rukojetí nahoru do příslušného slotu v parkovací oblasti (Obr. 7) IV. Nanesení vzorků Před dávkováním vzorků si připravte jednorázovou destičku do držáku a zajistěte kovovým rámečkem. Přístroj s integrovaným samplerem Pro správné nanesení vzorků, které se dispenzují automaticky, dodržte následující postup: 1. Vyjměte držák zkumavek z přístroje (Obr. 8) 2. Vložte zkumavky se vzorky, začněte od pozice 1 prvního držáku, opatrně zkumavky umisťujte až na dno držáku 3. Vložte držáky do přístroje, v případě používání čárových kódů musí tyto směřovat doprava do výřezů držáku (Obr. 9). DŮLEŽITÉ: Ujistěte se před startem analýzy, že jsou zkumavky zbaveny víček. Poznámka: Doporučujeme zahrnout kontrolní sérum do každého testu. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 7 / 14

8 Přístroj bez integrovaného sampleru Dejte 30µl vzorku do každé jamky podle stoupajících čísel. Vložte pomalu destičku do přístroje do parkovací pozice. V. Spouštění elektroforetické analýzy Pro spuštění použijte software Elfolab/Interlab G26, vyberte pozici prováděných držáků gelu. Přístroj automaticky provede následující kroky: distribuci vzorků (pouze s integrovaným samplerem), aplikaci vzorků na agarózový gel, migraci, denaturaci, barvení a odbarvení gelu a jeho vysušení. Na konci bude vysušený gel umístěn do parkovací pozice. Očistěte zadní stranu gelu papírem namočeným v etylalkoholu. Dejte gel do držáku v parkovací zóně. Klikněte na Restart v softwaru Interlab G26. Před započetím nového cyklu prověřte následující: tank na barvicí roztok č.3 je naplněn mezi hladinami MIN a MAX roztokem Sudan Black tank na odbarvovací roztok obsahuje nejméně 3 l odbarvovacího roztoku prověřte hladinu tekutin v odpadním tanku Operace po analýze Po dokončení procedury doporučujeme provést tyto procesy: Odstraňte usušený gel z držáku. Odstraňte houbičky nasycené pufrem z migrační komory, vyčistěte každý slot pomocí měkkého papírového ubrousku namočeného v destilované vodě a pak sloty vysušte. Odstraňte jednorázové zásobníky pro vzorky. Poznámka: Přečtěte si kapitolu Denní údržba v manuálu. UPOZORNĚNÍ: Je doporučeno provést kompletní promývací cyklus pomocí Cleaning Solutionu SRE243M. Doporučuje se udělat tento cyklus jednou za 15 dní, jak je uvedeno v postupu dodané s kitem SRE243M. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 8 / 14

9 Interpretace výsledků Interpretace paternu lipoproteinů Hodnocení výsledků je třeba provést spolu s informacemi, získanými vizuálně, o frakcích lipoproteinů po elektroforéze, s densitometrickými hodnotami frakcí a specifických kvantitativních měřeních cholesterolu a triglyceridů. Frakce jsou obarveny načerno až tmavě hnědě, zatímco pozadí je šedivé. 1. Normální vzorek zobrazí patern lipoproteinů s frakcemi alfa, pre-beta a beta, jejichž procentuální hodnoty se seřadí vzestupně takto: pre-beta, alfa a beta. 2. Alfa frakce je nejblíže anodě a je zobrazena jako fokusovaný malý proužek, dobře odlišitelný od ostatních frakcí. 3. Příležitostně se vyskytující frakce nazývaná pre-alfa neboli lipoalbumin, může být pozorována jako slabý světle obarvený proužek, který migruje anodicky k alfa frakci. Tento proužek vzniká barvením mastných kyselin a lecitinu vázaného na albumin a obecně spadá do densitometrie alfa frakce. 4. Proužek pre-beta se objevuje jako rozmazaný proužek, který se může objevit více ke katodě. Stárnutím vzorek projevuje rychlou degradaci pre-beta frakce, která vymizí z paternu. U některých vzorků je možné také pozorovat rozštěpení pre-beta. 5. Beta proužek je obvykle jasně a intenzivně zbarvený. Zóna mezi beta a pre-beta proužky se obvykle barví intenzivněji než pozadí stripu. 6. Vznik černé rovné linie na místě aplikace indikuje přítomnost chylomikronů ve vzorku. Frederickson a Lees sestavili v roce 1965 klasifikaci hyperlipoproteinémie (viz Obr.2) Normální hodnoty referenčního rozmezí FRAKCE % Alfa Pre- Beta 5 22 Beta Chylomikrony 0 Normální hodnoty referenčního rozmezí ukazuje tabulka a jsou pouze vodítkem. Každá laboratoř si musí stanovit vlastní normální rozmezí. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 9 / 14

10 Kontrola kvality Laboratoř by si měla pro každou šarži kontrolního materiálu stanovit hodnotící kritéria. Pokud kontroly tato kritéria nesplní, validita výsledků pacientských sér není potvrzena a analýza by měla být opakována. Vnitřní kontrola kvality Před dodáním jsou všechny šarže souprav testovány výrobcem (Interlab), je tak ověřeno, že soupravy vyhovují stanoveným požadavkům kontroly kvality - Interlab QC Procedures. Výsledky kontrolních testů jsou uvedeny v Certificate of Analysis. Řešení potíží Jestliže dodržujete návod na přípravu a skladování reagencií, pracovní postup, a přesto zjistíte změny v analytickém chování souprav, volejte servisního technika. Interference a omezení Zmrazení (na -20 C) a stárnutí kvůli dlouhému uchovávání u vzorků pozmění elektroforetickou mobilitu lipoproteinů. Vzorky odebrané s heparinem jako antikoagulanciem vykazují absenci pre-beta frakce. Je nezbytné dodržovat instrukce uvedené v tomto návodu v kapitole ODBĚR VZORKŮ, OŠETŘENÍ A UCHOVÁVÁNÍ Nedodržení doporučeného postupu může ovlivnit výsledky analýzy. CHARAKTERISTIKY PROVEDENÍ Přesnost v rámci analýzy (v rámci jednoho běhu) Byly analyzovány tři různé vzorky pacienta; třináct replikátů každého vzorku na stejné agarózové desce, za použití stejné šarže reagencií kitu SRE606K. Paterny byly vizuálně prohlédnuty a byly kvalitativně identické. Pro každou frakci byl vypočten průměr, standardní odchylka (SD) a koeficient variability (CV). Hodnoty pro každou frakci ukazuje následující tabulka. Lipoproteinová frakce Průměr SD CV (%) Alfa Pre-Beta Beta Přesnost mezi analýzami (Run to Run) Se stejnou šarží reagencií kitu SRE606K proběhly tři různé pacientské vzorky na sérii deseti agarózových desek. Paterny byly vizuálně posouzeny a byly kvalitativně identické. Byl vypočten průměr, SD a CV pro každou frakci. Lipoproteinová frakce PrĤmČr SD CV (%) Alfa Pre-Beta Beta Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 10 / 14

11 Správnost provedení Byla provedena studie sedmdesáti vzorků jak od normálních, tak od očekávaně patologických pacientů, které byly dodány rutinním testováním v nemocniční laboratoři. Vzorky byly hodnoceny s kitem Interlab Lipoprotein kit (SRE606K) na přístroji Interlab G26 a srovnány s laboratorní rutinou na komerčně dostupném testu na agarózovém gelu podle postupu výrobce. Interlab Lipoprotein test vykazoval rovnocenný patern proužků tomuto testu bez falešně negativních nebo falešně pozitivních proužků při vizuální kontrole. Tato studie vedle ke koeficientu korelace vyššímu než 0.97 a vykazujícímu 100% shodu s referenční metodou pro pozorované proužky. Tyto výsledky ukázaly, že Interlab Lipoprotein test je rovnocenný komerčně dostupnému referenčnímu testu. Výsledky ukazuje tabulka níže. Lipoproteinová frakce Sklon y-intercept koeficient korelace Alfa Pre-Beta Beta ,99 Chylomikrony Porovnání řady 1 a řady 2 (pro kit SRE621K) Tato studie byla provedena za použití 26 různých vzorků. Pro každou agarózovou desku proběhl stejný set třinácti vzorků na řádce 1 (pozice 1 až 13) a řádce 2 (pozice 14 až 26). Došlo k úplné shodě. Bylo tedy možné vztáhnout výsledky správnosti a korelační studii na kit SRE606K a zahrnout i kit SRE621K. Lipoproteinová frakce Sklon (Slop e) y- Interce pt Alfa Pre-Beta Beta ,97 Chylomikrony Korelační koeficient Omezení detekce Sériové ředění vzorků séra proběhlo na hodnocení citlivosti. Zředěné vzorky proběhly na Microgelu za použití Interlab Lipoproteins kit. Hodnoty nejnižší koncentrace pro každý proužek, detekované vizuálně, jsou: 15 mg/dl pro alfa lipoproteiny 15.4 mg/dl pro pre-beta lipoproteiny 4.17 mg/dl pro beta lipoproteiny Literatura 1. Fredrickson,D.S. et al. : System for Phenotyping Hyperlipoproteinemias. Circulation, 31(3) : , Mills,G.L. et al. : A Guidebook to Lipoprotein Techniques. Elsevier Henry,R.J. Ed.: Clinical Diagnosis and Management of Laboratory Methods, 17 th Ed. W.B. Saunders Co., new York, , Gambert,P. et al.human Low Density Lipoproteins Surfactant. J of Lipid Research, 1990,Vol.31, Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 11 / 14

12 INTERLAB TEST KIT URČENÝ NA ELEKTROFORÉZU LIPOPROTEINŮ Kit Přístroj Počet testů SRE606K Interlab G SRE621K Interlab G Výrobce: Interlab S. r. l. Via Rina Monti, Roma Italy Vaše dotazy a požadavky na servis rádi vyřídíme na adrese distributora: BioVendor Laboratorní medicína a. s. Karásek 1767/1, Brno Tel: Fax: info@biovendor.cz Revised edition 04/2016 Revize české verze 05/2016 BEZPEČNOSTNÍ POKYNY 1. Před započetím analýzy si pečlivě přečtěte instrukce k použití. Ujistěte se, že je vše dokonale pochopeno. 2. Nepoužívejte reagencie po datu expirace. 3. Dodržujte zásady správné laboratorní praxe. Používejte laboratorní plášť, jednorázové latexové rukavice a ochranné brýle. 4. Reagencie, které mohou způsobit poškození očí či kůže mají varování. Detaily jsou obsaženy v kapitole DODÁVANÝ MATERIÁL a POPIS produktů. Bezpečnostní listy pro tyto produkty jsou k dispozici u výrobce na písemné vyžádání. 5. Se všemi chemikáliemi a reagenciemi, těmi, které vyžadují přípravu i těmi, které jsou připraveny k použití, musí být nakládáno jako s potenciálním rizikovým odpadem dle místních předpisů. ODPOVĚDNOST Reklamace budou uznány, pouze pokud budou obsahovat všechny detaily o provedení testu a výsledky. Jakékoliv úpravy postupu testu nebo změny nebo míchání složek různých kitů může mít negativní dopad na výsledky. V takovém případě nebude uznána žádost o náhradu. Bez ohledu na druh reklamace nahradí výrobce pouze náklady, které nepřesáhnou cenu soupravy. Za jakékoliv poškození kitu způsobené při přepravě nenese výrobce odpovědnost. Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 12 / 14

13 Obr. 1: Umístění aplikátoru (všechny série) Obr. 2: Držák na promývání aplikátorů (pouze série 33) Obr. 3: Umístění držáku vzorků (všechny série) Obr. 4: Migrační komora (všechny série) Obr. 5:Odstranění přebytku pufru blotačním papírem (všechny série) Obr. 6: Zasunutí gelu (všechny série) Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 13 / 14

14 Obr. 7: Umístění držáku gelu (všechny série) Obr. 8: Umístění zkumavek vzorků (pouze při integrovaném sampleru) Obr. 9:Vložení držáku na vzorek (pouze s integrovaným samplerem) Pozn. Interlab G26 Easy Fix: držák vzorků musí být na pozici 1 a 2 Interlab S.r.l. Via Rina Monti N 26 C.A.P RomE ITALY VAT Tel: Fax: E.MAIL: INFO@INTERLAB-SRL.COM STRANA 14 / 14