Mikrobiologická kvalita syrového mléka

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Mikrobiologická kvalita syrového mléka Bakalářská práce Vedoucí práce: Ing. Táňa Luţová Vypracovala: Petra Tymová Brno 2011

2 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Mikrobiologická kvalita syrového mléka vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis bakaláře..

3 PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Táňě Luţové za metodické a odborné vedení při vypracování bakalářské práce. Paní Ivaně Kučínské za přístup do knihovny Ústavu technologie potravin. Dále děkuji své rodině za podporu při studiu.

4 ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá tématem Mikrobiologická kvalita syrového mléka. Cílem bakalářské práce bylo prostudování odborné literatury o kontrole jakosti a o mikrobiologické kvalitě syrového mléka. Nejvíce se v syrovém mléce vyskytují patogenní mikroorganismy. Somatické buňky, celkový počet mikroorganismů, bod mrznutí, rezidua inhibičních látek se pouţívají ke kontrole jakosti syrového mléka. Klíčová slova: mléko mikroorganismy jakost (kvalita) sloţení mléka ABSTRACT Baccalaureate work deal with subject Microbiology quality raw milks. Aim baccalaureate work was peruse special literature on quality control and about microbiology quality raw milks. Most in raw milk occur pathogenic microorganisms. Physical cell, load microorganisms, point freeze, residues inhibitory materials are used to quality control raw milks. Pivotal words: milk mikrobe quality constitution milks

5 OBSAH 1 ÚVOD 8 2 CÍL PRÁCE 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED Sloţení kravského mléka Voda Plyny Sušina Legislativa mléka Mikrobiologie mléka Charakteristika mikroorganismů Obecná charakteristika bakterií Obecná charakteristika plísní Obecná charakteristika kvasinek Mikroorganismy syrového mléka Fáze rozvoje mikroorganismů v mléce Mikroorganismy v mléce ve vemeni a po nadojení Enzymatická aktivita mikroorganismů syrového mléka Mikroorganismy rostoucí v mléce Kontaminace mléka z okolí Nemoci zvířat přenosné mlékem Inhibiční látky v mléce Mikrobiální vady mléka... 58

6 3.4.9 Čištění a sanitace Chlazení Ochrana syrového mléka před mikrobiálním znečištěním Jakost mléka Poţadavky na kvalitu syrového mléka ZÁVĚR 67 5 LITERATURA 68

7 1 ÚVOD Mléko je základní surovinou pro výrobu mléčných výrobků a zároveň je dobrým zdrojem potravy pro člověka i zvířata. Z tohoto hlediska je mikrobiologická kvalita syrového mléka velmi důleţitá. Nejčastěji se vyuţívá pro lidskou spotřebu a na výrobu mléčných výrobků mléko kravské. Uvádí se, ţe v rozvinutých zemích mléko kravské tvoří 98 % z mléka výrobního a v zemích rozvojových pouze 2/3, zbytek produkce tvoří mléko ovčí, kozí, buvolí a velbloudí. Jakost mléka a mléčných výrobků je ovlivněna jakostí produkovaného mléka (GAJDŮŠEK, 2003). K ošetření a zpracování mléka se pouţívají různé zákroky, kterými lze omezit nedostatky mléka. Nedostatky vznikají špatným zacházením s mlékem, například špatné získávání, nebo jeho nevhodné ošetření. Ošetření mléka v prvovýrobě znamená sníţení teploty mléka na poţadovanou teplotu. O kvalitě mléka rozhoduje prvovýroba. Kvalita mléka je ovlivněna následujícími vlivy: sezónou, laktací, zdravotním stavem, individualitou, stářím dojnic, krmením, pastvou, stájí, dojícím zařízením, ošetřením mléka, lidským přístupem. Po nadojení mléka má dojít k jeho ochlazení na teplotu 4 8 C. Ochlazení mléka má proběhnout v moţném nejkratším časovém úseku. Teplota mléka se nesmí zvýšit ani krátkodobě nad 10 C. Jakmile se teplota zvýší nad 10 C, mají mikroorganismy dobré prostředí pro svůj růst. Rozvoj mikroorganismů negativně ovlivní další zpracování mléka. Poţadavky na jakost syrového mléka nám udává legislativa

8 2 CÍL PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo: Prostudovat dostupnou odbornou literaturu o kontrole jakosti syrového mléka. Prostudovat dostupnou odbornou literaturu o mikrobiologické kvalitě syrového mléka

9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Sloţení kravského mléka Mléko je sloţitá biologická tekutina, sekret mléčné ţlázy zvířat. Mléko je určené k lidské výţivě a výţivě zvířat (DUŠEK et. al, 1964; KADLEC et. al, 2009). Mléko je bílé aţ naţloutlé barvy, nesladké, příjemné chuti a vůně. Sloţení mléka ovlivňují různé faktory. Mléko lze rozdělit podle druhu na kravské, mateřské, ovčí, kozí, kobylí a jiné. Z hlediska chemické skladby mléko obsahuje četné organické a anorganické látky, které jsou v různém poměru. Všeobecně se dá říci, ţe mléko se skládá ze třech hlavních sloţek: Voda je nositelem a rozpouštědlem celého systému mléka. Sušina skládající se ze sloţek (dusíkaté látky, lipidy, organické kyseliny, vitamíny, enzymy, sacharidy). Plyn je zastoupen kyslíkem, dusíkem a oxidem uhličitým (DUŠEK et. al, 1964). Na obrázku č. 1 je zobrazeno schéma sloţení mléka. Sloţky mléka lze rozdělit na původní, které vznikly při látkové přeměně v mléčné sekci a nepůvodní. Ty se do mléka dostaly krevním oběhem nebo stykem se zařízením okolního prostředí. Nyní je známo více neţ 200 druhů sloţek mléka (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Podle velikosti částeček se rozlišují fáze na molekulární, koloidní a emulzní: mezi molekulární fázi patří sloţky, které tvoří společně s vodou pravé roztoky jako například laktóza, chloridy, fosforečnany, citráty a mnoho jiných bílkoviny tvoří koloidní fázi mléčný tuk patří do emulzní fáze (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999; PROKŠ, 1964; JANÁL, BLAHOVEC, 1974)

10 Obr. č. 1: Schéma sloţení mléka dle Laktologie (GAJDŮŠEK, 2003) Voda Voda je hlavní přirozenou sloţkou mléka. V mléce je voda přítomná v různých vazbách. Jako volná nebo vázaná voda. Ve volné vodě jsou rozpuštěné soli, laktóza, vitamíny. Volnou vodu lze z mléka vymrazit nebo vysušit. Volná voda tvoří převáţnou část vody mléka (DUŠEK et. al, 1964). Vázaná voda můţe být obsaţena v systémech koloidních, chemických, substitučních. Voda vázaná na koloidy se váţe na bílkoviny. Tvoří ochranný hydratační povrch obalů, koloidní částice zajišťují stabilitu bílkovin v mléce. Koloidně vázanou vodu lze z mléka odstranit sušením při C. Chemicky vázanou vodu představuje voda krystalická. V mléce je přítomná ve formě monohydrátu laktózy, tato voda se z mléka nedá vysušit. Substitučně vázaná voda je vázaná přímo v molekulách solí a laktózy. Na obrázku č. 2 je znázorněna hydrofilní koloidní částice. Obr. č. 2: Hydrofilní koloidní částice (KRATOCHVÍL, 1988)

11 3.1.2 Plyny Plyny se nacházejí v čerstvě nadojeném mléce v mnoţství 8 objemových % (KRATOCHVÍL et. al, 1988). Oxid uhličitý je zastoupený v mléce nejvíce a to 5 7 objemových %. Oxid uhličitý přichází do mléka z krve. Některé plyny se do mléka dostanou při styku mléka se vzduchem například dusík, kyslík. Neţádoucím plynem mléka je kyslík, který způsobuje oxidační procesy mléka. Zvýšený obsah vzduchu negativně ovlivňuje oddělování tuku při odstřeďování, tím se ovlivní další úprava mléka (pasterace a sníţí se trvanlivost při skladování) (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999) Sušina Sušina je druhou nejhlavnější sloţkou mléka. Sušinu tvoří všechny sloţky, které zůstanou po vysušení vzorku do konstantní hmotnosti (LUKÁŠOVÁ et. al,1999). Skládá se z tuku a tukuprosté sušiny Mléčný tuk Lipidy v organismu slouţí jako rezerva a pohotový zdroj energie. Kravské mléko obsahuje 3,5 5 % tuku (DRBOHLAV, VODIČKOVÁ, 2002). Jemné rozptýlení mléčného tuku v mléčné plazmě vytváří velký povrch, který je přístupný lipolytickým enzymům a vyznačuje se dobrou stravitelností (KRATOCHVÍL et. al, 1988). Specifickou vlastností mléčného tuku je, že převážná část se nachází v mléce ve formě tukových kuliček (GAJDŮŠEK, 2003). Na obr. č. 3 je uvedeno schéma tukové kapénky. Tuková kapénka (globule) se skládá ze dvou vrstev. Lipofilní (nepolární) vrstva je orientovaná dovnitř tukové kapénky, obsahuje triacylglyceroly, cholesterol, karoteny a lipofilní vitamíny. Hydrofilní (polární) vrstva je orientovaná k vodní fázi mléka a nese bílkovinné sloţky (ŠUSTOVÁ, 2009). Jejich počet v 1 ml mléka se pohybuje kolem hodnoty 1, (při tučnosti 3,7 4,1 %) a jejichž průměr se může pohybovat v intervalu od 0,1 do 20 μm, převážná část má průměr však v intervalu od 2 do 3,5 μm (TEPLÝ et. al, 1979; GAJDŮŠEK, 2003)

12 Obr. č. 3: Schéma sloţení tukové kapénky dle Mlékařství: přednášky (ZADRAŢIL, 2002). Mléčný tuk je tvořen z jednoduchých nebo sloţitých esterů mastných kyselin s jednomocnými, nebo vícesytnými alkoholy. Lipidy v mléce se skládají z triacylglycerolu (estery vyšších mastných kyselin a glycerolu). Dále z látek rozpustných v tucích (fosfolipidy, cholesterol, karotenoidy, lipofilní vitamíny, ) a v nepatrném mnoţství volné mastné kyseliny (DRBOHLAV, VODIČKOVÁ, 2002). Nejdůleţitější mastné kyseliny v mléčném tuku jsou máselná, kaprylová, kapronová, kaprinová, laurová, myristová, stearová, palmitová, olejová, linoleová, linolová a arachidonová kyselina. Uvedené kyseliny jsou v mléčném tuku přítomny ve stopovém mnoţství. Jedná se o kyseliny nenasycené, nasycené, ketokyseliny, hydroxykyseliny a kyseliny obsahující cyklické vazby. Obsah esenciálních mastných kyselin (linolová, linoleová, arachidonová) v mléčném tuku je nízký. Esenciální mastné kyseliny jsou prekursory prostaglandinů a účastní se výstavby buněčných membrán (DRBOHLAV, VODIČKOVÁ, 2002). Mléčný tuk má ze všech přirozených tuků nejrozmanitější složení (DRBOHLAV, VODIČKOVÁ, 2002). Vlastnosti mléčného tuku značí kyseliny myristová, stearová, palmitová, olejová. Kyselina olejová a palmitová pouţívá srdeční sval jako zdroj energie. Kyseliny olejová a palmitová jsou v mléce i v tukovém podílu krve nejvíce zastoupené (DRBOHLAV, VODIČKOVÁ, 2002). Mléčný tuk na rozdíl od tuků rostlinného nebo ţivočišného původu je velice dobře stravitelný. Protoţe lipáza štěpí v triacylglycerolech mastné kyseliny v poloze 1 a 3. Obsahuje mastné kyseliny s krátkým a středním uhlíkatým řetězcem, které se lépe

13 resorbují. Uspořádání jednotlivých mastných kyselin v tiacylglycerolech mléčného tuku je příznivé (DRBOHLAV, VODIČKOVÁ, 2002). Fosfolipidy Fosfolipidy jsou sloučeniny kyseliny fosforečné a vysokomolekulárních mastných kyselin (KRATOCHVÍL et. al, 1988). Fosfolipidy se velice podobají tukům. Tyto látky mají nutriční a fyziologický význam a jsou důleţité pro činnost nervové soustavy organismu. Fosfolipidy doprovázející tuk mléka mají odlišné sloţení neţ tuk mléčný. V mléce je obsaţeno asi 0,02 0,03 % fosfolipidů (KRATOCHVÍL et. al, 1988; DRBOHLAV, VODIČKOVÁ, 2002). Z fosfolipidů je v mléce přítomen lecitin, kefalin, sfingomyelin a serinfosfatid. Fosfolipidy mohou způsobovat ţluknutí mléčného tuku. Lecitin patří mezi látky povrchově aktivní a přispívá ke stabilitě tukové emulze (HOLEC et. al, 1988). Dále přiřazujeme i cerebrosidy, které neobsahují fosfor, ale mají podobné vlastnosti jako fosfolipidy (DUŠEK et. al, 1964). Steroly Steroly jsou v mléce zastoupeny cholesterolem, je to cyklický alkohol. Cholesterol je v mléčném tuku obsaţen v mnoţství 0,25 0,4 %. V mléce se vyskytuje vázán na tukovou emulzi a nepodléhá zmýdelnění jako ostatní steroly. Cholesterol je fyziologicky významná látka a účastní se regulace biologických pochodů. Cholesterol má blízko k vitamínu D. Při ozáření ultrafialovými paprsky se částečně mění ve vysoce aktivní vitamín D 3. Zkrmování pokrutin s vysokým obsahem fytosterolu (rostlinný) nemá ţádný vliv na obsah cholesterolu v mléce. (HÖKL, ŠTĚPÁNEK, 1956; DUŠEK et. al, 1964; HOLEC et. al, 1988). Cholesterol společně s lecitinem hrají významnou roli ve fyziologii ţivočišného organismu. Cholesterol je antagonista lecitinu, ale současně s ním se zúčastňuje regulace některých biologických pochodů (ZAJKOVSKIJ, 1953). Tuk v mléce můţe ovlivnit hlavně fáze laktace. V neposlední řadě závisí, na druhu plemene (například plemeno Holštýnské má menší obsah tuku neţ plemeno Červenostrakaté). Obsah tuku v mléce se dá ovlivnit výţivou a šlechtěním plemen a zdravotním stavem (GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993)

14 Tukuprostá sušina Tukuprostá sušina se skládá z bílkovin, laktózy, nebílkovinných dusíkatých látek, minerálních látek, vitamínů a enzymů. a) Mléčné bílkoviny Podle vzájemného zastoupení hlavních druhů bílkovin se mléka rozdělují na: Kaseinová mléka produkují přeţvýkavci, ve kterých kasein představuje nejméně 75 % z celkových bílkovin. Mléka albuminová jsou produkována masoţravci, všeţravci a býloţravci s jednoduchým ţaludkem, obsahují méně neţ 75 % kaseinu (SIMEONOVOVÁ et. al, 2003). V mléce jsou bílkoviny obsaţeny 2,8 3,6 %. Na obrázku č. 4 je uvedeno schéma sloţení bílkovin. Mléčné bílkoviny tvoří základní fyzikální a chemické vlastnosti mléka (GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993). Bílkoviny jsou důleţité z nutričního hlediska. Řadíme je do skupiny vysokohodnotných bílkovin, obsahují esenciální aminokyseliny, které jsou nezbytné pro výţivu. Obr. č. 4: Schéma sloţení čisté bílkoviny dle Laktologie (GAJDŮŠEK, 2003). Aminokyseliny jsou v mléčných bílkovinách základem dobré stravitelnosti. Zastoupení aminokyselin v bílkovinách mléka: Esenciální aminokyseliny si člověk nedovede syntetizovat, proto je musí přijímat v potravě, (valin, leucin, isoleucin, threonin, methionin, lysin, fenylalanin, tryptofan). Neesenciální aminokyseliny se tvoří v organismu dospělého člověka, děti si je nedokáţou syntetizovat. K neesenciálním aminokyselinám zastoupených v mléce (alanin, asparagin, asparaginová kyselina, glutamin, glutaminová kyselina, cystein, glycin, prolin, serin a tyrosin)

15 Semiesenciální aminokyseliny zastoupené v mléce (arginin a histidin). Limitující aminokyselinou pro mléko je metionin. Syrovátkové bílkoviny jsou plnohodnotnější neţ bílkoviny kaseinové. Obecně je známo, ţe rostlinné bílkoviny jsou méně biologicky výhodné neţ bílkoviny ţivočišné. Struktura bílkovin: Primární struktura má jednotlivé aminokyseliny řazeny v řetězci. Sekundární struktura je uspořádána do řetězců α-šroubovice a β-skládaný list. Terciární struktura je uspořádání celého řetězce v prostoru (PROKŠ, 1964). Bílkoviny stanovíme metodou podle Kjeldahla spálením celého vzorku mléka kyselinou sírovou, tím dostaneme obsah dusíku ve vzorku, přepočteme na bílkovinu a vynásobíme faktorem 6,25. Dále se bílkoviny mohou stanovit Formolovou titrací (bílkovinný titr) a spektrofotometricky. Bílkovinný titr je počet mililitrů roztoku hydroxidu sodného spotřebovaného při titraci mléka po přídavku fenolftaleinu za podmínek metody. Aminová skupina volných aminokyselin se váţe formaldehydem, čímţ je umoţněna reakce karboxylu s roztokem hydroxidu sodného. U mléka s kyselostí do 8 (2,5 mmol/l) bílkovinný titr udává orientačně procento bílkovin. Stanovení bílkovin můţe být i v tomto případě ovlivněno, došlo-li k enzymatickému rozkladu mléka, který se projeví zvýšenou kyselostí, zředěním vodou, stupněm laktace. Na bílkoviny mléka se váţe barvivo amidočerň. Po oddělení vysráţených bílkovin společně s navázaným barvivem filtrací přes silikonový filtr (přístroj Pro-Milk) nebo odstředěním se změří pokles intenzity zabarvení roztoku, který je úměrný obsahu bílkovin (TEPLÝ et. al, 1985; ŠUSTOVÁ, 2009). V mléce se určí veškeré dusíkaté látky, z toho je tvoří % bílkovin a zbytek jsou nebílkovinné dusíkaté látky 5 7 %, označujeme je jako hrubá bílkovina. Kaseinové bílkoviny Kasein je hlavní a výhradní bílkovinou mléka, se kterou se jinde v přírodě nesetkáme. Kaseinové bílkoviny jsou souborem sloţitých bílkovin obsahující aminokyselin a esterově vázaný fosfor (fosfoproteiny jsou vázaný v komplexu fosforečnanu vápenatého). Kaseinové bílkoviny tvoří 78 % z celkových bílkovin v mléce (HÖKL, ŠTĚPÁNEK, 1956; HOLEC et. al, 1989). Kasein kravského mléka je směsí různých kaseinových frakcí. Kaseinové frakce jsou tvořeny především α, β, κ-kaseinem a ostatní frakce lze povaţovat za deriváty

16 α s -kaseinová frakce je hlavní sloţkou kaseinové frakce. Mléčnou ţlázou se syntetizuje α s1 -kasein, který je tvořen 199 aminokyselinami, je známo 6 genetických variant. α s -kasein je důleţitý při výrobě sýrů. α S2 -kasein je tvořen 207 aminokyselinami ve 4 genetických variantách. Jak α s1 tak i α s2 -kasein mají různé varianty primární struktury. α-kaseinové frakce mají největší podíl z kaseinových frakcí, protoţe obsahují nejvíce fosforu (chemicky nazýváme fosfoproteiny) (HOLEC et. al, 1989; GAJDŮŠEK, 2003; KADLEC et. al, 2002). Jakmile mléko zchladíme na 4 C nebo na vyšší teplotu dostaneme β-kasein ve formě nerozpustných vápenatých solí. Pokud klesne teplota pod 4 C, vytváří β-kasein rozpustnou sůl a obtíţně ho pak vysráţíme, zůstává většinou v syrovátce a tím se nám sníţí výtěţnost při výrobě sýrů. Tento děj je vratný při 30 C po dobu 24 hodin. β-kasein má 209 aminokyselin v 7 genetických variantách. β-kasein společně s α-kaseinem je citlivý na vápník. κ-kasein je tvořený 169 aminokyselinami v 6 genetických variantách, skládá se z bezcukerné sloţky a malých sloţek. κ-kasein obsahuje N-acetylneuraminovou kyselinu, galaktózu, galaktózamin. Jedna frakce obsahuje i sirné aminokyseliny (cystein a methionin). Společně s vápníkem tvoří κ-kaseinové rozpustné soli stabilizující α s a β-kaseiny v přítomnosti iontů vápníku. κ-kasein se nachází v povrchové části micely (GAJDŮŠEK, 2003; KADLEC et. al, 2002). Syrovátkové bílkoviny Syrovátkové bílkoviny se v mléce vyskytují ve formě koloidního roztoku (KADLEC et. al, 2009). Syrovátkové bílkoviny zůstávají v mléce po vysráţení přídavkem syřidla nebo kyselin. Tvoří 17% z celkových bílkovin mléka. Syrovátkové bílkoviny mají vyšší nutriční hodnotu neţ kaseinové bílkoviny. Pokud syrovátku zahřejeme a okyselíme, tak můţeme získat syrovátkové bílkoviny (například ve formě syrovátky sýrů). Syrovátkové bílkoviny jsou termostabilní a při tepelném ošetření mléka nad C, oproti kaseinu denaturují. V mléce nedojde k vysráţení, ale spojují se s κ-kaseinem a tím se změní vlastnosti kaseinových micel. Syrovátkové frakce jsou tvořeny β-laktoglobulinem, α-laktalbuminem, imunoglobuliny, proteoso-peptony, sérum albumin (KADLEC et. al, 2002; GAJDŮŠEK, 2003; KADLEC et. al, 2009). β-laktoglobulin se skládá ze 162 aminokyselin v 7 genetických variantách. V syrovátkových bílkovinách představuje asi 53 %. Obsahuje velké mnoţství sirných aminokyselin, zvláště cystin. Denaturuje od 65 C a při zahřívání vytváří

17 s α-laktaalbuminem a κ-kaseinem komplex, který zvyšuje termolabilitu mléka (oproti denaturaci v syrovátce) a inhibuje sýřitelnost mléka (HOLEC et. al, 1989; DRBOHLAV, VODIČKOVÁ, 2002). α-laktaalbumin tvoří asi 25 % obsahu syrovátkových bílkovin a je druhou nejdůležitější syrovátkovou bílkovinou v mléce (HOLEC et. al, 1989). α-laktaalbumin se skládá ze 123 aminokyselin ve 3 genetických variantách. α-laktaalbumin je v kaţdém mléce, které obsahuje laktózu, protoţe α-laktaalbuminy jsou potřebné pro syntézu laktózy (KADLEC et. al, 2002; HOLEC et. al, 1989; KRATOCHVÍL et. al, 1988; DUŠEK et. al, 1964). Má molekulovou hmotnost asi a obsahuje nejvyšší množství tryptofanu ze všech známých přírodních bílkovin (HOLEC et. al, 1989). Je znám v několika elektroforeticky rozdílných frakcích, které se liší obsahem síry a molekulovou hmotností (HOLEC et. al, 1989). Stavebně se podobá lysozymu a jako stavební subjednotka, zv. protein B, spolu s protein a tvoří laktózyntetázu (HOLEC et. al, 1989). Lysozym je vaječná bílkovina. Imunoglobuliny chemicky nazývané glykoproteiny. Imunoglobuliny jsou různorodá skupina protilátek pocházející z krevního séra dojnice (KADLEC et. al, 2002). Imunoglobuliny jsou součástí přirozeného antimikrobiálního systému mléka. Antimikrobiální systém zpomaluje růst kontaminující mikroflóry v čerstvě nadojeném mléce. Část imunoglobulinů je označovaná jako aglutinin, který vyvolává při teplotách pod 15 C shlukování tukových kuliček. Vede to k rychlému vyvstávání tuku do smetanové, snadno rozmíchatelné vrstvy (KADLEC et. al, 2002; KADLEC et. al, 2009). Současně dochází k shlukování bakteriálních buněk a jejich absorpci na povrch tukových kuliček a tím k jejich akumulaci ve smetanové vrstvě. Pokud dojde k inaktivaci aglutininů, mléko ztrácí schopnost rychlého vyvstávání tuku v chladu (KADLEC et. al, 2002). Při skladování mléka je vyvstávání tuku pomalejší, ale vytvořená smetanová vrstva je tuţší a špatně rozmíchatelná (KADLEC et. al, 2002; KADLEC et. al, 2009). Nejvyšší výskyt imunoglobulinů je v kolostru a díky tomu se přenáší imunita z matky na mládě, při mastitidě je také obsah imunoglobulinu vyšší. Imunoglobuliny jsou významné z hlediska imunity, antibakteriální látky mléka poskytují obranu proti mikroorganismům a toxinům (KADLEC et. al, 2002; DUŠEK et. al, 1964)

18 Proteoso-peptony jsou zařazovány taktéţ k proteinům, protoţe se částečně sráţí 12 % kyselinou trichloroctovou. Odlišují se tím, ţe se nesráţí zahřátím na C. Obsahují fosfor a mají kratší molekuly, proto se nazývají nízkomolekulární proteiny (KRATOCHVÍL et. al, 1988). Sérum albumin je zastoupen v syrovátkových bílkovinách asi 6 %. Skládá se z 582 aminokyselin. Přechází přímo z krve, při mastitidě se jeho mnoţství zvyšuje. Podle sérumalbuminu lze stanovit, zda dané mléko pochází od zdravé dojnice (HOLEC et. al, 1989). Alergie na mléčnou bílkovinu je jedna z forem alergií, projevující se po konzumaci kravského mléka, nebo výrobku, kde je obsaţena bílkovina kravského mléka. První potíţe se objeví u dětí, kdyţ dítěti se dá mléko jiné neţ mateřské. Objeví se ekzém, průjem, zvracení. Pokud se jedná o alergii na bílkovinu kravského mléka lze podat dítěti výrobky z ovčího, nebo kozího mléka (POTRAVINOVA ALERGIE, 2011) b) Nebílkovinné dusíkaté látky Po vysrážení a odstranění všech bílkovinných látek z mléka můžeme ve filtrátu zjistit skupinu dusíkatých látek nebílkovinné povahy (DUŠEK et. al, 1964). Jedná se většinou o zplodiny metabolismu dusíku v organismu, které přichází přímo z krve. Obsah stoupá se zvyšujícím se přísunem bílkovin v potravě. Nebílkovinné dusíkaté látky tvoří především močovina, amoniak, kreatin, kreatinin, kyselina močová, kyselina ortová, nukleotidy, vitamíny skupiny B a volné aminokyseliny (DUŠEK et. al, 1964; KRATOCHVÍL et. al, 1988). Močovina představuje nejvariabilnější a největší podíl nebílkovinných dusíkatých látek v kravském mléce asi %. Vzhledem k diskusím o proplácení mléka podle obsahu bílkovin jsou znalosti o variabilitě močoviny a její fyziologické příčiny velmi důleţité. Obsah močoviny je důleţitý i pro mlékařské technologie, protoţe se vztahuje k tepelné stabilitě mléka. Podává i určitý obraz o výţivě dojnic (KRATOCHVÍL et. al, 1988). Nyní lze zjistit i přítomnost nitrátů z přidané vody a z krmiva, které přejdou do mléka. U dojnice s vyváţenou krmnou dávkou je obsah močoviny mg.l -1. Při nadbytku močoviny v krmné dávce jde do krevního oběhu velké mnoţství čpavku a v játrech se mění na močovinu. Nadbytkem močoviny se zhorší kvalita

19 mléka a zhorší se i zpracování mléka. Nedostatek močoviny je také špatný, protoţe se bod mrznutí blíţí více k 0 C. c) Mléčný cukr V mléce se nacházejí jednoduché i sloţené sacharidy. Z jednoduchých sacharidů je to glukóza a galaktóza. Spojením těchto dvou monosacharidů se získá sloţený sacharid laktóza. Oligosacharid laktóza tvoří 90 % všech sacharidů v mléce (DUŠEK et. al, 1964). Zastoupení laktózy v jednom litru mléka je 4-5 %. Laktóza je redukující cukr, tvoří ji dva isomery, alfa a beta laktóza. Laktóza s chloridem sodným udrţuje osmotický tlak. Laktóza přispívá k fyzikálním vlastnostem mléka, bod mrznutí, bod varu (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Laktóza má menší sladivost neţ sacharóza, ale její sladivost je charakteristická. Obsah laktózy v mléce se dá jenom minimálně ovlivnit vnějšími vlivy. Niţší obsah můţeme zaznamenat v mlezivu (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990). Laktóza má vliv na vlastnosti mléčných výrobků (chuti a barvě). Laktóza při vyšších teplotách hnědne. Karamelizace nastane při 150 C i vyšších teplotách (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Mnoho lidí trpí laktózovou intolerancí. Objevuje se převáţně u malých dětí, jejichţ trávicí soustava nedokáţe hydrolyzovat laktózu v tenkém střevě. Dále je postiţena populace lidí v Asii, Africe. Není to klasická potravinová alergie, ale přesné označení zní metabolická porucha štěpení mléčného cukru. Porucha je vrozená. Nemoc vzniká, protoţe ve střevě chybí enzym laktáza, který má na starost štěpení mléčného cukru. U nemocných lidí se cukr pomocí enzymu nerozštěpí a organismus na něj reaguje jako na cizí látku. Projev onemocnění: zvracení, průjem, koţní projev. Onemocnění je celoţivotní, ale s věkem můţe dojít k mírnému zlepšení. Lidé postiţení intolerancí na laktózu se musí vyhnout konzumaci všech druhů mlék, ale mohou konzumovat sýry, ve kterých je laktóza v nepatrném mnoţství (POTRAVINOVA ALERGIE, 2011). Laktóza je dobrým substrátem pro rozvoj bakterií, kterému je zapotřebí na jedné straně zabránit. Zároveň jsou vhodné pro výrobu fermentovaných mléčných výrobků a sýrů. Laktózu vyuţívají bakterie mléčného kvašení v technologickém procesu (KADLEC et. al, 2009; KADLEC et. al, 2002)

20 d) Minerální látky V mléce je rozpuštěno v pravém i koloidním roztoku malé mnoţství minerálních solí (0,7 %). V mléčném séru rozpuštěný a nerozpuštěný podíl solí se podílí na stabilitě bílkovinných koloidů a kaseinového komplexu. Soli jsou důleţitými součástmi pufrovacího systému. Společně s mléčným cukrem podmiňují osmotický tlak mléka. Obsah solí a minerálních látek v mléce je relativně stabilní. Průběh laktace je nejzávaţnější faktor z hlediska změn. Nejvíce zastoupenými minerálními solemi jsou fosforečnany, chloridy a citronany. Z prvků jsou nejvíce zastoupeny vápník, fosfor, hořčík, méně pak ţelezo, měď, jod, síra, mangan, hliník. Ve stopovém mnoţství pak bor, stroncium, křemík (HÖKL, ŠTĚPÁNEK, 1956; HOLEC et. al, 1989; GAJDŮŠEK, 2003). Mezi makroelementy řadíme draslík, vápník, sodík, hořčík, chlor a fosfor. Draslík a sodík je přítomen v pravém roztoku ve formě disociovaných solí (94 %) a zbytek se váţe na kasein. Fosfor a vápník se nacházejí ve vodní fázi (45 % a 33 %). Chlor v mléce se vyskytuje ve formě solí a to především chlorid sodný, chlorid vápenatý, chlorid draselný (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Čerstvé mléko má v průměru 0,17 % kyseliny citronové. Obsaţeny v mléce ve formě solí (citráty) vápníku, sodíku a draslíku, mající ochranný vliv na labilní bílkoviny. Minerální látky společně s laktózou ovlivňují osmotický tlak, bod tání a varu. Soli mléčné mohou být i aktivátory enzymů, nebo sloţek a podílí se na udrţení acidobazické rovnováhy organismu (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Obsah mikroelementů v mléce ovlivňují zootechnické faktory, doprava a zpracování mléka. Ţelezo je nositelem správného fungování enzymových systémů. Mangan je součástí peptidáz. Měď je součástí oxidáz (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vápník patří z technologického hlediska mezi nejvýznamnější minerální látky v mléce. Aktivita Ca 2+ významně ovlivní koloidní stabilitu kaseinu, termostabilitu mléka a sladké sráţení mléka a vlastnosti sýřeniny při výrobě sýrů. Celkový obsah vápníku je v průměru 120 mg.l -1, 30 % je přítomno v rozpustné formě v mléčném séru, především jako hydrofosforečnan a citrát. Méně neţ 10 % z celkového mnoţství je v disociované formě. Většina vápníku je přítomna v nerozpustné formě, to znamená v koloidním fosforečnanu vápenatém. Vápník je součástí kaseinových micel (KADLEC

21 et. al, 2002). Rovnováha mezi jednotlivými formami vápníků, ale závisí na řadě faktorů: Při zvýšení kyselosti mléka např: fermentací laktózy na kyselinu mléčnou se zvýší podíl disociovaného a rozpustného vápníku. Při tepelném ošetření mléka nad 60 C vápenaté ionty přecházejí částečně na koloidní fosforečnan vápenatý. Změna fosforečnanu vápenatého je vratná, ale původní rozpustnosti se dosahuje pomalu. Aktivita vápenatých iontů zvyšuje přídavek sacharidů (sacharózy) a zvýšení iontové síly v mléce (přídavkem solí), naopak sníţit lze přídavkem fosforečnanu nebo citrátu (chelatační účinky má) (KADLEC et. al, 2009). e) Vitamíny Vitamíny v mléce jsou základním a jediným zdrojem potravy sajícího mláděte po narození. Přestoţe koncentrace některých vitamínů je minimální. Pokud jsou dojnice krmeny v létě zeleným krmením, v mléce se zvýší obsah karotenoidů a vitamínu A, D, E. Mléko je bohaté na vitamín B 2 (riboflavin). V mléce jsou zastoupeny vitamíny rozpustné ve vodě i v tucích (GAJDŮŠEK, 2003; LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vitamíny rozpustné v tucích Vitamín a (retinol) obsahuje β-karoten, prekurzor vitamínu A. β-karoten se podílí na ţlutém vybarvení mléčného tuku, z toho to důvodu je kravské mlék naţloutlé barvy (HOLEC et. al, 1988). Kozí mléka neobsahují β-karoten, proto jsou bílé barvy. Záhřev mu nevadí, ale za UV záření můţe docházet k jeho inaktivaci. Vitamín a se do mléka dostává z krve, do krve se dostane z potravy. Provitamín a se z potravy dostává do krve, odkud je syntetizován do mléka. V zimních měsících jeho obsah klesá (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990; LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vitamín D (kalciferol) se nachází v mléce jako D 2 -ergokalciferol a D 3 -cholekalceferol. Ergokalciferol je rostlinného původu v zimních měsících je v mléce, kdeţto v letních měsících převaţuje cholekalceferol (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990; LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vitamín E (tokoferol) je významný antioxidant, který chrání nenasycené lipidy před oxidací. Zároveň má pozitivní účinek na trvanlivost mléka a mléčného tuku (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990; LUKÁŠOVÁ et. al, 1999)

22 Vitamín K se skládá z vitamínu K 1 (fylochinon) a vitamínu K 2 (farnochinon), jsou odolné vůči vysokému záhřevu. V mléce ho je nepatrné mnoţství (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990; LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vitamín F pod tímto názvem se ukrývá skupina esenciálních mastných kyselin a to linolové, linolinové, arachidonové. V mléce jsou zastoupeny nízkými koncentracemi, ale i to stačí, při normální konzumaci mléka (sýrů), abychom zabezpečili jejich dostatečný přísun (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vitamíny rozpustné ve vodě Vitamín B 1 (thiamin) se v mléce nachází ve volné formě a to z %, % je ve formě fosfátové, 5 12 % váţe na bílkoviny. V mléce přeţvýkavců je zastoupen ve vyšším mnoţství díky bachorové mikroflóře (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990; LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vitamín B 2 (riboflavin) je obsaţen ve formě volné i vázané na bílkoviny a kyselinu fosforečnou. Obsah B 2 je téměř po celý rok stejný. B 2 vzniká činností bachorové mikroflóry a proto je ho nejvíce v mléce přeţvýkavců. Roztok riboflavinu vykazuje ţlutozelenou fluorescenci. Fluorescence je typická pro mléčné sérum (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990; GAJDŮŠEK, 2003; LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vitamín PP (niacin, niacinamid) jeho obsah v mléce podléhá individuálním výkyvům dojnic. Odolný vůči teplotě, oxidaci, světlu. V mléce ho vyuţívají mikroorganismy mléčného kysání (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990). Vitamín B 6 (kyselina pantotenová) se v mléce pohybuje skoro pořád ve stejné koncentraci. Mléko a mléčné výrobky ho obsahují menší mnoţství (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vitamín B 12 (kobalamin) vzniká syntézou bachorové mikroflóry. Převáţná část je vázaná na bílkoviny, hlavně na syrovátkové bílkoviny. V mléce je v nízké koncentraci (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). Vitamín H (biotin) se v mléce objevuje v nízkém mnoţství. Odolný vůči záhřevu a světlu. Ničí se oxidačními činidly (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990). Vitamín C jeho obsah závisí na plemeni, stádiu laktace a zdravotním stavu vemene. Je citlivý na působení světla a oxidaci. Vzduch společně s vysokou teplotou ho zničí (GRIEGER, HOLEC et. al, 1990; LUKÁŠOVÁ et. al, 1999)

23 Dále se ještě v mléce mohou objevit biotin, niacin, kyselina listová a to v nepatrných mnoţstvích (LUKÁŠOVÁ et. al, 1999). f) Enzymy Mléko obsahuje široké spektrum takzvaných nativních enzymů, které pocházejí z mléčné ţlázy. Řada z nich se podílí na přirozeném antibakteriálním systému mléka, některé mohou katalyzovat biochemické reakce, které vedou ke vzniku senzorických vad mléčných výrobků, nebo ke změně technologických vlastností (KADLEC et. al, 2009). Enzymy jsou organické katalyzátory produkované ţivou buňkou, ovlivňují nejrůznější ţivotní děje. Enzymy jsou ve své podstatě bílkoviny, přičemţ některé z nich obsahují další sloţku (koenzym), který můţe být nebílkovinné povahy. Mají podobné vlastnosti jako bílkoviny: inaktivace působením záhřevu, velká molekulová váha, specifičnost. Účinnost enzymů závisí na teplotě, reakci prostředí, přítomnosti aktivujících nebo inhibujících látek a další nespecifikované vlivy. Čerstvé mléko obsahuje různé enzymy, které jsou produktem mléčné ţlázy. Takovéto enzymy značíme jako nativní. Dále se mohou objevovat v mléce enzymy mikrobiálního původu, bývají produkovány mikroflórou mléka. Z nich je nejvýznamnější reduktáza, která se vyuţívá k hodnocení mikrobiální čistoty mléka (DUŠEK et. al, 1964). Některé z těchto enzymů jsou koncentrovány v povrchové vrstvě tukových kuliček a přecházejí do smetany (aldehydredukráza, fosfatáza, lipáza). Neţ stanovíme aktivitu enzymů, musíme znát vlastnosti sledovaného enzymu. Aktivita enzymů závisí na ph a teplotě. Záhřevem mléka dochází k denaturaci a inaktivaci enzymů. Zjišťování přítomnosti a aktivity enzymů lze vyuţít zejména pro zjištění: Rozlišnosti mlék jednotlivých savců (u kravského mléka k odlišení zralého mléka od mleziva). K diagnostice zdravotního stavu mléčné ţlázy nebo dojnice. Zjišťování hygieny získávání a ošetřování mléka. Pro kontrolu provedení tepelného ošetření mléka. K hodnocení nebezpečí rozkladu jednotlivých sloţek mléka působením enzymů (GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993). Oxidoreduktázy Laktoperoxidáza je první enzym, který byl v mléce objeven a izolován v čistém stavu. Rozkládá se za přítomnosti sulfokyanidu v mléce peroxidy na atomární kyslík, který působí baktericidně. Je součástí obranného systému mléčné ţlázy

24 Laktoperoxidáza se vyuţívá k prodlouţení doby skladování syrového mléka. Laktoperoxidáza má velkou tepelnou stabilitu. Při záhřevu mléka na 75 C se inaktivuje po 30 minutách. Podle přítomnosti laktoperoxidázy v tepelně upraveném mléce se pomocí přídavku peroxidu vodíku a indikátoru zjistí, jestli došlo k dostatečné tepelné úpravě (GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993). Kataláza je obsaţená ve všech tkáních a tekutinách ţivých organismů. Mléko obsahuje katalázu, ale její aktivita je nízká. Velká aktivita je v mléce od dojnic se záněty mléčné ţlázy nebo při zvýšeném počtu buněčných elementů v mléce. Kataláza rozkládá peroxid vodíku na vodík a kyslík, čímţ chrání organismy před účinkem peroxidu. Při teplotě 65 C se inaktivuje v průběhu 30 minut. Aktivita katalázy se zjišťuje podle mnoţství uvolněného kyslíku nebo podle oxidace sloučenin přidaných do mléka (DUŠEK, PAVEL, ŠEBELA, 1964; GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993). Xantioxidáza katalyzuje oxidaci xantinu na hypoxanthin a pak na kyselinu močovou. Xantinoxidáza se v mléce vyskytuje vázaná na lipoproteinový komplex membrány tukových kuliček, ze kterých se můţe enzym extrahovat. V mléce od zdravých dojnic je její aktivita relativně malá. U dojnic při zánětech mléčné ţlázy nebo ve starém mléce se zvyšuje aktivita (DUŠEK, PAVEL, ŠEBELA, 1964; GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993). Hydrolázy Lipázy jsou v mléce přirozené, i bakterální. Mnoţství přirozených lipáz stoupá s pokročilou laktací. Lipázy vyvolávají hydrolytické štěpení mléčného tuku (HÖKL, ŠTĚPÁNEK, 1956). Fosfatáza je v kaţdém syrovém mléce. Alkalická fosfatáza pochází z epitelu mléčné ţlázy, z krve, z buněčných útvarů. Kyselá fosfatáza pochází z leukocytů. Alkalická fosfatáza se při pasteraci mléka rozruší, ale kyselá fosfatáza je proti záhřevu odolná. Citlivost fosfatázy se vyuţívá ke kontrole fosfatázové zkoušky, která se pouţívá ke kontrole účinnosti pasterace mléka (HÖKL, ŠTĚPÁNEK, 1956; DUŠEK, PAVEL, ŠEBELA, 1964). Proteázy jsou přirozenou součástí mléka. Nativní protézy vykazují v mléce malou aktivitu. Mikrobiální protézy pocházející z kontaminované mikroflóry, které mohou tvořit značný podíl proteolytické aktivity mléka (GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993)

25 Amyláza je ferment, vzniká primárně činností mléčné ţlázy. Hydrolyzuje škrob aţ na maltosu. Amyláza je vázaná na lipoproteiny tukových kuliček. Pouţívá se k průkazu mleziva nebo mléka od nemocných dojnic (HÖKL, ŠTĚPÁNEK, 1956; GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993). Lysozymy štěpí glykosidické vazby mukoproteinů obsaţených v buněčné stěně některých bakterií. Působí baktericidně na některé druhy bakterií a brání jejich rozvoji v řadě orgánů a tělesných tekutin ţivého organismu i v mléce. Aktivita lysozymu v mléce je nízká (GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993). 3.2 Legislativa mléka Poţadavky na syrové kravské mléko vychází: Nařízení komise (ES) č. 852/2004 o hygieně potravin (MINISTERSTVO ZEMĚDĚLSTVÍ, 2010). Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny (MINISTERSTVO ZEMĚDĚLSTVÍ, 2010). Zákon č. 110/1997 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a ve znění pozdějších předpisů (MINISTERSTVO ZEMĚDĚLSTVÍ, 2010). Zákon č. 147/2006 Sb., 286/2003 Sb. přináší úplné znění zákona č. 164/1999 Sb. o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů (WIKIPEDIA, 2011; SAGIT 2011). Vyhláška č. 203/2003 Sb. o veterinárních poţadavcích na mléko mléčné výrobky (WIKIPEDIA, 2011; SAGIT 2011). Syrové mléko je produkt mléčné ţlázy hospodářských zvířat, získaný dojením a splňující poţadavky zákona o veterinární péči (KOMPRDA, 1999). Mlékem se rozumí syrové mléko ošetřené podle zákona o veterinární péči (KOMPRDA, 1999)

26 3.3 Mikrobiologie mléka Charakteristika mikroorganismů Skupiny mikroorganismů se navzájem od sebe liší nároky na kyslík, výţivu a ziskem energie. Podle zisku stavebních prvků a sloučenin se dělí na: Autotrofní syntetizují organické sloučeniny z anorganických zdrojů, jako jsou například amoniak, oxid uhličitý a další. Heterotrofní pouţívají k syntéze organických kyselin jednoduché organické látky, které slouţí zároveň jako zdroj energie (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Podle zisku energie mikroorganismů se dělí na: Fototrofní mikroorganismy pouţívají přeměnu světelné energie na energii chemickou jako zdroj energie. Tu pak vyuţívají pro své ţivotní pochody. Chemotrofní mikroorganismy získávají energii přeměnami organických nebo anorganických sloučenin (ŠILHÁNKOVÁ, 2002) Obecná charakteristika bakterií Bakterie jsou prokaryotické organismy, které mají jádro oddělené od cytoplazmy jadernou membránou. Velikost se uvádí v tisícinách milimetrů aţ mikrometrů. Rozměry bakterií mohou kolísat. Bakterie se lišit v závislosti na vývojové fázi, prostředí, obsahu ţivin a na pouţité mikroskopické technice. Vyskytují se v podobě dvou základních morfologických typů a to jako koky nebo jako tyčinky. Kulovitý tvar značíme coccus, tyčinkovitý bakterium a bacillus, šroubovitý spirillum, bakterie mohou tvořit i nitkovité tvary. Nejjednodušší tvar bakterií je kulovitý, který se vyskytuje buď ve tvaru jednotlivých kuliček koků, v dvojných kuličkách diplokoky nebo kuličky řazeny za sebou jako řetízky streptokoky, nebo v konečném tvaru kuliček sloučených po čtyřech tetrakoky (například: mezi koky patří Micrococcus pyogenes, diplokoky Micrococcus roseus, tetrakoky Streptococcus pyogenes) (LAXA, 1922; FJODOROV, 1952; TEPLÝ et. al, 1985; AMBROŢ, 1986; VLKOVÁ et. al, 2009). Některé druhy bakterií se dovedou v tekutinách pohybovat za pomocí bičíku střelhbitě. Bičík můţe být na jednom konci buňky, na obou pólech buňky, po celé buňce, svazek bičíků, nebo jenom jeden bičík (LAXA, 1922; AMBROŢ, 1986)

27 Bakterie se většinou mnoţí poltěním nebo dělením buněk. Tvar se protáhne jedním směrem a rozdělí přihrádkou. Některé druhy bakterií se mnoţí za zvláštních okolností. Obvykle se mnoţí za nepříznivých ţivotních podmínek. Některé bakterie tvoří uvnitř buňky spory. Spory mají drobná semena trvalého tvaru. Nedostatkem ţivin a zvýšenou teplotou se ničí tvary. Tyčinkovité tvary mohou tvořit spory například Bacillus, bakterium spory netvoří (LAXA, 1922; FJODOROV, 1952; AMBROŢ, 1986). Bakteriální buňky mají vzhledem ke své velikosti, velký specifický povrch. Je to dáno intenzivním metabolizmem podmiňujícím jejich rychlý růst a mnoţení. Bakterie se mnoţí dělením a jejich poţadavky na prostředí jsou odlišné. Podle vztahu ke kyslíku se dělí do čtyř základních skupin obligátně aerobní, fakultativně anaerobní, mikroaerofilní a obligátně anaerobní bakterie (VLKOVÁ et. al, 2009). Obligátně aerobní potřebují pro ţivot vzdušný kyslík. Mají vyvinutý aerobní metabolismus. Do aerobních mikroorganismů patří plísně, bakterie a některé kvasinky. Obligátně anaerobní nepotřebují pro svůj ţivot kyslík. Mají vyvinutý anaerobní metabolismus. Kyslík je pro ně toxický. Fakultativně anaerobní mají metabolismus jak anaerobní tak i aerobní. Potřebnou energii získávají fermentací jak za přístupu, tak i za nepřístupu kyslíku. Jiné mohou v prostředí obsahující kyslík přeměnit svůj metabolizmus na aerobní respiraci. Mikroaerofilní obsahují anaerobní metabolismus s nízkým obsahem kyslíku pro lepší rozmnoţení. Patří sem mléčné bakterie. Výjimku tvoří aerotolerantní bakterie mezi, které patří bakterie mléčného kvašení. Mají anaerobní metabolismus, ale jsou schopny se mnoţit i za přístupu kyslíku (ŠILHÁNKOVÁ, 2002; VLKOVÁ et. al, 2009) Bakterie se vyskytují v různých formách (například: jednobuněčných, vláknitých). Vláknité představují mnohobuněčné kolonie organismů, které ulpí na substrátu, nebo jsou volně plovoucí v tekutině (FJODOROV, 1952). Bakterie se barví podle Gramovy metody. Gram-pozitivní a Gram-negativní se v praktickém provedení rozlišení zaloţeno na skutečnosti, ţe po obarvení krystalovou violetí si buněčná stěna G + bakterií zachová obarvení i po promytí. U G - bakterie se rozpouštědlo extrahuje a výsledná reakce je negativní. G + bakterie mají silnější buněčnou stěnu, která je oklopena cytoplazmatickou membránou sloţenou z peptidoglykenu a teichové kyseliny. G - bakterie mají tenčí buněčnou stěnu, ale ta je

28 ještě obalena vnější membránou. Lipidová dvojvrstva vnější membrány se liší od membrány vnitřní, která obsahuje liposacharid (KOMPRDA, 2007) Růstová křivka Na obr. č. 5 je znázorněná růstová křivka bakterií, která má většinou zřetelně rozlišené čtyři hlavní růstové fáze: lag-fáze, exponenciální fáze (logaritmická fáze), stacionární fáze a fáze poklesu. Další fáze je přechodná. Pro projev fází jsou důleţité vnitřní podmínky bakterií, zároveň i podmínky vnějšího prostředí (KAŠ, 1964; WALSTRA et. al, 2006). Obr. č. 5 je uvedena růstová křivka bakterií dle Mikrobiologie (AMBROŢ, 1986) 1. Lag-fáze Lag-fáze začne zaočkováním bakterií do ţivného roztoku do počátku jejich mnoţení. Bakterie se nemnoţí, ale zvětšují svůj objem. V lag-fázi se vytváří nové potřebné enzymy. Také zde vznikne metabolický systém. Délka lag-fáze závisí na sloţení prostředí, fyziologickém stavu buněk, zejména na velikosti a stáří inokula, druhu mikroorganismů (KAŠ, 1964; ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 2. Fáze zrychlujícího se růstu Kultura je plně přizpůsobena podmínkám prostředí, buňky se začínají mnoţit. S narůstající rychlostí dělení se zvyšuje intenzita metabolismu, také se zvýší citlivost na nepříznivé vlivy prostředí (AMBROŢ, 1986). 3. Logaritmická (exponenciální) křivka V této fázi dochází k maximálnímu mnoţení, které je závislé na délce a druhu mikroba. Dále závisí na prostředí, vnějších podmínkách a hlavně na způsobu kultivace. Exponenciální fáze končí vyčerpáním ţivin pod určitou hranici a nahromaděním škodlivých zplodin látkové přeměny (KAŠ, 1964)

29 4. Fáze zpomalení růstu Nastává postupné zdrţení mnoţení a celkového metabolismu. Rychlost dělení se sniţuje v důsledku vyčerpání ţivin a hromadění metabolitů (AMBROŢ, 1986). 5. Stacionární fáze Ve stacionární fázi nevznikají ţivé bakterie. Mnoţení můţe ještě probíhat, ale zároveň dochází k rychlejšímu úmrtí. Po jakou dobu bude stacionární fáze působit, záleţí na rychlosti zhoršování podmínek prostředí (KAŠ, 1964; ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 6. Fáze postupného odumírání buněk Ve fázi poklesu nedochází k mnoţení mikrobů, ale mikroby rychle odumírají. Rychlé odumírání je způsobeno nahromaděním velkého počtu škodlivých ţivin nad únosnou hranici. Některé bakterie odumírají velice rychle, jiné aţ po docela dlouhé době. Největší odolnost mají sporulující bakterie (KAŠ, 1964) Faktory ovlivňující růst mikroorganismů a) Vnitřní faktory Mezi vnitřní faktory ovlivňující rozvoj mikroorganismů v potravinách patří: ph, vodní aktivita, oxidačne-redoxní potenciál, obsah ţivin, antimikrobiální látky. ph Biologickou aktivitu mikroorganismů ovlivňuje koncentrace vodíkových iontů v prostředí. Mikrobiální druhy se mohou rozmnoţovat v určitém rozmezí ph. Většina mikroorganismů se mnoţí při ph okolo 7, ale některé rostou při ph pod 4. Bakterie a kvasinky se mohou mnoţit při nízkém ph. Většina druhů bakterií mléčného kvašení (např: Lactococcus lactis při ph 4,8) se rozvíjí při ph 5,6 aţ 7,5, ale mnohé rostou i ve větších rozmezích ph. Kvasinky a plísně se rozvíjí při nízkých hodnotách ph. Hodnota ph ovlivňuje aktivitu mikrobiálních enzymů (GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993; VLKOVÁ et. al, 2009). Vodní aktivita Mikroorganismy potřebují, pro látkovou přeměnu dostatečné mnoţství vody. Bakterie vyţadují pro růst hodnoty vodní aktivity 0,99 aţ 0,91. Gramnegativní bakterie jsou náročnější na vlhkost neţ grampozitivní. Existují bakterie, které se mnoţí při hodnotách 0,75 a označujeme je jako halofilní. Halofilní bakterie rostou při více neţ 15 % chloridu sodného v prostředí (vodní aktivita je sníţena vysokou koncentrací solí)

30 Plísně a kvasinky snášejí niţší vlhkost neţ bakterie. Xerofilní (suchomilné) plísně a osmofilní kvasinky rostou při hodnotách vodní aktivity 0,65 aţ 0,61. Minimální hodnota vodní aktivity, kterou mikroorganismy potřebují. Souvisí to s dalšími faktory (ph, obsah ţivin, teplota a parciální tlak kyslíku) (VLKOVÁ et. al, 2009). Oxidačně redoxní potenciál Oxidačním procesem je odevzdání elektronů a redukce je příjem. Oxidačními činidly je kyslík, peroxidy, ţelezné ionty, dusičnany. Redukční čidlem je vodík, ţelezné ionty, sloučeniny se sulfhydrylovou skupinou. Hodnota redoxního potenciálu prostředí je mírou tendence látky odevzdat nebo přijímat elektrony. Při odevzdávání je elektron oxidován a při přijímání je redukován. Neměří se absolutní hodnoty oxidačně-redoxního potenciálu, ale potenciálový rozdíl vůči standardní elektrodě (KOMPRDA, 2007). Obsah živin Mikroorganismy potřebují pro růst řadu látek jako vodu, zdroj energie, zdroj dusíku, minerální látky, vitamíny a jiné. Mikroorganismy nejprve metabolizují jednoduší látky a po jejich spotřebování vyuţívají komplexní sloučeniny (VLKOVÁ et. al, 2009). Antimikrobiální látky Odolnost některých potravin, proti neţádoucí činnosti mikroorganismů. Je daná přirozeným obsahem antimikrobiálních látek. Antimikrobiální látky jsou sloučeniny, které mají specifické nepříznivé účinky na mikroorganismus. Mohou zastavit jejich rozmnoţování, nebo je rovnou usmrtí (VLKOVÁ et. al, 2009). V kravském mléce jsou antimikrobiální látky zastoupeny laktoferinem, konglutinem, inhibitory rozvoje rotavirů a laktoperoxidázovým komplexem. Uvedené látky významně omezují rozvoj mikrobů v čerstvém mléce, ale dobře se ničí pasterací. Laktoperoxidázový systém je významná sloţka čerstvého mléka. Skládá se z laktoperoxidázy, thiokyanátu a peroxidu vodíku. Tyto sloţky působí synergeticky a nejúčinnější jsou proti gramnegativním psychrofilním bakteriím. K jejich inhibici je potřeba koncentrace 0,5 1,0 ppm, čerstvé kravské mléko obsahuje aţ 30 ppm. Obsah jednotlivých sloţek kolísá. Hlavně to platí pro obsah thiokyanátu a peroxidu vodíku. Při zvýšení těchto dvouch látek je moţné prodlouţení trvanlivosti mléka ze dvou dnů na pět bez pouţití jiných konzervačních postupů. Jeto efektivnější při vyšších teplotách neţ při skladování v chladu (VLKOVÁ et. al, 2009)

31 b) Vnější faktory Vnější faktory ovlivňují nejen potravinu, ale i mikroorganismy v ní obsaţené. Jsou to teplota skladování, relativní vlhkost prostředí, přítomnost a koncentrace plynů, přítomnost a aktivita mikroorganismu. Teplota Má velký význam, protoţe umoţňuje rozvoj mikroorganismů a zároveň ovlivňuje jejich růst. Podle optimální teploty pro růst mikroorganismů je dělíme na psychrotrofní, psychrofilní, mezofilní, termofilní. Optimální teplotou se rozumí teplota, při které se mikroorganismy mnoţí největší rychlostí. V tabulce jsou uvedené teplotní rozmezí pro růst mikroorganismů. V tabulce č. 1 jsou uvedené skupiny mikroorganismů podle nároků na teplotu (GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993; VLKOVÁ et. al, 2009). Relativní vlhkost prostředí Relativní vlhkost prostředí je podíl aktuálního tlaku vodní páry obsaţené v prostředí k maximálnímu moţnému tlaku vodní páry za dané teploty. Relativní vlhkost je důleţitá z hlediska vodní aktivity, ale i z hlediska mnoţení mikroorganismů na jejich povrchu (VLKOVÁ et. al, 2009). Přítomnost a koncentrace plynů Obsah jednotlivých plynů v atmosféře má vliv na rozvoj mikroorganismů na povrchu potravin. Z tohoto důvodu jsou potraviny balené. U výrobky balených vakuově nebo v ochranné atmosféře nemohou růst plísně a aerobní bakterie, ale mohou se mnoţit fakultativně anaerobní a anaerobní bakterie. Vakuově balené potraviny se musí skladovat při nízkých teplotách (VLKOVÁ et. al, 2009)

32 Přítomnost a aktivita mikroorganismů Některé mikroorganismy vyskytující se v potravinách mohou produkovat látky působící antagonisticky na jiné. Jde o antibiotika, bakteriociny, peroxid vodíku a organické sloučeniny. V prostředích se uplatňuje obecná mikrobiální inference, je to nespecifické potlačení jedné skupiny mikroorganismů jinou skupinou nacházející se ve stejném prostředí (VLKOVÁ et. al, 2009) Zástupci bakterií Z níţe uvedeného seznamu bude patrné, ţe bakterie mohou způsobovat celou řadu onemocnění, ale zároveň některé se vyuţívají v potravinářském průmyslu. a) Grampozitivní koky Rod Streptococcus Jedná se o grampozitivní, fakultativně anaerobní, homofermentativní koky, které tvoří páry nebo řetízky. Některé streptokoky (Streptococcus pyogenes) mohou u lidí a zvířat vyvolat hnisavá onemocnění horních cest dýchacích. Streptococcus pyogenes byl izolován z hnisavých ran, poraněné kůţe a krve. Jiné druhy se běţně vyskytují v ústní dutině, horních cestách dýchacích a trávicím traktu, (Streptococcus bovis) kde nezpůsobí ţádné obtíţe (VLKOVÁ et. al, 2009). Streptococcus bovis se vyskytuje ve výkalech, odkud se dostává do mléka (DUŠEK et. al, 1964). Druh Streptococcus thermophilus se přirozeně vyskytuje v mléce a je součástí mlékařských kultur pouţívaných při výrobě tvarohu, sýru, jogurtu. Optimální teplota pro rozvoj je C. Divoké kmeny mohou přeţít tepelný záhřev nad 60 C po dobu i 30 minut, bývají to termofilní mikroorganismy. Sráţí mléko a vytváří v něm kyselinu mléčnou (DUŠEK et. al, 1964; GAJDŮŠEK, KLÍČNÍK, 1993). Streptococcus agalactiae dobře roste v mléce, které nesráţí. Můţe být původcem streptokokových mastitid u lidí a zvířat (DUŠEK et. al, 1964). Rod Lactococcus Laktokoky řadíme mezi homofermentativní bakterie mléčného kvašení, jsou grampozitivní, fakultativně anaerobní koky. Vyskytují se ve dvojicích nebo řetízcích. Tento rod je převáţně velmi rozšířený v přírodě, kde probíhá spontánní kvašení biologického materiálu (mléko, rostliny). V mlékařském průmyslu se vyuţívají jako