UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

Transkript

1 UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Studijní program Biologie Studijní obor Parazitologie Katedra parazitologie Bc. Vojtěch Vacek MITOCHONDRIE OXYMONÁD MITOCHONDRION-LIKE ORGANELLES OF OXYMONADS DIPLOMOVÁ PRÁCE Školitel: Mgr. Vladimír Hampl, PhD. Praha 2011

2 Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval samostatně a že jsem uvedl všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze dne: Vojtěch Vacek 2

3 Poděkování: Rád bych poděkoval svému školiteli Mgr. Vladimíru Hamplovi, PhD. za odborné vedení mé diplomové práce. Dále bych rád poděkoval Mgr. Jitce Hlavačkové a Mgr. Janu Pyrihovi za pomoc při práci v laboratoři a dalším lidem z naší laboratoře za přátelské prostředí a psychickou podporu. Děkuji také své rodině za podporu a trpělivost, které mi umožnili klidné a nerušené studium. 3

4 1 Obsah Obsah... 4 Abstrakt... 6 Úvod... 8 Literární přehled Mitochondrie Hydrogenosomy Mitosomy Obtížně zařaditelné MLO Společné znaky MLO ( mitochondrion-like organelles ) Import proteinů do MLO Targetovací sekvence do MLO [FeFe]Hydrogenáza a Pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáza PNT (Pyridin:nukleotid transhydrogenáza) Oxymonády Trimastix Cíle práce: Metody Monocercomonoides Pa203 kultivace Příprava TYSGM Filtrace Izolace RNA ethanol/chloroformovou extrakcí mrna selekce Syntéza cdna PCR (Polymerase chain reaction) Tabulka 1: Použité primery: Standardní PCR Nested PCR Touchdown PCR Advantage 2 PCR Colony PCR Koncentrace a přečištění DNA Agarózová elektroforéza Sekvenace DNA Sangerovou metodou Příprava poly-l-lysinovaných skel Fixace na imunofluorescenci Ethanolová fixace Methanol/acetonová fixace Inkubace s protilátkou (imunofluorescenční barvení) Polyakrylamidová denaturační proteinová elektroforéza (SDS PAGE) Imunoblot Příprava protilátek Příprava rekombinantního proteinu Pokusná exprese Exprese Purifikace proteinu Sonikace Jednoduchá frakcionace Fixace na elektronový mikroskop Bioinformatické metody

5 Skládání a editace sekvencí DNA Tvorba fylogenetického stromu: Výsledky: Elektronová mikroskopie Analýza EST sekvencí Sekvenace PNT Fylogenetická analýza PNT Lokalizace PNT v buňce Lokalizace v buněčných frakcích imunoblot Lokalizace PNT v buňce pomocí imunofluorescence Diskuze Závěry Seznam použitých zkratek Seznam použité literatury

6 2 Abstrakt Oxymonády jsou jednou z posledních větších skupin eukaryot, u kterých dosud nebyla potvrzena mitochondrie nebo jí podobná organela. V sekvencích transkriptomu oxymonády Monocercomonoides se nám podařilo nalézt tři proteiny asociované s mitochondriemi: pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázu (PFO), [FeFe]hydrogenázu a pyridin nukleotid transhydrogenázu (PNT). Z těchto tří enzymů je PNT nejtěsněji spjato s mitochondrií. Přes velké množství osekvenovaných sekvencí transkriptomu se nám nepodařilo najít žádné další mitochondriální proteiny ani proteiny pro syntézu FeS center a pro import proteinů do mitochondrie, které byly objeveny u všech studovaných mitochondriálních organel. Sekvence PNT se ve fylogenetické analýze umístila ve skupině s ostatními eukaryoty a je tedy pravděpodobné, že je mitochondriálního původu. Nemůžeme ovšem vyloučit ani možnost laterálního genového přenosu. Lokalizace PNT v buňce pomocí imunofluorescenční mikroskopie se specifickými protilátkami poskytla nejednoznačné výsledky. Přítomnost organely mitochondriálního typu se nám nepodařilo prokázat. Pokud však Monocercomonoides nějakou takovou organelu má, bude pravděpodobně velmi redukovaná, protože jsme v jeho transkriptomu nenalezli proteiny pro žádnou metabolickou dráhu typickou pro mitochondriální organely. Klíčová slova: Oxymonády, mitochondrie, mitosom, Monocercomonoides, pyridin:nukleotid transhydrogenáza (PNT), hydrogenosom, fylogeneze Abstract Oxymonads are among the last larger eukaryotic groups in which mitochondrion-like organelles were not detected. Among almost one million transcriptome sequences of oxymonad Monocercomonoides we found sequences for only three proteins commonly associated with mitochondrion-like organelles pyruvate:ferredoxin oxidoreductase (PFO), [FeFe]hydrogenase and pyridine:nucleotide transhydrogenase (PNT). Out of these tree proteins PNT is most closely associated with mitochondrion-like organelles. Although the transcriptome data set is quite large we did not detect any other mitochondrial proteins including proteins for synthesis of FeS clusters and proteins associated with mitochondrial protein import. In the phylogenetic tree, PNT from Monocercomonoides formed a clade with sequences of other eukaryotes. This suggests that PNT of Monocercomonoides is likely of mitochondrial origin; however, the possibility that Monocercomonoides acquired PNT by lateral gene transfer cannot be excluded. We tried to localize PNT in the cell of Monocercomonoides by immunofluorescent microscopy but the results were difficult to interpret. We could not prove the presence of mitochondrion-like organelle in 6

7 Monocercomonoides. If there is any such organelle, it is highly probable that this organelle is very reduced because we did not find proteins for any metabolic pathways typical for mitochondrion-like organelles. Key words: Oxymonads, mitochondrion, mitosome, Monocercomonoides, pyridine:nucleotide transhydrogenase (PNT), hydrogenosome, phylogeny 7

8 3 Úvod Archezoa (Cavalier-Smith 1983) byla parafyletickou skupinou spojující skupiny protist, o kterých se předpokládalo, že nemají mitochondrii a že se tedy jedná o primitivní eukaryota, která se od zbytku eukaryot oddělila ještě před získáním této organely. Archezoa původně obsahovala metamonády (zejména diplomonády a parabasala), archamoeby (dříve pelobionta a entamoebida) a mikrosporidie. U zástupců všech hlavních skupin řazených mezi Archezoa byly později nalezeny dvoumembránové organely mitochondriálního původu a bylo tak prokázáno, že se vyvinuly z předka s mitochondrií nebo jejím derivátem (Embley and Martin 2006). V současné době jsou mitochondrie nebo jim příbuzné organely, tzv. MLO ( mitochondrion-like organelle ), považovány za esenciální organely pro funkci a životaschopnost eukaryotické buňky. Předpokládá se, že získání mitochondrie pomocí endosymbiózy α-proteobakterie bylo jednou ze základních událostí pro vznik eukaryotické buňky jako takové. Přesto stále existuje několik skupin eukaryotických organismů, u kterých nebyla mitochondrie nebo jiná organela mitochondriálního původu nalezena. Oxymonády jsou z těchto skupin největší, a proto jsme se rozhodli mitochondriální organelu u oxymonád nalézt. 8

9 4 Literární přehled 4.1 Mitochondrie Mitochondrie jsou jednou ze základních organel eukaryotické buňky a jako takové je asi není třeba zvláště představovat. Podle v současnosti obecně uznávané hypotézy vznikla mitochondrie endosymbiózou z α-proteobakterie. Toto se usuzuje na základě porovnání genomu α-proteobakterie Rickettsia prowazekii a genomu mitochondrie (Andersson et al. 1998). Endosymbióza αproteobakterie a tedy vznik mitochondrie pravděpodobně proběhla v počátcích evoluce eukaryotické buňky nebo se na jejím vzniku přímo podílela. V průběhu vývoje eukaryotické buňky docházelo k postupné redukci mitochondriálního genomu a přesouvání genů do jádra hostitelské buňky. Genom R. prowazekii obsahuje 837 protein kódujících genů (Andersson et al. 1998), zatímco mitochondriální genom nejbohatší na protein kódující geny, který má Reclinomonas americana, obsahuje 67 protein kódujících genů (Lang et al. 1997). U většiny eukaryot je však mitochondriální genom redukován ještě více, například u parazita z kmene apikomplexa Plasmodium falciparum jsou v mitochondriálním genomu přítomny pouhé 3 protein kódující geny (Vaidya and Mather 2009). Mitochondrie se podílejí na velkém množství metabolických procesů v buňce. Jednou z nejdůležitějších funkcí je syntéza ATP pomocí oxidativní fosforylace, kde hraje esenciální roli tzv. dýchací řetězec (složitý komplex mnoha proteinů spojující samovolný tok elektronů za vzrůstajícím redoxní potenciálem s transportem protonů přes vnitřní mitochondriální membránu). Dalšími procesy probíhajícími v mitochondrii jsou metabolismus polyaminů a aminokyselin, syntéza železo-sirných center, hemu atd. Popis metabolických drah a vlastností klasických mitochondrií je nad rámec této práce, proto se zde budu věnovat spíše organelám, které se od mitochondrie odvozují a které se také někdy nazývají MLO ( mitochondrion-like organelles ). Toto označení zahrnuje kromě klasických aerobních a anaerobních mitochondrií také hydrogenosomy, mitosomy a organely, o kterých můžeme říci, že jsou jaksi na pomezí mezi jednotlivými výše jmenovanými skupinami. V další kapitole se budu věnovat nejdříve objevené a patrně nejlépe prostudované skupině MLO hydrogenosomům. 4.2 Hydrogenosomy Tyto dvoumembránové organely produkující vodík byly poprvé objeveny v tritrichomonádě Tritrichomonas foetus (Čerkasovová et al. 1973, Lindmark and Müller 1973). Později byly hydrogenosomy nalezeny i u jiných eukaryot anaerobních chytridiomycet (Neocallimastix, 9

10 Pyromyces), některých anaerobně žijících nálevníků (Nyctotherus, Trimyema, Dasytricha) a také u některých heteroloboseí např. Psalteriomonas lanterna, Sawyeria marylandensis a další (Broers et al. 1990, 1992, O Kelly 2003, Barbera et al. 2010). Hydrogenosomy těchto skupin se vzájemně liší. Mezi hlavní rozdíly patří metabolismus pyruvátu trichomonády a nálevník Dasytricha využívají enzym PFO (pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáza) naproti tomu chytridní houby (Neocallimastix, Pyromyces) a Trimyema využívají pro metabolismus pyruvátu enzym PFL (pyruvát:formát lyáza) (Akhmanova et al 1999). Vodík je produkován [FeFe]hydrogenázou, která je pro hydrogenosomy typickým enzymem. Na rozdíl od mitochondrií hydrogenosomy obvykle nemají genom, výjimkou je Nyctotherus ovalis (Akhmanova et al. 1998) Vzhledem k tomu, že oxymonády, které jsou tématem této práce, spadají do říše Exkaváta, budu se v této kapitole zabývat především hydrogenosomy organismů z říše Exkaváta, konkrétně trichomonád, které jsou nejlépe prostudované. V hydrogenosomu trichomonád je pyruvát Obr.1: Schéma hydrogenosomálního metabolismu T. vaginalis. Oranžovou barvou jsou označeny enzymy asociované s energetickým metabolismem. Proteiny asociované s dalšími metabolickými drahami jsou označeny následovně: žlutá metabolismus aminokyselin, růžová syntéza FeS center, zelená transport a maturace proteinů, modrá detoxifikace kyslíku, světle zelenou je označen ferredoxin, který slouží jako donor elektronů pro hydrogenázu. AK adenylát kináza, Fdx ferredoxin, GCV glycin štěpící systém, Hy hydrogenáza, PFO pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáza, SOD superoxid dismutáza, STK sukcinyl thiokináza, SHMT serin hydroxymethyl transferáza, Trx thioredoxin, TrxP thioredoxin peroxidáza, TrxR thioredoxin reduktáza, THF CH2-5,10-methylentetrahydrofolát, ASCT acetyl:sukcinát CoA-transferáza, Mz -metronidazol. Převzato z Carlton et al

11 oxidativně dekarboxylován pomocí pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy (PFO), v reakci se tvoří acetyl-coa, CO2 a dva elektrony. Tyto elektrony jsou předány na ferredoxin. Redukovaný ferredoxin je reoxidován [FeFe] hydrogenázou v reakci, která redukuje protony a vzniká molekulární vodík. Acetyl-CoA je dále acetát:sukcinát CoA transferázou (ASCT) přeměněn na acetát a CoA. Koenzym A je přenesen na sukcinát a vzniká sukcinyl-coa, který je sukcinátthiokinázou (STK nebo též sukcinyl-coa syntetáza) následně štěpen na CoA-SH a sukcinát. Při posledním kroku dochází k rozštěpení vysokoenergetické thioesterové vazby a dochází k substrátové fosforylaci ADP na ATP (viz Obr. 1). V hydrogenosomech T. vaginalis probíhá i metabolismus některých aminokyselin. Původně se předpokládalo, že v hydrogenosomech probíhá pouze metabolismus argininu a transaminační reakce. Při analýze osekvenovaného genomu (Carlton et al. 2007) však byly nalezeny další geny pro metabolismus aminokyselin glycin dekarboxylázový komplex (GDC) a serin:hydroxymethyl transferáza (SHMT). GDC je mitochondriální komplex 4 proteinů katalyzující dekarboxylaci a deaminaci glycinu. SHMT je enzym katalyzující reverzibilní přeměnu serinu a tetrahydrofolátu na glycin a N5,N10- metylen tetrahydrofolát. Přítomnost těchto dvou enzymů naznačuje, že hydrogenosom T. vaginalis hraje roli v metabolismu aminokyselin. Problémem je, že dosud nebyly nalezeny geny pro dva proteiny GDC P protein, který funguje jako glycin dekarboxyláza, a T protein, který přenáší methylovou skupinu na tetrahydrofolát. Navíc nebyla nalezena ani dihydrofolát reduktáza, která katalyzuje přeměnu folátu na tetrahydrofolát. Další metabolickou drahou přítomnou v hydrogenosomech T. vaginalis je metabolismus polyaminů. Polyaminy jsou sloučeniny, které se díky svému kladnému náboji za fyziologických podmínek váží k fosfolipidům, proteinům, nukleovým kyselinám a ovlivňují jejich stabilitu. Mají vliv na genovou expresi a diferenciaci buněk. Slouží také jako ochrana před oxidativním stresem (Feuerstein et al. 1990). V giardii a trichomonádách je arginin metabolizován na polyamin putrescin pomocí arginin dihydrolázové dráhy bakteriálního typu. V reakci vzniká vysokoenergetická molekula karbamoylfosfát, která je dále štěpena karbamát kinázou za vzniku ATP. Tato dráha představuje pro parazita v hostiteli pravděpodobně významný zdroj ATP (Yarlett et al. 1994). V genomu T. vaginalis byly nalezeny geny pro tři arginin deiminázy všechny s N-terminální sekvencí připomínající hydrogenosomální targetovací sekvenci. Bylo experimentálně prokázáno, že při overexpresi je arginin deimináza importována do hydrogenosomu (Morada et al. 2011). Proč je první enzym arginin dihydrolázové dráhy jako jediný lokalizován v hydrogenosomu a zbytek dráhy je v cytosolu není známo (Hrdý et al. 2008). 11

12 4.3 Mitosomy Mitosomy jsou dvoumembránové organely příbuzné mitochondriím. Podobně jako hydrogenosomy nemají vlastní genom. Je možné je najít u celé řady anaerobně žijících organismů. Na rozdíl od mitochondrií nebo hydrogenosomů se mitosomy neúčastní energetického metabolismu buňky (nebyly v nich nalezeny žádné enzymy účastnící se syntézy ATP). Mitosomy byly objeveny relativně nedávno pomocí lokalizace mitochondriálního chaperoninu cpn60 v archamoébě Entamoeba histolytica (Tovar et al. 1999, Mai et al. 1999). Později byly mitosomy objeveny i u jiných organismů jako jsou Giardia intestinalis, některé mikrosporidie (Trachypleistosphora hominis, Encephalitozoon cuniculi) a Cryptosporidium parvum. Mitosomy jsou z MLO nejmenší jejich velikost se obvykle pohybuje do 0,2 μm. V současnosti je jedinou známou společnou funkcí všech mitosomů (s možnou výjimkou u E. histolytica) syntéza FeS center, o které se více zmíním v kapitole 4.5. Mitosomy E. histolytica hrají pravděpodobně roli také v detoxifikaci peroxidů, protože zde byl nalezen enzym Ruberithrin (Rbr) (Maralikova et al. 2010) a v aktivaci síry proteomickou studií zde byla nalezena ATP sulfuryláza, APS kináza a anorganická pyrofosfatáza (Mi-ichi et al. 2009). Mitosomy cryptosporidií jsou v mnoha ohledech zajímavé. Lidští parazité Cryptosporidium parvum a Cryptosporidium hominis mají mitosomy, které ztratily cyklus trikarboxylových kyselin (TCA) s výjimkou málát-quinon oxidoreduktázy (MQO) a ztratily též všechny podjednotky ATP syntázy kromě podjednotek α a β. Místo pyruvát dehydrogenázového komplexu (PDH) využívají cryptosporidie pyruvát-nadp+ oxidoreduktázu (PNO), který byl u C. parvum lokalizován v cytosolu a krystaloidním tělísku (Ctrnacta et al 2006). Mitosom C. parvum je schopen využívat nekompletní dýchací řetězec k produkci membránového potenciálu (Henriquez et al. 2005). V genomech C. parvum a C. hominis byly dále nalezeny geny pro následující mitochondriální proteiny: alternativní NADH dehydrogenázu, alternativní oxidázu (AOX) a NADH transhydrogenázu (Abrahamsen et al. 2004, Xu et al. 2004). Na rozdíl od lidských cryptosporidií má mitosom C.muris (parazit hlodavců) kompletní TCA a funkční ATP syntázu. Mitosomy některých cryptosporidií jsou schopné produkce ATP, čímž se vymykají z definice mitosomu a není tedy zcela jasné, kam tyto organely zařadit, zda mezi mitochondrie nebo mezi mitosomy (Mogi and Kita 2010). 4.4 Obtížně zařaditelné MLO Kromě klasických dobře prostudovaných a definovaných zástupců MLO, existuje i celá řada organel, které jsou někde na pomezí mezi jednotlivými skupinami MLO a nebo je o nich jen velmi málo informací. Těmto obtížně zařaditelným nebo málo studovaným organelám se budu věnovat 12

13 v této kapitole. MLO u Blastocystis hominis je poněkud obskurní organelou a dá se o ní říci, že je někde na pomezí mezi hydrogenosomem a mitochondrií. Ačkoli je Blastocystis hominis striktně anaerobní organismus, její MLO má kristy a byl u ní naměřen transmembránový potenciál. Organela také obsahuje DNA, ale chybí u ní některé typické mitochondriální dráhy (Nasirudeen and Tan 2004, Stenzel and Boreham 1996). V EST ( Expressed sequence tag ) sekvencích Blastocystis bylo nalezeno celkem 115 mitochondriálních proteinů, mezi nimi byly i geny pro PFO a [FeFe]hydrogenázu, tedy proteiny obvykle vázané na energetický metabolismus hydrogenosomu. Oba proteiny mají kanonickou mitochondriální targetovací sekvenci (targetováním a targetovacími sekvencemi se budu zabývat kapitole 4.7) a [FeFe]hydrogenáza byla imunofluorescencí lokalizována v MLO. Produkce vodíku však nebyla naměřena (Hampl ústní sdělení). Zajímavé je, že ačkoliv zde byly nalezeny komplexy I a II elektron transportního řetězce, komplexy III a IV a F1FOATPáza nebyly prokázány (Stechmann et al. 2008). Roli posledního komplexu dýchacího řetězce, který předává elektrony kyslíku, by v tomto případě mohla zaujímat alternativní oxidáza (AOX), ta je známá především z rostlin, ale byla nalezená i mezi EST z Blastocystis (Stechmann et al. 2008). Nálevník N. ovalis má podobně zajímavou MLO jako B. hominis. Tato organela je obecně označovaná jako hydrogenosom. Ale na rozdíl od organely B. hominis byla u N. ovalis skutečně naměřena aktivita hydrogenázy (Boxma et al. 2005). Jak již bylo řečeno výše, hydrogenosom N. ovalis je výjimečný přítomností DNA (Akhmanova et al. 1998). Podobně jako u B. hominis byly i zde identifikovány komplexy I a II elektron transportního řetězce. Dále zde byly nalezeny jak geny pro pyruvát dehydrogenázový komplex (PDH) tak pro PFO, ale není známo, který z těchto enzymů je využíván v energetickém metabolismu. Mimo jiné zde byly nalezeny i geny pro několik proteinů TCA a některé elektron transportní flavoproteiny, které jsou obvykle přítomny v mitochondriích (de Graaf et al. 2011). Obě výše popsané organely představují mezistupně mezi mitochondrií a hydrogenosomem, které dále potvrzují teorii o společném původu MLO. Organela, která se nachází u Mastigamoeba balamuthi (volně žijící améby příbuzné E. histolytica), byla původně považována za mitosom, je však zřejmé, že se jedná o hydrogenosom, protože v ní byla naměřena aktivita hydrogenázy (Nývltová ústní sdělení). V EST sekvencích z Mastigamoeba balamuthi bylo nalezeno celkem 21 potencionálně mitochondriálních proteinů. Kromě genů pro syntézu FeS center a Cpn60 zde byly nalezeny též některé geny obvykle asociované s hydrogenosomy PFO, [FeFe]hydrogenáza, pyridin nukleotid transhydrogenáza (PNT) a jablečný enzym. Žádný z těchto proteinů neobsahuje N-terminální mitochondriální targetovací presekvenci. U Cpn60 bylo imunofluorescencí prokázáno, že u mastigaméby lokalizuje do malých početných organel, zřejmě hydrogenosomů. Elektronovou mikroskopií bylo potvrzeno, 13

14 že tyto organely mají dvojitou membránu a že jsou pravděpodobně mitochondriálního původu (Gill et al. 2007). Lokalizace dráhy pro syntézu FeS center a ostatních proteinů u mastigaméby není v současné době známa. Organely připomínající MLO byly nalezeny i u dalších protist. Většina z nich spadá do skupin, které jsou málo studované, a zpravidla je velmi málo informací o jejich biochemických vlastnostech. Údaje o většině z nich se obvykle omezují na snímky z elektronového mikroskopu. Organely s dvojitou membránou bez krist byly nalezeny u některých amoebozoí. Kromě již zmíněné E. histolytica a M. balamuthi se jedná o M. punctachora, M. simplex, Mastigella commutans (Walker et al. 2001) a Pelomyxa palustris (Seravin and Goodkov 1987). U P. palustris a M. commutans je tato organela asociována s methanogenními endosymbiotickými bakteriemi a je tedy pravděpodobné, že je schopná produkce H2 a že se tedy jedná o hydrogenosom (van Bruggen et al. 1985,1988, Walker et. al. 2001). Ve skupině Metamonada se kromě známých a dobře prostudovaných mitosomů giardie a hydrogenosomů trichomonád vyskytuje i celá řada organismů, u kterých byly pomocí elektronové mikroskopie nalezeny organely morfologicky připomínající MLO Spironucleus vortens (Sterud and Poynton 2002), Spironucleus elegans (Brugerolle et al. 1973), Dysnectes brevis (Yubuki et al. 2007), Carpediemonas membranifera (Simpson and Patterson 1999), Chilomastix cuspidata (Weerakoon et al. 1999), Trimastix marina (Simpson et al. 2000) a Trimastix pyriformis (O'Kelly et al. 1999). S výjimkou rodu Trimastix (kapitola 4.11) a Spironucleus barkhanus, u kterého byly nalezeny geny pro Cpn60 (Horner and Embley 2001), o těchto organismech nejsou známa žádná molekulární nebo biochemická data. Heterolobosea mají obvykle aerobní mitochondrii. U některých zástupců této skupiny se však vyskytují organely, o kterých se obecně předpokládá, že jsou to hydrogenosomy. Psalteriomonas lanterna má MLO asociované s methanogenními bakteriemi. Tyto bakterie pravděpodobně využívají vodík produkovaný těmito organelami, takže se tedy zřejmě jedná o hydrogenosomy (Broers et al. 1990, 1992). Tento předpoklad potvrzuje i nález ferredoxinu (Hackstein et al. 2001) a nález [FeFe]hydrogenázy, PFO a Hsp60 v EST sekvencích (de Graaf et al. 2009). Podobné MLO byly nalezeny i u Lyromonas vulgaris (dnes Psalteriomonas vulgaris) (Broers et al. 1990). Podobně jako u P. lanterna i tyto organely jsou asociované s methanogenními bakteriemi. V těchto organelách byla nalezena [FeFe]hydrogenáza (Broers et al. 1993). U Monopylocystis visvesvarai byly popsány organely, které by mohly být MLO (O`Kelly et al. 2003). U Sawyeria marylandensis byly popsány kulovité organely s dvojitou membránou a žíhanou elektrondenzní matrix (O`Kelly et al. 2003). Améba Vahlkampfia anaerobica má poměrně velké (až 1,5 μm) dvoumembránové organely bez krist (Smirnov and Fenchel 1996). Dále byly možné MLO nalezeny u Percolomonas descissus (Brugerolle and Simpson 2004) a extrémně halofilního 14

15 Pleurostomum flabellatum (Park et al. 2007). Euglenozoa mají obvykle klasicky vypadající aerobní mitochondrie s kristami. I zde se však najdou výjimky. Mitochondrie Euglena gracilis jsou zajímavé tím, že jsou fakultativně anaerobní jsou schopné produkovat ATP i za anaerobních podmínek. To je možné díky přítomnosti enzymu PNO, který vznikl spojením genu pro PFO a genu pro NADPH-cytochrom P450 oxidoreduktázu. PNO nalezená u Euglena gracilis je příbuzná s PNO u Cryptosporidium parvum na rozdíl od něj však má N-terminální targetovací sekvenci (Rotte et al. 2001). U dvou anaerobních euglenozoí Postgaardi mariagerensis (Fenchel et al. 1995, Simpson et al 1997) a Calkinsia aureus (Yubuki et al. 2009) byly nalezeny organely, které mají dvě membrány. O těchto organelách nejsou žádná biochemická data. Andalucia incarcerata organismus řazený mezi jakobidy má dvoumembránové organely podobné mitochondriím. Jediné informace o těchto organelách jsou z elektronového mikroskopu (Simpson and Patterson 2001). Zajímavé je, že její blízký příbuzný Andalucia godoyi má klasickou mitochondrii s tubulárními kristami (Lara et al. 2006). Breviata anathema, která se fylogeneticky řadí na bázi amoebozoí, má velkou (4-5 μm) rozvětvenou dvoumembránovou organelu bez krist (Walker et al. 2006). O této organele opět nejsou žádné biochemické ani molekulární informace, její zařazení a funkce jsou tedy nejasné. 4.5 Společné znaky MLO ( mitochondrion-like organelles ) Všechny MLO jsou tzv. semiautonomní organely, buňka tedy není schopna je syntetizovat de novo a musí je získat z mateřské buňky. Dělení probíhá nezávisle na buněčném dělení mitochondrie a hydrogenosomy se mohou replikovat v kterékoliv fázi buněčného cyklu, o dělení mitosomů se neví skoro nic. U hydrogenosomů a mitochondrií probíhá dělení podobnými mechanismy (1) segmentací, kdy jsou protažené organely rozděleny vnějšími membránovými profily, (2) přehrazením, při kterém jsou organely rozděleny vnitřním membránovým septem, a (3) srdcovitou formou (hearth-shape), kdy jsou organely rozděleny postupnou invaginací membrány (Benchimol and Engelke 2003). V membránách hydrogenosomů Trichomonas vaginalis byl též nalezen kardiolipin fosfolipid, který se vyskytuje pouze v mitochondriální membráně (De Andarare Rosa et al. 2006). Společným biochemickým znakem všech mitochondriálních organel, s možnou výjimkou u mitosomu Entamoeba histolytica a hydrogenosomu Mastigamoeba balamuthi (Ali et al. 2004, Gill et al. 2007), je přítomnost dráhy pro syntézu FeS center (Tachezy et al. 2001; Sutak et al Doležal et al. 2007). FeS centra jsou anorganické kofaktory, které jsou zcela nezbytné pro správnou funkci mnoha proteinů. FeS centra mohou být na proteiny přenesena i bez katalyzátorů, zpravidla je 15

16 však tento proces v buňce zprostředkováván zvláštním komplexem pro syntézu FeS center (ISC assembly). FeS centra jsou nejprve poskládána na proteinovém lešení (scaffold), z něhož jsou poté přenesena na cílový protein. První krok je katalyzován pomocí cystein desulfurázového komplexu (IscS/Isd1), který je donorem síry (cysteinu) pro IscU. Protein IscA působí jako alternativní proteinový scaffold pro maturaci FeS center (Johnson and Dean 2005). Ke správnému skládání FeS skupin jsou rovněž potřebné redukční ekvivalenty, které poskytuje [2Fe2S] ferredoxin. Dalším proteinem účastnícím se syntézy FeS center je frataxin tento protein je obvykle vysoce konzervovaný a účastní se syntézy hemu a FeS center v mitochondrii, kde slouží pravděpodobně jako donor železa. Frataxin byl pomocí imunofluorescenční mikroskopie lokalizován v hydrogenosomu Trichomonas vaginalis (Doležal et al. 2007). Pokusnou expresí v kvasince bylo prokázáno, že frataxin z T. vaginalis dokáže funkcí nahradit svůj mitochondriální homolog v kvasince (Doležal et al. 2007). Systém chaperonů zahrnující Hsp70 a ADP/ATP nukleotide exchange faktor se pravděpodobně následně účastní přenosu FeS center na protein a maturace celého komplexu (Sutak et al. 2004). Proteomická studie provedená na mitosomech Giardia intestinalis potvrdila přítomnost proteinů účastnících se syntézy FeS center IscS, IscU, Nfu a další. V porovnání s mitochondriemi Saccharomyces cerevisiae a Trypanosoma brucei však některé proteiny účastnících se syntézy FeS center chybí (Tovar et al. 2003, Jedelsky et al. 2011). Schopnost mitosomů giardie skládat FeS centra byla prokázána biochemicky (Tovar et al. 2003). Proteiny Isc dráhy byly nalezeny v mitosomu apikomplexa Cryptosporidium parvum (LaGier et al. 2003). U archaméb E. histolytica a M. balamuthi byl nalezen nehomologní NIF systém (podjednotky NifU a NifS) podílející se na syntéze FeS center zdá se, že tyto améby nahradily mitochondriální ISC systém jednodušším bakteriálním NIF systémem, který pravděpodobně získaly horizontálním genovým transferem z ε-proteobakterií (Ali et al. 2004). Experimentální expresí v Escherichia coli bylo prokázáno, že koexprimované podjednotky NifS a NifU entaméby jsou nezbytné a dostatečné pro tvorbu FeS center (Ali et al. 2004). Pomocí imunofluorescenční mikroskopie byla odhalena atypická distribuce podjednotek NIF systému v buňce entaméby NifS a NifU lokalizují jak do cytosolu tak do mitosomů. Imunoelektronovou mikroskopií bylo zjištěno, že koncentrace NIF je v mitosomech zhruba 10x vyšší než v cytosolu (Maralikova et al. 2010). Mitosomální NIF systém nejspíše slouží k tvorbě FeS center v mitosomu, protože je nepravděpodobné, že by v cytosolu vytvářená FeS centra byla transportována do mitosomu nejsou známé přenašeče, které by to umožňovaly (Maralikova et al. 2010). Dalším společným znakem MLO je přítomnost mitochondriálních heat-shock proteinů Hsp70, Hsp60 (Cpn60) a Hsp10 (Cpn10) (Bui et al. 1996), které jsou konzervované u většiny eukaryot a napomáhají správnému skládání proteinů. Hsp70 také napomáhá importu proteinů do organely (viz níže) (Walter nad Buchner 2002). 16

17 Transport metabolitů do MLO a naopak patří také mezi společné znaky těchto organel. Mitochondriální přenašeče (MCF mitochondrial carrier family) jsou skupinou proteinů, která přenáší ATP, ADP, NADH a další metabolicky významné molekuly mezi cytosolem a mitochondrií. Obecně lze předpokládat, že tyto proteiny budou zachovány u organismů s hydrogenosomy, protože hydrogenosomy syntetizují ATP, které je nutné transportovat do cytosolu, aby mohlo být využito. U mitosomů nelze předpokládat, že by tyto přenašeče transportovaly ATP do cytosolu. Mohou však transportovat ATP do mitosomu nebo se podílet na transportu FeS center. U Trichomonas vaginalis a Trichomonas gallinae byl objeven Hmp31, protein z rodiny MCF přenašečů. Tento protein patří do rodiny ATP/ADP přenašečů (AAC). Další studium tohoto proteinu ukázalo, že je odlišný od Hmp31 proteinů z hydrogenosomů a mitochondrií jiných organismů. Největším rozdílem je rezistence proti kyselině bongkrekové, která jiné AAC přenašeče inhibuje (Dyall et al. 2000, Tjaden et al. 2004). V genomu mikrosporidie Encephalitozoon cuniculi byly nalezeny čtyři geny pro MCF, tři tyto proteiny jsou lokalizovány na cytoplasmatické membráně a předpokládá se, že slouží k získávání ATP od hostitele. Čtvrtý protein je lokalizován v membráně mitosomu, kde pravděpodobně slouží k transportu ATP potřebného pro tvorbu FeS center do mitosomu (Tsaousis et al. 2008). Dalším společným znakem MLO je přítomnost mechanismu pro import proteinů, jedná se o komplikovaný systém skládající se z mnoha podjednotek, který umožňuje transport proteinů do mitochondrie. Popisu tohoto transportního komplexu se budu věnovat v následující kapitole. 4.6 Import proteinů do MLO Klasické mitochondrie sice mají genom, ale oproti jejich pravděpodobnému předkovi αproteobakterii je jejich genom značně redukován a mnoho genů bylo přesunuto do jaderného genomu. Průměrně je v mitochondriálním genomu kódováno kolem 40 proteinů. Mitochondriální proteom je však tvořen přibližně tisícem proteinů. Z toho vyplývá, že většina proteinů, která se nachází v mitochondrii, je kódována v jádře a translatována na cytosolických ribozomech. Aby se tyto proteiny mohly dostat přes dvojitou membránu mitochondrií, musel se vyvinout systém přenašečů. V první fázi importu do mitochondrie proteiny obvykle vstupují pomocí TOM komplexu do mezimembránového prostoru a jejich další osud záleží na jejich targetovací sekvenci. Proteiny určené do mitochondriální matrix a do vnitřní mitochondriální membrány jsou z TOM komplexu přeneseny na TIM23 komplex, který je pomocí proteinu PAM (presequence translocase-associated motor) přenese do mitochondriální matrix, kde je následně targetovací sekvence odštěpena. Proteiny určené pro vnitřní mitochondriální membránu mají obvykle několik transmembránových 17

18 helixů a jsou obvykle s vnitřní syntetizovány targetovací sekvencí. Často se jedná o vysoce hydrofobní proteiny fungující mitochondriální jako přenašeče (AAC ATP/ADP carriers aj.). Tyto proteiny jsou po průchodu TOM komplexem přeneseny na komplex TIM22, který je vloží do vnitřní Obr. 2 Schéma základních typů transportu do mitochondrie: Všechny čtyři typy proteinových prekurzorů jsou přenášeny pomocí TOM komplexu do intermembránového prostoru. Proteiny s Nterminální presekvencí (zelené) jsou z TOM komplexu přeneseny na TIM23 a pomocí PAM komplexu jsou importovány do mitochondriální matrix. Proteiny s α-helixy (modrá) jsou pomocí TIM22 vloženy do vnitřní mitochondriální membrány a β-barelové proteiny (fialová) jsou vkládány do vnější membrány SAM komplexem. Prekurzory β-barelových a α-helikálních membránových proteinů jsou v intermembránovém prostoru maturovány malými TIMy. Malé proteiny proteiny intermembránového prostoru bohaté na cystein (červená) jsou importovány MIA komplexem, který je zároveň maturuje. Oxa1 vkládá mitochondriálně kódované proteiny do vnitřní mitochondriální membrány (žlutě). Převzato z Hewitt et al mitochondriální membrány. Proteiny mezimembránového prostoru mají vnitřní targetovací signál a charakteristický Cys motiv. Prekurzory těchto proteinů jsou importovány pomocí TOM komplexu a MIA (mitochondrial intermembrane space assembly), která oxiduje Cys skupiny, do mezimembránového prostoru. Proteiny vnější mitochondriální membrány jsou translatovány s neodštěpitelnou targetovací sekvencí. Vnější membrána obvykle obsahuje 2 typy integrovaných proteinů: α-helikální proteiny, které jsou v membráně ukotveny pomocí α-helixu, nebo póry formující β-barelové proteiny složené z několika transmembránových β-listů. Import těchto proteinů zprostředkovává TOM komplex, intermembránový SAM komplex a intermembránové chaperony (viz. schéma mitochondriálních transportů Obr. 2). TOM komplex se skládá z centrální složky Tom40, tří receptorových proteinů Tom20, Tom22 a Tom70 a dále z několika malých TOM proteinů. Receptorový protein Tom20 rozpoznává hydrofobní sekvence a Tom22 rozpoznává kladně nabitý povrch N-terminální sekvence. Receptorové proteiny zprostředkovávají přenos prekurzorového proteinu na Tom40, který tvoří vlastní pór. Proteiny mohou přes Tom40 procházet pouze v lineární formě. Po průchodu přes Tom40 prekurzorový protein asociuje s mezimembránovým koncem Tom22 odkud následně přechází na Tim21. Translokace přes vnitřní membránu probíhá přes Tim23, který tvoří pór. Dalšími proteiny 18

19 Obr. 3 transportní systém mitochondrie a mitosomu Srovnání proteinů mitochondriálních importních systémům, nalezených pomocí HMM, do klasické mitochondrie améby a do mitosomu E. histolytica. Nalezené proteiny jsou vybarvené šedě. Proteiny, které byly nalezeny v mitochondriích živočichů (animalia) a hub (fungi) ale ne u dictyostelia jsou bíle. Převzato z Doležal et al tvořícími TIM komplex jsou Tim50 a Tim21, které jsou v mezimembránovém prostoru a tvoří spojku mezi komplexy TOM a TIM, dále pak se translokace účastní Tim17. Tim50 je pevně asociován s Tim23 a reguluje jeho funkci pór tvořený Tim23 je natolik velký (může jím procházet protein ve formě α-helixu), že kdyby byl neustále otevřený, mohlo by dojít k úniku iontů a ztrátě potenciálu na vnitřní membráně. Tim21 soupeří s Tom22 o prekurzor proteinu a umožňuje tak disociaci komplexu prekurzor-tom22 a přenos prekurzoru na Tim50 a Tim23. (Doležal et al. 2006, Endo et al. 2011, Hewitt et al. 2010, Lithgow and Schneider 2010, Schmidt et al. 2010). Pomocí bioinformatického screeningu a Hidden Markovovývh modelů (HMM) byly identifikovány geny pro Sam50, Tim17, Tim22, Tim23, Tim44, Hsp70 a Pam18 v genomu T. vaginalis. Jestli některý z těchto proteinů funguje jako translokáza není známo (Doležal et al. 2005). Podobná situace je i u G. intestinalis, kde byly prokázány geny pro Hsp70, Pam18, které mají mitosomální targetovací sekvence, a Tom40, jenž byl lokalizován v mitosomu a je součástí vysokomolekulárního komplexu (Dagley et al. 2009). V genomu Entamoeba histolytica byly nalezeny geny pro Hsp70 a homolog Tom40 (Aguilera et al. 2008) (srovnání s mitochondrií Obr. 3) a pomocí HMM zde byly odhaleny geny pro Sam50 a ATP/ADP přenašeč (Doležal et al. 2010). Overexpresí v kvasince bylo prokázáno, že AAC entaméby je importován do mitochondrie (Doležal et al. 2010). Většina proteinů účastnících se transportu do MLO (výjimkou jsou Hsp70 a Sam50) nemá homolog v α-proteobakterii. Z toho se usuzuje, že tato translokační mašinerie se vyvinula až po endosymbióze mitochondrie (Doležal et al. 2006). 4.7 Targetovací sekvence do MLO Studie provedené na kvasince S. cerevisiae prokázaly, že existují tři hlavní způsoby importu proteinů do mitochondrií, které jsou asociovány s určitým typem targetovacích sekvencí prvním typem je N-terminální presekvence na prekurzoru proteinu. Tyto presekvence jsou obvykle po 19

20 importu prekurzorového proteinu do mitochondrie proteolyticky odštěpeny pomocí k tomu určených peptidáz. Druhým způsobem je interní targetovací signál nacházející se uvnitř proteinové sekvence. Třetím typem jsou C-terminální targetovací sekvence, které jsou nejméně prostudované. Téměř všechny rozpustné a některé membránové proteiny mají klasickou N-terminální targetovací sekvenci prvního typu, která je dobře prostudována. N-terminální targetovací sekvence jsou obvykle dlouhé aminokyselin, kladně nabité a tvoří amfipatický α-helix, který je rozpoznáván komplexy TOM (podjednotkami Tom20 a Tom22) a TIM (podjednotkou Tim23) (Yamano et al. 2008). Proteiny určené do vnitřní mitochondriální membrány mají kromě toho ještě hydrofobní signál, který zastavuje translokaci přes vnitřní membránu. Bylo experimentálně ověřeno, že N-terminální sekvence je dostatečná i pro transport nemitochondriálních proteinů do matrix mitochondrie (Lemire et al. 1989). Struktura mitochondriálních targetovacích sekvencí je relativně konzervovaná ve všech šesti eukaryotických říších pokud byly mitochondriální proteiny z živočichů (animalia) nebo hub (fungi) experimentálně přeneseny do buněk organismů z jiných říší, byly v těchto buňkách úspěšně přeneseny do mitochondrií (Hausler et al. 1997, Doležal et al. 2005, Burri et al. 2006, Uboldi et al. 2006). N-terminální targetovací sekvence obvykle obsahují také sekvence usnadňující tvorbu αhelixu a procesování pomocí IMP (inner membrane protease) a MPP (mitochondrial processing peptidase), které odštěpí N-terminální sekvenci poté, co se protein dostane na místo určení. Tyto proteázy se vyvinuly z bakteriálních procesujících peptidáz (Burri et al. 2006, Smid et al. 2008). 4.8 [FeFe]Hydrogenáza a Pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáza Tyto dva enzymy jsou jedněmi ze základních enzymů anaerobního energetického metabolismu protist. V různých organismech mohou být lokalizovány do různých buněčných kompartmentů, cytosolu (u entaméby a giardie), mitochondrií a různých MLO (např. Trichomonas vaginalis). U některých fotosyntetických protist jsou lokalizovány do chloroplastu (Chlamydomonas reinhardtii) (Mus et al. 2007). PFO je enzym zodpovědný za dekarboxylaci pyruvátu a produkci acetyl-coa a dvou elektronů (Charon et al. 1999). Tyto elektrony jsou pak přeneseny na ferredoxin a následně na [FeFe]hydrogenázu, kde jdou použity k produkci vodíku (van Giezen et al. 2005). U některých organismů (Euglena a Cryptosporidium) existuje PNO, což je fúzní protein vzniklý spojením Nterminální domény PFO s C-terminální doménou NADPH cytochrom P450 oxidoreduktázy. PNO dekarboxyluje pyruvát na acetyl-coa, ale protony nejsou přenášeny na ferredoxin, ale na NADP+ a je produkováno NADPH. Hydrogenázy jsou relativně konzervované proteiny katalyzující reversibilní reakci: H2 2H++2e-. Existují tři základní typy hydrogenáz [FeFe]hydrogenázy, [NiFe]hydrogenázy a 20

21 Obr.4 - Fylogenetický strom pro PFO. Eukaryotické organismy jsou zvýrazněny šedě. Strom byl vytvořen metodou maximum likelihood. Hodnoty na uzlech představují RAxML bootstrap a bayesiánskou posteriorní pravděpodobnost. Převzato z Hug et al třetí typ hydrogenáz, který neobsahuje FeS centra a je někdy označován jako [Fe]hydrogenáza. Tento typ hydrogenázy je zcela odlišný od [NiFe] a [FeFe]hydrogenáz a vyskytuje se pouze u několika methanogenních archebakterií. Z hlediska eukaryot jsou důležité pouze [FeFe]hydogenázy ([NiFe]hydrogenázy jsou pouze u archeií a bakterií). Hydrogenázy u eukaryot lze rozdělit podle lokalizace na cytosolické a mitochondriální (Meyer et al. 2007). Trichomonas vaginalis, Neocallimastix a Piromyces obsahují dlouhou formu [FeFe]hydrogenázy, která podobně jako některé eubakteriální hydrogenázy obsahuje čtyři FeS centra u N-terminálního konce (Horner et al. 2002). Rod Trichomonas má navíc ještě 2 krátké 21

22 Obr.5 Fylogenetický strom sekvencí [FeFe]hydrogenáz. Eukaryotické organismy jsou zvýrazněny šedě. Strom byl vytvořen metodou maximum likelihood. Hodnoty na uzlech představují RAxML bootstrap a bayesiánskou posteriorní pravděpodobnost. Převzato z Hug et al formy [FeFe]hydrogenázy, které nemají terminální 2Fe2S centrum a první 4Fe4S centrum (Embley et al. 1995). [FeFe]hydrogenáza u nálevníka N. ovalis je odlišná od hydrogenáz ostatních eukaryot, liší se tím, že váže dvě NADH dehydrogenázové podjednotky (paralogy 24kDa a 51kDa podjednotek mitochondriálního komplexu I NuoF a NuoE). Pravděpodobně je schopná přímo reoxidovat NADH. N. ovalis ji nejspíše získal laterálním genovým přenosem z jiného zdroje než ostatní eukaryota, pravděpodobně z β-proteobakterií (Horner et al. 2000, Boxma et al. 2007). 22

23 Pro správnou funkci hydrogenáz je nutná jejich maturace pomocí specifických maturáz HydE, HydF a HydG (Meyer et al. 2007). Je zajímavé, že kompletní sada těchto maturáz byla dosud nalezena pouze u dvou eukaryotických organismů (Trichomonas vaginalis, Chlamydomonas reinhardtii), jedna z maturáz HydG byla také nalezena v sekvencích Mastigamoeba balamuthi, Andalucia incarcerata, Trimastix pyriformis a Acantamoeba castellanii (Hug et al. 2010). Přestože některé organismy postrádají maturázy hydrogenáz, jsou jejich [FeFe]hydrogenázy schopné produkce vodíku (Giardia intestinalis), i když ve značně menším množství než organismy, které maturázy mají (Lloyd et al. 2002). Fylogenetická studie provedená na PFO, [FeFe]hydrogenázách a maturázách hydrogenáz (Hug et al. 2010) prokázala, že tyto proteiny pravděpodobně nejsou mitochondriálního původu. To znamená, že byly pravděpodobně získány pomocí laterálního genového přenosu (LGT) z jiného zdroje (Obr. 4 a 5). Většina současných αproteobakterií dokonce ani nemá geny pro tyto proteiny. Na fylogenetických stromech tvoří sekvence eukaryotických [FeFe]hydrogenáz několik nezávislých skupin a je tedy možné, že [FeFe]hydrogenázy se do eukaryotické buňky dostaly několikrát nezávisle na sobě (Obr. 5). Naproti tomu v případě maturáz (HydE, HydF a HydG) tvoří všechna eukaryota na fylogenetickém stromě dobře podpořenou skupinu. Podobná situace jako panuje u hydrogenáz, je i u PFO, kde většina eukaryotických sekvencí tvoří jeden klád, byť s nízkou podporou. Výjimku však tvoří PFO oxymonád a Trimastix pyriformis, které se větví jinde (Obr. 4) (Hug et al. 2010). Bylo prokázáno, že geny pro proteiny připomínající [FeFe]hydrogenázu se vyskytují i u aerobních organismů včetně člověka. Tyto tzv. NARF-like proteiny obsahují unikátní vodíkový klastr, který definuje [FeFe]hydrogenázy. Zda jsou tyto proteiny skutečně schopné produkovat vodík, není známo. O NARF proteinech se předpokládá, že se účastní procesování laminu proteinu, který je nezbytný pro udržení strukturní integrity jádra (Horner et al. 2002, Meyer et al. 2007). 4.9 PNT (Pyridin:nukleotid transhydrogenáza) Pyridin:nukleotid transhydrogenáza patří mezi tzv. AB-specifické transhydrogenázy tj. transhydrogenázy, které transportující protony. PNT je protonová pumpa vnitřní mitochondriální membrány, která katalyzuje přenos vodíku z NADH na NADP+ a to je spřaženo s transportem protonu přes membránu, jak shrnuje následující rovnice: H+out + NADH + NADP+ H+in + NAD+ + NADPH 23

24 kde in označuje mitochondriální matrix a out mezimembránový prostor. PNT pracuje jako protonová pumpa v obou směrech. Ale v přítomnosti protonového gradientu probíhá reakce z leva do prava zhruba desetkrát rychleji. Jednomu odpovídá přenesenému jeden protonu přenesený vodíkový iont. Transhydrogenázou generované NADPH je esenciální pro udržení cytosolického/mitochondriálního NADPH/NADP+ nezbytného pro poměru detoxifikaci, udržení homeostázy Ca2+ a regulaci Obr.6 Schéma uspořádaní podjednotek PNT v membráně E. coli. Podjednotka je značena bíle a podjednotka je vybarvena šedě. Doména I je rozdělena na 2subdomény. Subdoména Ib obsahuje NAD(H) vazebné místo. Doména II tvoří transmembránový kanál a doména III obsahuje vazebné místo pro NADP(H). Obrázek převzat z Bizouran et al apoptózy. PNT u Escherichia coli se skládá ze dvou typů podjednotek α podjednotka má velikost kolem 54 kda a β podjednotka asi 48 kda. V nativním stavu je PNT tetramer tvořený dvěma αpodjednokami a dvěma β-podjednotkami. Jako všechny proton transportující (AB-specifické) transhydrogenázy je i PNT u E. coli tvořena třemi doménami (Obr. 6). Hydrofilní doména I obsahuje vazebné místo pro NAD(H), doména II je hydrofobní a obsahuje transmembránové αhelixy (Obr. 7). Tato doména obsahuje konzervovaný βhis91, o kterém se předpokládá, že je zodpovědný za přenos protonů. Doména III je opět hydrofilní a obsahuje vazebné místo pro NADP(H). Eukaryotické transhydrogenázy se liší od bakteriálních svou syntézou jsou syntetizovány jako homodimer, ve kterém každý monomer obsahuje podjednotku α i β. U prokaryot jsou podjednotky α a β syntetizovány jako samostatné proteiny, pořadí a funkce domén v komplexu je však u prokaryotických a eukaryotických transhydrogenáz stejná. Domény I a III jsou lokalizovány směrem do matrix mitochondrie (cytosolu bakterie). U prokaryotických organismů a některých protozoálních parazitů má doména II 13 transmembránových α-helixů (Kramer et al. 1993, Meuller and Rydstrom 1999), u mitochondriálních transhydrogenáz vyšších eukaryot má doména II 14 transmembránových α-helixů (Olausson et al. 1995). U eukaryot se PNT až na výjimky (kvasinka S. cerevisiae) vyskytuje ve vnitřní membráně klasických mitochondrií, byla ale také nalezena v genomech mnoha protist Entamoeba histolytica, Eimeria tenella, Mastigamoeba balamuthi, Trimastix pyriformis, Entamoeba dispar, Perkinsus 24

25 Obr.7 Schéma uspořádání transmembránových helixů u PNT domény II (E. coli). Doména II tvoří transportní kanál pro transport protonů přes membránu. Helixy H1 - H4 jsou tvořeny podjednotkou a helixy H6 H14 jsou tvořeny podjednotkou. Obrázek převzat z Bizouran et al marinus, Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Paramecium tetraurelia, Cryptosporidium muris, Cryptosporidium hominis, Blastocystis hominis a dále pak u většiny savčích plasmodií (vlastní průzkum databáze Genbank). Naopak chybí v genomech Trichomonas vaginalis a Giardia intestinalis. Lokalizace tohoto enzymu nebyla kromě entamoeby u protist studována. U entamoeby překvapivě není PNT lokalizována v MLO, ale je lokalizována na jiných měchýřcích, zřejmě fagosomech nebo lysosomech (Yousuf et al. 2010) Oxymonády Oxymonády jsou skupinou bičíkatých protozoí, která je součástí říše Excavata (Simpson et al. 2002) a v rámci ní je řazena do podskupiny Metamonada (Cavalier-Smith 2003). Do říše Excavata je řazena na základě podobnosti cytoskeletu a díky několika fylogenetickým studiím (Simpson et al. 2006, Hampl et al. 2005, 2009). Jedná se o skupinu anaerobních či mikroaerofilních, komenzálních nebo endosymbiotických prvoků. Oxymonády nejčastěji obývají střevo nižších termitů a dřevem se živících švábů, některé skupiny ale žijí i u jiného hmyzu a zástupci rodu Monocercomonoides žijí také ve střevě obratlovců. Oxymonády jsou jednou z posledních větších skupin protist, u kterých dosud nebyla prokázána mitochondrie ani žádné od ní odvozené organely. U oxymonád též nebyly potvrzeny peroxisomy a klasický dyctiozomální Golgiho komplex. Buňka oxymonád má vždy jeden nebo více karyomastigontů. Karyomastigont je u oxymonád tvořen jádrem a čtyřmi bazálními tělísky s bičíky. Bazální tělíska jsou organizována do párů, které jsou od sebe odděleny preaxostylární laminou. Bičíky mohou být u některých rodů 25

26 zmnoženy (Pyrsonympha, Saccinobaculus, Sauromonas) a někdy mohou být zmnožené i celé karyomastigonty (Microrhopalodina a Barroella). Preaxostyl je tvořený dvěma vrstvami první je natočená k jádru a je mikrotubulárního charakteru, druhá vrstva je tvořena neznámým proteinem. Axostyl je útvar tvořený paralelními řadami mikrotubulů, které jsou mezi sebou propojeny můstky. U některých oxymonád je axostyl kontraktilní a slouží jako pohybová organela (Pyrsonymphidae, Saccinobaculidae a Obr.8 Monocercomonoides - ultrastruktura: Terminologie podle Radek (1994), terminologie podle Simpson et al. (2002) je v závorkách. 1, 2, 3, 4 bazální tělíska 1-4; AFl přední bičík; Ax axostyl; DV trávicí vakuola; F vějíř; Pax preaxostyl; Pe pelta; PPG perinukleární polysacharidová granula; R1 mikrotubulární kořen R1; R2 mikrotubulární kořen R2; RFl zpětný bičík; RER hrubé endoplasmatické retikulum; SR proužkovaný kořen. Autor obrázku Eva Nohýnková. Oxymonadidae). Axostyl je s preaxostylem v jaderné oblasti spojen pomocí vrstvy mikrotubulů. Funis neboli mikrotubulární kořen R1 je napojen na bazální tělísko 1 a podkládá rekurentní bičík. Nejpřednější bazální tělísko 4 je u rodu Monocercomonoides asociováno s mikrotubulárním kořenem R2, který podkládá peltu. Pelta je mikrotubulární obal chránící jádro (Obr. 8 a 9) (Simpson et al. 2002). U žádného zástupce oxymonád dosud nebyl osekvenován genom, a protože oxymonády nelze kultivovat v axenické kultuře, jsou biochemické a molekulární studie velmi obtížné. Většina informací je tedy omezena na EST studie a hledání genů v cdna popřípadě gdna. O energetickém metabolismu se předpokládá, že je podobný ostatním dosud studovaným anaerobním zástupcům exkavát. Genom oxymonád je v porovnání s metamonádami (kmen protist v rámci říše Exkaváta kam patří například diplomonády a parabasala) nezvykle bohatý na introny (Slamovits and Keeling et al. 2006). U některých oxymonád (rod Streblomastix a někteří zástupci rodu Monocercomonoides) bylo prokázáno využívání nekanonického genetického kódu, u kterého TAA a TAG nefungují jako stop kodóny, ale místo toho kódují glutamin (Keeling and Leander 2003, de Koning et al. 2008). U některých oxymonád byly pomocí elektronové mikroskopie nalezeny útvary podobné MLO u Pyrsonympha sp., izolované ze střeva termitů, byly popsány velké denzní 26

27 cytoplazmatické struktury (Bloodgood et al. 1974). Tyto podezřelé útvary ovšem nejsou většinou autorů považovány za mitochondrie ani hydrogenosomy, ale spíše za endosymbiotické bakterie. V případě oxymonády Saccinobaculus doroaxostylus, izolované ze střeva švába, však byly popsány elektrondenzní organely, které by mohly být organelami mitochondriálního původu (Carpenter et al. 2008). Organely jsou zhruba kruhového tvaru o průměru 0,51,5 μm a nemají žádnou zjevnou vnitřní strukturu. Počet membrán obklopujících organelu se dosud nepodařilo s jistotou určit, ale na některých snímcích byly pozorovány 2 tmavší vrstvy oddělené světlejší vrstvou a na dalších snímcích byl pozorován pětivrstvý vzor podobný vzoru pozorovanému u hydrogenosomů parabasalidů (Hampl V: Class Oxymonadea. In Handbook of Protoctista II. Eddition (Margulis et al. Ed.), Jones and Bartlett, v tisku) 4.11 Trimastix Nejbližším volně žijícím příbuzným oxymonád je rod Trimastix (Dacks et al. 2001) ten v současné době obsahuje tři zástupce Trimastix marina, Trimastix pyriformis a Trimastix inequalis. Jedná se o volně žijící bičíkovce vyskytující se v anoxických vodách. V buňce Trimastix marina se nachází oválné dvoumembránové organely kruhovitého průřezu, které jsou přibližně 200 nm široké a 300 nm dlouhé. Strukturou připomínají hydrogenosom (Simpson et al. 2000). Tyto organely se nachází na různých místech buňky a na rozdíl od podobných organel popsaných u Trimastix pyriformis nejsou asociovány s cisternami endoplasmatického retikula, i když se často vyskytují v jeho blízkosti. U Trimastix pyriformis byly popsány 27 Obr.9 Monocercomonoides sp. izolovaný z Parasphaeria boleiriana Snímky z transmisního elektronového mikroskopu (A) příčný řez oblastí jádra, (B) podélný řez, (C) Příčný řez axostylem složeným z propojených mikrotubulárních řad. 1, 2, 4 bazální tělíska 1, 2 4; Ax axostyl; B bakterie; BB bazální tělísko; DV trávicí vakuola; N jádro; Pax preaxostyl; Pe pelta; RER drsné endoplasmatické retikulum; měřítko 200 nm. Terminologie podle Radek (1994). Autor obrázků Guy Brugerolle.

28 0,5-1,0μm dlouhé tyčovité organely obklopené dvojitou membránou (O`Kelly et al. 1999). Pomocí EST sekvenování bylo u Trimastix pyriformis nalezeno 19 genů kódující proteiny asociované s mitochondriemi PFO, [FeFe]hydrogenáza (3 různé), HydE, HydG, PNT (obě podjednotky), Cpn60, Tom40, α podjednotka MPP, kompletní GCS komplex (glycine cleavage system) a další. Mimo jiné i akonitáza enzym, který je typický pro aerobní mitochondrie, kde tvoří součást cyklu trikarboxylových kyselin. Čtyři z těchto proteinů obsahovaly prodlouženou Nterminální sekvenci, která však nebyla v použitých software (Mitoprot II, TargetP) rozpoznána jako mitochondriální targetovací sekvence. Analýza sekvencí ukázala, že dvě podjednotky P-proteinu (součást GCS) jsou ve dvou samostatných klastrech transkriptů, každý s poly-a koncem. To naznačuje, že podjednotky P-proteinu jsou pravděpodobně exprimovány samostatně, což je mezi eukaryotními organismy unikátní. Přítomnost těchto genů naznačuje, že organely pozorované u Trimastix pyriformis jsou pravděpodobně homology mitochondrie (Hampl et al. 2008). 28

29 5 Cíle práce: 1) Pokusit se nalézt organelu mitochondriálního typu pomocí transmisní elektronové mikroskopie 2) Vytvořit další cdna z Monocercomonoides, osekvenovat EST sekvence a pokusit se v nich najít transkripty mitochondriálních proteinů 3) Získat co možná nejkompletnější sekvence těchto transkriptů a zjistit jejich fylogenetický původ 4) Vytvořit specifické protilátky proti vybraným proteinům a pokusit se tyto proteiny lokalizovat v buňce Monocercomonoides pomocí imunofluorescenční mikroskopie. 29

30 6 Metody 6.1 Monocercomonoides Pa203 kultivace Monocercomonoides roste podobně jako všechny známé kultivované oxymonády pouze v xenické kultuře s příměsí bakterií v případě kmene Pa203 jsme inokulovali směs bakterií do média několik dní před vlastní inokulací monocercomonoida. Asi 1 ml kultury monocercomonoida jsme očkovali do cca 10 ml média se směsí bakterií každých 5 dnů. Pro kultivaci jsme používali jednofázové médium TYSGM 9 (Diamond 1982). 6.2 Příprava TYSGM - 9 Složení TYSGM - 9 trypton 1g kvasničný autolyzát 0,5 g K2HPO4 1,4 g KH2PO4 0,2 g NaCl 3,75 g dh2o 475 ml inaktivované koňské sérum (GIBCO) 15 ml Vše kromě séra jsme rozpustili v 300 ml destilované vody a upravili ph na 7,2 doplnili jsme destilovanou vodou do 475 ml a sterilizoval autoklávováním. Po vyklávování jsme sterilně přidali 15 ml inaktivovaného (56ºC 30 ) bovinního nebo koňského séra. Médium jsme rozpipetovali po 10 ml do 15 ml zkumavek a uchovávali v lednici ve 4 C. 6.3 Filtrace Abychom minimalizovali bakteriální kontaminaci, tak jsme před přípravou vzorků pro izolaci proteinů nebo gdna kulturu přefiltrovali. Nejdříve jsme kulturu přefiltrovali přes filtrační papír, abychom odstranily velké shluky bakterií. Poté jsme filtrát filtrovali přes filtry Whatman s 3μm póry, kterými bakterie projdou, ale Monocercomonoides ne. Buňky monocercomonoida v prostoru nad filtrem jsme třikrát propláchli čistým médiem TYSGM bez bovinního séra, které bylo vytemperováno na pokojovou teplotu. Filtraci je potřeba provést co nejrychleji, aby nedošlo k velkým ztrátám monocercomonoida. 30

31 6.4 Izolace RNA ethanol/chloroformovou extrakcí Chemikálie: Tri Reagent (Ambion) Chloroform ethanol 75% vychlazený (-20 C) isopropanol dh20 Postup: Izolaci a veškerou práci s RNA jsme prováděli v rukavicích nejlépe v místě přímo vyhrazeném pro práci s RNA a používali jsme nástroje k tomu určené, jinak by mohlo dojít k degradaci RNA působením RNAáz. Buňky jsme nejdříve centrifugovali, 3000 g po dobu 10 minut při 4 C. Následně jsme odstranili supernatant a buňky z peletu jsme resuspendovali v TRI reagent a přenesli do 1,5 ml mikrozkumavky. Pak jsme přidali 200 μl chloroformu. Směs jsme protřepávali na vortexu po dobu 15 s a pak nechali 2 minuty stát při pokojové teplotě. Následně jsme směs centrifugovali na stolní centrifuze na g po dobu15 minut při 4 C. Ve zkumavce se utvořily tři fáze. Horní fázi obsahující RNA jsme opatrně odsáli pomocí pipetmana tak, aby nedošlo k nabrání fáze s proteiny raději jsme odebírali méně RNA, než abychom vzorek kontaminovali proteiny. Horní fáze s RNA jsme přenesli do čisté zkumavky a přidali jsme 500 μl isopropanolu. Zkumavku jsme následně protřepávali na vortexu po dobu 15 s a následně jsme ji ponechali 10 minut stát při pokojové teplotě. Poté jsme ji centrifugovali 10 minut, g, 4 C. Pak jsme odebrali supernatant a přidali jsme ledový (-20 C) 75% ethanol. Zkumavku jsme centrifugovali 10 minut, g 4 C. Supernatant jsme odstranili a pelet jsme vysušili (ne však úplně) a následně rozpustili ve 20 μl dh2o. U takto izolované RNA jsme změřili koncentrace pomocí spektometru Nanodrop a uchovávali při -80 C. 6.5 mrna selekce Selekce mrna z celkové izolované RNA jsme prováděli pomocí kitu Dynabeads mrna purification kit (Invitrogen) podle přiloženého protokolu. Koncentrace mrna jsme následně změřili pomocí spektometru Nanodrop a mrna jsme uchovávali v 80 C 31

32 6.6 Syntéza cdna Pro syntézu cdna jsme použili SMARTerTM PCR cdna Synthesis Kit (Clontech) a syntézu jsme prováděli podle přiloženého protokolu. Nasyntetizovanou cdna jsme uchovávali při -20 C 6.7 PCR (Polymerase chain reaction) Tabulka 1: Použité primery: Primer Monides-PNTbeta-F Monides-PNTbeta-R Monides-PNTalpha-F Monides-PNTalpha-R Monides-PNTbeta-F2 Monides-PNTbeta-R2 Monides-PNTalpha-F2 Monides-PNTalpha-R2 Monides-PNTbeta-R0 Mon-PNTbeta-F-NdeI Mon-PNTbeta-R-XhoI Mon-PNTalfa-F-NdeI Mon-PNTalfa-R-XhoI Cpn60 R - Trim Cpn60 F - Trim SP6 T7 AP1 Sekvence AGG TGC CGT CGA AGC CGT ACA TGT TTG GG TGC CAC TGC ATG CTG CGC CTT TCC CGC T GGG GAG AGT TCC TGA CGG TGA GTG TGA AGG ATC ACA ATC AGG TTC AGC ATC TCC GTC GTC ATG AGCGGGAAAGGCGCAGCATGCAGTGGCA CCCAAACATGTACGGCTTCGACGGCACCT CATGACGACGGAGATGCTGAACCTGATTGTGAT CCTTCACACTCACCGTCAGGAACTCTCCCC CGCATTCCCATACAGCATCCGCGTGTTCTC CATGCATATGCTGGGGATCTTCATTGGG CATGCTCGAGCAGGTTCGCCAGCATCTT CATGCATATGACAGGGCAGATCACGGCA CATGCTCGAGGTTCATCTTCTTCTCCATCAC GCR TCK DYR AHY CDR TCC TTC TTC TC GTT GMY RCS ACM YTM GGH CCM AAR GG ATT-TAG-GTG-ACA-CTA-TAG-AA TAA-TAC-GAC-TCA-CTA-TAG-GG CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC Poznámka pro dna pro dna pro dna pro dna nested PCR na expresi na expresi na expresi na expresi Cpn60 z trimastixe Cpn60 z trimastixe Plasmid Plasmid konce cdna Standardní PCR Standardní nastavení cykleru: -1 cyklus 94 C 4 min -35 cyklů 94 C 30 s C 30 s 72 C 3 min 1 cyklus 72 C 15 minut Standardně používané nastavení cykleru. Teploty annealingu jsme upravovali podle potřeb jednotlivých primerů. 32

33 Složení standardní PCR reakce (50 μl): dh2o (PCR grade) 31 μl 10X PCR pufr (Top-bio) 5 μl MgCl2 (25 mm) (Top-bio) 5 μl dntp mix (10 mm) (Top-bio) 3 μl primer 1 2 μl primer 2 2 μl DNA 1 μl Taq polymeráza (Top-bio) 1 μl Nested PCR Metodu nested PCR jsme používali v případech, kdy byly výsledky PCR nejednoznačné nebo bylo výsledného produktu příliš málo. Pro nested PCR jsme použili speciální primery (viz. Tabulka 1) a teplotu annealingu jsme přizpůsobovali konkrétním primerům Touchdown PCR Pro zvýšení specifity některých PCR reakcí jsme použili metodu touchdown PCR. Tato metoda využívá toho, že při vyšších teplotách annealingu nasedají primery specifičtěji. Proto je v této metodě prvních několik cyklů provedeno při teplotách kolem melting teplot primerů pro selektivní nasedání primerů. Následující cykly jsou pak prováděny při nižších teplotách annealingu pro zvýšení výtěžku PCR reakce. Nespecifické nasedání primerů v těchto cyklech nevadí, protože požadovaná sekvence byla naamplifikována v cyklech s vysokou teplotou a tvoří tedy většinu templátu. Pro touchdown PCR jsme používali standardní primery a následující nastavení cykleru. Nastavení touchdown PCR -1cyklus - 94 C 1min -5cyklů 94 C 30s - 72 C 3,5 min -5 cyklů 94 C 3Os - 70 C 30s - 72 C 3 min -25 cyklů 94 C 20s - 68 C 30s - 72 C 3min 33

34 - 1cyklus 72 C 15min Advantage 2 PCR Advantage 2 PCR (Clontech) kit jsme použili pro sekvenaci úseků DNA, které nešli osekvenovat pomocí klasické PCR. Dále jsme tento kit využily pro sekvenování 3 a 5 konců metodou RACE pomocí primerů komplementárních s adaptéry navázanými na cdna Colony PCR Tuto metodu jsme používali pro ověření přítomnosti požadovaných plasmidů v transformovaných kompetentních buňkách. Případně jsme produkty colony PCR osekvenovali pro kontrolu správnosti sekvence zakódované v plasmidu. Colony PCR probíhala podle standardních protokolů (uvedených výše), místo DNA byl přidán vzorek bakteriální kolonie. 6.8 Koncentrace a přečištění DNA V případě potřeby jsme produkty PCR koncentrovali a vyčistili pomocí DNA clean and concentrator kitu (Zymo research). 6.9 Agarózová elektroforéza Pro ověřování a separaci PCR produktů jsme používali klasickou horizontální agarózovou elektroforézu. Jako elektrodový pufr jsme používali 1x koncentrovaný TAE pufr (BIORAD). Gely jsme nejčastěji používali o koncentraci 1% (0,4 g agarózy na 40 ml 1x TAE) nebo 1,5% (0,6g agarózy, 40 ml 1x TAE). Pro zviditelnění DNA jsme do gelů přidávali barvičku SYBR safe (1:1000). Jako délkový standard jsme používali DNA ladder mix (Fermentas). V případě potřeby jsme pruhy z gelu vyřízli pod modrým světlem a vyčistili pomocí ZymocleanTM Gel DNA recovery kitu (Zymoresearch) Sekvenace DNA Sangerovou metodou Produkty PCR a plasmidy byly sekvenovány v sekvenační laboratoři ( Sekvenační reakce obsahovala 3,2 pmol primeru, 5-10 ng PCR produktu na 100 bp produktu a PCR byla doplněna vodou (PCR grade) do 14 μl. 34

35 6.11 Příprava poly-l-lysinovaných skel Pro přípravu poly-l-lysinovaných skel jsme používali odmaštěná a předčištěná podložní skla SuperFrost Plus (Menzel-Glaser). Poly-L-lysin jsme naředili v poměru 1:10 a podložní skla do něj ponořili na minut. Důležité je pro namáčení používat plastové nádoby. Poté jsme skla vyjmuli a nechali okapat. Skla schla buď při pokojové teplotě přes noc nebo 1h při 55 C Fixace na imunofluorescenci Pro fixaci monocercomonoida na imunofluorescenci jsme používali poly-l-lysinovaná skla. Pomocí injekční stříkačky a jehly jsme do anaerobní komůrky vstříkli kulturu monocercomonoida tak, aby v ní nebyly vzduchové bubliny. Komůrku jsme nechali inkubovat 1 hodinu ve 37 C. Pak jsme komůrku opatrně vyjmuli a injekční stříkačkou odebrali obsah tak, abychom neodplavili monocercomonoidy zachycené na spodním sklíčku. Anaerobní komůrku jsme rozebrali, odsáli přebytečné médium a ihned fixovali Ethanolová fixace Chemikálie: Ethanol 70% ledový (-20 C) Postup: Poly-L-lysinované podložní sklo s monocercomonoidy jsme ponořili na 15 minut do ledového (20 C) 70% ethanolu. Poté jsme ho vyjmuli a odsáli přebytečný ethanol a nechali usušit Methanol/acetonová fixace chemikálie: metanol (-20 C) aceton (-20 C) Poly-L-lysinované sklo s monocercomonoidem jsme ponořili na 10 minut do ledového (-20 C) metanolu, pak jsme sklíčko vyjmuli, odsáli přebytečný methanol a ponořili ho na 1 minutu do ledového (-20 C) acetonu. Odsáli jsme přebytečný ethanol a nechali zaschnout Inkubace s protilátkou (imunofluorescenční barvení) 35

36 Blokační médium 0,25% FISH želatina 0,25% BSA (bovinní sérový albumin) 0,05% TWEEN Použité fluorescenčně značené sekundární protilátky: Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) (Invitrogen) Alexa Fluor 594 goat anti-guineapig IgG (H+L) (Invitrogen) Montážní médium: Vectashield hard mounting medium with DAPI (Vector laboratories) Postup: Preparáty pro imunofluorescenční mikroskopii jsme připravovali na poly-l-lysinových sklech s monocercomonoidem zafixovaným podle výše uvedených protokolů. Přibližně 0,5 ml blokačního média jsme kápli na preparát a nechali ve vlhké komůrce 1 hodinu blokovat. Pak jsem sklepli přebytečné blokační médium a kápli 0,5 ml blokačního média s naředěnou primární protilátkou (optimální koncentraci je nutno vyzkoušet) a nechali 1 hodinu inkubovat ve vlhké komůrce. Promývali jsme 3x 5minut v PBS, po posledním promytí jsme ze sklíčka sklepli přebytečné PBS a přidali 0,5 ml blokačního média s naředěnou sekundární protilátkou (opět je nutné zjistit optimální koncentraci) a inkubovali 1 hodinu ve vlhké komůrce a následně promyli 3x 5 minut v PBS. Sklepli jsme přebytečné PBS a kápli na každé sklíčko kapku montážního média Vectashield s DAPI a překryli krycím sklem, odsáli jsme přebytečné montážní médium a krycí sklo zafixovali lakem na nehty Polyakrylamidová denaturační proteinová elektroforéza (SDS PAGE) Chemikálie: Roztok A: 30% Acrylamide/Bis solution 29:1 (3,3%) (BIORAD) Roztok B: 1g SDS (sodium dodecyl sulfát) v 10ml dh2o Roztok C: 9,1 g Tris (Trizma base) 0,2 g SDS, ph=8,8, doplnit do 100 ml dh2o Roztok D: 3 g Tris, ph=6,8, 0,2g SDS, doplnit do 100ml dh2o 36

37 Roztok E: 1x TGS (BIORAD) Roztok F: 10 mg Bromfenolové modři na 1ml roztoku D bez SDS Roztok G: 1 g persíranu amonného rozpustit v 10ml dh20 Barvicí roztok CBB ( Coomasie brilliant blue ) CBB 250 mg Ethanol 225 ml dh2o 225 ml kys. octová 50 ml Odbarvovací roztok na CBB ethanol 250 ml dh2o 650 ml kys. octová 100 ml Vzorkový pufr I 5x I roztok D (bez SDS) 2,4 ml roztok C 2 ml glycerol 2,5 ml dh2o 1,6 ml roztok F 1 ml 2-merkaptoethanol 0,5 ml 1x I roztok D (bez SDS) 2,4 ml roztok C 2 ml glycerol 1 ml dh2o 4 ml roztok F 0,1 ml 2-merkaptoethanol 0,5 ml Další chemikálie: TEMED (Sigma) Velikostní standard: Pageruler protein ladder plus (Fermentas) 37

38 Pro SDS PAGE jsme používali elektroforézu Biorad mini-protean 3 s gely o rozměrech 7 x 8 cm a spacerem 0,75 mm. Gely jsme pouštěli pod napětím 60 V, poté co vzorky prošly stacking gelem jsme napětí zvýšili na 120 V. Gely jsme namíchali podle následující tabulky (nejčastěji jsme používali 12% gely): A (ml) C (ml) H2O (ml) TEMED (µl) G (µl) 10% 3,4 5 1, gely spacer" 0,75mm 12% 13,50% 15% 4 4, ,8 0, Imunoblot Použité roztoky: PBS NaCl 8g KCL 0,2 g Na2HPO4 1,44 g dh2o 1000 ml Blokační pufr 10%: odtučněné mléko 10 g TWEEN 250 μl PBS 100 ml Blotovací pufr: 10x TGS (BIORAD) 100 ml Metanol 200 ml dh2o 700 ml Ponceau S Ponceau S 0,1 g 38 Stack D (ml) 5% 0,8 2,5 1,6 5 50

39 kyselina octová 5 ml dh2o 95 ml Použité protilátky: Goat Anti-rabbit IgG (whole molekule) Alkaline phosphatase (Sigma) Goat Anti-guinea pig IgG (whole molekule) Alkaline phosphatase (Sigma) Postup: Skla s SDS PAGE gelem jsme opatrně rozebrali a odstranili horní stacking gel. Gel jsme změřili a dali do nádoby s blotovacím pufrem. Filtrační papír na blot jsme nastříhali tak, aby byl na každé straně o 1-2 mm větší než gel a také namočili do blotovacího pufru. Nitrocelulózovou membránu jsme Obr.10 - Uspořádání semidry blotu nastříhat tak, aby byla o cca 2 mm větší než filtrační papíry a opět namočili do blotovacího pufru. Namočené filtrační papíry, nitrocelulózovou membránu a gel jsme poskládali do blotovacího přístroje podle obrázku a přejeli skleněnou trubičkou, abychom vytlačili všechen vzduch. Je důležité, aby se filtrační papíry nedotýkaly. Zavřeli jsme blotovací přístroj a nastavili napětí 1,5 ma na každý cm2 gelu. Blot běžel 1 hodinu. Membránu z blotu jsme vyjmuli a obarvili pomocí Ponceau a tužkou označili sloupce. Odbarvili jsme Ponceau destilovanou vodou, přidali blokační pufr a nechali blokovat přes noc v lednici při 4 C. Blot jsme rozřezali na proužky a přenesli do inkubační vaničky s blokačním pufrem s naředěnou primární protilátkou. Inkubovali 1 hodinu na třepačce při pokojové teplotě. Slili jsme blokační pufr s primární protilátkou a přidali blokační pufr s naředěnou sekundární protilátkou. Inkubovali jsme 1 hodinu na třepačce při pokojové teplotě. Blokační pufr se sekundární protilátkou jsme slili a blot promyli 2x 15 minut v 0,25% roztoku TWEENu v PBS a 1x 15 minut v PBS. Gel jsme vyvolali pomocí vyvolávacího roztoku z tablet SigmaFASTTM BCIP /NBT (Sigma) Příprava protilátek Lyzační pufr Pufr B (1 litr): 100 mm NaH2PO g (NaH2PO4 H2O) 39

40 10 mm Tris Cl 1.2 g 8 M močovina g upravit ph na 8,0 pomocí NaOH. Promývací Pufry Pufr C (1 litr): 100 mm NaH2PO g (NaH2PO4 H2O) 10 mm Tris Cl 1.2 g 8 M močovina g upravit ph na 6,3 pomocí HCl. Eluční pufry Pufr D (1 litr): 100 mm NaH2PO g (NaH2PO4 H2O) 10 mm Tris Cl 1.2 g 8 M močovina g upravit ph na 5,9 pomocí HCl. Pufr E (1 litr): 100 mm NaH2PO g (NaH2PO4 H2O) 10 mm Tris Cl 1.2 g 8 M močovina g upravit ph na 4,5 pomocí HCl. LB médium (1 litr) LB broth (Sigma) 20g dh2o 1000 ml LB broth jsme rozpustili v 1000 ml dh2o, vysterilizovali autoklávováním a skladovali v lednici při 4 C LB agar: agar 15g LB médium 1000ml 40

41 Konečné koncentrace antibiotik: ampicilin 100 μg/ml kanamycin 50 μg/ml Další použité chemikálie: IPTG (0,1 M) X-Gal 100 mg 5-bromo-4chloro-3-indoyl-β-D-galactosid rozpustit ve 2 ml N,N -dimethylformamidu Příprava LB ploten: LB agar jsme namíchali podle předpisu výše. Vysterilizovali autoklávování a vysterilizovaný agar jsme před vychladnutím nalili do sterilních petriho misek. Přibližně 20 ml LB agaru do každé misky. Po vychladnutí agaru jsme pomocí sterilní skleněné kličky rozetřeli antibiotika a případně další požadované látky (IPTG, X-Gal). Nepoužité plotny jsme skladovali v lednici při 4 C Příprava rekombinantního proteinu Pomocí PCR se specifickými primery (viz. tabulka s primery v kapitole primery označeny jako expresní) jsme naamplifikovali z cdna požadovanou část transkriptu pro PNT. PCR reakci jsme prověřili na agarózové elektroforéze a příslušný pruh jsme vyřízli. DNA jsme vyextrahovali a vyčistili pomocí ZymocleanTM Gel DNA recovery kitu (Zymoresearch). Vyčištěnou DNA jsme zaligovali do plasmidu pgem-t easy vector system (Promega) podle přiloženého protokolu. Ligační směs jsme transformovali do kompetentních buněk a provedli jsme výsev a selekci na IPTG/X-Gal agarových plotnách s ampicilinem. Vybrané kolonie jsme označili a pro ověření přítomnosti insertu jsme provedli Colony PCR s PNT specifickými primery. Vybrané kolonie jsme osekvenovali pro ověření, že se jedná o správnou sekvenci, a že sekvence neobsahuje chyby. Vybrané klony jsme napěstovali v LB médiu s ampicilinem a plasmidy z nich jsme izolovali pomocí Wizzard Plus SV minipreps Purification system (Promega). Ze získaných plasmidů jsme pomocí restrikčních enzymů vyštěpili inzerty a na agarózové elektroforéze jsme provedli kontrolu velikosti. Pruhy jsme následně z gelu vyextrahovali a zaligovali do expresních plasmidů pet42b. Pro ligaci jsme použili stejný protokol jako pro pgem-t vektor. Ligační směs jsme transformovali do expresních buněk BL21. Provedli jsme selekci klonů na agarových plotnách s kanamycinem. U vybraných klonů jsme provedli colony PCR pro zjištění přítomnosti insertu a vybrané klony jsme napěstovali v LB médiu s kanamycinem. Plasmidy jsme izolovali pomocí Wizzard Plus SV minipreps Purification system (Promega) a osekvenovali pomocí specifických primerů. 41

42 Pokusná exprese Kolonie s expresním plasmidem jsme přes noc napěstovali v LB kanamycinem na třepačce při 37 C. Po té jsme je přeočkovali do čerstvého LB. Průběžně jsme sledovali OD600. když OD600 dosáhla hodnot mezi 0,6 0,8 odebrali jsme 1ml buněk, scentrifugovali, a sediment resuspendovali v 1x I a povařili 5 min. U zbytku buněk jsme indukovali expresi přidáním IPTG tak, aby výsledná koncentrace byla 0,5 mm. Buňky jsme ponechali další 4 hodiny na třepačce (37 C). Poté jsme odebrali 1ml scentrifugovali a sediment jsme resuspendovali s 1x I a povařili 5 min.. Zbytek buněk jsme sonikovali (amplituda 60, pulzy 1s, doba 1 min, zopakovat 2x-3x). Scentrifugovali na maximální otáčky na stolní centrifuze a supernatant jsme smíchali 5x I a povařili 5 min.. Se všemi vzorky jsme provedli SDS PAGE pro kontrolu exprese proteinu Exprese Buňky BL21 s s plasmidem jsme napěstovali v 1l LB média na třepačce (225 rpm, 37 C). Po dosažení OD600 mezi 0,6 0,8 jsme přidali IPTG (před indukcí jsme odebrali vzorek 1 ml na kontrolu) tak, aby finální koncentrace byla 1mM IPTG. Buňky jsme ponechali na třepačce další 4 hodiny (odebrali jsme druhý kontrolní vzorek). Buňky jsme centrifugovali při 4000 g, 20 minut. Pelet jsme zamrazili a uchovávali v -20 C Purifikace proteinu Pelet jsme rozmrazili a resuspendovali v lyzačním pufru B (5 ml pufru na 1g peletu) a ponechali inkubovat v pokojové teplotě, dokud nebyla směs průhledná (15-60 minut). Lyzát jsme scentrifugovali v centrifuze při pokojové teplotě (10000 g, 30 minut). Supernatant jsme odebrali a uchovali. 5μl vzorek supernatantu jsme povařili s I pufrem). Supernatant jsme smíchali s Ni-NTA agarózou (PerfectPro Ni-NTA agarose 5prime) v poměru 1ml 50% Ni-NTA agarózy na 4 ml supernatantu. Směs jsme inkubovali 60 minut na třepačce (200 rpm) při pokojové teplotě. Poté jsme směs přelili do kolony. Spodní čepičku kolony jsme odstranili a vytékající frakce jsme zachytili a uchovali. Kolonu s Ni-NTA agarózou jsme dvakrát promyli 4 ml pufru C pak čtyřikrát 0,5 ml pufru D a nakonec 4x 0,5 ml pufru E. Frakce jsme po každém promytí jímali zvlášť a analyzovali je na SDS-PAGE. Frakce s největším obsahem proteinu jsme spojili dohromady a protein jsme vyextrahovali na separační elektroforéze (Hoefer SE600). Pruh o požadované velikosti jsme z gelu vyřízli a promyli 2x v destilované vodě a 4x ve sterilním fyziologickém roztoku (30 minut na třepačce). Takto vyextrahovaný protein jsme zaslali 42

43 do firmy Eurogentec (Belgie) na přípravu protilátky Sonikace Sonikovali jsme s amplitudou 40, délkou impulsů 1 s a dobou 1minuta. Celý proces byl 2x 3x zopakován. Stav buněk jsme průběžně kontrolovali mikroskopem. Během sonikace jsme buňky neustále přechovávali na ledu Jednoduchá frakcionace Lyzát buněk získaný sonikací jsme stočili na chlazené centrifuze (10 minut, 2700 g, 4 C). Supernatant jsme přenesli do čisté mikrozkumavky a pelet resuspendovali v 1x I pufru a povařili 5 minut. Supernatant jsme scentrifugovali na maximální rychlost (cca g, 20 minut, 4 C). Supernatant jsme odebrali a smíchali s 5x I pufrem, aby výsledná koncentrace byla 1x I a povařili 5 min. Pelet jsme resuspendovali v 1x I a povařen 5 min. Vše bylo jsme skladovali v -80 C Fixace na elektronový mikroskop Kulturu monocercomonoida jsme centrifugovali na 3000 g 10 minut při pokojové teplotě. Většina supernatantu jsme odstranili a pelet resuspendovali v cca 100 μl supernatantu a přenesli do mikrozkumavky. Kterou jsme opět centrifugovali na 3000 g 10 minut při pokojové teplotě. Supernatant jsme zcela odstranili a přidali jsme fixační činidlo (2,5% glutaraldehyd v cacodylátovém pufru) a CaCl2 do požadované finální koncentrace. Vzorek jsme odeslali na další zpracování do servisní laboratoře elektronové mikroskopie Bioinformatické metody Skládání a editace sekvencí DNA Pro skládání a úpravu sekvencí získaných z cdna či sekvencí PCR produktů jsme používali software Seqman a Bioedit. Pro tvorbu alimentů byl používán algoritmus ClustalW inkorporovaný v programu Bioedit Tvorba fylogenetického stromu: Algoritmem BLAST jsme vyhledaly sekvence pro PNT. Sekvence obou podjednotek PNT, zástupců všech hlavních skupin eukaryotických i prokaryotických organismů, jsme stáhli z databáze 43

44 GenBank. A připravili nezávislé alignmenty pro obě podjednotky zvlášť pomocí algoritmu ClustalW v programu Bioedit. Poté byly alignmenty manuálně upraveny a konkatenovány do jednoho alignmentu. Fylogenetický strom byl konstruován metodou maximum likelihood (ML) a bayeskou metodou. V případě ML jsme použili program RAxML. Pro obě podjednotky jsme samostatně nastavili model a jejich parametry byly nezávislé. V obou případech se jednalo o model PROTGAMMAIBLOSUM62F, který byl vybrán jako nejvhodnější podle Akaike information criterion (AIC) v programu Prottest ( Byl proveden bootstraping se 100 opakováními. V případě bayéské analýzy jsme použili program MrBayes. Opět jsme použili oddělené modely a parametry pro obě podjednotky. Tentokrát jsme použili model WAG+I+G, změna mutační rychlosti na jednotlivých větvích byla modelována pomocí funkce covarion. MrBayes běžel generací a poté skončil díky přerušení dodávky proudu. Statistika "Average standard deviation of split frequencies" ukazuje, že řetězcům se nepodařilo dosáhnout ekvilibria. Přesto jsme vytvořili konsenzuální strom z posledních generací. Grafická úprava stromu byla provedena v programu FigTree 44

45 7 Výsledky: 7.1 Elektronová mikroskopie MLO jsme se pokusili v buňkách (Monocercomonoides kmen Pa203) nalézt pomocí transmisní elektronové mikroskopie. Vzorky pro elektronovou mikroskopii byly fixovány pomocí 2,5 % glutaraldehydu v kakodylátovém pufru, vyzkoušeli jsme tři různé koncentrace CaCl2 ve fixáži bez CaCl2, CaCl2 o finální koncentraci 5mM a 50mM. První dva vzorky poskytovaly relativně dobré výsledky, CaCl2 ve finální koncentraci 50mM se ukázalo jako nejhorší a neposkytovalo dobré výsledky. V preparátech se nám s jednou výjimkou (Obr. 11) nepodařilo nalézt žádné organely, u kterých by bylo možné rozlišit dvě membrány. I v případě této jedné organely na obr. 11 se pravděpodobně jedná o náhodné uskupení struktur připomínajících dvoumembránový obal. Obr. 11 Snímky z transmisního elektronového mikroskopu zobrazující elektrondenzní tělísko, které by mohlo být obklopené dvěma membránami. Červená šipka označuje tělísko na snímku s menším zvětšením (vpravo), totéž tělísko při větším zvětšení (vlevo). 7.2 Analýza EST sekvencí Na začátku mé práce byla k dispozici cdna kmene Pa203 připravená školitelem v roce Z této cdna bylo již osekvenováno přibližně čtení Sangerovou metodou v laboratořích dr. Embleyho, Rogera a Dackse. V roce 2010, kdy jsem již pracoval na této diplomové práci, byla cdna normalizována a v laboratoři dr. Vlčka (UMG AVČR) osekvenovali přibližně čtení, které se složily do kontigů (singletony nejsou v tomto počtu zahrnuty). Osekvenované EST sekvence byly prohledány na přítomnost genů pro proteiny obvykle asociované s MLO. Pro prohledání sekvencí byly použity algoritmy BLAST a program CBOrg (komparativní BLAST 45

46 Box 1: Aminokyselinová sekvence PNT Žlutě jsou označeny peptidy použité na výrobu protilátky proti podjednotce alfa, zeleně je označena sekvence rekombinantního proteinu použitého na výrobu protilátky proti podjednotce β (předpokládaná velikost tohoto peptidu je kd). Sekvence podjednotky α je vyznačena modrým písmem a sekvence podjednotky β je vyznačena červeným písmem. N-konec sekvence je neúplný. LGIFIGAVTFTGSLIAFGKLNGKVPSKPYMFGGKYRMWINGGIIGISLVCMMLYMYGLSWGWDLMNLT VGTVLSLVLGVVLIMAIGGADMPVVISMLNSYSGWATAMSGLMLSNMVMVVTGALVGSSGAILSYIMCR AMNRSFISVILGGFGEGAGGAAAAAAVEGEMKEIQPMDAAQLVAKSKSIIIVPGYGMAAGKAQHAVAAIT KLMRKHGCNLRFAVHPVXGRLPGHMNVLXAEARVPYDIVMEMEKINPDFPSTDLAIVLGANDIVNPSALD DPNSPIAGMXXVECWKAKNVIVIKRGKGTGYAGVENPLFYKENTRMLYGNALAVCEKMLANLTGILGDS SAVAAAAPKVDETTPLKQEEKAGYQTQEKFPDPVHFVGVPKEVFGGERRVAATPEXVVWMRKMGFGVYI ESGAGEHSRFSDEDYVKVGATICPNAEELYKKXEIVLKVRPPQEHPVYKVNECQLMRQXTVILSYLYPARN GEVMKEMEKAGVTAIAMDQIPRISRAQKCDVLSSMXGISGYRAVIEAASYFPRYMTGQITAAGSVKPAKV LIVGAGVXGLAAIGAAKGLGAIVRAFDSRVAVQEQXESMGGEFLTVSVKEDGEVXGGYSKAMSEAYVRE EIALFTRQAEEVDIIITTAQIPNKKAPVLVTXEAVSKMKAGSVIVDLAAETGGNCELTVPGKTIDVSNXVKIV GETDLVGKMATQASTMYSNNLCHLLDEMGKAQNFSVDEKNEIIYGSLCVIQGKIRWDPNRKXVSVTAQK KPAGAAAAGAAKPATPAAPVAAAAXAATEKKEEQSLHAPAGGEEEKKSKGWFFYFKWTLFVVFVVGILI LAVFMTTEMLNLIVIFVFAIYIGFMVIWNVTPSLHTPLMSVTNXVSGIIICGGIVELTAPFLGVCFCVGXVSVF LASINVFGGFIVTHRMLQMFVMEKKMN* algoritmus pro prohledání sekvencí MLO) vyvinutý v laboratoři A. J. Rogera1 (analýzu provedl Daniel Gaston), dále byly použity HMM na vyhledávání TIM a TOM komplexů, vyvinuté v laboratoři T. Lithgowa (analýzu provedl Vladimir Likič). Jediné transkripty potenciálně asociované s MLO, které se podařilo detekovat, byly pyridin nukleotid transhydrogenáza (PNT), [FeFe]hydrogenáza a PFO. Proto jsem připravil novou cdna (přibližně 4,63 μg) pomocí kitu SMARTerTM PCR cdna Synthesis Kit (Clontech). Tato cdna nebyla normalizována, aby nedošlo k vyřazení některých transkriptů, které by mohly být asociovány s mitochondriálními geny. Část z této cdna byla osekvenována v laboratoři dr. Vlčka (UMG AVČR) metodou 454 Life science pyrosequencing. Výsledkem je celkem čtení, tato čtení nebyla dosud asemblována, byla však prohledána algoritmem BLAST na mitochondriální transkripty. Podobně jako u předchozího vzorku cdna zde byly nalezeny pouze transkripty PFO, [FeFe]hydrogenázy a PNT. Konečně jsem se také pokusil detekovat Cpn60 v gdna a cdna pomocí PCR se specifickými primery navrženými podle sekvence Cpn60 z trimastixe, ale výsledky byly negativní. Ze tří nalezených proteinů je PNT nejtěsněji vázaný k mitochondrii (v současnosti je známá pouze jediná výjimka E. histolytica viz výše).pro [FeFe]hydrogenázu i PFO je známa řada případů

47 s cytosolickou lokalizací (viz. výše), proto jsme se rozhodli dále se věnovat zejména PNT. 7.3 Sekvenace PNT Pomocí PCR z gdna a cdna a také skládáním cdna čtení se nám podařilo získat velkou část sekvence PNT (Box 1). Zjistili jsme, že PNT monocercomonoida se skládá ze dvou podjednotek (α a β), které jsou jako u ostatních eukaryot exprimovány jako jeden protein, protože oblast spojující podjednotky (Box 1, černé písmo) je přítomna v cdna. Podjednotky jsou v sekvenci PNT uspořádány tak, že první je podjednotka β a druhá je podjednotka α. Molekulární hmotnost námi získané sekvence předpovězená pomocí software protein molecular weight calculator ) je kda ( 7.4 Fylogenetická analýza PNT Pro ověření, zda je námi získaná PNT mitochondriálního původu, jsme provedli fylogenetickou analýzu a sestavili fylogenetický strom metodami maximum likelihood a bayéskou metodou (Obr. 12). Jak je z fylogenetického stromu zřejmé, PNT z Monocercomonoides utvořila skupinu spolu Obr Fylogenetický strom pro PNT. Bootstrap RAxML/Bayes. Eukaryotické organismy jsou ve stromě zvýrazněny barevně. Červená barva značí eukaryota, která mají první podjednotku β a druhou podjednotku α. Modře jsou označena eukaryota, která mají podjednotky v opačném pořadí. Čísla v závorkách u kolabovaných skupin udávají počet zástupců ve skupině. 47

48 Obr. 13 Lokalizace peptidů na protilátky proti PNT α. Vlevo je zobrazena pozice peptidu RPPQEHPVYKVNEC a vpravo je lokalizace peptidu GAGEHSRFSDEDYVK. Peptidy jsou v obrázku zvýrazněny žlutě a označeny šipkou s ostatními eukaryoty, podpora pro tuto skupinu je však nízká a umístily se v ní i některá prokaryota - Porphyromonas gingivalis, Lactobacillus oris, Halorhabdus utahensis a Ignisphaera aggregans. Sesterskou skupinou eukaryotické větve kupodivu netvoří α-proteobakterie ale sinice. Ze stromu je dále zřejmé, že eukaryota utvořila dvě dobře podpořené skupiny. Tyto skupiny nejsou v souladu s fylogenezí eukaryot, ale odpovídají tomu, v jakém pořadím jsou kódovány podjednotky PNT. Organismy, které mají podjednotky kódovány v pořadí βα, jsou ve stromu označeny červeně. Tato skupina je tvořena výhradně komenzálními nebo parazitickými protisty. Druhou skupinu, která je ve stromu označena modře, tvoří organismy, které mají podjednotky v pořadí αβ. Tuto skupinu tvoří Metazoa, Fungi a také někteří protisti. Obr. 14 Exprese části PNTβ. Vlevo - Snímek gelu z pokusné indukce exprese PNT podjednotky β. Sloupce označené (+) jsou z bakterií, u kterých byla indukována exprese, sloupce označené (-) představují negativní kontrolu. Vpravo obrázek gelu z purifikace rekombinantní podjednotky β na Niagarózové koloně. Sloupce jsou označeny číslem frakce. Červené šipky označují pruh odpovídající exprimovanému peptidu. 48

49 7.5 Lokalizace PNT v buňce Pro lokalizaci PNT v buňce Monocercomonoides Pa203 jsme vytvořili dvě sady polyklonálních protilátek. První je namířena proti podjednotce α, tyto protilátky byly vytvořeny v morčeti proti směsi dvou peptidů (Box 1, žlutě). Protože PNT je transmembránový protein vybrali jsme takové peptidy, které leží mimo transmembránové sekvence, pokud možno na povrchu proteinu. Polohu peptidů jsme ověřovali na modelu PNT z E. coli, u které je známá terciální sekvence (Obr. 13). Druhou sadu protilátek jsme vytvořili proti rekombinantnímu proteinu představujícímu velkou část podjednotky β (Box 1, zeleně). Protein jsme zaklonovali do plasmidu pet42b a exprimovali v expresních buňkách BL21. Exprimovaný protein jsme přečistili na Ni-agarózové koloně (Obr. 14). Protilátka proti tomuto proteinu byla vytvořena v králíkovi. 7.6 Lokalizace v buněčných frakcích imunoblot Pro ověření funkčnosti a předběžnou lokalizaci byly protilátky nejdříve vyzkoušeny na western blotu se sekundárními protilátkami značenými alkalickou fosfatázou. Bloty ukázaly, že obě protilátky vytváří signál o stejné délce, která odpovídá předpokládané délce proteinu (Obr. 15), proto předpokládáme, že se jedná o specifický signál. Pro předběžné určení lokalizace PNT byly protilátky použity na western blotu s proteiny získanými z jednoduché frakcionace (kapitola 6.18), kterou byly připraveny 3 frakce z kultury: 1) sediment 1 obsahující bakterie a nerozbité buňky Monocercomonoides, 2) sediment 2 obsahující jádra a membránové organely a 3) supernatant 2 obsahující cytosol. Protilátky vytvářely signál o předpokládané velikosti ve frakci sediment 2 (tzv. LGF - large granula fraction ), ale také a dokonce mnohem silnější signál ve frakci sediment 1. Žádný signál jsme nepozorovali ve frakci supernatant 2 (Obr. 16). Protilátka proti podjednotce α dává výrazně slabší signál než protilátky proti podjednotce β, 49 Obr. 15 Western blot celkového proteinového vzorku. Červená šipka označuje predikovanou velikost PNT. Bakterie představují negativní kontrolu, zda protilátky nereagují s bakteriálními proteiny

50 to může být způsobeno nižší afinitou antipeptidové protilátky k proteinu. Z blotu je zřejmé, že obě protilátky rozpoznávají protein, který je lokalizován výhradně ve frakcích s membránami a není přítomen v cytosolu. 7.7 Lokalizace PNT v buňce pomocí imunofluorescence Pro imunofluorescenční lokalizaci PNT bylo nejprve nutné optimalizovat metodu fixace buněk. Vyzkoušel jsme dvě metody fixace - ethanolovou fixaci, která se již dříve v naší laboratoři osvědčila na fixaci Obr. 16 Western blot proteinovém vzorku z jednoduché frakcionace. Šipka označuje predikovanou velkost PNT. Sediment 1 frakce obsahující bakterie a nezlyzované buňky prvoka, sediment 2 (LGF) frakce obsahující membránové organely, supernatant 2cytosolická frakce. buněk Trimastix a methanol/acetonovou fixaci (kapitola 6.12). Lepší výsledky poskytovala methanol/acetonová fixace, ve které byly buňky lépe zachovalé. Protilátky v buňce Monocercomonoides vzájemně nekolokalizují (Obr.17, E-J) a navíc barví i bičíky a některé bakterie. Znamená to, že jedna z protilátek nebo dokonce obě se váží nespecificky. 50

51 8 Obr. 17 Tabule se snímky z imunofluorescenční lokalizace PNT. Zeleně jsou značené protilátky proti PNT β. Červeně značené jsou protilátky proti PNT α. Modře (DAPI) je značená DNA. Snímky F-H zobrazují kolokalizaci protilátek proti oběma podjednotkám. Snímky I a J zobrazují kolokalizaci obou protilátek a jsou spojeny diferenciálním kontrastem 51