SOUPRAVA FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A

Transkript

1 SOUPRAVA FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A REF Pro použití se zařízením LightCycler Souprava pro 32 reakcí pro maximálně 30 klinických vzorků Pro diagnostické použití in vitro. DŮLEŽITÁ POZNÁMKA: SPECIFICKÉ INFORMACE O ŠARŽI PRO SOUPRAVU FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A JSOU UVEDENY NA ZADNÍ STRANĚ TOHOTO PŘÍBALOVÉHO LETÁKU VE FORMĚ ČÁROVÉHO KÓDU NEBO V ALFANUMERICKÉ FORMĚ. TATO SPECIFICKÁ INFORMACE ŠARŽE MUSÍ BÝT ZADÁNA DO SOFTWARU ZAŘÍZENÍ LIGHTCYCLER 2.0 BUĎ RUČNĚ NEBO NAČTENÍM ČÁROVÉHO KÓDU BĚHEM PRŮBĚHU PRÁCE. PŘED ZADÁNÍM INFORMACE JE DŮLEŽITÉ SE UJISTIT, ŽE SE ČÍSLO ŠARŽE NA ZADNÍ STRANĚ TOHOTO PŘÍBALOVÉHO LETÁKU SHODUJE S ČÍSLEM ŠARŽE NA KRABICI SOUPRAVY. ÚČEL POUŽITÍ Souprava Factor II (Prothrombin) G20210A slouží k detekci a genotypizaci jednobodové mutace (G na A v pozici 20210) genu lidského faktoru II z DNA izolované z plné lidské periferní krve. Test se provádí na zařízení LightCycler 2.0 za využití polymerázové řetězové reakce (PCR) k amplifikaci DNA faktoru II získané z klinických vzorků a fluorigenní cílově specifické hybridizace k detekci a genotypizaci amplifikované DNA faktoru II. Test Factor II (Prothrombin) G20210A je diagnostický test in vitro pro detekci a genotypizaci mutace Factor II (Prothrombin) G20210A jako diagnostické pomůcky při posuzování pacientů s podezřením na trombofílii. Tento test je určen k použití na zařízení LightCycler 2.0 s využitím software LightCycler Software 4.05 nebo 4.1. Příprava vzorku se musí provádět podle pracovních postupů uvedených níže. PRINCIP TESTU Dědičná trombofilie predisponuje jedince k trombotickým stavům, jako je žilní trombóza třetí nejrozšířenější kardiovaskulární onemocnění (1). Za nejobvyklejší koagulační abnormalitu při žilní trombóze se považuje rezistence na aktivovaný protein C (APC) (1,2). U pacientů, jejichž testy na APC rezistenci nebo mutaci Factor V Leiden jsou pozitivní, je třeba zvážit molekulárně genetické vyšetření na další nejčastější trombofiliní stavy s překryvným fenotypem, pro které jsou v současnosti k dispozici testy [tzn. Factor II (Prothrombin) varianta G20210A] (2). Ten se vyskytuje u 1 2 % obecné populace a jeho spojitost s žilní tromboembolií je dobře stanovena (2). PODSTATA TESTU / SOUHRN Příprava vzorku Příprava vzorku může být uskutečněna manuálně nebo automaticky pomocí soupravy High Pure PCR Template Preparation Kit nebo zařízení MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0, používající MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I. Jedná se o jediné purifikační metody schválené pro použití s testem Factor II Prothrombin. Detekce 1. Pomocí specifických primerů je z lidské genomické DNA amplifikován 165 bp fragment genu faktoru II. 2. Amplikon je detekován fluorescenčně pomocí specifického páru sond H. H sondy se skládají ze dvou různých oligonukleotidů, jež ve fázi připojování v PCR cyklu hybridizují s vnitřní sekvencí amplifikovaného fragmentu. Jedna sonda je značena na 5 -konci činidlem LightCycler Red 640-N-hydroxy-sukcinimid ester (Red 640-NHS ester), a aby se předešlo polymerizaci, je na 3 -konci modifikována fosforylací. Druhá sonda je na 3 -konci značena fluoresceinem. 3. Až po hybridizaci k templátové DNA se obě sondy dostávají do těsné blízkosti, což vede k přenosu fluorescenční rezonanční energie (FRET) mezi oběma fluorofory. Během FRET je fluorescein (fluorofor-donor) excitován světelným zdrojem zařízení LightCycler 2.0 aurčitý podíl excitační energie se přenáší na LightCycler Red 640-NHS ester (fluorofor-akceptor). 4. Emitovaná fluorescence činidla LightCycler Red 640-NHS ester je pak měřena zařízením LightCycler 2.0. Genotypizace H sondy slouží také k určení genotypu pomocí analýzy křivky tání po dokončení amplifikačních cyklů a za přítomnosti amplikonu ve zvýšené koncentraci. H sonda značená činidlem Red 640 hybridizuje k části cílové sekvence, která není zmutovaná a funguje jako kotvící sonda. H sonda značená fluoresceinem se nachází na místě mutace (mutační sonda). Při analýze křivky tání vyvolává rostoucí teplota pokles fluorescence, protože kratší z obou sond (mutační sonda) disociuje první a fluorescenční barviva přestávají být v těsné blízkosti. Pokud je přítomna mutace Factor II (Prothrombin) G20210A, hybrid se v důsledku nesouladu mutační sondy s cílem destabilizuje a k poklesu fluorescence dochází při nižší teplotě. U divokého genotypu k nesouladu nedochází, takže heteroduplex DNA má teplotu tání (T m ) vyšší. Heterozygotní genotyp vykazuje distinktivní kombinaci vlastností. 1

2 ČINIDLA PRACOVNÍ ROZTOKY 1. FIIG20210A MD Mix <0,01 % FIIG20210A dopředný a reverzní primer [Směs pro detekci mutace faktoru II (protrombinu) G20210A] <0,01 % FIIG20210A H sonda Red μl <0,01 % FIIG20210A H sonda fluorescein 2. FIIG20210A R Mix [Reakční směs faktoru II (protrombin) G20210A] 1 78 μl 3. FIIG20210A CT [Faktor II (prothrombin) G20210A kontrolní templát] 1 50 μl 4. FIIG20210A DIL [Ředidlo pro faktor II (protrombin) G20210A] 1 1 ml Pufr Tris-HCl <0,01 % Taq DNA polymeráza (hmotn.) <0,07 % datp, dctp, dgtp, dutp, dttp <0,01 % kontrolní templát DNA obsahuje plazmid: pf2 WT a pf2 MUT BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ A VAROVÁNÍ Polymorfismus V genu faktoru II existují vedle mutace FIIG20210A v polohách 20209, 20207, a čtyři další mutace (tj. mutace C20209T, A20207C, A20218G a C20221T), které jsou mutační sondou překlenuty. Tyto vzácné mutace způsobí po provedení genotypizace nedefinovaný výsledek nebo výsledek odpovídající divokému typu. Požadavky na manipulaci PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. S produktem by měli pracovat pouze pracovníci proškolení v technice PCR. Dodržujte normální bezpečnostní opatření pro práci se všemi laboratorními činidly. Test je vhodný pouze pro plnou lidskou krev odebranou do antikoagulantů EDTA nebo citrátu. Heparin může interferovat s PCR a proto se při této metodě používat nesmí. Laboratorní pracovní tok musí splňovat zásady správné laboratorní praxe (GLP) a mimoto musí probíhat jednosměrně (tzn., že příprava vzorku, příprava PCR a provedení PCR za použití zařízení LightCycler 2.0 musejí být fyzicky odděleny). Nesměšujte dohromady činidla z různých šarží, ani z různých lahviček téže šarže. Všechny lahvičky hned po použití uzavřete, aby se předešlo případným únikům nebo změnám koncentrací či podmínek pufrů. Po otevření skladujte všechny lahvičky a lékovky ve svislé (vzpřímené) poloze. Nesměšujte dohromady činidla z různých šarží. Po uplynutí data expirace již soupravu nepoužívejte. Dbejte na to, aby se lytický/vazebný pufr a promývací pufr I ze soupravy MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I nebo vazebný pufr či pufr pro odstraňování inhibitorů ze soupravy High Pure PCR Template Preparation Kit nedostaly do styku s pokožkou, očima či sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud by byla tato opatření zanedbána, může dojít k popáleninám. Pokud se činidlo rozlije, zřeďte ho před vytřením dosucha vodou. Lytický/vazebný pufr ze soupravy MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, který obsahuje guanidin-thiokyanát, se nesmí dostat do kontaktu s roztokem chlornanu sodného (bělidla), ani s roztoky silných kyselin. Tato směs vytváří vysoce toxický plyn. Laboratorní postupy S veškerým materiálem lidského původu a s veškerým odpadem z něj je třeba zacházet jako s potenciálně infekčním. Všechny pracovní plochy důkladně vyčistěte a vydezinfikujte pomocí dezinfekčních prostředků, jež doporučují příslušné místní orgány. V laboratorních prostorech nejezte, nepijte ani nekuřte. Nepipetujte ústy. Při manipulaci se vzorky a s činidly noste ochranné rukavice na jedno použití, laboratorní pláště a prostředek ochrany očí. Při odebírání podílů z lahviček s činidly dbejte na to, abyste zabránili jejich mikrobiální či nukleázové kontaminaci. Doporučuje se používat sterilní pipety na jedno použití. Po práci se vzorky a zkušebními činidly si důkladně umyjte ruce. Zacházení s odpadem Nespotřebovaná činidla a odpad likvidujte v souladu s celostátními resp. místními předpisy. Materiálové bezpečnostní listy (MSDS) si lze vyžádat od místního zastoupení firmy Roche. Příprava vzorku Odkazujeme na bezpečnostní instrukce v příbalovém letáku k soupravám MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, resp. High Pure PCR Template Preparation Kit týkající se manipulace a likvidace materiálů. Soupravy MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I, resp. High Pure PCR Template Preparation Kit se musí uchovávat při pokojové teplotě (+15 C až +25 C). Před použitím lytického/vazebného pufru v soupravě MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I důkladně protřepejte pro rozpuštění precipitátu. Neskladujte při teplotě nižší, než je pokojová teplota. Používejte pouze střední nádobu č. 20 na činidlo MagNA Pure LC (kat. č ) nebo nádoby na činidla MagNA Pure LC (velké) (kat. č ) a to v příslušných pozicích, jak pro tento postup indikuje zařízení MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0. Amplifikace a detekce Před použitím soupravy si prostudujte pracovní příručku pro IVD použití zařízení LightCycler 2.0. Vytvořte písemný záznam odpovídající identifikačnímu číslu LightCycler karuselu. Záznam musí obsahovat pozici LightCycler karuselu na vzorky, číslo kapiláry a jméno asociované s každým vzorkem, aby byla zajištěna jeho správná identifikace. Nedotýkejte se povrchu kapilár. Při manipulaci s nimi noste vždy na rukou rukavice. MANIPULACE S ČINIDLY 1. FIIG20210A MD Mix (žlutý uzávěr, lékovka č. 1), připravená pro použití 2. FIIG20210A R Mix (červený uzávěr, lékovka č. 2), připravená k použití 3. FIIG20210A CT (purpurový uzávěr, lékovka č. 3), připravená k použití 4. FIIG20210A DIL(bezbarvý uzávěr, lékovka č. 4), připravená k použití 2 Brij 35 MgCl 2 Brij 35 MgCl 2 H 2 O, PCR-stupeň (použitá také jako negativní kontrola pro amplifikaci) Uchovávat při -15 C až -25 C. Uchovávejte v temnu! Uchovávat při -15 C až -25 C. Uchovávat při -15 C až -25 C. Uchovávat při -15 C až -25 C.

3 SKLADOVÁNÍ / STABILITA (ČINIDLA) Neotevřená souprava se až do data expirace vyznačeného na štítku uchovává za teplot -15 C až -25 C. Uchovávejte FIIG20210A MD Mix (lékovka č. 1, žlutý uzávěr) mimo dosah světla! Součásti soupravy Factor II (Prothrombin) G20210A nechte roztát, opatrně promíchejte a uložte na led. Okamžitě po použití zmrazit. Činidla soupravy je možno zmrazit a rozmrazit až pětkrát. ODBĚR VZORKŮ / PŘÍPRAVA A STABILITA K přípravě genomické DNA z lidské krve se nukleová kyselina purifikuje pomocí soupravy High Pure PCR Template Preparation Kit (kat. č ) nebo MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (kat. č ) za použití zařízení MagNA Pure LC (kat. č ) nebo zařízení MagNA Pure LC 2.0 (kat. č ), jak je popsáno dále. Lidská periferní krev s EDTA nebo citrátem jako antikoagulantem je stabilní po dobu minimálně 7 dní při teplotě +2 C až +8 C. Může být skladována ve zmrazeném stavu při teplotě -20 C po dobu až 12 měsíců a jednou rozmrazena. Eluovaná DNA může být skladována v utěsněné patroně na vzorky nebo ve zkumavkách Sarstedt se šroubovacím uzávěrem při teplotě +2 C až +8 C po dobu maximálně 7 dnů. Je stabilní pro dlouhodobé skladování (přibližně 3 týdny) při teplotě -15 C až -25 C. Eluovaná DNA může být zmrazena a rozmrazena maximálně třikrát. DODÁVANÉ MATERIÁLY Viz Činidla pracovní roztoky na straně 2. POTŘEBNÉ MATERIÁLY A ZAŘÍZENÍ, JEŽ NEJSOU SOUČÁSTÍ DODÁVKY Zařízení LightCycler 2.0 (kat. č ) Poznámka: Pro USA mohou platit jiná katalogová čísla. Obrat te se prosím na obchodní oddělení v USA pro bližší informace. (Sériové číslo a vyšší jsou schváleny pro IVD použití a pro použití s touto soupravou. Zařízení s nižším sériovým číslem než jsou také schválena pro použití s touto soupravou poté, co byly schváleny pro IVD použití pomocí speciálního aktualizačního postupu. Kontaktujte prosím místní zákaznickou podporu pro získání podrobností o postupu aktualizace.) LightCycler Software 4.05 (kat. č ) nebo 4.1 (kat. č ) Kapiláry k zařízení LightCycler (20 μl) (kat. č ) Souprava pro přípravu templátů - High Pure PCR Template Preparation Kit (kat. č ) Zkumavky do mikrocentrifugy o objemu 1,5 ml, sterilní, prosté nukleázy Adaptéry k centrifuze LightCycler (kat. č ) Čtečka čárových kódů (kat. č ) Souprava Factor II (Prothrombin) G20210A Macro (kat. č ) VOLITELNÉ MATERIÁLY CD Thrombophilia Post-Elution Protocols (kat. č ) Tiskárna čárových kódů MagNA Pure LC TLP 2844 (kat. č ) Štítky s čárovým kódem k soupravě MagNA Pure LC (kat. č ) POSTUP TESTU DŮLEŽITÁ POZNÁMKA: SPECIFICKÉ INFORMACE O ŠARŽI PRO SOUPRAVU FACTOR II (PROTHROMBIN) G20210A JSOU UVEDENY NA ZADNÍ STRANĚ TOHOTO PŘÍBALOVÉHO LETÁKU VE FORMĚ ČÁROVÉHO KÓDU NEBO V ALFANUMERICKÉ FORMĚ. TATO SPECIFICKÁ INFORMACE ŠARŽE MUSÍ BÝT ZADÁNA DO SOFTWARU ZAŘÍZENÍ LIGHTCYCLER 2.0 BUĎ RUČNĚ NEBO NAČTENÍM ČÁROVÉHO KÓDU BĚHEM PRŮBĚHU PRÁCE. PŘED ZADÁNÍM INFORMACE JE DŮLEŽITÉ SE UJISTIT, ŽE SE ČÍSLO ŠARŽE NA ZADNÍ STRANĚ TOHOTO PŘÍBALOVÉHO LETÁKU SHODUJE S ČÍSLEM ŠARŽE NA KRABICI SOUPRAVY. A. PURIFIKACE Předtím, než začnete Nejprve vychlaďte MagNA Pure LC chladicí blok, LC karusel na vzorky (kat. č ) v chladničce na teplotu +2 C až +8 C (po dobu minimálně 2 hodin). Zapnutí zařízení a software MagNA Pure LC/MagNA Pure LC Nejprve zapněte zařízení MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0, potom zapněte počítač. Etanol p.a. Izopropanol p.a. H 2 O, dvakrát destilovaná, sterilní, prostá nukleázy Zařízení MagNA Pure LC (kat. č ) se softwarem MagNA Pure LC nebo vyšším nebo zařízení MagNA Pure LC 2.0 (kat. č ) s jakoukoli softwarovou konfigurací Souprava MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (kat. č ) LC karuselová centrifuga 2.0 plus nádoby rotoru [kat. č (230 V) nebo kat. č (115 V)]. Pokud jste si již zakoupili karusel LC centrifugu [kat. č (230 V) nebo kat. č (115 V)], LightCycler karusel 2.0 souprava rotoru (kat. č )* je také vyžadována. Zkumavky se šroubovacím uzávěrem Sarstedt 1,5 ml, sterilní * Viz příručka k zařízení LightCycler 2.0, verze softwaru 4.05 nebo 4.1 pro in vitro diagnostické použití, nebo kontaktujte technickou podporu pro ekvivalentní specifikace centrifugy pokud není k dispozici karuselová centrifuga LC. V tomto případě jsou potřebné také adaptéry centrifugy pro LightCycler (kat. č ) Páska do tiskárny čárových kódů k soupravě MagNA Pure LC (kat. č ) Chladicí blok MagNA Pure LC, LC karusel na vzorky (kat. č ) Uzavírací nástroj LightCycler (kat. č ) Všeobecné laboratorní vybavení ➀ Postup automatizované přípravy vzorků pro 15 nebo 30 vzorků pomocí soupravy MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (kat. č ) za použití zařízení MagNA Pure LC (kat. č ) nebo zařízení MagNA Pure LC 2.0 (kat. č ) 3

4 2. Pro software MagNA Pure LC: Spus te software MagNA Pure LC, potom na obrazovce Main Menu klikněte na tlačítko Sample Ordering. Pro software MagNA Pure LC 2.0: Otevřete záložku Workplace a zvolte podzáložku Ordering. 3. Pro MagNA Pure LC: Na obrazovce Sample Ordering zvolte protokol nazvaný DNA I Blood Cells Fast a potom vložte čísla šarží soupravy MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (kat. č ) a soupravy Factor II (Prothrombin) G20210A Kit a zadejte identifikační číslo LightCycler karuselu (ostatní nastavení neměňte). Pro MagNA Pure LC 2.0: Na podzáložce Ordering zvolte protokol nazvaný DNA I Blood Cells Fast a potom vložte čísla šarží soupravy MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (kat. č ) a soupravy Factor II (Prothrombin) G20210A Kit a zadejte identifikační číslo LightCycler karuselu (ostatní nastavení neměňte). 4. Vložte negativní kontrolu (FIIG20210A DIL, lékovka č. 4, bezbarvý uzávěr) do 1. řádku tabulky objednávky vzorku (pozice A1) napsáním "negativní kontrola". 5. Začněte na 1. řádku (pozice B1) a napište do něj názvy vzorků nebo použijte snímač čárových kódů MagNA Pure LC. (Volitelné.) Jako objem vzorku vložte 50 μl a jako ředicí objem 0 μl (předvolený). Eluční objem je přednastaven na 100 μl. 6. Informace souboru objednávky vzorku uložte a vytiskněte. 7. Použijte funkci Print Sample Names pro vytisknutí názvu vzorků a jejich správné polohy v patroně na vzorky. (Volitelné.) 8. Vytiskněte štítky Cartridge Barcode ve třech kopiích. (Volitelné.) 9. Označte patronu na vzorky (pro eluci) a výtisky pomocí štítků s čárovým kódem. (Volitelné.) 10. Klikněte na Stage Setup. Příprava pracovního roztoku proteinázy K (dostatečné pro 32 vzorků) 1. Do jedné lékovky proteinázy K, lyofilizované (lékovka č. 4, růžový uzávěr) přidejte 3 ml elučního pufru (lahvička č. 6, žlutý uzávěr). Po úplném rozpuštění proteinázy K přidejte další 2 ml elučního pufru pro dosažení konečného objemu 5 ml. 2. Lékovku uzavřete a dobře promíchejte. Poznámka: Není-li rekonstituovaný roztok použit ve stejný den, uskladněte ho při teplotě +2 C až +8 C v lékovce č. 4 (maximálně 4 týdny). Všechna ostatní činidla jsou připravena k použití. Zavádění činidel a plastů na jedno použití Poznámka: Nepoužívejte nádobku MagNA Pure LC 30. Používejte pouze střední nádobku činidla MagNA Pure LC 20 (kat. č ) nebo nádobku činidla MagNA Pure LC (velká) (kat. č ) v příslušných pozicích vyhrazených zařízením MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 pro tuto proceduru. Stav Heat Unit a Cool Units 1 & 2 musí být zobrazen jako PASS před plněním příslušné nádobky na činidlo suspenzí s magnetickými skleněnými částicemi (MGP). 1. Nádobky na činidla naplňte ručně (mimo přístroj MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0) objemy vyznačenými na obrazovce Start Information (zařízení MagNA Pure LC) nebo na podzáložce Stage Setup (zařízení MagNA Pure LC 2.0) (podle vyobrazení Stage Layout), potom je uzavřete příslušnými víčky a těsněním. Naplněné nádobky na činidla uložte do stojanu na činidla do pozic, které ukazuje obrazovka Start Information (zařízení MagNA Pure LC) nebo podzáložka Stage Setup (zařízení MagNA Pure LC 2.0) (kromě MGP suspenze, viz krok 4). 2. Na plošinu pro činidla/vzorky uložte další potřebný plastový materiál na jedno použití (jak je uvedeno) a připravený stojan zásobníku činidla podle informace uvedené na obrazovce Start Information (zařízení MagNA Pure LC) nebo na podzáložce Stage Setup (zařízení MagNA Pure LC 2.0). 3. Ručně přeneste 50 μl resuspendovaných vzorků plné lidské periferní krve s EDTA nebo citrátem jako antikoagulantem přímo do patrony na vzorky (mimo zařízení MagNA Pure LC) dle seznamu objednávek vzorku. 4. Těsně před začátkem procedury důkladně promíchejte vířením skleněnou lékovku s MGP, naplňte nádobku suspenzí MGP, uzavřete ji příslušným víčkem a uložte na plošinu zařízení pro činidla/vzorky do pozice specifikované na obrazovce Start Information (zařízení MagNA Pure LC) nebo na podzáložce Stage Setup (zářízení MagNA Pure LC 2.0). 5. Patronu na vzorky vložte do zařízení MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0. Čisticí procedura 1. Potvrďte všechny zaplněné pozice v zařízení MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 kliknutím myší na obrazovku Start Information (zařízení MagNA Pure LC) nebo na podzáložku Stage Setup (zařízení MagNA Pure LC 2.0). Po potvrzení všech položek se objeví tlačítko OK (zařízení MagNA Pure LC) nebo tlačítko Start (zařízení MagNA Pure LC 2.0). 2. Sejměte těsnění víčka zkumavky a zavřete uzavírací tyčku a dveře zařízení MagNA Pure LC/MagNA Pure LC Kliknutím na tlačítko OK (zařízení MagNA Pure LC) nebo tlačítko Start (zařízení MagNA Pure LC 2.0) zahájíte běh. Objeví se obrazovka Batch Status (zařízení MagNA Pure LC) nebo Run Status (zařízení MagNA Pure LC 2.0) a aktuální postup izolační procedury ukazuje rudá čára postupující zleva doprava. 4. Pro zařízení MagNA Pure LC: Po skončení procedury se ukáže obrazovka Result. Pro zařízení MagNA Pure LC 2.0: Výsledky čisticí procedury jsou zobrazeny na podzáložce Batch Results. 5. Obrazovku Result/podzáložku Batch Results si uložte a vytiskněte (volitelně). 6. Volitelně vyberte funkci Open Post-Elution v nabídce Action (zařízení MagNA Pure LC) nebo podzáložku Post-Elution Edit (zařízení MagNA Pure LC 2.0). Jinak pokračujte ke kroku B v kapitole 2 tohoto příbalového letáku (manuální příprava vzorku). 7. Pokud dojde k selhání extrakce MagNA Pure u jednotlivého vzorku (uvedeno na obrazovce Result/na podzáložce Batch Results) musí být příslušný vzorek znovu extrahován. Pokud nemůže být poeluční funkce provedena, pokračujte krokem B v kapitole 2 tohoto příbalového letáku (manuální příprava vzorku) použitím vzorků, které byly původně úspěšně extrahovány nebo znova extrahovány. B. PO ELUCI (Volitelné.) Postup po provedení eluce (Volitelné.) 1. Ujistěte se, že je chladící blok MagNA Pure LC karuselu na vzorky LC na místě, a že byl předem vychlazen (např. vychlaďte na teplotu +2 C až +8 C po dobu minimálně 2 hodin). 2. Zaveďte poeluční protokol nazvaný Thrombophilia 15 or 30 samples z Thrombophilia Post-Elution Protocols CD (kat. č ). (Volitelné.) 4

5 3. Příprava Master Mix (pouze pro poeluční postupy) Těsně před použitím připravte pouze požadované množství. Součásti soupravy Factor II (Prothrombin) G20210A nechte roztát, opatrně promíchejte a uložte na led. Vložte jednu LightCycler kapiláru na vzorek DNA a jednu pro každou kontrolu do LightCycler karuselu, tzn., 17 kapilár pro 15 vzorků, resp. 32 kapilár pro 30 vzorků. Připravte Master Mix: Krok Akce 1 Do zkumavky Sarstedt 1,5 ml se šroubovacím uzávěrem na ledu přidejte následující složky v pořadí uvedeném níže (Příklady pro 15 nebo 30 vzorků): Činidla pracovní roztoky Objem* / 15 vzorků Objem* / 30 vzorků FIIG20210A DIL, lékovka č μl 396 μl FIIG20210A MD Mix, lékovka č μl 72 μl FIIG20210A R Mix, lékovka č μl 72 μl Celkový objem 285 μl 540 μl * uvedené objemy zahrnují kontroly a pipetovací hranice 2 Opatrně promíchejte. Přesvědčte se, že ve špičce zkumavky nezůstaly žádné vzduchové bublinky. 3 Vložte zkumavku obsahující Master Mix na MagNA Pure LC chladicí blok do pozice 1. Odstraňte víčko nádobky. 4. Vložte LightCycler karusel, včetně kapilár uvedených v poelučním protokolu, do chladícího bloku a vložte potřebný počet hrotů pipet, jak je uvedeno na obrazovce, na plošinu zařízení MagNA Pure LC. 5. Otevřete FIIG20210A CT (lékovka č. 3, purpurový uzávěr), odpipetujte 25 μl do nové zkumavky Sarstedt 1,5 ml se šroubovacím uzávěrem a pak ji vložte do chladícího bloku MagNA Pure LCdo pozice 16, jak je uvedeno v poelučním protokolu. Poznámka: Lékovku obsahující FIIG20210A CT před otevřením odstřeďte, abyste její obsah oddělili. Přesvědčte se, že ve špičce zkumavky nezůstaly žádné vzduchové bublinky. Po manipulaci s kontrolním templátem si vyměňte rukavice. 6. Zařízení uzavřete a klikněte na Start (zařízení MagNA Pure LC) nebo Run (zařízení MagNA Pure LC 2.0) a OK pro zahájení automatického pipetování. Po skončení Post-Elution se zobrazí výsledek na obrazovce Post-Elution Result (zařízení MagNA Pure LC) nebo otevřete podzáložku Post-Elution results na záložce Workplace (zařízení MagNA Pure LC 2.0). 7. Vytiskněte čárový kód chladicího bloku třikrát. (Volitelné.) 8. Tabulku výsledků Post-Elution uložte a vytiskněte (Save a Print) (pro MagNA Pure LC) nebo když jste na podzáložce Post- Elution Results, můžete použít globální tlačítko pro tisk (zařízení MagNA Pure LC 2.0) a poté sestavu opatřte štítkem s čárovým kódem chladicího bloku. (Volitelné.) 9. Označte prázdnou disketu názvem čisticí procedury nebo čárovým kódem chladicího bloku. Na disketě vytvořte soubor LightCycler SAM (Soubor profilu vzorku). 10. Utěsněte každou kapiláru uzávěrem pomocí uzavíracího nástroje LC (kat. č ). 11. Označte LightCycler karusel čárovým kódem chladicího bloku. (Volitelné.) 12. Vložte LightCycler karusel do nádoby rotoru LC karuselové centrifugy. 13. Přemístěte nádobu rotoru, včetně LightCycler karuselu, do LC karuselové centrifugy. Poznámka: Není-li dostupná žádná LC karuselová centrifuga, použijte stolní centrifugu (například Biofuge 13 firmy Heraeus Instruments nebo Kendro Laboratory Products) s adaptéry pro centrifugu LightCycler a centrifugujte při max. 735 g po dobu 30 s. 14. Stiskněte Start pro spuštění běhu LC karuselové centrifugy. 15. Po centrifugaci přesuňte LightCycler karusel do zařízení LightCycler 2.0. Poznámka: Skladujte eluovanou DNA při teplotě +2 C až +8 C maximálně sedm dní a při teplotě -15 C až -25 C pro dlouhodobé skladování (přibližně 3 týdny). Pokud nepoužíváte poeluční protokol se zařízením MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0, pokračujte krokem B v kapitole 2 protokolu pro nastavení činidla PCR Master Mix. 16. Pokud nemají být provedeny žádné další MagNA Pure běhy, vypněte počítač MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0 a zařízení MagNA Pure LC/MagNA Pure LC 2.0. C. AMPLIFIKACE A DETEKCE Zařízení LightCycler 2.0 Poznámka: Před spuštěním programu Macro se přihlaste do databáze Exor (DB) pomocí revizního záznamu. Pokud jste přihlášeni do databáze Exor pomocí revizního záznamu (audit trail), je na stavové liště softwaru zobrazen text Traceable. Pro další informace opřihlášení do softwaru, viz příručka pro přístroj LightCycler 2.0, verze softwaru 4.05 nebo 4.1 pro in vitro diagnostiku. 1. Pokud bylo již provedeno označení (krok B.11), odstraňte štítek s čárovým kódem z LightCycler karuselu. (Volitelné.) 2. Vložte karusel do zařízení LightCycler Ujistěte se, že je nainstalovaná souprava Factor II (Prothrombin) G20210A Macro (kat. č ). Tato souprava Makro musí být nainstalována pouze jednou při prvním provádění testu. 4. Spust te makro stisknutím tlačítka Roche a zadáním kat. čísla soupravy, buď ručně nebo načtením čárového kódu. Viz zadní strana tohoto příbalového letáku pro získání informací o čárovém kódu soupravy. Poznámka: Perform self test nemusí být aktivní. 5. Průvodce soupravou vás provede celým postupem. 6. Zadejte názvy vzorků na obrazovce Capillary View buď ručně, nebo, pokud byly vytvořeny dříve, pomocí souboru SAM stisknutím tlačítka Import SAM. Zadejte číslo šarže soupravy do příslušného pole na obrazovce Capillary View. 7. Klikněte na tlačítko Start Run v průvodci soupravy. 8. Jakmile je cyklus dokončen, zařízení LightCycler 2.0 automaticky stanoví a zobrazí genotyp na základě provedení analýzy křivky tání. Poznámka: Fluorescenční signál se měří v kanálu 640 nm. 5

6 ➁ Postup manuální přípravy vzorku pro jeden vzorek použitím High Pure PCR Template Preparation Kit (kat. č ) A. PURIFIKACE Předtím, než začnete Zahajte chlazení centrifugového adaptéru LightCycler v chladničce při teplotě +2 C až +8 C (po dobu minimálně 2 hodin). Příprava pracovních roztoků Činidlo Rekonstituce/Příprava pracovního roztoku Skladování a stabilita pracovního roztoku Proteináza K Proteinázu K rozpust te ve 4,5 ml dvakrát destilované vody, Skladujte při teplotě -15 C až -25 C. Stabilní (lékovka č. 3, růžový uzávěr) alikvotní roztok. po dobu 12 měsíců. Pufr na odstraňování K pufru na odstraňování inhibitorů přidejte 20 ml etanolu. Uchovávat při teplotě +15 C až +25 C. inhibitorů Poznámka: Po přidání etanolu lahvičku označte a napište Roztok je stabilní do data expirace (lékovka č. 4a, černý uzávěr) datum. vyznačeného na štítku soupravy. Promývací pufr (lékovka č. 4, modrý uzávěr) Purifikační procedura K promývacímu pufru přidejte 80 ml etanolu. Poznámka: Po přidání etanolu lahvičku označte a napište datum. Poznámka: Ujistěte se, že přesně dodržujete postup popsaný níže a nikoliv postup popsaný v příbalovém letáku soupravy High Pure PCR Template Preparation Kit. 1. Do sterilních reakčních zkumavek o objemu 1,5 ml odměřte 200 μl elučního pufru na vzorek, zkumavku uzavřete a předehřejte na teplotu +70 C. 2. Ke 200 μl resuspendované plné lidské periferní krve s EDTA nebo citrátem jako antikoagulantem přidejte: 200 μl vazebného pufru (zelený uzávěr) 40 μl proteinázy K (rekonstituované). Ihned vířením promíchejte a po dobu 10 minut inkubujte při teplotě +70 C. 3. Přidejte 100 μl izopropanolu a vířením důkladně promíchejte. 4. Směs vzorku odpipetujte do horního rezervoáru kombinované soupravy High Pure filtrační zkumavky a jímací zkumavky. 5. Po dobu 1 minuty centrifugujte na standardní stolní odstředivce při 6000 g. 6. Průtokovou a jímací zkumavku zlikvidujte. 7. Zkombinujte filtrační zkumavku s novou jímací zkumavkou. 8. Do horního rezervoáru předejte 500 μl pufru na odstraňování inhibitorů (černý uzávěr). 9. Po dobu 1 minuty centrifugujte při 6000 g. 10. Průtokovou a jímací zkumavku zlikvidujte. 11. Zkombinujte filtrační zkumavku s novou jímací zkumavkou. 12. Do horního rezervoáru přidejte 500 μl promývacího pufru (modrý uzávěr). 13. Po dobu 1 minuty centrifugujte při 6000 g. 14. Průtokovou a jímací zkumavku zlikvidujte. 15. Zkombinujte filtrační zkumavku s novou jímací zkumavkou. 16. Do horního rezervoáru přidejte 500 μl promývacího pufru (modrý uzávěr). 17. Po dobu 1 minuty centrifugujte při 6000 g. 18. Průtokovou zkumavku zlikvidujte. 19. Zkombinujte filtrační zkumavku se stejnou jímací zkumavkou. 20. Centrifugujte po dobu 10 s maximální rychlostí ( g nebo vyšší), abyste odstranili zbytkový promývací pufr. 21. Jímací zkumavku zlikvidujte. 22. Filtrační zkumavku vložte do čisté reakční zkumavky o objemu 1,5 ml. 23. Do filtrační zkumavky přidejte 200 μl předehřátého (+70 C) elučního pufru. 24. Po dobu 1 minuty centrifugujte při 6000 g. Zkumavka mikrocentrifugy obsahuje eluovanou DNA. B. PŘÍPRAVA MASTER MIX 1. Součásti soupravy Factor II (Prothrombin) G20210A nechte roztát, opatrně promíchejte a uložte na led. 2. Vložte jednu LightCycler kapiláru na vzorek DNA a jednu pro každou kontrolu do předem vychlazeného centrifugového adaptéru pro zařízení LightCycler. 3. Připravte Master Mix vynásobením množství ve sloupci Objem/reakce počtem reakcí, které se budou provádět (tzn. DNA vzorků, negativních a pozitivních kontrol), plus ještě jedna reakce. Postupujte, jak je dále uvedeno pro standardní reakci s objemem 20 μl. Krok Akce 1 Do reakční zkumavky o objemu 1,5 ml na ledu přidejte následující složky v pořadí uvedeném níže: Činidla pracovní roztoky FIIG20210A DIL, lékovka č. 4 FIIG20210A MD Mix, lékovka č. 1 FIIG20210A R Mix, lékovka č. 2 Celkový objem 6 Uchovávat při teplotě +15 C až +25 C. Roztok je stabilní do data expirace vyznačeného na štítku soupravy. Objem/reakce 11 μl 2 μl 2 μl 15 μl 2 Opatrně promíchejte. Odpipetujte 15 μl Master Mix do každé předchlazené LightCycler kapiláry. Ověřte identitu seznamu vzorků (kapitola 1, A7, výtisk) s příslušnou patronou na vzorky srovnáním čísel čárového kódu. (Volitelné.) Přidejte 5 μl izolovaného vzorku DNA nebo 5 μl FIIG20210A CT (lékovka č. 3, purpurový uzávěr) jako pozitivní kontroly nebo 5 μl FIIG20210A DIL (lékovka č. 4, bezbarvý uzávěr) jako negativní kontroly.

7 3 Utěsněte každou kapiláru uzávěrem pomocí uzavíracího nástroje LC (kat. č ). 4 Pokud používáte LC karuselovou centrifugu, postupte na krok č. 5. Pokud používáte ekvivalentní stolní centrifugu (jako například Biofuge 13 od společnosti Heraeus Instruments nebo Kendro Laboratory Products), vložte každou kapiláru do příslušného předem vychlazeného centrifugačního adaptéru pro LightCycler aproveďte následující kroky: Vložte adaptéry do stolní centrifugy. Centrifugujte při maximálně 735 g po dobu 30 s. Pokračujte krokem č Kapiláru s negativní kontrolou vložte do pozice 1 a kapiláru s pozitivní kontrolou vložte do pozice 2 LightCycler karuselu. 6 Počínaje pozicí 3 vkládejte do LightCycler karuselu kapiláry obsahující DNA vzorku. 7 Nádobu rotoru s karuselem LightCycler přeneste do karuselové centrifugy LC 2.0 nebo karuselové centrifugy LC vybavené soupravou rotoru karuselové centrifugy LC Stiskněte Start pro zapnutí běhu LC karuselové centrifugy. 9 Po centrifugaci přesuňte LightCycler karusel do zařízení LightCycler 2.0. C. AMPLIFIKACE A DETEKCE Zařízení LightCycler 2.0 Poznámka: Před spuštěním programu Macro se přihlaste do databáze Exor (DB) pomocí revizního záznamu. Pokud jste přihlášeni do databáze Exor pomocí revizního záznamu (audit trail), je na stavové liště softwaru zobrazen text Traceable. Pro další informace opřihlášení do softwaru, viz příručka pro přístroj LightCycler 2.0, verze softwaru 4.05 nebo 4.1 pro in vitro diagnostiku. 1. Vložte karusel do zařízení LightCycler Ujistěte se, že je nainstalovaná souprava Factor II (Prothrombin) G20210A Macro (kat. č ). Tato souprava Makro musí být nainstalována pouze jednou při prvním provádění testu. 3. Spust te makro stisknutím tlačítka Roche a zadáním kat. čísla soupravy, buď ručně nebo načtením čárového kódu. Viz zadní strana tohoto příbalového letáku pro získání informací o čárovém kódu soupravy. Poznámka: Perform self test nemusí být aktivní. 4. Průvodce soupravou vás provede celým postupem. 5. Zadejte číslo vzorku do části pro počet vzorků a názvy vzorků na obrazovce Capillary View, podle aktuálního schématu vkládání vzorků. Zadejte číslo šarže soupravy do příslušného pole na obrazovce Capillary View. 6. Klikněte na tlačítko Start Run v průvodci soupravy. 7. Jakmile je cyklus dokončen, zařízení LightCycler 2.0 automaticky stanoví a zobrazí genotyp na základě provedení analýzy křivky tání. Poznámka: Fluorescenční signál se měří v kanálu 640 nm. KALIBRACE ZAŘÍZENÍ Žádná kalibrace není potřebná. KONTROLA KVALITY V každém cyklu PCR musí být zahrnuty negativní a pozitivní kontroly. Negativní kontrola: Výsledek testu pro negativní kontrolu FIIG20210A musí být vždy negativní. Pokud tomu tak není, je celý cyklus označen jako neplatný. Celý proces (příprava vzorků, amplifikace a detekce) musí být zopakován. Jestliže negativní kontrola dává soustavně jiný než negativní výsledek, vyžádejte si technickou pomoc u místního zastoupení firmy Roche. Pozitivní kontrola: Výsledek testu pro FIIG20210A CT musí být vždy genotyp het. Pokud tomu tak není, běh není platný a PCR je nutné opakovat. Jestliže je pozitivní kontrola vzorků na heterozygotní genotyp soustavně nevyhovující, požádejte místní zastoupení firmy Roche o technickou pomoc. Výsledek vzorku: Výsledek testu pro vzorek DNA musí vždy poskytnout profil křivky tání pro homozygotní divoký typ, homozygotního mutanta nebo heterozygotní genotyp. Pokud tato podmínka splněna není, je výsledek pro tento vzorek neplatný a celý postup (příprava vzorku, amplifikace a detekce) je třeba zopakovat. OMEZENÍ A INTERFERENCE Směs FIIG20210A MD Mix (lékovka č. 1, žlutý uzávěr) je sekvenčně specifická pro gen lidského faktoru II. Vysoké hladiny heparinu mohou interferovat s polymerázovou řetězovou reakcí. Žádné jiné interference známy nejsou. Souprava Factor II (Prothrombin) G20210A Macro (kat. č ) slouží k detekci mutace G20210A v genu lidského faktoru II. Přítomnost jiných mutací a polymorfismů může, za jistých okolností, vygenerovat křivky tání odlišné od křivek pro divoký typ, heterozygotní formu G20210A nebo mutaci G20210A. Velmi se doporučuje vlastní vyhodnocení křivky tání. 7

8 OČEKÁVANÉ HODNOTY / INTERPRETACE VÝSLEDKŮ 1. Ujistěte se, že jsou výsledky kontrol pro cyklus platné. Pokud cyklus platný není, zopakujte celý postup (přípravu vzorku, amplifikaci a detekci). 2. Pro platný cyklus jsou zobrazeny následující výsledky podle modulu analýzy genotypu softwaru LightCycler : Zobrazený výsledek wt Interpretace homozygotní divoký genotyp: vzorek je negativní na mutaci Factor II (Prothrombin) G20210A (tj. není přítomna žádná mutantní alela). het heterozygotní genotyp: vzorek obsahuje obě alely, jednu divokého typu a jednu mutantní alelu (Factor II (Prothrombin) G20210A) mut homozygotní mutantní genotyp: vzorek je pozitivní na mutaci Factor II (Prothrombin) G20210A (tj. jsou přítomny dvě mutantní alely). unknown (neznámý) Genotyp nelze zařadit do předem definovaných standardů tání. Zopakujte celý postup testu, včetně přípravy vzorku, amplifikace a detekce. Jestliže je výsledek vzorku opět neznámý ( unknown ), vyžádejte si technickou pomoc u místního zastoupení firmy Roche. negativní vzorek se shoduje s kritérii softwaru pro negativní kontrolu SPECIFICKÉ VÝKONNOSTNÍ ÚDAJE Analytická specificita S použitím syntetických oligonukleotidů jakožto primerů a H sond bylo zjištěno, že stanovení genotypu softwarem LightCycler 4.05 nebo 4.1 jasně identifikuje mutaci Factor II (Prothrombin) G20210A. Sekvenční analýzou se prokázalo, že zvolené syntetické oligonukleotidy použité jako primery amplifikují specificky 165 bp fragment genu faktoru II obsahující sekvenci Factor II (Prothrombin) G20210A. Analytická senzitivita Purifikovaná lidská DNA heterozygotní pro mutaci Factor II (Prothrombin) G20210A byla naředěna ve čtyřech postupných ředicích krocích. Každé ředění bylo analyzováno v šesti replikátech a výsledky byly vyhodnoceny statistickou metodou. Výpočtem byla u soupravy Factor II (Prothrombin) G20210A získána minimální úroveň detekce v hodnotě 198 kopií na jednu reakci. -(d/dt) Fluorescence (640) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Teplota [ C] heterozygotní divoký (homozygotní) mutantní (homozygotní) FIIG20210A DIL Diagnostická senzitivita a specificita V rámci prospektivní studie čerstvě odebraných a repozitorních vzorků lidské DNA bylo analyzováno 522 vzorků pacientů bílé rasy s podezřením na trombofílii pomocí soupravy Factor II (Prothrombin) G20210A a jednořetězcové a dvouřetězcové sekvenční analýzy na systému MegaBACE 500 Sequencing System za použití Cimarron Base Caller SW Oba panely reprezentovaly kompletní rutinní odběry hospitalizovaných pacientů s trombofilií laboratoře jedné fakultní nemocnice odebrané v definovaném časovém rámci. Shoda mezi soupravou Factor II (Prothrombin) G20210A a sekvenční analýzou činila 98,9 % (516/522). Detailní údaje uvádí níže uvedená tabulka. Tabulka 1: Porovnání výsledků soupravy Factor II (Prothrombin) G20210A a sekvenční analýzy Sekvenční analýza Souprava Factor II (Prothrombin) G20210A divoký typ (wt) heterozygotní (het) mutant (mut) unknown (neznámý) wt het 40 1 mut Poznámka: 41,0 % vzorků lidské DNA pocházelo od pacientů s podezřením na žilní tromboembolickou příhodu v souladu s dohodou American College of Medical Genetics (ACMG) resp. College of American Pathologists (CAP) (2,4), 38,0 % od pacientů s arteriální trombotickou poruchou (např. mrtvice), 18,0 % od pacientů odeslaných s podezřením na trombofilii z jiných důvodů a 3,0 % z nezaznamenaných důvodů. Genotypy pro šest vzorků nebylo možné pomocí soupravy Factor II (Prothrombin) G20210A získat. POZNÁMKA PRO KUPUJÍCÍHO Koupí tohoto produktu získává kupující právo produkt používat k amplifikaci a detekci sekvencí nukleový ch kyselin za účelem humánní diagnostiky in vitro. Žádný obecný patent ani jiná licence jakéhokoliv typu mimo toto konkrétní právo použití se tímto neudílí. LITERATURA 1 Ridker, PM, et al. (1997) Ethnic Distribution of Factor V Leiden in 4047 Men and Women: Implications for Venous Thromboembolism screening. JAMA, 277, Grody, WW. et al. (2001) American College of Medical Genetics Consensus Statement on Factor V Leiden Mutation Testing. Genetics in Medicine, 3, Vol. 2, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices; Approved Guideline. NCCLS document EP5-A (ISBN X). NCCLS 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pa , USA (1999). 4 Press, RD, et al. (2003) Clinical Utility of Factor V Leiden (R506Q) Testing for the Diagnosis and Management of Thromboembolic Disorders. CAP Consensus Conference XXXVI: Diagnostic Issues in Thrombophilia. 8

9 2009 Roche Diagnostics Technologie použitá v zařízení LightCycler je licencována od společnosti Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, USA. ROCHE, LIGHTCYCLER, HYBPROBE, MAGNA PURE, LC a HIGH PURE jsou obchodní známky společnosti Roche. Biofuge je obchodní známka společnosti Heraeus Instruments GmbH. Brij je registrovaná obchodní známka ICI Americas, Inc., PA, USA. MegaBACE je registrovaná obchodní známka GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Cimarron je obchodní známka Cimarron Software, Inc., Salt Lake City, UT, USA Kyaninová barviva v tomto produktu podléhají patentovým právům GE Healthcare Bio-Sciences Corp. a Carnegie Mellon University a jsou licencovány společnosti Roche pouze za účelem výzkumu a jako součást diagnostických sad in-vitro. Jakékoli užití jiné než za účelem výzkumu a jako součást diagnostických sad in-vitro vyžaduje sublicence od GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, USA a Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvánie, USA. Vyrobeno v Německu pro Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ USA Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Německu, Pro USA: Distribuce v USA: Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA Zákaznická technická podpora v USA: /2009 ( EN) Doc Rev