UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

Transkript

1 UIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Studium biologické aktivity C-8 substituovaných purinových derivátů cytokininů BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Autor: Eva Dohnálková Studijní program: B1406 Biochemie Studijní obor: Biochemie Forma studia: Prezenční Vedoucí práce: Mgr. Jaroslav isler, Ph.D. Termín odevzdání práce:

2 Prohlašuji, že jsem předloženou bakalářskou práci vypracovala samostatně za použití citované literatury. V Olomouci dne Poděkování V první řadě bych ráda poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce Mgr. Jaroslavu islerovi, Ph.D. za ochotný a přátelský přístup, odborné vedení, konzultace a cenné rady při plnění této bakalářské práce. Děkuji také Mgr. Lukáši Spíchalovi, Ph.D. a všem z Laboratoře růstových regulátorů za vytvoření příjemného pracovního prostředí a vstřícnost, kterou mi poskytli. Poděkování dále patří grantu ED0007/01/01 Centru regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat celé své rodině, která mě po celou dobu mého studia podporovala.

3 Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora Eva Dohnálková ázev práce Studium biologické aktivity C-8 substituovaných purinových derivátů cytokininů Typ práce Bakalářská Pracoviště Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum Oddělení růstových regulátorů Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci Šlechtitelů 11, , Olomouc Vedoucí práce Mgr. Jaroslav isler, Ph.D. Rok obhajoby práce 2012 Abstrakt Rostlinné hormony cytokininy hrají důležitou roli ve vývoji, růstu a fyziologických procesech rostlin. Cytokininy jsou 6 substituované deriváty adeninu a dělí se na isoprenoidní a aromatické. Za účelem studia vztahu mezi strukturou a cytokininovou aktivitou byla v Laboratoři růstových regulátorů UP & UEB, AV ČR připravena řada C-8 substituovaných purinových derivátů cytokininů, jak aromatických, tak isoprenoidních. áplní této práce bylo zkoumat jejich cytokininovou aktivitu. Byly použity 2 typy testů, CRE1/AHK4 a AHK3 receptorový test a ARR5::GUS reportérový test. Bylo tak otestováno 33 látek, z toho deriváty trans-zeatinu, cis-zeatinu, 6 -isopentenyladeninu, 6 -benzyladeninu a kinetinu. Látky vykazovaly různou biologickou aktivitu. Většina látek byla rozpoznána receptorem AHK3, naopak receptor CRE1/AHK4 byl k testovaným látkám více selektivní. Klíčová slova Cytokininy, deriváty cytokininů, cytokininová aktivita Počet stran 44 Počet příloh 0 Jazyk Český 3

4 Bibliographical identification: Autor s first name and Eva Dohnálková Suriname Title The biological activity of C8-substituted purine derivatives of cytokinins Type of thesis Bachelor Department Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research Department of Growth Regulators Faculty of Science, Palacky University Šlechtitelů 11, Olomouc, CZ-78371, Czech Republic Supervisor Mgr. Jaroslav isler, Ph.D. The year of presentation 2012 Abstract Cytokinins are plant hormons which play an important role in development, growth and physiological processes of plants. Cytokinins are 6 substituted derivatives of adenin. They are divided into two groups - isoprenoid and aromatic. In Laboratory of Growth Regulators UP & IEB, AV CR was prepared C8-substituted group of purine derivatives of cytokinins for the purpose of studying the relationship between cytokinin structure and their activity. For the study both isoprenoid and aromatic cytokinins were used. The goal of this research was to examine their cytokinin activity in two types of bioassays - CRE1/AHK4 and AHK3 receptor assay and ARR5::GUS reporter gene assay. The 33 compounds were tested in total, including derivatives of trans-zeatin, cis-zeatin, 6 -( 2 - isopentenyl)- adenine, 6 -benzyladenine and kinetin. Compounds showed different biological activities. Most of them were recognized by AHK3 receptor, on the other hand CRE1/AHK4 receptor was more selective for tested substances. Keywords Cytokinins, cytokinin derivatives, cytokinin activity umber of pages 44 umber of appendices 0 Language Czech 4

5 Obsah Cíle práce... 6 Teoretická část 1. Cytokininy Úvod Rozdělení Fyziologické funkce Biosyntéza Degradace Signální dráha Standardní metody měření CK aktivity Amarantový biotest Kalusový biotest Senescenční biotest Moderní metody měření CK aktivity Bakteriální receptorový test ARR5::GUS reportérový test Cytokininové receptory Biologická aktivita derivátů cytokininů Experimentální část 2. Materiál a přístroje Biologický materiál Chemikálie Pracovní pomůcky Přístroje Metody Receptorový test ARR5::GUS reportérový test Přehled testovaných látek Výsledky a diskuze Závěr Seznam použité literatury Seznam použitých zkratek

6 Cíle práce Cílem bakalářské práce bylo: vypracování literární rešerše na téma biologická aktivita vybraných derivátů cytokininů testování cytokininové aktivity nových C-8 substituovaných purinových derivátů cytokininů v in vitro receptorovém a in vivo ARR5::GUS reportérovém testu sledování a popsání vztahu mezi strukturou a aktivitou testovaných látek nalezení vhodného substituentu, který nebude snižovat CK aktivitu mateřské molekuly a mohl by tak sloužit k navázání dalších funkčních skupin, jako je například fluorescenční marker; delší řetězec by také mohl sloužit jako linker k navázání CK molekuly na pevnou matrici (fázi) 6

7 Teoretická část 7

8 1. Cytokininy 1.1 Úvod Cytokininy jsou skupinou rostlinných hormonů (fytohormonů), které hrají klíčovou roli ve vývoji a růstu rostlin a řídí důležité fyziologické procesy v rostlinném těle. Působí téměř vždy v interakci s dalšími rostlinnými hormony, jako jsou auxiny, gibereliny, kyselina abscisová nebo etylen. Jejich bližší význam je popsán v kapitole Fyziologické funkce. Jako první byl izolován cytokinin s názvem 6-furfurylaminopurin, tzv. kinetin, který byl nalezen ve sledím spermatu (Miller et al., 1955). První přírodní cytokinin vyskytující se v rostlinách byl izolován ve velmi malém množství z nezralých semen kukuřice Zea mays (0,7 mg z 60 kg), proto dostal název zeatin (Letham, 1963). O rok později byla chemická struktura zeatinu, (E)-4-(hydroxy-3-methyl-but-2- enyl)aminopurin, potvrzena chemickou syntézou (Shaw and Wilson, 1964). Přirozeně se vyskytující zeatin byl později nalezen také v mnoha dalších rostlinách, bakteriích, houbách a v mořských organismech, jako jsou korály, kde byl detekován chromatograficky (Mok & Mok, 1994). Kromě toho, že se cytokininy mohou vyskytovat jako volné báze (nukleobáze), existují k nim příslušné nukleosidy (ribosidy a glukosidy) a nukleotidy, ty vykazují obecně nižší biologickou aktivitu než volné báze (Spíchal et al., 2004). Cytokininy jsou součástí i některých t-ra a mohou být jejich potencionálním zdrojem, dojde-li k jejich metabolické degradaci (Miyawaki et al., 2004). 1.2 Rozdělení Přirozeně se vyskytující cytokininy jsou po chemické stránce 6 substituované deriváty adeninu. Míra biologické aktivity závisí právě na tomto substituentu, podle kterého se rozdělují cytokininy na isoprenoidní a aromatické. Mezi isoprenoidní cytokininy patří 6 -( 2 -isopentenyl)adenin (ip), cis-zeatin (cz), trans-zeatin (tz) nebo dihydrozeatin (DHZ; Obr.1 ). Příkladem aromatického cytokininu je 6 -benzyladenin (BA), kinetin (K), meta-topolin (mt) a ortho-topolin (ot; Obr.2 ). Další širokou skupinou látek s cytokininovou aktivitou jsou syntetické deriváty, např. fenylmočoviny. Mezi tyto deriváty patří difenylmočovina (DPU), vysoce aktivní thidiazuron (TDZ) a -fenyl- -(2-chloro-4-pyridyl)močovina (CPPU; Obr. 3 ; Mok & Mok, 1982). 8

9 V dnešní době je již popsáno velké množství syntetických látek, především derivátů BA (Doležal et al., 2006), ale i ostatních cytokininů. apř. v publikaci isler et al., 2010 bylo nasyntetizováno a biologicky zkoumáno jedenáct nových derivátů BA substituovaných v benzylovém kruhu a v C2, 7 a 9 pozici. Derivátů cytokininů substituovaných v poloze C8 bylo do dnešní doby připraveno jen málo a o jejich biologické aktivitě se neví mnoho (Dammann & Leonard, 1974; Chen et al., 1975). Jsou tedy předmětem této bakalářské práce. CH 3 CH 3 OH OH CH 3 OH CH 3 CH 3 H H H H H H H H 6 -( 2 - cis-zeatin trans-zeatin dihydrozeatin isopentenyl)adenin (cz) (tz) (DHZ) (ip) Obr.1: Strukturní vzorce isoprenoidních CK s jejich triviálními názvy. O OH OH H H H H H H H H 6 -benzyladenin kinetin meta-topolin ortho-topolin (BA) (K) (mt) (ot) Obr.2: Strukturní vzorce aromatických CK s jejich triviálními názvy. 9

10 H H O, -diphenylmočovina (DPU) H H O S -phenyl- -(1,2,3-thidiazol-5- yl)močovina; thidiazuron (TDZ) H H O -fenyl- -(2-chloro-4-pyridyl)močovina (CPPU) Cl Obr.3: Strukturní vzorce derivátů močoviny s jejich triviálními názvy. 1.3 Fyziologické funkce Cytokininy ovlivňují různé fyziologické a vývojové funkce rostlin. Společně s auxiny regulují buněčném dělení a diferenciaci, podílí se na regulaci a regeneraci růstu orgánů. V laboratorních podmínkách se užívají k pěstování kalusů. Poměr koncentrace cytokininu a auxinu je důležitý pro vývoj různých částí rostlin. Cytokininy podporují růst kořene a růst rostliny do stran a tím potlačují apikální dominanci, tj. stimulují větvení, zatímco auxiny stimulují růst stonku do výšky. Dále CK oddalují senescenci, inhibují rozpad chlorofylu v listu a stimulují fotosyntézu, zpomalují opad listů a plodů. Při exogenní aplikaci cytokininů je rozhodující jejich koncentrace a načasování. apř. aplikace kinetinu v nízkých koncentracích na kořeny stimuluje fotosyntézu a růst, ale při delším účinku kinetinu dochází k inhibici růstu. Konkrétně 9-substituované deriváty kinetinu vedou ještě k většímu zpoždění senescence (opadu listů u pšenice) tím, že zabraňují membránové peroxidaci lipidů, která je typickým příznakem stárnutí (Mik et al., 2011a). 1.4 Biosyntéza Dříve se vědělo, že po infekci rostliny patogenní půdní bakterií Agrobacterium tumefaciens byl do hostitelské rostlinné buňky vpraven gen ipt pro enzym IPT pomocí Ti-plasmidu bakterie. Toto vyvolává nadprodukci cytokininů (Takei et al., 2001). Přímá 10

11 biosyntéza cytokininů ve vyšších rostlinách začíná obvykle tvorbou isopentenyladenosin-5-monofosfátu (ipmp) z adenosin-5 -fosfátu (AMP, ADP, ATP) a dimethylallylpyrofosfátu (DMAPP) za katalýzy enzymu isopentenyltransferasy (IPT; EC ). U Arabidopsis thaliana bylo identifikováno osm IPT genů (AtIPT1, AtIPT2,, AtIPT8). Bylo prokázáno, že AtIPT4 katalyzuje přenos isopentenylu z DMAPP na ADP a ATP, ale ne na AMP (Kakimoto, 2001). epřímá tvorba cytokininů se děje rozkladem tra, na kterou jsou vázány CK isopentenylového a zeatinového typu. Tato modifikace je katalyzována tra isopentenyltransferasou (EC ), která se také nachází v Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus acidophilus (Takei et al., 2001). Studie ukazují, že isopentenyl pyrofosfát se váže na 3 konec antikodonu tra. Takto vzniká jen malá část cytokininů, protože existuje pouze několik tra, které obsahují isopentenyladenosinové zbytky na straně antikodonu tra. Tyto postranní zbytky mohou být dále hydroxylovány a methylovány (Chen, 1997). Hydroxylace těchto isopentenylových zbytků cytochromem P450 vede ke vzniku zeatinového typu cytokininů (cz, tz). Touto přímou a nepřímou cestou se syntetizují isoprenoidní CK, zatímco tvorba aromatických CK nebyla zatím objasněna (Takei et al., 2004). 1.5 Degradace evratná degradace cytokininů je katalyzována enzymem cytokinindehydrogenasa (CKX; EC ), který štěpí vazbu mezi dusíkem 6 a postranním řetězcem cytokininu. Poprvé byla činnost tohoto enzymu popsána již v roce 1971 Pačesem, který zkoumal buněčné extrakty z tabáku (Pačes, 1971). Touto katabolickou degradací vzniká adenin a příslušný aldehyd. Reakčními produkty degradace ip jsou tak adenin a 3-methyl-2-butenal. U A. thaliana bylo nalezeno a prozkoumáno sedm CKX genů (AtCKX1 až AtCKX7). Jednotlivé formy CKX se od sebe liší lokalizací a svými katalytickými vlastnostmi (Schmülling et al., 2003). CKX enzymy mají největší substrátovou specifitu k nenasyceným isoprenoidním postranním řetězcům, jako mají volné báze tz, ip a jejich glykosidy a nukleosidy. Bylo dokázáno, že CKX enzym obsahuje ve své molekule kovalentně vázaný kofaktor flavin adenin dinukleotid (Bilyeu et al., 2001). 11

12 1.6 Signální dráha V plazmatické membráně modelové rostliny Arabidopsis thaliana se vyskytují tři cytokininové receptory AHK2, AHK3 a CRE1/AHK4 (Inoue et al., 2001; Suzuki et al., 2001; Yamada et al., 2001). Receptory AHK2 a AHK3 jsou lokalizovány v různých rostlinných orgánech, zatímco receptor AHK4 byl nalezen především v kořenech (Ueguchi et al., 2001). Cytokininové receptory jsou hybridní histidinkinasy, které obsahují extracelulární cytokinin-vázající CHASE doménu a intracelulární přijímací a přenašečovou doménu (Mougel & Zhulin, 2001). Cytokininová signální dráha je zahájena vazbou ligandu ve formě cytokininu na extracelulární CHASE doménu receptoru. Dochází k autofosforylaci histidinového zbytku v intracelulární přijímací doméně. Signál je ve formě fosfátu přenesen z histidinu (His) na aspartát (Asp) druhé intracelulární domény. ásledně je fosfát transdukován malým proteinem fosfotransmiterem Hpt z cytoplasmy do jádra, kde reaguje s regulátory odpovědi ARR (Kakimoto, 2003). V současné době je známo u Arabidopsis thaliana pět fosfátových přenašečů AHPs a dvacet dva regulátorů odpovědi ARRs (D Agostino & Kieber, 1999; Imamura et al., 1999; Kiba et al., 1999). Regulátory odpovědi plní funkci transkripčních faktorů a zahajují transkripci a následnou expresi cílových genů, které jsou odpovědí na CK signál. Regulátory odpovědi mohou být typu A a B. Typ A-ARR působí jako negativní regulátor zpětné vazby signálu a rychle transkripčně reguluje odpověď na cytokinin (To et al., 2004). Typ B-ARR hraje stěžejní roli při počáteční odpovědi na CK, protože vyvolává transkripci A-ARR genů. Strukturně se liší typ B od A typu tím, že obsahuje dlouhé C- terminální domény tzv. GARP, která interaguje s DA. Typem B-ARR jsou tedy myšleny pozitivní regulátory CK signálu, které iniciují transkripci genu (Hosoda et al., 2002). Schéma přenosu signálu je znázorněno na obrázku níže ( Obr. 4 ). Zmíněná signální dráha vyšších rostlin je podobná dvousložkovému systému TCS (two component system), který byl popsán u prokaryot. Je tvořen z receptoru histidin-kinasy a regulátorů odpovědi, které jsou transkripčními faktory (West & Stock, 2001; Mizuno, 2005). 12

13 OH CH 3 H H Obr. 4: Schéma přenosu signálu přes His-Asp dráhu u Arabidopsis thaliana. Receptor CRE1/AHK4 je uveden jako příklad. Po navázání ligandu ve formě cytokininu (tz) na receptor dochází k jeho dimerizaci a autofosforylaci. Přenos fosfátové skupiny aktivuje proteinový přenašeč AHP, který převádí signál z cytoplasmy do jádra na regulátory odpovědi typu B-ARR. Regulátory odpovědi typu B-ARR řídí transkripci cílových genů, mimo jiné i A-ARR geny. Regulátory odpovědi typu A-ARR mohou regulovat primární cytokininovou odezvu přes negativní zpětné vazby, upravovat cytokininovou odezvu pozitivním či negativním způsobem, nebo regulovat signální dráhy přes protein-proteinové interakce. Mohou existovat i složitější regulace, než jaké jsou tu uvedeny. Vysvětlivky: D aspartát, H histidin, P fosfátová skupina (převzato z Heyl & Schmülling, 2003). 13

14 1.7 Standardní metody měření CK aktivity Biologická aktivita cytokininů je velice variabilní, proto se používají různé biotesty k odhalení této aktivity. ejčastěji se používají níže uvedené typy testů Amarantový biotest Podstatou tohoto testu je spektrofotometrické měření koncentrace barviva betacyaninu, který vznikl v kotyledonu Amaranthu ve tmě v přítomnosti cytokininu. Jedná se o běžně používaný biotest, který lze využít ke kvantitativnímu stanovení CK aktivity (Bamberger & Mayer, 1960) Kalusový biotest Kalusový biotest je založen na schopnosti cytokininu stimulovat buněčné dělení tzv. cytokinin-dependentního kalusu, který vzniká pouze za přítomnosti CK v živném médiu. Kalus se pěstuje na MS médiu, ve kterém jsou mimo jiné obsaženy i testované látky. Má-li látka CK aktivitu, tak dochází k růstu kalusu, který se po 4 týdnech zváží. Hmotnost kalusu odpovídá i míře CK aktivity studované látky. V médiu, které neobsahuje CK, nedochází k dělení kalusu. Jedná se o technicky náročný biotest s dlouhou dobou kultivace a prací ve sterilních podmínkách, proto jej dnes nahrazují modernější metody. evýhodou je i možný rozklad testované látky, a proto je vhodnější používat receptorový test, kde kultivační doba nepřesahuje 24 hodin Senescenční biotest Senescenční biotest je založen na schopnosti látky zpomalovat degradaci chlorofylu a tím oddálit senescenci. Většinou se používají ustřižené lístky pšenice, které se vloží do roztoku látky. Doba trvání tohoto testu je 5-7 dní. 1.8 Moderní metody měření CK aktivity Bakteriální receptorový test Bakteriální receptorový test umožňuje měření CK aktivity in vitro pomocí bakterií Escherichia coli, které exprimují geny pro jednotlivé CK receptory (Inoue et al., 14

15 2001; Suzuki et al., 2001a). Po spuštění signální dráhy určitým cytokininem dojde k aktivaci reportérového genu cps::lacz a k syntéze β-galaktosidasy. Aktivita β- galaktosidasy je snadno stanovitelná pomocí přidaného fluorogenního substrátu MUG, který je tímto enzymem rozštěpen na dvě složky. a bezbarvý galaktosid a fluorescenční produkt MU, jehož fluorescence se měří. Tento biotest je poměrně rychlý a eliminuje metabolické přeměny testované látky ARR5::GUS reportérový test ARR5::GUS reportérový test slouží k měření CK aktivity in vivo v Arabidopsis thaliana, kde hraje klíčovou roli promotor genu ARR5 a funkční část genu GUS (D Agostino & Kieber, 1999; Higuchi et al., 2004). Jedná se o poměrně rychlý biotest, kdy k 3 denním transgenním rostlinám A. thaliana byly aplikovány testované látky a po 17 hodinové kultivaci v živném médiu byly rostliny sklizeny, homogenizovány, extrahovány proteiny a nakonec stanovena specifická aktivita enzymu β-glukuronidasy. Podle tohoto enzymu byla tedy zjištěna i míra aktivace receptoru testovanou látkou. Specifická aktivita enzymu GUS byla vyjádřena v jednotkách nmol MU/mg/h. 1.9 Cytokininové receptory Citlivost CK receptorů CRE1/AHK4 a AHK3 byla zkoumána v bakteriálním testu. Tyto receptory jsou různě citlivé a specifické k různým ligandům. Oba receptory byly nejcitlivější na isoprenoidní cytokininy s tím, že receptor CRE1/AHK4 je obecně méně citlivý a více specifický než receptor AHK3 (Spíchal et al., 2004). Do nedávna se myslelo, že CK receptory jsou lokalizovány pouze v plazmatické membráně rostlin. icméně, nové studie ukázaly, že CK receptory (CRE1/AHK4, AHK3 a AHK2) jsou lokalizovány převážně na vnitřním membránovém systému endoplasmatického retikula. Tyto skutečnosti byly zkoumány třemi nezávislými metodami. Byl tak navržen modifikovaný model CK signalizace i v rámci ER (Wulfetange et al., 2011). V průběhu tvorby této bakalářské práce byla publikována rentgenová strukturní analýza proteinu (receptoru) CRE1/AHK4. V této publikaci je uvedeno, že pozice 3, 7 a 9 adeninového cyklu jsou zanořeny do vazebného místa. Proto tyto pozice jsou nevhodné pro dalším objemnější substituce. Oproti tomu poloha C8 se jeví jako vhodná (Hothorn et al., 2011). 15

16 1.10 Biologická aktivita derivátů cytokininů Derivátů cytokininů bylo již popsáno velké množství, není ovšem cílem této bakalářské práce se zabývat všemi, proto bude zmíněno jen několik příkladů. Většinou se jedná o deriváty aromatických cytokininů, jejichž organická syntéza není tak náročná, jako syntéza isoprenoidních cytokininů. Obecně lze molekulu cytokininu substituovat v polohách C2, C8 a 7 a 9 ( Obr.5 ). Časté jsou také substituce aromatického kruhu u BA (Doležal et al., 2006, 2007; isler et al., 2010). V nedávné době bylo publikováno několik derivátů kinetinu substituovaných v poloze 9 různými halogenalkylovými, alkylkarboxylovými a alkyletherovými substituenty. Žádná z těchto látek neaktivovala cytokininové receptory, ale z biotestů je zřejmé, že mají silné antisenescenční účinky (Mik et al., 2011a). Ten samý autor dále publikoval biologickou aktivitu -9 substituovaných derivátů ip, kde substituenty byly alkylové zbytky zakončeny různými funkčními skupinami. Také tyto látky nebyly rozpoznány receptorem CRE1/AHK4 a AHK3 a pouze slabě aktivovaly receptor ZmHK3 (Mik et al., 2011b). -7 substituované deriváty cytokininů jsou méně časté a většinou postrádají CK aktivitu (Skoog et al., 1967; isler et al., 2010). Z těchto výsledků je zřejmé, že substituce v polohách 7 a 9 by nebyly vhodným nositelem fluorescenčního markeru. Biologická aktivita derivátů ip v závislosti na pozici, počtu a typu substituentu na uhlíku v poloze C2 a/nebo C8 byla testována pomocí tabákového biotestu již dříve. avázané skupiny byly MeS, Me, MeSO 2, C 6 H 5 CH 2 S, HS a Cl. Bylo prokázáno, že větší aktivitu měla mateřská molekula, protože substituenty v těchto polohách snižovaly cytokininovou aktivitu. Výjimku tvořil 8-methyl derivát, který byl aktivnější než samotný ip. Molekula cytokininu substituovaná zároveň v obou polohách C2 a C8 snižovala biologickou aktivitu více než substituce na jedné z nich, ovšem kromě 2, 8-dimethyl derivátu ip. Podobnou aktivitu vykazovaly chlor, methylthio a methyl deriváty, zatímco merkapto substituenty měly nižší aktivitu. K velkému snížení biologické aktivity přispěly také objemné molekuly jako C 6 H 5 CH 2 S a MeSO 2 (Dammann & Leonard, 1974). Dále bylo prokázáno, že enzym xantin oxidasa převádí oxidací Z a ip na meziprodukty 8-hydroxy a následně na 2, 8-dihydroxy deriváty Z a ip. CK aktivita těchto čtyř látek byla také měřena v tabákovém biotestu a byla srovnána vůči mateřské molekule. Bylo tak potvrzeno, že substituenty v polohách na uhlíku C2 a C8 snižují CK aktivitu původní molekuly, jak již bylo zjištěno Dammannem v roce V porovnání největší biologickou aktivitu vykazoval 8-hydroxy derivát, menší 2, 8-dihydroxyderivát, ale nejvyšší aktivitu měla samotná molekula Z a ip (Chen et al., 1975). 16

17 Otestováno bylo tedy pouze několik cytokininů substituovaných v poloze C8, kde substituce methyl skupinou zvyšovala biologickou aktivitu ip. Moje bakalářská práce více méně navazuje na tuto problematiku, kde v experimentální části popisuji biologickou aktivitu dalších 33 C-8 substituovaných purinových derivátů cytokininů. Většina C-8 substituovaných derivátů nebyla tedy zatím publikována a o jejich biologické aktivitě se nic neví. H C 2 7 C 8 9 Obr.5: Molekula BA s vyznačenými atomy purinového jádra, na kterých lze nejčastěji substituovat vodíkový atom. Atomy vodíku nejsou na obrázku znázorněny. 17

18 Experimentální část 18

19 2. Materiál a přístroje 2.1 Biologický materiál bakteriální kultura Escherichia coli kmen KMI001-pIIII/AHK4 bakteriální kultura Escherichia coli kme KMI001-pSTV28/AHK3 (Suzuki et al., 2001b; Yamada et al., 2001) transgenní Arabidopsis thaliana (ekotyp Col-0) obsahující fúzní gen P ARR5 ::GUS (D Agostino et al., 2000) 2.2 Chemikálie 96% ethanol, ethanol 70% (v/v) + triton X-100 0,01% (v/v), dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich, ěmecko) 4-methylumbelliferyl galaktosid (MUGal; Sigma-Aldrich, ěmecko) 4-methylumbelliferyl glukuronid (MUGlu, Sigma-Aldrich, ěmecko) uhličitan sodný (a 2 CO 3, Lach-er, ČR), glycin (Lach-er, ČR), sacharosa (Sigma-Aldrich, ěmecko) M9 médium (Sambrook): 80 ml 5x M9 salts + 0,8 ml 1M MgSO ml 20% glukosy + 0,4 ml 0,1 M CaCl ml casamino acids + 20 μl ampicilinu (pro AHK4 médium) nebo 400 μl chloramfenykolu (pro AHK3 médium), vše bylo doplněno sterilní redestilovanou vodou na objem 400 ml 5x M9 salts: 64 g a 2 HPO 4 x 7H 2 O + 15 g KH 2 PO 4 + 2,5 g acl + 5 g H 4 Cl rozpuštěno v 1 l redestilované vody, roztok byl rozdělen do lahví po 200 ml a sterilizován autoklávováním stop pufr: na 200 ml - 1,99 g 133 mm glycinu + 1,76 g 83 mm a 2 CO 3, ph 10,7 ½ MS (Murashige & Skoog médium, MES, sacharosa, agar): 2,15 g Murashige & Skoog média + 0,5 g MES + 10 g sacharosy rozpuštěno v 950 ml destilované vody, upraveno ph 4 M roztokem KOH na ph 5,8, doplněno do 1 litru destilovanou vodou, nakonec naváženo 11 g agaru na dno sklenice a vyautoklávováno ve skleněných lahvích se šroubovacím víčkem EBI (extrakční pufr I): 50 mm fosfátový pufr ph 7, 10 mm EDTA, 10 mm β- merkaptoethanol, deionizovaná voda EBII (extrakční pufr II): 50 mm fosfátový pufr ph 7,10 mm EDTA, 10 mm β- merkaptoethanol, 0,2% triton X-100, 0,2% dodecylsíran sodný (SDS), deionizovaná voda testované látky (10 mm) deriváty BA, ip, K, tz a cz (připraveny v Laboratoři růstových regulátorů UP & UEB, AV ČR) 19

20 standardy (10 mm) BA, ip, K, tz a cz (Olchemim, Česká republika) 2.3 Pracovní pomůcky pipety pro objemy 1-10 μl, μl a μl, 8-kanálová pipeta, opakovací pipeta, špičky, rukavice, 6-jamková deska, 96-jamková deska, lžička, pinzeta, zkumavky o objemu 1,5 ml, stojánek na zkumavky, falkonky o objemu 50 ml, odměrný válec, kádinky, mikrozkumavky 2.4 Přístroje třepací inkubátor (Thermomixer comfort Eppendorf, ěmecko) spektrofotometr (Synergy H4 Hybrid Reader) oscilační kulový mlýnek (Retsch MM 301) centrifuga (BECKMA Avanti TM 30 Centrifuge) 3. Metody 3.1 Receptorový test Pracovala jsem s kmenem E. coli KMI001-pIIII/AHK4, resp. KMI001- pstv28/ahk3. Tento biotest byl s každou kulturou exprimující geny pro cytokininové receptory CRE1/AHK4 nebo AHK3 zopakován dvakrát. Jako kontrola sloužil roztok DMSO. Vlastní postup provedení tohoto testu je shrnut v následujících bodech. Příprava bakteriální kultury Escherichia coli kmen KMI001-pIIII/AHK4, resp. KMI001-pSTV28/AHK3 Ředění kultury s testovanou látkou Stanovení aktivity β-galaktosidasy Příprava bakteriální kultury Escherichia coli KMI001-pIIII/AHK4, resp. KMI001- pstv28/ahk3 ejprve byla připravena zásobní kultura tak, že pomocí sterilní špičky bylo malé množství zmražené kultury E. coli rozmícháno ve 3 ml M9 média v 6-jamkové desce. Destička byla vložena do třepacího inkubátoru a kultivovaná 24 hodin při 25 C a 300 rpm. 20

21 Ředění kultury s testovanou látkou ejdříve byl vytažen 10 mm standard (trans-zeatin) a roztoky testovaných látek z ledničky. Do plastové vaničky s 28 ml M9 média bylo zředěno 40 μl zásobní kultury. Takto zředěná kultura byla pipetována po 1 ml do osmi jamek 24-jamkové desky. ásledně bylo do jamek postupně napipetováno 5 μl 10 mm standardu a testovaných látek. Výsledná koncentrace látek byla 50 μm. Jednotlivé látky byly přepipetovány do řady A a E po 244 μl ve třech opakováních do 96-jamkové desky. Z vaničky se zředěnou kulturou bylo dále osmikanálovou pipetou odpipetováno 178 μl/jamku do řady B a F a dále 200 μl/jamku do řady C, D a G, H. akonec bylo provedeno ředění tak, že z řady A bylo osmikanálovou pipetou odebráno 2x 22 μl a přeneseno do řady B. ásledně bylo z řady B odebráno už jen 22 μl a přepipetováno do řady C. Dále opět 22 μl z řady C do D a naposledy z řady D bylo konečně 22 μl vyhozeno do odpadu. Stejný postup ředění byl použit ve druhé polovině mikrotitrační destičky. Docílilo se tak zředění o výsledné koncentraci v řadě A a E 50 μm, B a F 10 μm, C a F 1 μm a v řadě D a G 0, 1 μm. Ve shrnutí látky tedy odpovídaly celkové koncentraci 50 μm, 10 μm, 1 μm a 0, 1 μm, ve třech opakování. a víčku desky byly popsány standard a testované látky, typ testu a start kultivace. Takto byla destička vložena do třepacího inkubátoru a 17 hodin kultivovaná při 25 C a 450 rpm přes noc. Stanovení aktivity β-galaktosidasy ásledující den ráno po 17 hodinové kultivaci byl jako první vytažen 25 mm substrát MUGal z mrazničky. Destička byla vyjmuta z inkubátoru a vložena do přístroje na změření hustoty bakterií OD 600 (optická denzita při 600 nm). Hodnoty OD 600 byly uloženy do souboru Microsoft Excel. Do nové 96-jamkové destičky byl opakovací pipetou napipetován 25 mm substrát MUGal (v DMSO) o objemu 2 μl a osmikanálovou pipetou přidáno 50 μl kultury s testovanými látkami z původní desky. Deska byla vložena na 30 minut do inkubátoru o teplotě 37 C, kde proběhla enzymatická reakce. Po inkubaci byla reakce zastavena přidáním 100 μl stop pufru. Fluorescence byla změřena při excitační vlnové délce 355 nm a emisní vlnové délce 460 nm. Fluorescence byla převedena na nmol MU podle kalibrační křivky. Výsledná aktivita β-galaktosidasy byla spočítána jako podíl nmol MU a OD 600. Aktivita byla vyjádřena v jednotkách nmol MU x OD x h -1. Tato aktivita odpovídala i aktivitě testovaného cytokininu. V této bakalářské práci je aktivita vyjádřena v procentech (relativní aktivita). 21

22 3.2 ARR5::GUS reportérový test Po bakteriálním receptorovém testu byla biologická aktivita testovaných látek zkoumána ještě in vivo v ARR5::GUS reportérovém testu s Arabidopsis thaliana. Výhodou je, že obsahuje všechny tři receptory (CRE1/AHK4, AHK3 a AHK2). Pracovní postup byl proveden v následujících bodech: Sterilizace semen ARR5::GUS ve flow-boxu Kultivace semen v ½ MS médiu Homogenizace rostlin a extrakce proteinů Stanovení aktivity β-glukuronidasy Stanovení celkových proteinů v rostlinném extraktu Výpočet aktivity β-glukuronidasy Sterilizace semen ARR5::GUS ve flow-boxu esterilní semena (asi půl mikrolžičky) byla vložena do mikrozkumavky a k nim bylo přidáno 800 μl 70% etanolu s 0,01% tritonem, vše bylo vortexováno 10 minut. Mikrozkumavka byla přenesena do flow-boxu, kde se nadále pracovalo ve sterilním prostředí. Roztok bez semen byl odsán pipetou a opět bylo přidáno 800 μl daného roztoku. Takto byla semena promyta celkem třikrát. Do zkumavky, která obsahovala pouze semena byla napipetována agarosa (0,1% v/v) asi 1 ml pro snadné dávkování semen do 6-jamkové desky. Kultivace semen v ½ MS médiu Ve flow-boxu bylo do 6-jamkové desky napipetováno 3 ml 1/2MS média. Dále bylo přidáno malé množství asi 20 μl suspenze semen. Destičky byly zabaleny do alobalu a umístěny do lednice (4 C) na 4 dny. Poté byly destičky se semeny přemístěny do fytotromu (21 C) na třepačku po dobu 4 dnů. Po vyklíčení semen byly k rostlinkám připipetované 3 μl předem připravených roztoků testovaných látek a jejich standardů o různé koncentraci. Roztok DMSO (0,1% v/v) sloužil jako negativní kontrola. Semenáčky z destičky byly po 17 hodinové kultivaci vyjmuty pomocí pinzety a osušeny na savém papíře a v kapalném dusíku zmraženy. 22

23 Homogenizace rostlin a extrakce proteinů Do všech mikrozkumavek byla vložena 1 kovová kulička a 150 μl extrakčního pufru EBI. Homogenizace rostlinného materiálu proběhla v oscilačním vibračním mlýnku po dobu 3 minut s frekvencí 25 Hz. Po homogenizaci bylo přidáno150 μl extrakčního pufru EBII a následovala extrakce glukuronidasy 30 minut při 4 C. Stanovení aktivity β-glukuronidasy ejprve bylo do jamek 96-jamkové desky napipetováno 10 μl 25 mm substrátu MUGlu pomocí opakovací pipety a po té 15 μl rostlinného extraktu. Všechny vzorky byly inkubovány 30 minut při teplotě 37 C v inkubátoru. Enzymatická reakce byla zastavena přidáním 125 μl stop-pufru. akonec byla změřena fluorescence při emisní (355 nm) a excitační vlnové délce (460 nm). Stanovení celkových proteinů v rostlinném extraktu Do nové 96-jamkové desky bylo napipetováno 5 μl extraktu ve dvou opakováních a osmikanálovou pipetou přidáno 100 μl roztoku kyseliny bicinchoninové BCA (zelený roztok připraven čerstvě z roztoku A a B, 50/1). Po proběhnutí reakce vznikl fialový roztok a byla změřena jeho absorbance při vlnové délce 562 nm. Výpočet aktivity β-glukuronidasy 1 nmol MU = 2000 RFU Aktivita (β-glukuronidasa) = fluorescence [RFU] / (c [mg/ml protein] x 2000 x t [h]) 23

24 4. Přehled testovaných látek elze zveřejnit 24

25 elze zveřejnit 25

26 elze zveřejnit 26

27 elze zveřejnit 27

28 5. Výsledky a diskuze elze zveřejnit 28

29 elze zveřejnit 29

30 elze zveřejnit 30

31 elze zveřejnit 31

32 elze zveřejnit 32

33 elze zveřejnit 33

34 elze zveřejnit 34

35 elze zveřejnit 35

36 elze zveřejnit 36

37 6. Závěr elze zveřejnit 37

38 7. Seznam použité literatury Bamberger E. and Mayer A. (1960) Effect of kinetin on formation of red pigment in seedlings of Amaranthus retroflexus. Science 131, Bilyeu K. D., Cole J. L., Laskey J. G., Riekhof W. R., Esparza T. J., Kramer M. D. and Morris R. O. (2001) Molecular and biochemical characterization of a cytokinin oxidase from maize. Plant Physiol. 125, D Agostino I. B. and Kieber J. J. (1999) Phosphorelay signal transduction: The emerging family of plant response regulators. Trends Biol. Sci. 24, D Agostino I. B., Deruere J. and Kieber J. J. (2000) Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiol. 124, Dammann L. G. and Leonard. J. (1974) Cytokinins: synthesis of 2-, 8-, and 2,8- substituted 6-(3-methyl-2- butenylamino)purines and their relative activities in promoting cell growth. Phytochemistry 13, Doležal K., Popa I., Hauserová E., Spíchal L., Chakrabarty K., ovák O., Kryštof V., Voller J., Holub J. and Strnad M. (2007) Preparation, biological activity and endogenous occurrence of 6-benzyladenosines. Bioorg. Med. Chem. 15, Doležal K., Popa I., Kryštof V., Spíchal L., Fojtíková M., Holub J., Lenobel R., Schmülling T. and Strnad M. (2006) Preparation and biological activity of 6- benzylaminopurine derivatives in plants and human cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 14, Heyl A. and Schmülling T. (2003) Cytokinin signal perception and transduction. Curr. Opin. Plant Biol. 6, Higuchi M., Pischke M. S., Mähönen A. P., Miyawaki K., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Shinozaki K., Kato T., Tabata S., Helariutta Y., Sussman M. R. and 38

39 Kakimoto T. (2004) In planta functions of the Arabidopsis cytokinin receptor family. Proc. atl. Acad. Sci. U. S. A. 101, Hosoda K., Imamura A., Katoh E., Hatta T., Tachiki M., Yamada H., Mizuno T. and Yamazaki T. (2002) Molecular structure of the GARP family of plant Myb-related DA binding motifs of the Arabidopsis response regulators. Plant Cell 14, Hothorn M., Dabi T. and Chory J. (2011) Structural basis for cytokinin recognition by Arabidopsis thaliana histidine kinase 4. at. Chem. Biol. 7, Chen C. M. (1997) Cytokinin biosynthesis and interconversion. Physiol. Plant. 101, Chen C. M., Smith O. C. and McChesney J. D. (1975) Biosynthesis and cytokinin activity of 8-hydroxy and 2,8-dihydroxy derivatives of zeatin and 6 -( 2 - isopentenyl)adenine. Biochemistry 14, Imamura A., Hanaki., akamura A., Suzuki T., Taniguchi M., Kiba T., Ueguchi C., Sugiyama T. and Mizuno T. (1999) Compilation and characterization of Arabidopsis thaliana response regulators implicated in His-Asp phosphorelay signal transduction. Plant Cell Physiol. 40, Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K. and Kakimoto T. (2001) Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis. ature 409, Kakimoto T. (2001) Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate:atp/adp isopentenyltransferases. Plant Cell Physiol. 42, Kakimoto, T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol. 54, Kiba T., Taniguchi M., Imamura A., Ueguchi C., Mizuno T. and Sugiyama T. (1999) Differential expression of genes for response regulators in response to cytokinins and nitrate in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 40,

40 Letham D. S. (1963) Zeatin, a factor inducing cell division from Zea mays. Life Sci. 8, 596. Mik V., Szüčová L., Spíchal L., Plíhal O., isler J., Zahajská L., Doležal K., Strnad M. (2011b) 9-Substituted 6 -[(3-methylbut-2-en-1-yl)amino]purine derivatives and their biological activity in selected cytokinin bioassays. Bioorg. Med. Chem. 19, Mik V., Szüčová L., Šmehilová M., Zatloukal M., Doležal K., isler J., Grúza J., Galuszk P., Strnad M., Spíchal L. (2011a) 9-substituted derivatives of kinetin: Effective anti-senescence agents. Phytochemistry 72, Miller C. O., Skoog F., Von Saltza M. H., Strong F. M. (1955) Kinetin, a cell division factor from deoxyribonucleic acid. J. Amer. Chem. Soc. 77, Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M. and Kakimoto T. (2004) Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate. Plant J. 37, Mizuno T. (2005) Two-component phosphorelay signal transduction systems in plants: from hormone responses to circadian rhythms. Biosci. Biotechnol. Biochem. 69, Mok D. W. S. and Mok M. C. (1994) Cytokinins: Chemistry, Activity and Function, pp , CRC Press, Boca Raton, FL, USA. Mok M. C., Mok D. W. S., Armstrong D. J, Shudo K., Isogai Y., et al. (1982) Cytokinin activity of -phenyl- -1,2,3-thiadiazol-5-ylurea (thidiazuron). Phytochemistry 21, Mougel C. and Zhulin I. B. (2001) CHASE: an extracellular sensing domain common to transmembrane receptors from prokaryotes, lower eukaryots and plants. Trends Biochem. Sci. 26, isler J., Zatloukal M., Popa I., Doležal K., Strnad M., Spíchal L. (2010) Cytokinin receptor antagonists derived from 6-benzylaminopurine. Phytochemistry 71, Pačes V., Werstiuk E., Hall R. H. (1971) Conversion of 6 -( 2 -isopentenyl) 40

41 adenosine to adenosine by enzyme activity in tobacco tissue. Plant Physiol. 48, Shaw G. and Wilson D. V. (1964) A synthesis of zeatin. Proc. Chem. Soc Schmülling T., Werner T., Riefler M. et al. (2003) Structure and function of cytokinin oxidase/dehydrogenase genes of maize, rice, Arabidopsis and other species. J. Plant Res. 116, Skoog F., Hamzi H. Q., Szweykowska A.M. (1967) Cytokinins: Structure/activity relationships. Phytochemistry 6, Spíchal L., Rakova Y.., Riefler M., Mizuno T., Romanov A. G., Strnad M. and Schmülling T. (2004) Two cytokinin receptors of Arabidopsis thaliana, CRE1/AHK4 and AHK3, differ in their ligand specificity in a bacterial assay. Plant Cell Physiol. 45, Suzuki T., Miwa K., Ishikawa K., Yamada H., Aiba H. and Mizuno T. (2001b) The Arabidopsis senzor His-kinase, AHK4, can respond to cytokinins. Plant Cell Physiol. 42, Suzuki T., Sakurai K., Ueguchi C. and Mizuno T. (2001a) Two types of putative nuclear factors that physically interact with histidine-containing phosphotransfer (Hpt) domains, signaling mediators in His-to-Asp phosphorelay, in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 42, Takei K., Sakakibara H. and Sugiyama T. (2001) Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase, a cytokinin biosynthesis enzyme, in Arabidopsis thaliana. J. Biol. Chem. 276, Takei K., Yamaya T. and Sakakibara H. (2004) Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 encode cytokinin hydroxylases that catalyze the biosynthesis of trans-zeatin. J. Biol. Chem. 279, To J. P., Haberer G., Ferreira F. J., Deruere J., Mason M. G., Schaller G. E., Alonso J. M., Ecker J. R. and Kieber J. J. (2004) Type-A Arabidopsis response regulators are partially redundant negative regulators of cytokinin signaling. Plant Cell 16,

42 Ueguchi C., Koizumi H., Suzuki T., Mizuno T. (2001) ovel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 42, West A. H. and Stock A. M. (2001) Histidine kinases and response regulator proteins in two-component signaling systems. Trends Biochem. Sci. 26, Wulfetange K., Lomin S.., Romanov G. A., Stolz A., Heyl A. and Schmülling T. (2011) The cytokinin receptors of Arabidopsis are located mainly to the endoplasmic reticulum. Plant Physiol. 156, Yamada H., Suzuki T., Terada K., Takei K., Ishikawa K., Miwa K., Yamashino T. and Mizuno T. (2001) The Arabidopsis AHK4 histidine kinase is a cytokinin-binding receptor that transduces cytokinin signals across the membrane. Plant Cell Physiol. 42, Zatloukal M., Gemrotová M., Doležal K., Havlíček L., Spíchal L. and Strnad M. (2008) ovel potent inhibitors of A. thaliana cytokinin oxidase/dehydrogenase. Bioorg. Med. Chem. 16,

43 8. Seznam použitých zkratek ADP adenosin 5 -difosfát AHK2/ AHK3 Arabidopsis histidin kinasa 2 a 3 AHP Arabidopsis histidin fosfo-přenašečový protein AMP adenosin 5 -monofosfát ARR Arabidopsis response regulator (regulátor odpovědi u A. thaliana) A. thaliana Arabidopsis thaliana ATP adenosin 5 -trifosfát BA 6 -benzyladenin CHASE cyclases/histidine-kinase-associated sensory extracellular CK cytokinin; cytokininová CKX cytokinin dehydrogenasa CPPU CRE1/AHK4 cps::lacz cz DHZ -fenyl- -(2-chloro-4-pyridyl)urea cytokinin response 1 / Arabidopsis histidin kinasa fúzní gen s promotorem pro kapsulární polysacharid a funkční oblastí pro β-galaktosidasu cis-zeatin dihydrozeatin DMSO dimethylsulfoxid DPU difenylmočovina EBI extrakční pufr I EBII extrakční pufr II E. coli Escherichia coli GUS β-glukuronidasa Hpt histidine-obsahující fosfopřenašeč ip 6 -( 2 -isopentenyl)adenin IPT K MS médium mt MU MUGal MUGlu isopentenyltransferasa kinetin Murashige-Skoog médium meta-topolin 4-methylumbelliferon 4-methylumbelliferyl galaktosid 4-methylumbelliferyl glukuronid 43

44 ot RFU TDZ tz TCS ZmHK ortho-topolin relative fluorescence units (relativní fluorescenční jednotka) thidiazuron; -fenyl-'-(1,2,3-thidiazol-5-yl)močovina trans-zeatin two-component system (dvoukomponentní systém) Zea mays Histidin Kinasa 44