Alelov specifická PCR

HTML
DOWNLOAD

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Alelov specifická PCR"

Lubomír Staněk
před 9 lety
Počet zobrazení:

1 Pímá analýza muací jedné známé muace (SNP polymorfismy) MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA PÍMOU ANALÝZOU Marin Beránek Pednáka pro magisry a UK PCR RLP viz pedelý seminá ARMS (ASA) Real-ime PCR viz aké pednáka dr Libry Hybridizace na pevném podklad druhá polovina pednáky Primer exension Sekvenování zde vinou konfirmaní meoda Základní sloení PCR smsi Alelov specifická PCR DNA polymeráza marice /emplá/ - ssdna primery - oligonukleoidy pufr opimalizace chem. podmínek reakce hoenaé iony pro innos polymerázy dntps datp, dgtp, dctp, dttp (2 -deoxyrifosfá) adiiva efekivia PCR voda negaivní konrola 1. zkum. 2. zkum. 5 normální genoyp WT 5 bodová muace Urí známé ypy bodových muací Není nezbyná píomnos palindromu primery pln komplemenární k populaní sekvenci genu amplifikují wild-ype alelu primery s mismachy umoují amplifikaci muanních alel V obou zkumavkách je sejná délka PCR produk M Rizikové fakory pro vznik a rozvoj rombofilních sav Vyeované rombofilní muace Defici AT Defici proeinu C Defici proeinu S V Leiden G20210 II Dysfibrinogenemie Defici plasminogenu Vyí Hcy Vk + rod. anamnéza Imobilizace Chirurgické operace Malignia Hormon. anikoncepce Obezia Anifosfolipidový sy Gen Muac e Dsledek Ddinos Projev V G1691A Arg 506 Gln AD APC resisence Leiden II G20210A zmna UTR AD prorombin MTHR C677T Ala 222 Val AR homocysein Geneický podklad + vlivy prosedí rombus 1

ssdna primery - oligonukleoidy pufr opimalizace chem. podmínek reakce hoenaé iony pro innos polymerázy dntps datp, dgtp, dctp, dttp (2 -deoxyrifosfá) adiiva efekivia PCR voda negaivní konrola 1. zkum.

2 Sruná charakerisika PCR-RLP a ASA Pímá analýza (poeba DNA paciena, nikoliv rodinných písluník a posieného) Sandardní PCR amplifikace Nuná elekroforéza Doba analýzy: 2-3 dny Náklady: K Poe pacien v sérii: 5-10 Vyeení známé muace hydrolyickou (= hydrolyzaní) sondou Lze PCR a deekci produk zauomaizova? K rozliení obou alel (w a M) hydrolyickými (Taqman) sondami se pouívá meoda alelické diskriminace jen1 hydrolyická sonda nasedající na dané vlákno kadá sonda 2 znaky (jen 1 z nich schopná fluorescence) 2 reakní smsi (jako ASA), v kadé 1 sonda komplemenární k w i mu. sekvence oba ypy sond pokrývají oblas muace (jako primery u ASA) snímání fluorescence pouze pi polymeraci (pi pení sond) rozliení alel vzájemnou diskriminací (sou o ezce) ve 2 zkumavkách (sejný fluorofor) nebo v 1 zk. (rozdílné fluorofory) w M nm nm Zái Quencher zháe (energie odchází formou epla) Pi TaqMAN deekci se rosoucí fluorescence snímá po elongaci ANNEALING 1-5 base ROCHE Vyeení známé muace párem hybridizaních sond 525 nm 640 (705) nm Donor záení Akcepor záení Dv RET sondy nasedající sn za sebou na vlákno Ob sondy jsou designované zpravidla pro w alelu Jen jedna z nich pokrývá míso muace Kadá sonda vlasní znaku (ob schopné fluorescence) Snímání fluorescence pouze pi annealingu Rozliení alel pomocí eploy ání hybridizaních sond 2

K rozliení obou alel (w a M) hydrolyickými (Taqman) sondami se pouívá meoda alelické diskriminace jen1 hydrolyická sonda nasedající na dané vlákno kadá sonda 2 znaky (jen 1 z nich schopná

3 Sruná charakerisika real-ime PCR Poeba DNA paciena, nikoliv rodiny PCR amplifikace se sondami (i inerkalaními lákami) Bez elekroforézy Doba analýzy: 1 den Náklady: K Poe pacien v sérii: Izolace DNA PCR amplifikace Meoda primer exension Syneická reakce (asymerická amplifikace se znaenými ddntps) Muaci dopedu známe Separace produk na HPCE (kapilárním sekvenáoru) ddatp JOE (550 nm) ddctp AM (520 nm) ddgtp- TAMRA (585 nm) ddttp ROX (620 nm) A C G T Meoda primer exension Analýza omezeného pou známých bodových muací (jedna i nkolik) w/w ddt A ddt M/w ddt/c A ddt G ddc M/M ddc G ddc Trombofilní muace (V, II, MTHR) Hemochromaosa (HE) Defek v genu pro alfa-1-anirypsin (A1AT) Defek v genu pro apolipoproein B (apob) Genoypizace genu apoe armakogeneika (izoenzymy P450) enylkeonurie (PAH) Srpkoviá anémie (bea globin) Hemoglobinopaie (HbS, HbC,) Duchennova muskulární dysrofie One-ube muliplex PCR (píklad DMD) M 750 bp 426 bp - exon bp - exon bp - exon bp - exon bp - exon bp 300 bp 200 bp 100 bp 50 bp Velké delece podmiují pes 60% pípad DMD 3

nm) ddctp AM (520 nm) ddgtp- TAMRA (585 nm) ddttp ROX (620 nm) A C G T Meoda primer exension Analýza omezeného pou známých bodových muací (jedna i nkolik) w/w ddt A ddt M/w ddt/c A ddt G ddc M/M ddc

Muliplex Ligaion-dependen Probe Amplificaion (MLPA) Muliplex Ligaion-dependen Probe Amplificaion (MLPA) Muliplex Ligaion-dependen Probe Amplificaion (MLPA) Hybridizace - Souhern bloing DNA fragmen se

4 Muliplex Ligaion-dependen Probe Amplificaion (MLPA) Muliplex Ligaion-dependen Probe Amplificaion (MLPA) Muliplex Ligaion-dependen Probe Amplificaion (MLPA) Hybridizace - Souhern bloing DNA fragmen se sekvencí genu Hybridizaní sonda pro gen se znakou nylon agarózový gel DNA fragmeny Do bloing 1. ixace vyeované DNA do membrány v ss form 2. Hybridizace sondy komplemenární ke genu (s normální nebo muanní sekvencí) 3. Vizualizace signálu sondy Sekvence sondy Ani GGT (12) Ani GTT (12) Ani GAT (12) Vzorek: Al-Mulla. J Pahol, 185, 1998,

fragmeny Do bloing 1. ixace vyeované DNA do membrány v ss form 2.

5 Reverzní bloing 1. ixace mnoha neoznaených sond ke genu do membrány 2. Amplifikace DNA a znaení (primeru) 2. Hybridizace vyeované ss DNA k sondám 3. Vizualizace signálu primeru DNA vzorek. 1 anigat anigtt anigct aniagt anicgt Sonda: Podklady pro nanesení sond Nylonová membrána (desíky a sovky sond) Plasy (sovky) Sklo (isíce a soisíce) Kemík (soisíce a milióny) Microarray Píprava spo pro navázání sondy mikropipeováním Sruná charakerisika hybridizaních meod Poeba DNA paciena, nikoliv rodiny PCR se znaeným primerem nebo DNA znaení po PCR Není nuná elekroforéza Doba analýzy: 2-3 dny Náklady: K / 1 spo Poe spo v sérii: nad 20 5

1 anigat anigtt anigct aniagt anicgt Sonda: 1 2 3 4 5 Podklady pro nanesení sond Nylonová membrána (desíky a sovky sond) Plasy (sovky) Sklo (isíce a soisíce)

6 Analýza velkého pou známých muací i mikrodelecí v genu (cca nad 20) Cysická fibrosa Duchennova/Beckerova svalová dysrofie Williamsv-Beurenv syndrom 6

Podobné dokumenty

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Náplň praktik 1. Izolace DNA z buněk bukální sliznice - izolační kit MACHEREY-NAGEL 2. PCR polymerázová řetězová reakce (templát gdna) 3. Restrikční