Cestující do Prahy. Smlouva s Katedrou analytické chemie UPOL o úhradě cestovních výdajů (Denisa Vlčková nebo Ing. Petra Táborská)

Transkript

1 MODELOVÉ ÚKOLY Obhajoba struktury na konci zimního semestru (2019, zápočet) NMR, MS, IR jsou základ, jestli si seženete něco navíc, tím líp pro vás NMR a MS spektra nasbírána v Praze (dostanete jpg i raw data), IR by jste si měli pořešit v Olomouci (sami vzorek připravit, změřit spektra zinterpretovat) Kdo chce, může za mnou vyrazit do Prahy (NMR, MS)

2 Cestující do Prahy Smlouva s Katedrou analytické chemie UPOL o úhradě cestovních výdajů (Denisa Vlčková nebo Ing. Petra Táborská)

3 Úvod do interpretace IR spekter Střední infračervená oblast (MIR medium infra red) cm -1

4 Základní postup Spektrum interpretujeme od nejvyšších vlnočtů k nejnižším. Každou skupinu je třeba potvrdit přítomností dalších charakteristických vibrací u nižších vlnočtů. Po ukončení interpretace jedné funkční skupiny se vracíme k nejvyšším vlnočtům a interpretujeme další pás/funkční skupinu. Srozumitelně popsaný postup v ČJ lze nalézt ve skriptu Příklady z analytické chemie pro bakaláře, které je zdarma přístupné na webu vscht.cz.

5 Zdarma přístupné studijní materiály na:

6 Kapitola 16 řešené jednoduché příklady interpretace IR spekter

7 Tabulky vlnočtů a atlas spekter Základní: dostanete ve formátu pdf, 7 stran zdroj: Krofta J. a kol.: Návody pro cvičení z analytické chemie II. VŠCHT Praha, Kompletní : k zapůjčení u Davida Mildeho, cca 350 stran Socrates G.: Infrared and Raman Characteristic Group Frequencies, 3rd Ed. Wiley, Chichester V katedrální knihovně přístupný atlas spekter: The Aldrich Library of Infrared Spectra cca spekter.

8 Wiley Desktop Databases: ASC and XY formats To download and activate your free 30-day trial, click this link and follow the instructions: This trial is fully functional and includes all three Wiley Spectra Lab collections (MS, IR, NMR), giving you access to over 2.2 million reference spectra. The attached Quick Start Guide will help you get started.

9 Minimální MS základ Najdu molekulární ion ve spektru a určím jeho elementární složení (izotopy nebo přesná hmotnost) Změřím si produktové spektrum a na fragmentech udělám totéž Dusíkové pravidlo, počet kruhů a dvojných vazeb, atd bakalářská analytika Vztahy mezi ionty, resp. jejich elementárním složením (neutrální ztráty skupin versus illogical losses) Navržená struktura se koreluje s NMR (počet uhlíků v 13C ) a IR

10 Molekulární kation-radikál (OE, odd-electron) - M Nízko-rozlišená spektra ion s nejvyšší hmotností v EI spektru ion s nepárovým elektronem korespondence s ostatními ionty ve spektru - podmínky nutné, ne však vždy dostačující M m/z Courtesy: Pepa Čáslavský

11 Nízko-rozlišená spektra Intenzita molekulárního iontu (EI) Závislost na struktuře (MW ~130) Struktura Typ sloučeniny Intenzita M + N Aromáty, heterocykly 100 % Cykloalkany 90 % R-SH thioly 40 % R n-alkany 6 % RCHO aldehydy 2 % R-OH alkohol 0,1 % Courtesy: Pepa Čáslavský

12 Nízko-rozlišená spektra Intenzita molekulárního iontu (EI) Závislost na MW: Struktura Intenzita M + MW 75 MW 130 MW 185 R1-O-R2 30 % 2 % 0,05 % RCOOH 80 % 0,5 % 9 % Courtesy: Pepa Čáslavský

13 Nízko-rozlišená spektra Dusíkové pravidlo (OE ionty, EI) Jestliže sloučenina obsahuje 1 nebo lichý počet atomů dusíku, hmotnost molekulárního iontu je lichá. Jestliže sloučenina neobsahuje žádný nebo má sudý počet atomů dusíku, hmotnost molekulárního iontu je sudá. H 2 O m/z 18 NH 3 m/z 17 C 2 H 5 OH m/z 46 C 4 H 11 N m/z 73 C 10 H 8 m/z 128 C 5 H 6 N 2 m/z 94 N H Courtesy: Pepa Čáslavský

14 Izotopické zastoupení prvků v přírodě Nízko-rozlišená spektra 128 A A+1 A+2 pík % pík % H 1 F 19 P 31 I 127 C ,1 N ,37 13 C O , ,20 Si ,1 30 3,4 S , ,4 Cl ,0 Br , m/z Pík A odpovídá 100 % Courtesy: Pepa Čáslavský

15 Izotopické zastoupení prvků v přírodě Nízko-rozlišená spektra 186 1x Cl A A+1 A+2 pík % pík % H 1 F 19 P 31 I 127 C ,1 * N , Cl m/z O , ,20 Si ,1 30 3,4 S , ,4 Cl ,0 Br ,3 Pík A odpovídá 100 % Courtesy: Pepa Čáslavský

16 Nízko-rozlišená spektra Izotopy uhlíku 99% 12 C, 1% 13 C C 1 : 99% 12 C 1% 13 C C 2 : 98% 12 C 12 C 2% 12 C 13 C 0.01% 13 C 13 C C 3 : 97% 12 C 12 C 12 C 3% 12 C 12 C 13 C 0.04% 12 C 13 C 13 C 10-4 % 13 C 13 C 13 C

17 Nízko-rozlišená spektra Zastoupení izotopů lze spočítat podle koeficientů binomického rozvoje: C 2 : (99a+1b) 2 12 C/ 13 C = cca 99:1, 99 2 a ab+1b 2 C 3 : (99+1) 3 Br 2 : (a+b) 2 79 Br/ 81 Br = cca 1:1, a 2 +2ab+b 2 (1:2:1) Br 3 : (a+b) 3 a 3 +3a 2 b+3ab 2 +b 3 (1:3:3:1) Cl 2 : (3a+b) 2 35 Cl/ 37 Cl = cca 3:1, 9a 2 +6ab+b 2 (9:6:1)

18 Princip superpozice Nízko-rozlišená spektra

19 Nízko-rozlišená spektra

20 Teoretické izotopické obálky peptidů s m/z Da Nízko-rozlišená spektra

21 Nízko-rozlišená spektra Výpočet sumárního vzorce 128 Spektrum s nízkým rozlišením: Naměřená data: m/z ,0 % m/z ,2 % m/z 130 0,6 % Tabulkové hodnoty: A+1 A+2 C ,9 % 0,44 % C ,0 0,54 C ,1 0, m/z Courtesy: Pepa Čáslavský

22 Nízko-rozlišená spektra Určení počtu cyklů a násobných vazeb 128 C x H y N z O n h = x ½ y + ½ z + 1 C 10 H ½ 8 + ½ = m/z Courtesy: Pepa Čáslavský

23 Nízko-rozlišená spektra Neutrální ztráty Obvyklé ztráty: - 1 H (labilní) - 15, 29, alkyl - 18, 20, 28, 34, H 2 O, HF, CO, C 2 H 4, H 2 S, HCl Současná ztráta 18 (H 2 O) a 28 (C 2 H 4 )... alifatický aldehyd Nepravděpodobné neutrální ztráty (illogical losses): - intenzivní [M 2], [M 14] - rozdíly m/z 4-14, Courtesy: Pepa Čáslavský

24 Nízko-rozlišená spektra Skupina Iontové serie výsledek sekundárních fragmentací poskytují informaci o skupinách látek m/z alkyly 15, 29, 43, 57, 71, 85 alkeny, cykloalkany 28, 42, 56, 70, 84 alkenyly, cykloalkyly 27, 41, 55, 69, 83 alkoholy, ethery 31, 45, 59, 73, 87 aldehydy, ketony 29, 43, 57, 71, 85 kyseliny, estery 45, 59, 73, 87 aminy 30, 44, 58, 72, 86 nitrily 40, 54, 68, 82 thioly, sulfidy 33, 47, 61, 75, 89 chloralkyly 35, 49, 63, 77, 91 aromáty 38, 39, 50-52, 63-65, polycykl. aromáty 87-89, , 112, 113, , 138, 139, Courtesy: Pepa Čáslavský

25 Jaký je rozdíl mezi nominální, monoizotopickou a průměrnou hmotností? Kolik neutronů má 7 Li a 6 Li? Jak se odlišuje 12 C od 13 C? Formulujte dusíkové pravidlo Jak se získá počet dvojných vazeb a cyklů v molekule nebo iontu? Při měření neznámého peptidu technikou ESI jsme určili, že [M+Na+H] 2+ ion je ve spektru na hodnotě m/z Na jaké hodnotě m/z lze očekávat deprotonovanou molekulu?

26 Interpretujte EI spektrum

31 100 Hmotnostní spektrometrie základní pojmy MOLEKULÁRNÍ ION 112 % IZOTOPICKÝ ION Cl (nistdemo) Benzene, chloro- Molekulární ion odpovídá základnímu iontu.

32 Hmotnostní spektrometrie základní pojmy 100 % ZÁKLADNÍ ION (Text File) Hexane, 1-chloro Ion fragmentu odpovídá základnímu iontu. IZOTOPICKÝ ION C 6 H 13 Cl MOLEKULÁRNÍ ION - chybí

33 Pro látku obecného vzorce C x H y N z O n platí, že počet dvojných vazeb a cyklů v ní přítomných se spočítá podle obecného vzorce: h = x ½ y + ½ z + 1 x=počet atomů C, y=počet atomů H, z=počet atomů N h celé číslo značí ion s lichým počtem e - C... Si H... F, Cl, Br, I N... P O... S končící ½ značí ion se sudým počtem e - Kolik dvojných vazeb a cyklů mají ionty: C 2 H 5 OH.+ C 4 H 11 N.+ C 6 H 5 -CO + O 2 - ½ 6 + ½ N + 1 = ½ 5 + ½ N + 1 = 5,5 4 - ½ 11 + ½ = 0

34 Až sem jsme pracovali pouze s nominálními hmotnostmi Teď pojďme vzít do úvahy monoizotopické hmotnosti

35 Výpočet sumárního vzorce Spektrum s vysokým rozlišením: Možnost stanovení sumárního vzorce na základě hmotnosti změřené s vysokou přesností Příklad: C 2 H 3 O 43,0184 C 3 H 7 43,0547 Courtesy: Pepa Čáslavský

36 Looking into the fine structure of isotopes mass defect of isotopes 10 1 H mass defect [mda] C 14 N 15 N 12 C 18 O 16 O S 33 S 34 S 12 C N S Da Da Da 33 S (0.8%) 13 C (1.1%) m/z 15 N (0.37%) m/z Da 34 S (4.5%) m/z Courtesy: Arnd Ingendoh and Michal Bohac, BDAL

37 Nomenclature of Peptide Fragment Ions C-terminus x 3 y 3 z 3 x 2 z 2 y 1 y 2 x 1 z 1 R1 O R2 O R3 O R4 H 2 N C C N C C N C C N C COOH H H H H H H H a 1 b 1 c 1 a 3 a 2 b 2 c 2 b 3 c 3 N-terminus

38 Peptidové sekvenování Kvadrupol 1 Kolizní cela Kvadrupol 3 Eluce peptidů z HPLC 1823 Peptid + Ar (Fragmentace) Sběr dat VLADIMIRHAVLICEK VLADIMIRHAVLICE VLADIMIRHAVLIC VLADIMIRHAVLI VLADIMIRHAVL VLADIMIRHAV VLADIMIRHA VLADIMIRH VLADIMIR VLADIMI VLADIM VLADI VLAD VLA VL (Uvedena pouze b-iontová série) Bioinformatika

39 Peptidové sekvenování

40 Když je klika, lze sekvenovat i cyklické peptidy H 3 C (CH 2 ) 3 Me O O 1 O HN O 4 3 N H 2 O NH Nízko-rozlišená spektra

41 Př. 3: Malý lineární peptid (LR) Identifikuj molekulární ion a vyděl jeho hodnotu m/z číslem 110 (tzv. averaginem, tj. průměrnou molekulární hmotností všech základních aminokyselin). Takto získáme orientační maximální počet aminokyselin přítomných v daném peptidu. Přiřaď imoniové ionty aminokyselin v oblasti nízkých hodnot m/z spektra (pozor na cut-off na iontové pasti). Případná nepřítomnost daného iontu ještě nemusí znamenat, že odpovídající aminokyselina v peptidu není. Ionty vzniklé ztrátami bočních řetězců z [M+H] + iontů (hlavně během vysokoenergetických procesů) mohou poskytnout další informace. S pomocí tabulky (viz níže) urči b 2 ion na hodnotě m/z (AK 1 +AK 2 +1), který je obvykle doprovázen příslušným a 2 iontem na m/z o hodnotě 28 daltonů nižší. Hodnota b 2 současně nás současně navádí na ionty y n-2 příp. y n-1. Tabulka protonovaných aminokyselinových párů pokrývá interval hodnot m/z od 115 (Gly-Gly+H) do 373 (Trp-Trp+H). S pomocí imoniových iontů, přiřazeného dipeptidu a iontu y n-1 získáme počátek N-koncové sekvence. Nízko-rozlišená spektra

42 Př. 3: Malý lineární peptid (LR) Pracujeme-li s tryptickými peptidy, můžeme nalézt ion y 1 na m/z 147, pokud byl C-koncovou aminokyselinou lysin nebo na m/z 175 (odpovídá Arg-OH). Je-li nalezen y 1 ion, lze přiřadit komplementární ion b n-1. Je-li přítomen i ion b n, můžeme z hmotnostního rozdílu mezi protonovanou molekulou a iontem b n zjistit, jaká je C-koncová skupina: OH (18Da), NH 2 (17Da), atd. Pokud je vzorek tryptickým peptidem, nemůže být Arg nebo Lys jinde než na C-konci peptidu. Proto, je-li nalezena aminokyselina o velikosti 128 uvnitř sekvence, musí se jednat o Gln. Pokus se identifikovat ionty typu b i a y i a jejich hmotnostní diference použij ke konstrukci částečných sekvencí. Pokud se dvě neúplné sekvence nepřekrývají, lze tyto použít k sestavení sekvence delší. V případě překryvových sekvencí získáváme kontrolu správnosti dříve navržené sekvence částečné. Pokud některé fragmentové ionty významně intenzitně převyšují ionty ostatní, může být v sekvenci přítomen Pro, His nebo jiná aminokyselina tvořící tzv. hypercleavage. Sečti hmotnosti všech již určených aminokyselin (informace z imoniových iontů, dipeptidu, z diferencí mezi sekvenčními ionty) a dále přičti 19 (hmotnost H 3 O + ). Získaný součet odečti od hodnoty protonované molekuly, aby se získala celková velikost dosud v sekvenci chybějících aminokyselin. Použij další pravidla k určení úplné sekvence: ionty typu a i jsou na hodnotách m/z o 28 Da nižších než ionty typu b i. Dále, některé b i ionty eliminují neutrální částice: Ser, Thr, Asp a Glu ztrácejí vodu z C-konců (pozorujeme ionty b i -18). Asp, Gln, Lys, Arg uvolňují amoniak z N-konců příslušných fragmentových iontů (pozorujeme ionty b i -17). Obě výše uvedené eliminace lze pozorovat i u a i iontů. Cys často poskytuje b i -34 pík. Met poskytuje b i -46 pík. Oxidovaný Met dává b i -64 píky. V komplikovaných případech lze dále použít řadu derivatizačních reakcí k získání přesnější sekvenční informace. Lze provést: Acetylace N-konce nebo jakéhokoli lysinu (42 Da přírůstek na jednu skupinu). To přináší zlepšení N-koncové fragmentace tryptických peptidů obsahujících Arg na C-konci. Methylace C-konce nebo jakékoli aminokyseliny nesoucí karboxyskupinu (Glu, Asp), přírůstek 14 Da na jednu skupinu: lepší tvorba y i iontové série. N-pyridylacetylace zlepší nejen tvorbu celých b i i y i sérií, ale podpoří i vznik iontu b 1. Nízko-rozlišená spektra

43 Př. 3: Malý lineární peptid (LR) Nízko-rozlišená spektra Podle hodnoty m/z protonované molekuly (523) lze soudit, že peptid obsahuje čtyři nebo maximálně pět aminokyselin. Imoniové ionty v oblasti nízkých hodnot m/z ukazují na přítomnost Pro (70), Phe (120) a Tyr (136). Fakt, že jiné imoniové ionty nevidíme, může (ale také nemusí) indikovat vícenásobné zastoupení aminokyseliny jednoho druhu. Odečtením hmotností prokazatelně přítomných aminokyselin získáváme chybějící stavební jednotku(ky) peptidu: 523-( )=97. Zbývající aminokyselinou je tedy prolin.

44 Aminokyselina Hmotnost Boční řetězec Imoniové ionty a další fragmenty G Gly A Ala S Ser P Pro Nízko-rozlišená spektra V Val T Thr C Cys L Leu (72) I Ile (72) N Asn (70) D Asp Q Gln (84, 129) K Lys (129, 112, 84, 70) E Glu M Met (61) H His (166, 138, 123, 121, 82) F Phe (91) R Arg (112, 100, 87, 73, 70, 59) Y Tyr W Trp

45 Př. 3: Malý lineární peptid (LR) Nízko-rozlišená spektra 523-( )=97: dvakrát Pro, jednou Phe, jednou Tyr

46 Př. 3: Malý lineární peptid (LR) Nízko-rozlišená spektra Z dosud identifikovaných aminokyselin víme, jakých teoretických hodnot m/z může nabývat dipeptid b 2 : 195, 245, 261 nebo 311. Správnou hodnotou je m/z 261 (Pro, Tyr), neboť tato je současně podpořena i existencí a 2 iontu (m/z 233). Pokud je naše myšlenková konstrukce správná, komplementárním iontem k b 2 je ion y n-2 (čili y 2 ), který obsahuje dvojici Pro, Phe. Tento ion je opravdu ve spektru přítomen na m/z 263 (Pro+Phe+19).

47 Fragmentace lineárních peptidů y 2 y 1 O O O H 2 N CH C NH CH C NH CH C OH R 1 R 2 R 3 a 1 a 2 b 1 b 2

48 Př. 3: Malý lineární peptid (LR) Nízko-rozlišená spektra Dosud jsme zjistili, že sekvence má tvar (Pro, Tyr)-(Pro, Phe). Nyní je na řadě určení pořadí jednotlivých aminokyselin, které se získá testováním jednotlivých teoretických variant. Víme, že ion y 2 má hodnotu m/z 263. Další člen řady, ion y 3, bude buď větší o Tyr (m/z 426) nebo o Pro (360). Pouze druhý z iontů je přítomen a protože tento je současně o 163 Da menší než protonovaná molekula, musí být N-koncovou aminokyselinou tyrosin. Naše současná sekvence má tedy tvar H-Tyr-Pro-(Pro, Phe). Stejným způsobem určíme C-koncovou sekvenci, a to za použití b i série. Víme, že ion b 2 má hodnotu m/z 261. Pokud byl by třetí aminokyselinou z N-konce prolin, b 3 ion by měl hodnotu m/z 358. Pokud by na třetí pozici byl fenylalanin, příslušná hodnota by byla m/z 408. Druhá varianta je správná (vidíme i ion a 3 na m/z 380) a potvrzuje ji i existence iontu y 1 na m/z 116.

49 Př. 3: Malý lineární peptid (LR) Kompletní sekvence je tedy H-Tyr-Pro-Phe-Pro-OH. Nízko-rozlišená spektra

50 Něco pro ty, co mají na víc: Vytvořte si peaklist.txt z MS dat Stáhněte si MartinMass ( File, New From Clipboard Processing, Swap data Mass Calculator: simulace izotopového profilu Mass to Formula: zadejte změřenou hmotnost, přesnost měření (ppm) a generujte složení. Využijte composition rules Využijte hmotnostní defekty, rekalibrace, differences, integrované knihovny, webové nástroje.

51 Data analysis viewer

52 Data analysis viewer

53 Ctrl+A

54

55 MS Excel Obtáhnout m/z a I Ctrl+C

56 MMass

57 Error při vkládání dat? Troubleshooting na konci prezentace

58

59

60

61

62

63 Najdeme peaky s nejvyšší intenzitou a podíváme se na izotopové složení

64 Z izotopového zastoupení je patrné, že molekula obsahuje dva atomy bromu

65 2 atomy bromuv molekule mají takové izotopové zastoupení

66 K určení hmotnosti molekuly použijeme monoisotopický signál

67 Najdeme si iont napravo v seznamu

68 Pravým tlačítkem Send to Mass to Formula

69 Tolerance: 3.0 ppm Minimal formula: Br2 -> Generate

70 Můj sumární vzorec Jak dále? Co s tím?

71

72 A je to

73 Troubleshooting nejdou vložit data do MMass Data nejdou importovat

74 V intenzitě se nachází písmenko E+20, to Mmass nepřekousne. Kliknutím musíme doplnit nuly ručně. Pak to jde

75 CompassExport pro mmass nebo CycloBranch Stáhněte si program Compass_export EXE soubor ve verzi 3.0.9, vydavatelem je firma Bruker: Ten program dělá to, že vezme nativní Bruker formát (baf) a přeloží ho do texťáku. Ten txt soubor si můžete i sami ručně vytvořit, kdybyste měli jakákoli spektra před sebou v grafické formě. Nainstalujte si CompassExport a následně zkuste mmass na vašich MS datech.

76 Cyclobranch Program a manuály jsou ke stažení zde: Nejdříve si otevřete okno Settings, a to je třeba správně vyplnit (viz manuál na webu). Vlevo nahoře se zadává jméno souboru a opět je podporován BAF i TXT. Když Settings vyplníte, pak teprve spouštíte samotný program (RUN).

77 Pokud je problém při spouštění souborů klikněte pravým na "Počítač", dejte "Vlastnosti", "Změnit nastaveni", "Upřesnit", "Proměnné Prostředí", "Systémové Proměnné", proměnná "Path", dejte "Upravit", "Nový", a přidejte cestu, kde je nainstalovaný CompassXport napr. "C:\Program Files (x86)\bruker Daltonik\CompassXport". U Win 7, to "Nový" není a přidává se to nakonec do měněné PATH oddělené středníkem (žádná mezera za středníkem a žádné uvozovky). Všechno potvrďte ok, restartujte PC Kdyby ani toto nepomohlo, pak vytvořte soubor off set PATH=%PATH% del "%~f1_converted*.csv" 2>NUL "%programfiles(x86)%\bruker Daltonik\CompassXport\CompassXport.exe" - mode 4 -a "%~f1" -o "%~f1_converted" 1>NUL copy "%~f1_converted*.csv" "%~f1.csv" 1>NUL del "%~f1_converted*.csv" 2>NUL A vložte ho do adresáře "External/windows".

78 CycloBranch open-source, stand-alone, and cross-platform (Windows 7/8/10, Linux, OS X) dereplication (LCMS/MSI data) - non-ribosomal peptides (NRPs) - siderophores (Li, Na, Mg, Al, K, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga) - microbial secondary metabolites (in-house) - lipids ( - spectra from multiple MS scans are batch-processed