MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA NÁRODNÍ CENTRUM PRO VÝZKUM BIOMOLEKUL. Diplomová práce. Bc. Eliška Petulová

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA NÁRODNÍ CENTRUM PRO VÝZKUM BIOMOLEKUL Diplomová práce Brno 2013 Bc. Eliška Petulová 1

2 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA NÁRODNÍ CENTRUM PRO VÝZKUM BIOMOLEKUL PŘÍPRAVA A FUNKČNÍ CHARAKTERIZACE REKOMBINANTNÍCH PROTEINŮ AHP4 A AHP6 Diplomová práce Eliška Petulová VEDOUCÍ PRÁCE: Mgr. Radka Dopitová, Ph. D. Brno

3 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Bc. Eliška Petulová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Národní centrum pro výzkum biomolekul Příprava a funkční charakterizace rekombinantních proteinů AHP4 a AHP6 Biochemie Biomolekulární chemie Mgr. Radka Dopitová, Ph.D. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 96 Klíčová slova: Cytokininy, cytokininová signální dráha, vícekroková fosforylace, AHP proteiny, elektroforéza, westernový přenos, protilátky 3

4 Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Bc. Eliška Petulová Faculty of Science, Masaryk University National Centre for Biomolecular Research Preparation and functional characterization of recombinant proteins AHP4 and AHP6 Biochemistry Biomolecular chemistry Mgr. Radka Dopitová, Ph.D. Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 96 Keywords: Cytokinins, cytokinin signalling pathway, multistep phosphorelay, AHP proteins, electrophoresis, western bloting, antibody 4

5 Abstrakt Přenos rostlinného cytokininového signálu je zprostředkován tzv. vícekomponentním systémem, který se vyvinul z bakteriálního dvoukomponentního systému. V těchto systémech fungují proteiny AHP jako můstky mezi příjmem signálu receptory v cytoplazmatické membráně a aktivací transkripčních faktorů v jádře. Protein AHP6 je, na rozdíl od ostatních AHP, inhibitorem této dráhy. V poslední době se předpokládá, že i protein AHP4 by mohl být jejím negativním regulátorem. První část této diplomové práce se zabývala optimalizací podmínek pro expresi rekombinantních proteinů AHP4 a AHP6 a optimalizací přípravy těchto proteinů o dostatečné čistotě, aby mohly být použity pro následnou strukturní analýzu. K optimalizaci přípravy proteinů bylo využito purifikačních metod. V druhé části byla s využitím western blotingu testována specifita monoklonálních protilátek připravených proti AHP4 a AHP6 k jednotlivým proteinům AHP. Jejich specifita byla testována v lyzátu ze suspenzní kultury A. thaliana, v lyzátu bakterií E. coli a v lyzátu kvasinek S. cerevisiae. Byly vybrány protilátky vhodné k dalšímu použití. Abstract Cytokinin signal transduction in plant cells is mediated via the so-called multistep phosphorelay, which had developed from the bacterial two-component system. In these arrangements, AHP proteins are known to function as connectors between the income signal (via the cytoplasmic membrane receptors) and the transcription factors activation in nucleus. The AHP6 protein is an inhibitory agent of this pathway, contrary to the other AHP proteins. Recently it has been thought that either the AHP4 protein might manage to be inhibitory. The first part of the diploma thesis is dealing with the optimization of expression conditions for recombinant AHP4 and AHP6 proteins. Preparation step in order to get the proteins of a maximum purity possible for the structure analysis was being further optimized. In the second part, specifity of the monoclonal anti AHP4 and anti AHP6 was tested with the use of western blot. The specifity of the antibodies was examined using the lysates of the suspense cultures of A. thaliana, E. coli a S. cerevisiae. The proper antibodies for following experiments were chosen. 5

6 6

7 7

8 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat především své školitelce Mgr. Radce Dopitové, Ph.D. za odbornou pomoc, trpělivost a všestrannou podporu. Také bych ráda poděkovala Bc. Martině Válkové za přípravu bakteriálního lyzátu z E. coli pro testování protilátek i další pomoc při práci v laboratoři. Poděkování si zaslouží také všichni kolegové doktorského studijního programu za cenné rady, které mi pomohly při zpracovávání mojí diplomové práce, a rodiče, kteří mi poskytli podporu v průběhu celé doby mého studia. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 15. května 2013 Jméno Příjmení 8

9 Obsah 1. Úvod do problematiky Dvoukomponentní a vícekrokový systém Dvoukomponentní systém Vícekroková fosforylace Cytokininy a jejich signální dráha Cytokininy Cytokininová signální dráha u A. thaliana Proteiny vícekrokové fosforylace u A. thaliana Histidin-kinázy Přenašeče fosfátu Struktura proteinů AHP Lokalizace proteinů AHP Protein AHP Protein AHP Proteiny CRF Regulátory odpovědi Interakce proteinů vícekrokové fosforylace Vzájemné interakce mezi histidin kinázami, AHP a regulátory odpovědi Interakce mezi proteiny AHP a etylenovými receptory Interakce histidin kinázy CKI Interakce proteinů CRF s proteiny cytokininové signální dráhy Interakce proteinů MSP s proteiny jiných signálních drah Strukturní charakterizace proteinů vícekrokové fosforylace AHK5 RD v komplexu s AHP Přijímačová doména histidin kinázy CKI Přijímačová doména etylénového receptoru ETR Struktura senzorové domény AHK DNA-vazebný motiv regulátoru odpovědi ARR Struktura proteinů HPt a AHP Cíle diplomové práce 34 3 Materiál a metody 35 9

10 3.1 Základní metody Stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) Western blot Optimalizace exprese proteinu AHP Příprava bakteriálních konzerv Růst a exprese AHP4 Ub Příprava vzorků na 15 % SDS PAGE % SDS PAGE Western blot Optimalizace exprese proteinu AHP Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Exprese fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Štěpení kotvy fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 pomocí S-TEV proteázy Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Exprese fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Štepení fúzního proeinu Ub3-His 6 -AHP6 pomocí S-TEV proteázy Příprava PROTEINOVÝCH EXTRAKTŮ ze suspenzní buněčné kultury A. thaliana Testování monoklonálních protilátek namířených proti AHP4 a AHP6 pomocí western blotingu Optimalizace množství proteinového extraktu ze suspenzní kultury Arabidopsis nanášených na gel Testování specifity protilátek Výsledky Optimalizace exprese proteinu AHP Optimalizace exprese proteinu AHP Purifikace proteinu AHP Exprese fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Štěpení kotvy u fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 pomocí S-TEV proteázy Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Exprese fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP

11 4.4.2 Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Štepení kotvy fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP6 pomocí S-TEV proteázy Testování monoklonálních protilátek namířených proti AHP4 a AHP6 pomocí western blotingu Optimalizace množství proteinového extraktu ze suspenzní kultury A. thaliana nanášeného na gel Testování specifity protilátek Diskuze Optimalizace exprese proteinů AHP4 a AHP Purifikace fúzního proteinů Ub3-His 6 -AHP4 a Ub3-His 6 -AHP Testování monoklonálních protilátek namířených proti AHP4 a AHP6 pomocí western blotingu Souhrn 88 7 Seznam zkratek 91 8 Literatura 93 11

12 1. Úvod do problematiky 1.1 Dvoukomponentní a vícekrokový systém Dvoukomponentní systém Dvoukomponentní systém (two component system, zkráceně TCS) je klíčovým mechanismem pro vnitrobuněčný přenos signálu, založeným na fosforylaci proteinů a katalyzovaným protein-kinázami. Prokaryotické organismy využívají tento způsob přenosu jako reakci na extracelulární signál (Hoch 2000; Stock, Robinson et al. 2000). Dvoukomponentní systém přenosu signálu převládá u bakterií (Horak, Grefen et al. 2008). TCS umožňují bakteriím vnímat a reagovat na environmentální podněty a jsou zapojeny také do různorodých procesů jako chemotaxe, osmóza nebo rozpoznání hostitele (Stock, Robinson et al. 2000). V bakteriálním systému bylo popsáno několik konkrétních signálních drah. Je zde dodržována selektivita při přenosu signálu histidinkinázou přes specifické fosfatázy až k odpovídajícímu reakčnímu partnerovi. Každá jednotlivá histidin-kináza reaguje s jedním konkrétním regulátorem odpovědi (Laub and Goulian 2007). Až do roku 1993 se předpokládalo, že TCS je využíván pouze prokaryotickými organismy. Teprve objev ethylenového receptoru ETR1 u Arabidopsis thaliana (Chang, Kwok et al. 1993) a objev osmotického receptoru u kvasinek Saccharomyces Cerevisiae (Ota and Varshavsky 1993) byly důkazem, který tento předpoklad vyvrátil. Prvky TCS byly identifikovány také v houbách a především v rostlinách (Mizuno 2005). V té nejjednodušší formě se TCS skládá ze dvou samostatných proteinů: histidin-kinázového senzoru (HK histidine protein kinase) a regulátoru odpovědi. N konec histidin-kinázy funguje jako vstupní doména, která rozeznává environmentální signál. Výsledkem toho je konformační změna spouštějící autofosforylaci histidinu lokalizovaného na C konci HK, skládajícího se obvykle z cca 240 aminokyselin. Fosfátová skupina je poté přenesena z histidinového zbytku na konzervativní kyselinu asparagovou cca 120 aminokyselin dlouhé N - koncové přijímačové domény regulátoru odpovědi (RR response regulator), druhého samostatného proteinu TCS (Appleby, Parkinson et al. 1996). Zde dojde k další konformační změně, což má za následek 12

13 modulaci aktivity tohoto proteinu a spuštění výstupních odpovědí (Argueso, Raines et al. 2010; Hwang, Chen et al. 2002) Vícekroková fosforylace Zvláštním případem TCS u rostlin je vícekroková fosforylace (multistep phosphorelay, MSP). Na rozdíl od TCS, který obsahuje jednoduchý histidin-kinázový senzor, nachází se u MSP hybridní senzor spojující histidin-kinázu s regulátorem odpovědi. Dalším výrazným rozdílem je přítomnost histidin fosfotransferového proteinu (HPt), tzv. člunku, u vícekrokové fosforylace. Zatímco v TCS přechází signál z HK senzoru přímo na přijímačovou doménu, v těchto vícekrokových fosforylacích je fosfát pomocí tohoto člunku převáděn z aminokyseliny na aminokyselinu. Fosfát je přenášen v sekvenci His - > Asp -> His -> Asp. Teprve následně signál končí na samotném regulátoru odpovědi umístěném v jádře s přímým efektem na genovou transkripci (Kakimoto 2003; Schaller, Kieber et al. 2008). Rozdíl mezi TCS a MSP je popsán na obr. 1. Obr. 1 Dvoukomponentní systém a vícekroková fosforylace. A) Jednoduchý dvoukomponentí systém (TCS), který zobrazuje histidin kinázu a regulátor odpovědi. B) Vícekroková fosforylace, která zobrazuje hybridní histidin-kinázu zahrnující cytoplazmatickou kinázovou a přijímačovou doménu podobnou tak regulátoru odpovědi, histidin obsahuje fosfotransferový protein (HPt) a samostatný regulátor odpovědi. Převzato z (Schaller, Kieber et al. 2008), upraveno. 13

14 1.2 Cytokininy a jejich signální dráha Typickým zástupcem vícekrokového systému přenosu signálu je cytokininová signální dráha. Cytokininová signální dráha byla nejlépe popsána u A. thaliana Cytokininy Cytokininy jsou rostlinné hormony (fytohormony) zásadní pro růst rostlin a jejich vývojové procesy (Mok and Mok 2001; Kieber 2002; Heyl and Schmulling 2003). Chemicky se jedná o N6 substituované deriváty adeninu (obr. 2). Jsou nezbytné pro podporu aktivního růstu a diferenciaci rostlinných buněk. Regulují vývoj kořene i prýtu (nadzemní části rostliny), funkci meristémů a vývoj chloroplastů, řídí stárnutí listů a velikosti semen. Zajišťují reakci rostliny na abiotické i biotické stresy (Argueso, Raines et al. 2010). Prvním definovaným zástupcem cytokininů byl zeatin, izolovaný z nevyvinutého endospermu kukuřice (Zea mays). Spolu s dalšími dvěma, isopentyladeninem a dihydrozeatinem, je zeatin (obr. 2) nejhojněji zastoupeným cytokininem ve vyšších rostlinách. V dnešní době existuje téměř padesát zástupců cytokininů. Tento počet zahrnuje cytokininy jak přirozené, tak uměle připravené (Dolezal, Popa et al. 2007). Obr. 2 Struktura adeninu a trans-zeatinu. (převzato z upraveno) 14

15 1.2.2 Cytokininová signální dráha u A. thaliana Cytokinin jako signální molekula se nachází v extracelulárním prostoru, kde jeho přítomnost způsobí aktivaci signální dráhy (Imamura, Yoshino et al. 2001). Cytokininový signál spouští kaskádu dějů, jejichž cílem je přenos informace z extracelulárního prostoru do jádra buňky. Stejně jako u TCS je signál zachycen extracelulární doménou, tzv. CHASE doménou hybridního histidin-kinázového receptoru. Vazba cytokininu indukuje autofosforylaci konzervativního histidinu umístěného na cytoplazmatické kinázové doméně. Následně dochází k uvolnění fosfátového zbytku a jeho navázání na zbytek kyseliny asparagové přijímačové domény histidin-kinázy. Odtud putuje fosfát opět na konzervativní histidin, tentokráte navázaný na histidin fosfotransferovém proteinu (HPt). HPt funguje jako přenašeč fosfátu z cytoplazmy do jádra buňky, až ke konzervativnímu zbytku kyseliny asparagové umístěnému na N koncové přijímačové doméně regulátoru odpovědi. Fosforylace N konce regulátoru odpovědi aktivuje jeho C koncovou vazebnou doménu. Tím je způsobeno její uvolnění a navázání se na daná místa na DNA, což má za následek spuštění transkripce genů (Argueso, Raines et al. 2010). Mezi těmito geny jsou i geny pro proteiny ARR-A, které negativně regulují tento mechanismus. Graficky je cytokininová signální dráha zobrazena na obrázku č

16 Obr. 3 Model cytokininové signální dráhy. Cytokinin se váže na cytokininový receptor AHK a spouští autofosforylaci histidinu. Fosfátová skupina je přenesena na Asp navázaný na přijímačové doméně histidin-kinázy a poté prostřednictvím proteinu AHP dále k přijímačové doméně regulátoru odpovědi typu A a B. Fosforylovaný regulátor odpovědi typu B spouští transkripci genů. Typ A negativně reguluje tento mechanismus. CRF souběžně s regulátorem odpovědi typu B modulují cytokininy regulovanou transkripci. (převzato z Proteiny vícekrokové fosforylace u A. thaliana Mezi proteiny vícekrokové fosforylace v genomu modelového organismu A. thaliana řadíme membránové hybridní histidin-kinázy AHK2, AHK3, CRE1/AHK4, CKI2/AHK5, CKI1, ETR1 (Heyl and Schmulling 2003), 5 histidin fosfotransferových proteinů (AHP 1 5) a 21 regulátorů odpovědi, 10 regulátorů odpovědi typu A (ARR-A) a 11 typu B (ARR- B). Uvedené proteiny jsou přímými účastníky přenosu cytokininového signálu. Mimo ně jsou dále známy další typy proteinů fungující na principu MSP, ale tohoto konkrétního typu signalizace se neúčastní (Hwang, Chen et al. 2002) Histidin-kinázy Histidin-kinázová rodina u A. thaliana dosud čítá 8 členů s rozdílnými rolemi. ETR1 a ERS1 patří do rodiny ethylenových receptorů (Moussatche and Klee 2004). Byly 16

17 lokalizovány v membráně endoplazmatického retikula a jejich exprese probíhá ve všech orgánech. ERS1 je zároveň uváděna jako jediná známá rostlinná histidin-kináza nehybridního typu (Grefen and Harter 2004). Dalšími důležitými histidin-kinázami jsou na cytokininu nezávislé CKI1 (Kakimoto 1996; Hejatko, Ryu et al. 2009) a CKI2/AHK5. CKI2/AHK5 působící jako negativní regulátor ethylenové signalizace v kořenovém systému (Iwama, Yamashino et al. 2007). AHK1/AtHK1 je histidin-kináza fungující jako potenciální osmosenzor lokalizovaný na cytoplazmatické membráně, jehož exprese probíhá ve všech orgánech, především však v kořenech (Grefen and Harter 2004). Pouze 3 histidin-kinázy se však účastní cytokininové signální dráhy v závislosti na přijatém cytokininovém signálu, a to hybridní histidin-kinázy AHK2, AHK3 a AHK4/CRE/WOL (Riefler, Novak et al. 2006). Struktura hybridních histidin-kináz AHK2, AHK3 a AHK4/CRE/WOL Tyto histidin-kinázy se skládají z transmembránových domén na svém N-konci, jejichž počet je v podstatě jediným rozdílem ve struktuře AHK2, AHK3 a AHK4/CRE/WOL. Dále se struktury všech tří HK velmi podobají. Mezi transmembránovými doménami je umístěna extracelulární cytokinin vazebná doména, tzv. CHASE doména (Hwang, Chen et al. 2002). CHASE doména byla nalezena v různých prokaryotických i eukaryotických receptorech. Bylo prokázáno, že obsahuje specifickou aminokyselinovou sekvenci pro vazbu ligandu, což popisuje její konkrétní funkci jakožto prvku určeného pro vazbu cytokininu (Heyl, Wulfetange et al. 2007). Další části HK jsou konzervovaná histidin-kinázová doména, pseudopřijímačová doména a přijímačová doména (Hwang, Chen et al. 2002). Histidin-kinázovou doménu A. thaliana tvoří pět motivů histidin (H), asparagin (N), glycin (G1 a G2) a fenylalanin (F). Přijímačová doména se skládá ze tří oblastí, které zahrnují konzervovanou asparagovou kyselinu (D), asparagovou kyselinu (D) a zbytek aminokyseliny lysin (K). Motivy a struktura HK jsou znázorněny a popsány na obr. 4. Přestože studie ukazují, že konzervovaný histidinový zbytek na HK doméně i konzervovaný asparagový zbytek v přijímačové doméně HK jsou nezbytné pro autofosforylaci a signální dráhu (Hwang and Sheen 2001), konkrétní funkce těchto motivů nebyla zatím jasně určena. 17

18 Obr. 4 a) Schéma hybridní histidin-kinázy. Signální molekula se váže na vstupní doménu (ID). Histidin-kinázová doména je tvořena dvěma částmi. První z nich, histidin zahrnující fosfotransferová doména (DHpD), obsahuje konzervovaný zbytek histidinu (H), jeden z pěti motivů tvořících histidinkinázovou doménu, jehož autofosforylace je spuštěna navázáním signálu na ID. Druhá část, katalytická ATP-vázající doména (CAD) je tvořena zbývajícími čtyřmi motivy: asparagin (N), glycin (G1 a G2) a fenylalanin (F). Zde probíhá hydrolýza ATP na ADP, uvolněný fosfát zajišťuje další fosforylaci histidinu. Fosfát je intramolekulárně přenášen k C-konci hybridní histidin-kinázy, na němž je umístěna přijímačová doména (RD), obsahující konzervovaný zbytek kyseliny asparagové (D). b) Schematické strukturní modely DHpD a RD domén. Válce znázorňují alfa-helixy, pentagony beta skládané listy. Převzato z (Horak, Janda et al. 2011), upraveno. Lokalizace hybridních histidin-kináz AHK2, AHK3 a AHK4/CRE/WOL Všechny tři cytokininové receptory A.thaliana byly detekovány v různých orgánech v kořenech, listech, stoncích, a také v kytkách v různé fázi vývoje. Pomocí RT-PCR, Northernového přenosu a exprese s AHK4 promotor:gus byla AHK4/CRE/WOL detekována především v kořeni. Dále RT-PCR potvrdila nejhojnější výskyt AHK2 v listovém pletivu, naopak v nejmenší míře se vyskytuje ve stopkách. AHK3 se také nejhojněji vyskytuje v listech, ale byl potvrzen i silný výskyt v kořenech, stoncích i květech (Ueguchi, Koizumi et al. 2001). Na základě doménových analýz, sekvenční podobnosti s dvoukomponentními hybridními molekulami a některých experimentů, které byly provedeny s receptorovým GFP fúzním proteinem, se dlouho předpokládalo, že cytokininové receptory jsou lokalizovány na cytoplazmatické membráně (Mahonen, Bonke et al. 2000). Několik nedávných studií však dokládá také lokalizaci AHK2, AHK3 i AHK4/CRE/WOL na membráně endoplazmatického retikula (Caesar, Thamm et al. 2011). Otázkou je, za jakých podmínek je cytokininová signalizace spuštěna z plazmatické membrány a kdy ji zahajují receptory v membráně endoplazmatického 18

19 retikula. Vzhledem k tomu, že lokalizace cytokininových receptorů na membráně endoplazmatického retikula je experimentálně podložena, můžeme na obr. 4 vidět navržený model cytokininového přenosu signálu zahrnujícího obě možné varianty výskytu AHK receptorů. Obr. 5 Model modifikované cytokininové signální dráhy. Cytokininové receptory jsou lokalizovány jak na plazmatické membráně, tak na membráně endoplazmatického retikula (ER). Cytokininový signál se váže k jednomu z AHK receptorů a spouští autofosforylaci a přenos fosfátové skupiny pomocí proteinů AHP na regulátory odpovědi. Převzato z (Shi and Rashotte 2012) Přenašeče fosfátu Přenašeče fosfátu (HPt) představují další krok v cytokininové signalizaci. Jedná se o nezbytné prvky His-Asp-His-Asp fosforylace, které přenáší fosfátovou skupinu z hybridního histidin-kinázového receptoru na regulátory odpovědi. V A.thaliana byla prokázána existence pěti proteinů HPt. Jedná se o AHP1, AHP2, AHP3, AHP4 a AHP5. Všechny nesou konzervovaný histidin, který je akceptorem pro fosfátovou skupinu (Heyl and Schmulling 2003). Dále je znám protein AHP6, někdy také nazývaný APHP1. Jedná se o pseudohistidin fosfotransferový protein, který neobsahuje konzervovaný 19

20 histidinový zbytek nezbytný pro fosfotransferovou aktivitu (Mahonen, Bishopp et al. 2006). Nepřenáší tedy cytokininový signál, naopak funguje jako negativní regulátor této signalizace. Předmětem experimentální části této diplomové práce jsou proteiny AHP4 a AHP6, které vykazují na rozdíl od ostatních proteinů AHP, fungujících na podobném principu, odlišné chování Struktura proteinů AHP Struktura proteinů AHP (Arabidopsis Histidine Phosphotransfer) je mnohem jednodušší než struktura proteinů AHK, protože obsahují pouze krátkou HPt doménu. Sekvenční motiv XHQXKGSSXS se opakuje u všech proteinů AHP. Výjimkou je pouze AHP6, kde je histidin nahrazen asparaginem: XRQXKGSSXS. Právě absence tohoto histidinu, díky němuž jsou AHP schopny přenášet fosfátovou skupinu mezi jednotlivými proteiny je důvodem odlišných vlastností AHP6. Každý z proteinů AHP je složen z přibližně 150 aminokyselin. Výjimkou je AHP4, tvořený pouze 127 aminokyselinami (Suzuki, Sakurai et al. 2000). Proteiny AHP tedy tvoří poměrně homologní skupinu. Největší podobnost vykazují AHP2 a AHP3. Jejich shoda v aminokyselinové sekvenci je 81%. Velikost AHP se pohybuje od 14,5 kda do 18 kda. Jejich předpokládané izoelektrické body (pi) se pohybují v rozmezí hodnot od 5.5 do 3.9, což znamená, že se nacházejí v kyselé oblasti Lokalizace proteinů AHP AHP1 je exprimován především v kořenech. AHP2 a AHP3 jsou detekovatelné v celých rostlinách v kořenech, stoncích, listech i květech. Největší exprese AHP2 je však v kořenech a květech, největší exprese AHP3 v kořenech a listech. AHP5, podobně jako AHP2 a AHP3, je detekován v různých orgánech. AHP4 je obtížně detekovatelný v kořenech a listech (Suzuki, Sakurai et al. 2000). Exprese AHP6 probíhá v rozvíjejícím se protoxylému, špičkách výhonků a mladých listech (Mahonen, Bishopp et al. 2006). Původní studie buněčné lokalizace s AHP:GFP fúzním proteinem ukázaly, že většina proteinů AHP byla lokalizována především v cytosolu a teprve po vystavení cytokininům došlo k jejich transportu do jádra (Hwang and Sheen 2001). Nedávné studie AHP2 a AHP5 však dokazují jejich jadernou i cytoplazmatickou lokalizaci v rostlinách a potvrzují, že cytokininový signál nemá na subcelulární lokalizaci žádný vliv 20

21 (Punwani and Kieber 2010). Další studie prokázaly, že AHP1, AHP2, AHP3 a AHP5 fungují jako pozitivní regulátory cytokinového přenosu signálu, zatímco protein AHP4 může fungovat v některých situacích také jako negativní regulátor schopný inhibice signální dráhy (Mahonen, Bishopp et al. 2006) Protein AHP4 Protein AHP4 je na základě fylogenetické analýzy často zařazován do stejné skupiny s rýžovými pseudo-hpt proteiny (Hutchison, Li et al. 2006) a vykazuje nízkou hladinu transkriptu v RT-PCR (Suzuki, Sakurai et al. 2000). Analýza mutantů ztrácejících funkci AHP naznačuje, že AHP4 může hrát jen mírně pozitivní, žádnou nebo dokonce negativní roli v cytokininové signalizaci (Hutchison, Li et al. 2006). Přesná role AHP4 zatím nebyla objasněna. Existuje studie, která sledovala expresi proteinu AHP4 v mladých květech A. thaliana (wild type wt) a srovnávali ji s nadměrnou expresí téhož proteinu v transgenické linii A. thaliana (AHP4-ox) a také s linií ahp4 knock-out. Rostliny s nadměrnou expresí AHP4 (AHP4-ox) vykazovaly sníženou plodnost v důsledku nedostatečného tloustnutí subepidermální vrstvy buněk prašníků a inhibici exprese nepravidelných xylémů v mladých kytkách. Naopak stěny buněk prašníků linie ahp4 knock-out byly lignifikovány více než stěny buněk prašníků divokého typu (wt) a exprese nepravidelných xylému byla zvýšena. Tato studie tedy dokazuje negativní regulaci tloustnutí subepidermální vrstvy buněk prašníků díky působení AHP4 (Jung, Oh et al. 2008). Tloustnutí sekundárních buněčných stěn v rostlinách je důležité pro řadu biologických procesů, např. formování stavebních prvků průduchů a pletiv (Liljegren, Roeder et al. 2004) Protein AHP6 AHP6 je pseudo-hpt protein, protože neobsahuje histidinový zbytek nezbytný pro přenos fosfátu a aktivitu s tím spojenou. Histidin je v sekvenci nahrazen asparaginem. Exprese jeho transkripce není regulována působením cytokininů (Suzuki, Sakurai et al. 2000). In vitro testováním přenosu fosfátu bylo také zjištěno, že AHP6 není schopen přijímat fosforylovanou skupinu z kvasinkové histidin-kinázy SLN1. Pro tento test bylo využito informací o již dobře popsané aktivitě SLN1. Byly připraveny dva samostatné 21

22 proteiny: histidin kinázová doména (SLN1 HisK) a přijímačová doména (SLN1 Rec). V tomto experimentu byla fosfátová skupina přenášena z ATP značeného 32 P na konzervovaný zbytek histidinu SLN1 HisK, poté na konzervovaný zbytek kyseliny asparagové SLN1 Rec a následně na konzervovaný histidinový zbytek HPt proteinu. Pro experiment byly využity proteiny AHP1, AHP2, AHP3, AHP5, AHP6 a jeho mutantní verze AHP6b. AHP6b byl připraven záměnou asparaginu v pozici 83. V proteinu AHP6 byl na toto místo vložen histidin, nezbytný pro fosfotransferovou aktivitu. Pomocí tohoto systému bylo prokázáno, že AHP1, AHP2, AHP3, AHP5 i AHP6b jsou schopny přijmout fosfátovou skupinu z SLN1. Oproti tomu AHP6 toho schopen není, nefunguje tedy jako přenašeč fosfátu (Mahonen, Bishopp et al. 2006). Dalšími experimenty bylo zjištěno, že diferenciace protoxylému je negativně regulována cytokininy, ale podporována proteinem AHP6. Ten zde účinkuje prostřednictvím inhibice cytokininové signalizace. Z toho plyne, že správná rovnováha mezi účinkem cytokininů a AHP6 je důležitá pro správnou specifikaci protoxylému v kořenové systému (Mahonen, Bishopp et al. 2006) Proteiny CRF Proteiny CRF (cytokinin response regulator) jsou transkripční faktory, jejichž regulace je zajištěna cytokininy. Mohou být identifikovány ve všech čeledích suchozemských rostlin. Proteiny CRF představují malou část jedné z největších rodin rostlinných transkripčních faktorů AP 2 /ERF. Pro A. thaliana bylo doposud definováno 6 proteinů CRF (CRF 1 6 ). CRF mohou být charakterizovány přítomností 2 konkrétních domén. AP 2 /ERF doména vázající DNA se skládá z asi 68 aminokyselin a nachází se v blízkosti středu proteinu, CRF doména je lokalizována poblíž N konce proteinu. Zajímavostí je, že zatímco doména AP 2 /ERF byla nalezena v široké škále rostlin a dokonce i v některých bakteriích samostatně, doména CRF nebyla nalezena bez domény AP 2 /ERF nikdy. V současné době je již dostupných několik kompletních sekvencí genomů zelených řas. V této linii však nebyly objeveny žádné geny obsahující domény CRF. Zdá se tedy, že suchozemské rostliny jsou unikátní pro výskyt těchto proteinů (Cutcliffe, Hellmann et al. 2011). První experimenty s proteiny CRF byly prováděny v roce Podle těchto studií byla přítomností cytokininu regulována exprese proteinů CRF 2, CRF 5 a CRF 6, 22

23 ostatních nikoli. Následné studie využívající srovnávací rentgenovou analýzu či cytokininy regulovanou jadernou lokalizaci však dokázaly regulaci exprese přítomností cytokininu u všech ostatních proteinů CRF. CRF byly umístěny do signální dráhy proteinů AHP a byla dokázána jejich interakce. Fosforylované proteiny AHP indukovaly přesun CRF z cytoplazmy do jádra. Dále pak byla zjištěna regulace CRF proteiny ARR-B a to tak, že ARR-B zvyšovaly transkripci proteinů CRF (Rashotte, Mason et al. 2006). Novější experimenty potvrzují také fakt, že proteiny CRF 1-6 reagují i vzájemně mezi sebou. Využitím bimolekulárních fluorescenčních komplementačních (BiFC) analýz a kvasinkového dvouhybridního systému (Y2H) byla dokázána jejich schopnost tvořit homo- a heterodimery. Kromě původních 6 genů (CRF 1-6 ) definovaných pro A. thaliana byly pro následné experimenty využity ještě další 2 geny, které s A. thaliana úzce souvisí. Jsou to CRF 7 a CRF 8. Výsledky interakčních experimentů mezi CRF 1-8 a různými částmi dvoukomponentních systémů jasně dokazují, že proteiny CRF hrají významnou roli v cytokininové signální dráze (Cutcliffe, Hellmann et al. 2011; Rashotte and Goertzen 2010) Regulátory odpovědi Poprvé byly regulátory odpovědi u A. thaliana popsány v roce 1998 (Imamura, Hanaki et al. 1998; Sakai, Aoyama et al. 1998). Na základě sjednocení nomenklatury a podrobnějšího popsání aminokyselinových sekvencí a doménových struktur byly o rok později tyto geny, souhrnně označované jako ARR (Arabidopsis response regulator), rozděleny do dvou tříd: Regulátory odpovědi typu A (ARR-A) a typu B (ARR-B). Později byla popsána ještě třetí skupina, regulátory odpovědi typu C (ARR-C) (Imamura, Hanaki et al. 1999; Schaller, Doi et al. 2007). Kromě uvedených tří typů ARR bylo objeveno devět dalších genů, které vykazují s regulátory odpovědi blízkou podobnost. Tvoří samostatnou skupinu a jsou označovány jako pseudo-regulátory odpovědi, zkráceně APRR (Arabidopsis Pseudo- Response Regulator). Zásadní rozdíl je nepřítomnost konzervativní kyseliny asparagové v přijímačové doméně. Z tohoto důvodu nejsou schopny akceptovat fosfátovou skupinu, tudíž se nemohou účastnit TCS. Kyselina asparagová je nahrazena kyselinou glutamovou. Vyskytuje se také na aminokyseliny arginin a lysin bohatý DNA vázající 23

24 motiv, neboli C motiv (Hwang, Chen et al. 2002; Grefen and Harter 2004). Dále bylo prokázáno zapojení APRR v regulaci cirkadiánních rytmů rostlin (Matsushika 2000). Regulátory odpovědi typu A Skupina regulátorů odpovědi typu A čítá 10 členů: ARR 3-9 a ARR Mají menší velikost, jsou složené ze aminokyselin, vykazují aminokyselinovou podobnost v sekvenci % (Imamura, Hanaki et al. 1999). Obsahují pouze přijímačovou doménu. Lokalizovány byly v cytoplazmě i v jádře. Cytokininy mají silný vliv na expresi některých ARR-A. V současné době se předpokládá, že ARR-A soutěží o fosfátovou skupinu s ARR-B. Z tohoto důvodu jsou ARR-A považovány za negativní regulátory cytokininové signální dráhy (To, Haberer et al. 2004). Regulátory odpovědi typu B Prvními lokalizovanými ARR typu B byly ARR 1 a ARR 2, a to v roce 1998 (Sakai, Aoyama et al. 1998). Nyní se do této skupiny řadí celkem 11 genů. Kromě ARR 1 a ARR 2 jsou to ARR a ARR Regulátory odpovědi typu B jsou větší než regulátory odpovědi typu A, jsou tvořeny aminokyselinami (Imamura, Yoshino et al. 2001). Skládají se z přijímačové domény, domény pro lokalizaci v buněčném jádře, kde se všechny ARR-B nacházejí, ale navíc také z domény pro vazbu DNA. Ta je označována názvem GARP doména, v případě ARR také jako B-motiv. Tato doména se nachází na C konci a specificky se váže k aminokyselinové sekvenci (A/T)GAT(A/T) v promotorech cílových genů. ARR-B byly popsány jako pozitivní regulátory cytokininového přenosu signálu. Dále přímo aktivují expresi ARR-A. (Lohrmann and Harter 2002). Regulátory odpovědi typu C Regulátory odpovědi typu C (ARR-C) jsou známy pouze dva. Jako první byl popsán ARR22. Pomocí detailní RT-PCR analýzy byla dokázána jeho exprese v širokém spektru rostlinných tkání - v listech, stoncích i květech. V A. thaliana byla potvrzena nejvyšší akumulace ARR22 v reprodukčních orgánech zralých rostlin. ARR22 vykazoval společné rysy s regulátory odpovědi typu A (Kiba, Aoki et al. 2004). Následně byla v genomu A. thaliana identifikována sekvence vykazující 66% podobnost s ARR22 a vznikl tedy předpoklad o funkční homologii těchto dvou genů. Pomocí RT-PCR bylo 24

25 dokázáno, že akumulace tohoto druhého genu, pojmenovaného ARR24, je velice podobná. Nejvyšší úroveň exprese ARR24 byla pozorována u mladých pupenů (Gattolin, Alandete-Saez et al. 2006). Přesná funkce ARR-C není dosud známa. Tvorba není indukována cytokininy, přesto existují studie, které potvrzují zapojení ARR-C do cytokininové signální dráhy (Kiba, Aoki et al. 2004). Rostliny s nadprodukovaným proteinem ARR-C vykázaly sníženou citlivost k cytokininu (Gattolin, Alandete-Saez et al. 2006). Obr. 6 Primární doménová struktura regulátorů odpovědi. D kyselina asparagová, K lysin, N asparagin, E kyselina glutamová. Převzato z (Hwang, Chen et al. 2002), upraveno. 1.4 Interakce proteinů vícekrokové fosforylace Výzkumu protein proteinových interakcí mezi jednotlivými členy vícekrokových fosforylací (MSP) navzájem i mezi proteiny MSP s proteiny jiných signalizačních drah je věnováno mnoho prostoru a úsilí. Existuje řada studií potvrzujících jednotlivé interakce, ale taky studií nastiňujících interakce nové. Již dříve byly zkoumány interakce mezi proteiny AHP s vybranými histidin kinázami. Za použití dvouhybridních kvasinkových systémů byly prokázány interakce mezi AHK1 a AHP1, mezi AHK4 a AHP1-2, dále pak interakce ETR1 s proteiny AHP1-3 a interakce mezi CKI1 a AHP2. Na základě těchto průzkumu nebyla prokázána interakce ERS1 s žádným z AHP1-3 (Lohrmann and Harter 2002) Vzájemné interakce mezi histidin kinázami, AHP a regulátory odpovědi Později byly provedeny rozsáhlé studie zkoumající vzájemné interakce mezi histidin kinázami AHK2-4, proteiny AHP1-3, AHP5 a 13 různými regulátory odpovědi. I k těmto studiím bylo využito kvasinkového dvouhybridního systému a pomocí něj zjištěno 68 protein proteinových interakcí. Výsledkem bylo, že AHP1-3 i AHP5 jsou schopny 25

26 reagovat s AHK2-4. Protein AHP4 nebyl do studie zahrnut. Dále byla prokázána interakce mezi testovanými proteiny AHP a většinou regulátorů odpovědí typu A i typu B. Byla potvrzena role proteinů AHP jako přenašečů fosfátu mezi histidin kinázami a regulátory odpovědi (Dortay, Mehnert et al. 2006). Síť interakcí je znázorněna na obr. 7. Obr. 7 Síť interakcí v dvoukomponentním systému A. thaliana. Je zde zobrazeno 68 známých protein proteinových interakcí, které byly získány využitím kvasinkového dvouhybridního systému. Plné čáry vyznačují interakce potvrzené také in vitro studiemi. Převzato z (Dortay, Mehnert et al. 2006), upraveno Interakce mezi proteiny AHP a etylenovými receptory Za použití kvasinkových dvouhybridních studií byla už v roce 2002 prokázána interakce ETR1 s proteiny AHP1-3 (Lohrmann and Harter 2002). Nověji byly interakce mezi proteiny AHP a etylenovými receptory zkoumány pomocí fluorescenčně polarizačních technik. Pro tyto experimenty byly do bakteriálního hostitele naklonovány, exprimovány a purifikovány ETR1, prototyp etylenových receptorů, a fúzní protein GFP:AHP1 z A. thaliana. Interakce byla potvrzena (Scharein, Voet-van-Vormizeele et al. 2008). Z nejnověji publikovaných studií je známo, že fosforylace mění interakce AHP1 s jeho senzorovou kinázou ETR1. ETR spolu s AHP1 tvoří in vitro pevný komplex. Podle nejaktuálnějšího modelu tohoto komplexu tvoří spolu s regulátorem odpovědi fosforylovaný systém kontrolující genovou expresi etylenové odpovědi na působení rostlinného hormonu, podobně jako v bakteriálním dvoukomponentním systému. 26

27 Tento model předpokládá, že ETR1 funguje jako senzorová kináza a je fosforylován bez přítomnosti etylenu. Fosfátová skupina je poté přenesena na histidin umístěný na AHP1. Pro přenos fosfátu musí partneři tvořit pevný komplex. Po navázání etylenu se receptor přepne do nefosforylovaného stavu. Toto přepnutí je provázeno konformační změnou, která snižuje afinitu ETR1 k AHP1. Celý proces lze tedy shrnout tak, že vzájemná afinita k tvorbě komplexů se rapidně snižuje v případě, že se oba reakční partneři nachází buď ve fosforylované, nebo v nefosforylované formě. Naopak afinita k tvorbě komplexů je mnohem vyšší, jestliže se jeden protein nachází ve fosforylovaném stavu a jeho reakční partner v nefosforylovaném. K těmto experimentům, které ukázaly významnou úlohu fosfátu v tvorbě komplexů, bylo opět využito fluorescenčně polarizačních technik (Scharein and Groth 2011) Interakce histidin kinázy CKI1 Pomocí in vivo studií byla ověřena interakce na cytokininu nezávislé histidin kinázy CKI1, konkrétně její přijímačové domény (CKI1 RD ), s proteiny AHP2, AHP3 a AHP5. Výsledky ukazují, že CKI RD reaguje silněji s proteiny AHP2 a AHP3. Interakce s proteinem AHP5 je mnohem slabší (Pekarova, Klumpler et al. 2011) Interakce proteinů CRF s proteiny cytokininové signální dráhy Další interakce cytokininové signální dráhy jsou spojeny s objevem proteinu CRF. Pomocí kvasinkového dvouhybridního systému a biomolekulární fluorescenční komplementace byla vytvořena rozsáhlá studie, která potvrzuje, že proteiny CRF mezi sebou vzájemně vytváří homodimery a heterodimery. Tento fakt dokazuje, že fungují na stejném principu jako transkripční faktory AP 2 /ERF, tudíž také náleží do této rodiny. Dále byly potvrzeny interakce CRF s proteiny AHP a s regulátory odpovědi (zobrazeno na obr. 8). Interakce s histidin-kinázami však potvrzeny nebyly, z čehož vyplývá, že proteiny CRF tvoří další větev cytokininové signalizace. Signál je jim předáván až na úrovni AHP (Cutcliffe, Hellmann et al. 2011). 27

28 Obr. 8 Model interakcí proteinů CRF s proteiny cytokininové signální dráhy. Čáry zobrazují interakce proteinů CRF 1-8 s proteiny AHP a také s vybranými regulátory odpovědi typu A (ARR-A) i typu B (ARR-B). Proteiny CRF však neinteragují s histidin-kinázami (AHK). Převzato z (Cutcliffe, Hellmann et al. 2011), upraveno Interakce proteinů MSP s proteiny jiných signálních drah Byly popsány interakce proteinů vícekrokových fosforylací také s proteiny jiných signálních drah. Např. byla potvrzena interakce regulátoru odpovědi ARR4 se světelným receptorem PhyB (Sweere, Eichenberg et al. 2001). Další rozsáhlou studii zpracovali Hanak Dortay a jeho kolegové v roce Nově bylo objeveno 136 interakcí a s těmi již známými bylo identifikováno celkem 160 různých interakcí, z nichž většina souvisela s metabolismem nebo specifickými signálními drahami (Dortay, Gruhn et al. 2008). 28

29 1.5 Strukturní charakterizace proteinů vícekrokové fosforylace Vícekroková fosforylace hraje důležitou roli v rostlinné signalizaci. Mnoho proteinů MSP bylo zkoumáno v A. thaliana i dalších rostlinách. Ale jen málo z nich bylo strukturně charakterizováno. Doposud je známa struktura následujících komponentů: Senzorová doména AHK4 v komplexu s jeho cytokininovými ligandy (Hothorn, Dabi et al. 2011), přijímačová doména ETR1 (ETR1 RD ) (Muller-Dieckmann, Grantz et al. 1999) a přijímačová doména CKI1 (CKI1 RD ) (Pekarova, Klumpler et al. 2011). Dále byla popsána struktura DNA-vazebného motivu regulátoru odpovědi ARR 10 (Hosoda, Imamura et al. 2002) a nejnověji byl v naší laboratoři připraven a krystalizován protein AHP2 (Degtjarik, Dopitova et al.) a v nejbližší době bude publikována i struktura proteinu AHP2. Strukturní informace o způsobu přenosu fosforylované skupiny z histidin-kinázy na AHP však chybí. Za účelem definování specifity a poznání této interakce byla determinována první krystalová struktura přijímačové domény rostlinné HK, konkrétně AHK5, v komplexu s proteinem AHP1 (Bauer, Reiss et al. 2012) AHK5 RD v komplexu s AHP1 AHK5 RD a AHP1 tvoří komplex 1:1 jak v roztoku, tak v krystalové podobě. Strukturu tohoto komplexu vidíme na obrázku č. 9. AHP1 je složen z šesti α-šroubovic, z nichž 4 (α3, α4, α5 a α6) tvoří centrální jádro, které je umocněno zbývajícími dvěma α- šroubovicemi (α1 a α2). Z jedné strany svazku, směrem k interakčnímu partnerovi, vyčnívá konzervovaný zbytek histidinu, konkrétně His79, zprostředkovávající přenos fosforylované skupiny. Strukturu AHK5 RD tvoří pětice paralelních β-listů, obklopená 5 α-šroubovicemi. Šestá α-šroubovice (α4) leží samostatně na povrchu AHK5 RD, naproti od vazebného rozhraní interakčních partnerů. Konzervovaný zbytek kyseliny asparagové, Asp828, nesoucí fosforylovanou skupinu, je lokalizován na špici řetězce β3. Smyčka L5, která spojuje řetězec β3 se šroubovicí α3, nese tzv. motiv γ-otočky (aminokyselinové zbytky ), který je strukturálně zachován u všech přijímačových domén. γ-otočka je vložena do delší smyčky, nazývané γ-smyčka, která nese v přijímačové doméně AHK5 sekvenci MPVLDG. Smyčka L8, spojující β4 s α5, 29

30 může podléhat různým konformacím, a to v závislosti na přítomnosti Mg 2+ iontů. Leží v těsné blízkosti γ-smyčky (Bauer, Reiss et al. 2012). Obr. 9 Strukturní model komplexu AHK5 RD -AHP1. Zeleně je znázorněn protein AHP1, modře AHK5 RD, červeně histidin a aspartát nesoucí fosforylovanou skupinu. Převzato z (Bauer, Reiss et al. 2012), upraveno Přijímačová doména histidin kinázy CKI1 Přijímačová doména CKI1 (CKI1 RD ) byla identifikována jakožto doména určující specifitu interakce CKI1 s proteiny AHP in vivo. Ke studiu 3D struktury byla využita metoda rentgenové difrakce. Struktura CKI1 RD je znázorněna na obr. 10a. Přijímačová doména se skládá z pěti α-šroubovic a pěti β-řetězců. Pět paralelních β-řetězců tvoří centrální β- list (β2-β1-β3-β4-β5 ), který je z jedné strany obklopen α1 a α5 šroubovicemi a ze strany druhé α3, α4 a α5 šroubovicemi. Jednotlivé prvky sekundární struktury jsou spojeny pomocí 5 smyček (L1-L5). (Pekarova, Klumpler et al. 2011) Přijímačová doména etylénového receptoru ETR1 Přijímačová doména etylénového receptoru ETR1 (ETR RD ), vykazuje vysokou strukturní podobnost s CKI1 RD (obr. 10b). ETR1 RD byla první rostlinnou přijímačovou doménu, jejíž 30

31 krystalová struktura byla popsána, a to již v roce Je složena z pěti paralelních β- řetězců tvořících β-list, z obou stran obklopený α-helixy. V nefosforylované formě tvoří homodimer jak v roztoku, tak v krystalové podobě (Muller-Dieckmann, Grantz et al. 1999). ETR RD jen málo souvisí s přijímačovými doménami dalších AHK, protože s nimi vykazuje pouze 14% sekvenční podobnost (Romir, Harter et al. 2009). Obr. 10 Struktura CKI1 RD a její podobnost s ETR1 RD. a) Struktura CKI1 RD je tvořena α-šroubovicemi (α1- α5) a β-řetězci (β0-β5). L1-L5 jsou smyčky mezi α-šroubovicemi a β-řetězci. Dále jsou zobrazeny postranní řetězce katalytického aspartátu D1050 a lysinu K1105. b) Strukturní podobnost CKI1 RD (zelená) a ETR1 RD (oranžová) A. thaliana. Hlavní rozdíl mezi těmito dvěma strukturami představuje smyčka L3, menší rozdíly jsou ve smyčkách L2 a L4. Převzato z (Pekarova, Klumpler et al. 2011), upraveno Struktura senzorové domény AHK4 Byla zjištěna vysoká strukturní podobnost senzorové domény AHK s rodinou bakteriálních histidin kináz. V obou případech tvoří senzorové domény v krystalové podobě homodimery. Senzorová doména AHK4 je tvořena 270 aminokyselinovými zbytky (konkrétně ). Mutace konzervovaného treoninu (Thr278) vede ke ztrátě fenotypové funkce. Strukturu senzorové domény AHK4 popisuje obr. 11. N- koncová část přechází do dlouhé α-šroubovice. Ta je přes helikální linker připojena k membránové PAS doméně, sloužící jako místo pro rozpoznání cytokininu. Cytokinin je rozpoznán v závislosti na přítomnosti N6-isopentenyladeninu ve struktuře AHK4. Poslední β-řetězec membránové PAS-domény je spojen s N-koncem α-šroubovice pomocí disulfidického můstku (Hothorn, Dabi et al. 2011). 31

32 Obr. 11 Struktura senzorové domény AHK4. Červeně je znázorněna N-koncová šroubovice, modře β- řetězce, zeleně disulfidické můstky. Žlutě je zakreslen ligand N6-isopentenyladenin, v jehož přítomnosti ve struktuře dochází k vazbě cytokininu. Převzato z (Hothorn, Dabi et al. 2011), upraveno DNA-vazebný motiv regulátoru odpovědi ARR 10 ARR 10 patří mezi regulátory odpovědi typu B, řadící se do tzv. GARP (Golgi-associated retrograde protein) rodiny rostlinných transkripčních faktorů. B motiv ARR 10, neboli ARR 10-B, se skládá z 64 aminokyselinových zbytků (Thr179 - Ser242). Jedná se o multifunkční doménu zodpovědnou za jadernou lokalizaci a současně za schopnost vázat DNA. Pomocí NMR byl u ARR 10-B krystalová struktura popsána jako šrouboviceotočka-šroubovice (obr. 12) (Romir, Harter et al. 2009; Hosoda, Imamura et al. 2002). Obr. 12 Struktura DNA-vazebného motivu ARR 10. Struktura je tvořena třemi α-šroubovicemi. α2 a α3 tvoří základní motiv helix-otočka-helix. Zbytky zapojené do vazby DNA jsou znázorněny jako tyčinky (modrá a červená). Převzato z (Romir, Harter et al. 2009), upraveno. 32

33 1.5.6 Struktura proteinů HPt a AHP2 Pomocí rentgenové strukturní krystalografie byla popsána struktura několika proteinů HPt, odpovídajících za přenos fosfátu v TCS. Doposud je známa struktura několika bakteriálních proteinů/domén HPt (Kato, Mizuno et al. 1997), proteinů HPt z kukuřice (Zea mays), konkrétně ZmHP1 a ZmHP2 (Sugawara, Kawano et al. 2005) a také z rýže (Oryza sativa) (Levin, Kondrashov et al. 2007). Sekvenční podobnost se pohybuje mezi 41% až 54%, přesto všechny tyto domény sdílí společný motiv složený ze čtyřšroubovicového svazku a dvou přídavných α-šroubovic (obr. 13a). Konzervovaný zbytek histidinu se nachází v oblasti čtvrté alfa šroubovice, na přístupném místě na povrchu molekuly, a plní zde funkci tzv. aktivního místa (Romir, Harter et al. 2009). Strukturní data samotných proteinů AHP, na jejichž získání se intenzivně pracuje v naší laboratoři, nebyla ještě donedávna publikována. První strukturou, která bude v brzké době publikována, je trojrozměrná struktura AHP2. Protein AHP2 byl klonován, exprimován a purifikován do čistoty vyšší než 95%. Po stabilizaci proteinu 50 mm imidazolem a 5 mm DTT byly získány krystaly proteinu (obr. 13b), které difraktovaly při 2,5 Å (Degtjarik, Dopitova et al.). Obr. 13 Struktura AHP2. a) Model proteinu AHP2 navržený pomocí programu MODELLER. Je zde platný motiv svazku 4 α-šroubovic, společný pro všechny HPt, a dvě přídavné α-šroubovice. Modře je označen N-konec, červeně C-konec. (Romir, Harter et al. 2009). b) Krystaly proteinu AHP2 (Degtjarik, Dopitova et al.). 33

34 2 Cíle diplomové práce Pro tuto diplomovou práci byly vytyčeny následující cíle: 1. Optimalizace exprese rekombinantních proteinů AHP4 a AHP6 v bakteriálním expresním systému. 2. Optimalizace purifikace a zisku nativních proteinů AHP4 a AHP6. 3. Testování monoklonálních protilátek připravených proti proteinům AHP4 a AHP6 a výběr protilátek vhodných citlivě a specificky rozeznávat AHP4 a AHP6 v rostlinných, bakteriálních a kvasinkových proteinových extraktech. 34

35 3 Materiál a metody 3.1 Základní metody Stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové Přístroje a materiál: Spektrofotometr Helios β (Spectronic Unicam) Kyvety semi-mikro, polystyren (P-lab) Barvivo Protein Assay dye concentrate (Bio-Rad) Koncentrace proteinů byla stanovena pomocí metody dle Bradfordové. Barvivo používané pro tuto metodu, Coomassie Brilliant blue, se váže na proteiny. Výsledkem je barevná změna, při které se posune absorbční maximum barviva z vlnové délky 456 nm na vlnovou délku 595 nm. Tato změna je úměrná množství proteinu. Měřený roztok byl připraven smícháním 1-10 µl proteinu s vodou na celkový objem 800 µl, přidáním 200 µl barviva a následným promícháním. Hodnota absorbance této směsi byla měřena na spektrofotometru při vlnové délce 595 nm. Hodnota koncentrace proteinu ve vzorku byla vypočítána ze směrnice kalibrační přímky, k jejímuž sestrojení byl použit hovězí sérový albumin (BSA) Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) Pro účely polyakrylamidové gelové elektroforézy, provedené za denaturačních podmínek, byly použity polyakrylamidové gely s obsahem SDS (SDS PAGE) a v diskontinuálním uspořádání. Polyakrylamidový gel byl složen z vrstvy koncentračního gelu, ve které došlo ke zakoncentrování proteinů, a z vrstvy separační, v níž došlo k vlastnímu rozdělení proteinu. Příprava gelu pro 15% SDS PAGE Byl připraven 15% separační gel smícháním následujících látek: 1,25 ml 4x koncentrovaného 1,5 M Tris-Cl ph 8,8 1,2 ml ddh2o 35

36 2,5 ml roztoku Rotiphorese gel 30 (30 % akrylamid a 0,8 % bisakrylamid ROTH) 50 µl 10 % roztoku SDS 50 µl 10 % roztoku APS 3 µl TEMED Tato směs byla následně nalita mezi připravená skla asi 2,5 cm pod okraj. Vrstva gelu byla převrstvena vodou, aby se zabránilo přístupu kyslíku, a následujících zhruba třicet minut probíhala polymerizační reakce. Následně byla voda odsáta filtračním papírem a separační gel byl převrstven směsí 5% koncentračního gelu, připraveného smícháním následujících látek: 400 µl 4 x koncentrovaného 0,5 M Tris-Cl ph 6,8 800 μl ddh2o 250 μl roztoku Rotiphorese gel 30 (30 % akrylamid a 0,8 % bisakrylamid ROTH) 16 µl 10 % roztoku SDS 25 µl 10 % roztoku APS 1 µl TEMED Ihned po nalití koncentračního gelu byl vložen deseti-jamkový hřebínek. Následujících přibližně 30 minut probíhala polymerizace. Příprava vzorků pro elektroforézu Přístroje: Termoblok Thermo Dri-Block 20 Materiál: 4x koncentrovaný nanášecí pufr o složení 200 mm TrisCl ph 6.8, 400 mm DTT, 8% SDS, 0.4 % bromfenolová modř, 35% glycerol K vzorku byl přidán 4x koncentrovaný nanášecí pufr s obsahem SDS. Následovala inkubace v termobloku při 95 C po dobu 10 minut. Elektroforéza Přístroje: Aparatura Mini-PROTEAN 3 (Bio-Rad) 36

37 Zdroj napětí PowePac Basic (Bio-Rad) Materiál: Elektroforetický pufr: 25 mm Tris-Cl ph 8.3, 192 mm glycin, 0.1% SDS Hmotnostní standard: PageRuler TM Prestained Protein Ladder, kda (Thermo scientific) Coomassie Brilliant Blue G250 Připravené gely byly vloženy do aparatury a zality elektroforetickým pufrem. Po vytažení hřebínku byly do jamek naneseny vzorky a hmotnostní standard, a to pod hladinou pufru. Elektroforéza probíhala pod napětím 25 ma na jeden gel. Po skončení elektroforézy byly gely třikrát 5 minut promývány v ddh 2 O. Následně proběhla vizualizace proteinů na gelu nespecifickou technikou pomocí Coomassie Brilliant Blue G250, případně byly gely použity pro western blot Western blot Western blot, neboli imunoblot, je analytická metoda používaná pro detekci specifického proteinu ve směsi s dalšími proteiny. Po separaci proteinů dle jejich velikosti pomocí SDS PAGE následuje přenos proteinů z gelu na povrch nitrocelulosové nebo PVDF membrány, na jejímž povrchu jsou detekovány specifickými protilátkami. Přenos je umožněn elektrotransferem. Pro účely této diplomové práce byla nejčastěji použita metoda polosuchého westernového přenosu ( semi-dry ). Elektrotransfer Přístroje: Aparatura pro semidry elektrotransfer: Trans-blot Turbo (Bio-Rad) Materiál: Filtrační papír (Whatman 3mm), 4 kusy Membrána: PVDF Immobilon -P Transfer Membrane (Millipore) Metanol Transferový pufr (TOWBIN): 25 mm Tris-Cl o ph 8.3, 150 mm glycin, 10% metanol 37

38 Postup: Membrána PVDF byla aktivována ponořením do metanolu a následně 5 minut inkubována v ddh 2 0. Poté byla PVDF membrána spolu s papíry Whatman ponořena na 10 minut do transferového pufru. Aparatura byla sestavena tak, že na spodní díl přístroje (anody), byly přiloženy dva papíry Whatman, na ně membrána PVDF, gel a nakonec znovu dva papíry Whatman. Nakonec byl sendvič přikryt víkem aparatury (katodou) a zapnuta metoda. Zdroj byl nastaven na 5 ma/cm 2 gelu po dobu 15 minut. Během této doby byly záporně nabité proteiny elektrickým proudem přeneseny z gelu směrem dolů, na povrch membrány. Imunodetekce Přístroje: Kývačka Biometra WT 12 Materiál: TBST: 20 mm Tris-Cl o ph 7.6, 100 mm NaCl, 0.1% Tween-20 Blokační pufr: 5% mléko v TBST Detekční pufr: 100 mm Tris-Cl o ph 9.5, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 Barvící roztok: 30 ml detekčního pufru bylo smícháno se 150 µl NBT (4- nitroblue tetrazolium, zásobní roztok o koncentraci 100 mg/ml v 70% DMF) a 100 µl BCPI (5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfát, zásobní roztok o koncentraci 50 mg/ml ve 100% DMF) Protilátky: Protilátky, které byly použity pro jednotlivé experimenty, byly ředěny v blokačním pufru. Myšší monoklonální Anti-polyhistidin (Sigma) Green fluorescent protein mouse IgG κ monoclonal antipody (Roche) Anti AHP4 a anti AHP6 (připraveny na našem pracovišti (MCGPR CEITEC MU) ve spolupráci s VÚVEL Brno Anti Mouse IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou (Sigma) 38

39 Postup: Po skončení přenosu proteinů byla membrána PVDF inkubována 1 hodinu v blokačním pufru a následně byla na 1 hodinu ponořena do roztoku první protilátky (ředění 1:500, 1:5000 nebo 1:10 000). Poté byla membrána 3 x 5 minut promývána v TBST a další hodinu inkubována v roztoku sekundární protilátky značené alkalickou fosfatázou (1:10 000). Po promytí 3 x 5 minut v TBST byla membrána 10 minut inkubována v detekčním pufru. Všechny tyto kroky probíhaly za stálého míchání na kývačce. Následně byla vložena do barvícího roztoku, kde za nepřítomnosti světla probíhala vizualizace proteinu. Obvyklá doba detekce byla 1-5 minut. Nakonec byla membrána promyta v ddh 2 0, čímž byla reakce zastavena, a osušena ve filtračním papíru. 3.2 Optimalizace exprese proteinu AHP Příprava bakteriálních konzerv Přístroje: Centrifuga 5810R (Eppendorf) Třepačka Thermomixer 5437 (Eppendorf) Třepačka Multitron Standard (Bio Trade s.r.o.) Materiál: Sterilní antibiotika: kanamycin (50 mg/ml), chloramfenikol (100 mg/ml) 5x KCM: 2 M KCl, 0.3 M CaCl 2, 2 M MgCl 2 40 % glukóza 10 % sterilní glycerol LB medium tekuté: 2.5 g LB rozpustit ve 100 ml ddh 2 0 LB medium tuhé: do 100 ml ddh 2 O přidat 2.5 g LB a 1.5 agaru, sterilizovat autoklávováním a po vychladnutí na cca 40 C přidat 5 ml 40% glukózy, 100 µl kanamycinu a 50 µl chloramfenikolu. Konstrukt rekombinantní DNA: AHP4::pETM60-Ub3 (dar od Mgr. Radky Dopitové Ph.D.) 39

40 Bakteriální kmen: BL21(DE3)pLysS (Novagen) F - ompthsds b (r b - m b - ; klon B E. coli) Postup: Rekombinantní DNA AHP4::pETM60-Ub3 byla transformována do expresního bakteriálního kmene BL21(DE3)pLysS. K 50 µl chemokompetentních buněk BL21(DE3)pLysS bylo přidáno 2.5 µl DNA, 10 µl 5x KCM a 37.5 ddh 2 0. Směs byla inkubována 20 minut na ledu a dalších 10 minut při laboratorní teplotě. Po přidání 400 µl LB média probíhala 1 hodinu inkubace při 37 C za stálého třepání. Směs byla rozetřena na Petriho misky s tuhým LB mediem a ty byly inkubovány přes noc při 37 C. Následně byly misky ponechány na laboratorní teplotě. Z Petriho misky obsahující narostlé kolonie expresního kmene E. coli BL21(DE3)pLysS transformované konstrukty AHP4::pETM60-Ub3 bylo odpíchnuto asi 20 kolonií. Ty byly zaočkovány do tekutého LB media, do kterého bylo předem přidáno 2.5 ml 40 % glukózy a 100 µl kanamycinu, jakožto selekčního antibiotika. Bakteriální suspenze rostla přes noc při 37 C. Poté byla kultura centrifugována při 3220 g. Pelet z 50 ml kultury byl rozsuspendován ve 2 ml 10 % sterilního glycerolu, rozpipetován do mikrozkumavek, zamražen v tekutém dusíku a skladován na -80 C Růst a exprese AHP4 Ub3 Přístroje: Třepačka Multitron Standard (Bio Trade s.r.o.) Materiál: LB médium TB médium (na 1 l): 900 ml ddh 2 O, 12 g trypton, 24 g kvasniční výtažek, 4 ml glycerol K-fosfát (na 1 l): 23.1 g KH 3 PO 4 a 125 g K 2 HPO 4 ; ph % glukóza Antibiotikum: kanamycin (zásobní koncentrace 50 mg/ml) IPTG 40

41 Podmínky: Média: a) LB médium b) TB médium Teploty: Růst Exprese 22 C 22 C 37 C 28 C 37 C 22 C Postup: Do 50 ml LB média bylo přidáno 1.25 ml 40% glukózy a 50 µl kanamycinu (finální koncentrace činila 100 µg/ml). Do 45 ml TB média bylo přidáno 5 ml K-fosfátu, 1.25 ml 40% glukózy a 50 µl kanamycinu. Následně byla připravená růstová média inokulována 50 µl bakteriální konzervy. Růst buněk probíhal při teplotách 22 C a 37 C při 200 otáčkách za minutu. V okamžiku, kdy bylo dosaženo hodnoty OD , byla zahájena indukce exprese přídavkem 1 mm IPTG a změnou teploty na 22 C případně 28 C. Indukce probíhala 3 hodiny, bylo nastaveno třepání 200 otáček za minutu. Po ukončení indukce byla kultura 20 minut centrifugována při 3220 g a 4 C. Kultura byla před zpracováním uskladněna na -20 C Příprava vzorků na 15 % SDS PAGE Přístroje: Sonikátor Ultrasonic Liquid Proccesor (Misonix) Centrifuga 5810R (Eppendorf) Materiál: Sonikační pufr: 20 mm Tris ph 7.9, 300 mm NaCl, 10% glycerol, 3,5 mm merkaptoetanol, 20 mm imidazol, 0,1 % TritonX mm Tris ph

42 Hmotnostní standard: PageRuler TM Prestained Protein Ladder, kda (Thermo scientific) Myšší monoklonální Anti-polyhistidin (Sigma) Anti Mouse IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou (Sigma) Postup: Pelet z 50 ml kultury byl rozsuspendován v 1 ml sonikačního pufru v ependorfce. Buňky byly následně lyzovány ultrazvukovými pulzy o výkonu 40 W po dobu 6 x 1 minutu za stálého chlazení ledem, byla použita sonda MS1. Po 40 minutové centrifugaci při g a 4 C byl oddělen supernatant od peletu. V supernatantu byla změřena koncentrace proteinů (viz. kapitola 3.1.1). Pelet byl rozsuspendován v 50 mm Tris o ph 7.5. Takto připravené vzorky byly použity pro následnou 15% SDS PAGE % SDS PAGE Do jedné jamky 15% polyakrylamidového gelu s obsahem SDS bylo naneseno 20 µg proteinu ze supernatantu a stejný objem vzorku z peletu. Dále bylo na gel naneseno 5 µl hmotnostního standardu. Pro všechny vzorky byla provedena elektroforéza (viz. kapitola 3.1.2). Gel byl dále použit pro semi-dry western blot Western blot Pomocí polosuchého westernového přenosu (viz. kapitola 3.1.3) byly proteiny z gelu přeneseny na membránu PVDF. K imunodetekci byly použity myšší monoklonální Antipolyhistidin (Sigma), jakožto primární protilátka, a sekundární protilátka anti Mouse IgG (Sigma) konjugovaná s alkalickou fosfatázou. Obě protilátky byly ředěny v poměru 1 :

43 3.3 Optimalizace exprese proteinu AHP6 Optimalizace exprese proteinu AHP6 probíhala stejným způsobem jako u proteinu AHP4. Jediným rozdílem bylo, že u AHP6 bylo navíc testováno, zda je pro následné experimenty vhodnější využít fúzní konstrukt s ubiquitinem 2 nebo ubiquitinem 3. Na tomto místě je uvedeno shrnutí expresních podmínek testovaných pro AHP6. Podmínky: Média: a) LB b) TB Teploty: Růst Exprese 22 C 22 C 37 C 28 C 37 C 22 C Konstrukty rekombinantní DNA: 1. petm60-ub2::ahp6 (dar od Mgr. Radky Dopitové Ph.D.) 2. petm60-ub3::ahp6 (dar od Mgr. Radky Dopitové Ph.D.) Bakteriální kmen: BL21(DE3)pLysS (Novagen) F - ompthsds b (r - b m - b ; klon B E. coli) Po ukončení indukce byla kultura 20 minut centrifugována při 3220 g a 4 C a následně byly vzorky připraveny pro 15% SDS PAGE stejně jako v případě AHP4. Po proběhnutí elektroforézy a polosuchého westernového přenosu, byla provedena imunodetekce za použití stejných protilátek, jaké byly použity pro protein AHP4: primární protilátka Myšší monoklonální Anti-polyhistidin (Sigma) a sekundární protilátka anti Mouse IgG (Sigma) konjugovaná s alkalickou fosfatázou, ředěny opět 1 :

44 3.4 Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Exprese fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 Přístroje: Třepačka Multitron Standard (Bio Trade s.r.o.) Materiál: TB médium (na 1 l): 900 ml ddh 2 O, 12 g trypton, 24 g kvasniční výtažek, 4 ml glycerol K-fosfátový pufr (na 1 l): 23.1 g KH 3 PO 4 a 125 g K 2 HPO 4 ; ph % glukóza Antibiotikum: kanamycin (zásobní koncentrace 50 mg/ml) Bakteriální konzerva: petm60-ub3::ahp4 v buňkách BL21(DE)3pLysS 1 M IPTG Postup: Na základě výsledků expresního screenu byly vybrány nejvhodnější podmínky pro přípravu proteinu pro purifikaci. K 900 ml TB média bylo přidáno 100 ml K-fosfátu, 25 ml 40% glukózy a 1 ml sterilního kanamycinu. Poté bylo růstové médium inokulováno 70 µl expresního štoku. Růst probíhal 3 hodiny při teplotě 37 C a 200 otáčkách. Při dosažení OD byla zahájena indukce exprese přídavkem 500 µl 1 M IPTG. Exprese probíhala 3 hodiny při teplotě 28 C a 200 otáčkách za minutu. Po ukončení indukce byla kultura 20 minut centrifugována při 3220g a 4 C. Supernatant byl odebrán, pelet použit pro purifikaci Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 Přístroje: Sonikátor Ultrasonic Liquid Proccesor (Misonix) Ultracentrifuga Avanti J-30I (Beckman) FPLC ÄKTA s automatickým sběračem frakcí Frac-950 (GE Healthcare) Kolona His TRAP (GE Healthcare) Materiál: Sonikační pufr: 50 mm Tris ph 7.9, 300 mm NaCl, 10 % glycerol, 0.1% Triton X- 100, 20 mm imidazol, 3.5 mm mercaptoethanol 44

45 50 mm CAPS o ph M NaOH 70% (NH 4 ) 2 SO mm Tris o ph 8.0 Ultrafiltrační kolonky s membránou (cut off) NMWL (Millipore) Ekvilibrační pufr (A): 50 mm Tris o ph 7.9, 300 mm NaCl, 10% glycerol, 3.5 mm merkaptoetanol, 20 mm imidazol Eluční pufr (B): 50 mm Tris o ph 7.9, 300 mm NaCl, 10 % glycerol, 3.5 mm merkaptoethanol, 500 mm imidazol Myšší monoklonální Anti-polyhistidin (Sigma) Anti AHP4 (připravena na našem pracovišti (MCGPR CEITEC MU) Anti Mouse IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou (Sigma) Postup: Pelet z 1 l kultury byl rozsuspendován ve 30 ml sonikačního pufru a buňky byly následně lyzovány ultrazvukovými pulzy o výkonu 40 W po dobu 6 x 1 minutu za stálého chlazení ledem, byla použita sonda MS1. Poté probíhala 30 minut centrifugace při g a teplotě 4 C. Supernatant (S 1 ) byl odebrán a pelet znovu rozsuspendován v 30 ml sonikačního pufru a opět sonikován ultrazvukovými pulzy o výkonu 40 W po dobu 6 x 1 minutu za stálého chlazení ledem. Následně byl 2 hodiny inkubován na rotátoru při 4 C a poté 30 minut centrifugován při g a teplotě 4 C. Po centrifugaci byl opět odebrán supernatant (S 2 ) a pelet byl rozsuspendován v 30 ml 50 mm CAPS o ph K suspenzi bylo přikapáno několik kapek 5 M NaOH, dokud se neprojasnila, a znovu proběhla 30 minutová centrifugace při g a teplotě 4 C. Nyní byl jako odpadní materiál odebrán pelet (P 1 ). Supernatant (S 3 ) byl vysrážen 70% (NH 4 ) 2 SO 4 a to tak, že k 30 ml roztoku bylo přidáno mg síranu amonného. Srážení probíhalo přes noc při teplotě 4 C, za stálého míchání na rotátoru. Po 14 hodinách byl vysrážený roztok centrifugován při g a teplotě 4 C. Supernatant (S 4 supernatant po vysrážení síranem amonným) byl odebrán a pelet (P 2 ) rozpuštěn ve 30 ml 100 mm Tris o ph 8.0 a přes noc inkubován při 4 C za stálého míchání na rotátoru. 45

46 Následující den byl roztok znovu centrifugován při g a teplotě 4 C, pelet (P 3 ) byl odebrán a supernatant (S 5 ) dialyzován ve 2 l 100 mm Tris o ph 8.0 při teplotě 4 C. Po 5 hodinách byl 100 mm Tris o ph 8.0 vyměněn za další 2 l téhož dialyzačního pufru a dialýza dále probíhala přes noc. Byla změřena koncentrace proteinu (viz. kapitola 3.1.1) a protein byl zahuštěn. Zahuštění proteinu probíhalo na ultrafiltrační koloně o cut off 10 kda, při otáčkách g a teplotě 4 C. Pomocí 15% SDS PAGE byla provedena kontrola jednotlivých frakcí z purifikace na gelu a také kontrola čistoty nezahuštěného i zahuštěného fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4. Zahuštěný fúzní protein Ub3-His 6 -AHP4 byl dále purifikován pomocí metalochelatační afinitní chromatografie. Hexahistidinová kotvička umožnila izolaci proteinu pomocí této metody na základě jeho vazby k imobilizovanému iontu kovu. Pro tento purifikační krok byla použita 1 ml kolona HisTrap a metoda jednoduchého lineárního gradientu. Bakteriální lyzát byl před aplikací na chromatografickou matrici přečištěn od zbytků buněčných stěn použitím mikrofiltru s póry o velikosti 0,2 µm a naředěn ekvilibračním pufrem na objem 20 ml. Matrice v kolonce byla nejdříve ekvilibrována pufrem ekvilibračním (A). Poté proběhlo dávkování vzorku na kolonu. Po navázání proteinů byly nenavázané proteiny vymyty ekvilibračním pufrem A. Následně byl pomocí lineárního gradientu od 20 (pufr A) do 500 mm imidazolu (pufr B) eluován navázaný fúzní protein AHP4. Byla provedena kontrola jednotlivých frakcí z purifikace na gelu a frakce obsahující protein byly zahuštěny na ultrafiltrační koloně o cut off 10 kda, při otáčkách g a teplotě 4 C. Byla změřena koncentrace proteinu. Ověření čistoty zakoncentrovaného proteinu bylo provedeno pomocí 15 % SDS PAGE. Byl také testován vliv přídavku redukčního činidla (DTT) a denaturačního činidla (4 M UREA) na chování proteinu. Vzorky byly připraveny tak, že k 20 µg proteinu bylo přidáno malé množství DTT a UREY. Pomocí westernového polosuchého přenosu bylo provedeno ověření, zda se jedná o různé formy proteinu. K následné specifické detekci proteinu byly použity 2 odlišné primární protilátky: protilátka proti histidinové kotvě (Myšší monoklonální 46

47 Anti-polyhistidin) v ředění 1 : a protilátka proti proteinu AHP4 (E8) v ředění 1:500). Jako sekundární protilátka byla použita anti Mouse IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou, ředěna 1 : Štěpení kotvy fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 pomocí S-TEV proteázy Přístroje: Termoblok Techne Dri-Block DB 20 Materiál: 10x TEV štěpící pufr: 500 mm Tris o ph 7.9, 1 M NaCl, 10 mm DTT, 5 mm EDTA S-TEV proteáza o koncentraci 1 mg/ml (připravena na našem pracovišti MCGPR CEITEC MU) Fúzní Ub3-His 6 -AHP4 o koncentraci 8.12 mg/ml Testování teplotních podmínek pro štěpení v malém objemu Bylo testováno množství S-TEV proteázy potřebné ke štěpení proteinu Ub3-His 6 -AHP4. Vzorek byl připraven tak, že k 20 µg proteinu byly přidány 3 µl 10x TEV pufru, 2 µl S- TEV proteázy a tato směs byla doplněna ddh 2 O do celkového objemu 30 µl. Vzorek byl inkubován nejprve 1 hodinu na ledě, poté 16 hodin při 30 C a nakonec znovu 1 hodinu na ledě. Byla také připravena kontrola, která neobsahovala S-TEV proteázu (místo ní byl objem doplněn ddh 2 0). Kontrola byla inkubována při stejných teplotních podmínkách jako vzorek. Stupeň štěpení byl sledován pomocí 15% SDS PAGE. Štepení proteinu ve velkém objemu Nakonec byl proveden pokus rozštěpit celý objem proteinu S-TEV proteázou. Na štěpení 2000 µg proteinu bylo použito 100 µg S-TEV proteázy. Byl přidán štěpící TEV pufr do celkového objemu reakce 4500 µl a byl proveden teplotní šok. Vzorek byl inkubován 1 hodinu na ledě, poté 16 hodin při 30 C a nakonec znovu 1 hodinu na ledě. Kontrola štěpení byla provedena pomocí 15% SDS PAGE. 47

48 3.5 Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Exprese fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP6 Přístroje: Třepačka Multitron Standard (Bio Trade s.r.o.) Materiál: TB médium (na 1 l): 900 ml ddh 2 O, 12 g trypton, 24 g kvasniční výtažek, 4 ml glycerol K-fosfátový pufr (na 1 l): 23.1 g KH 3 PO 4 a 125 g K 2 HPO 4 ; ph % glukóza Antibiotikum: kanamycin (zásobní koncentrace 50 mg/ml) bakteriální konzerva: AHP6::pETM60-Ub3 v buňkách BL21(DE)3pLysS 1 M IPTG Postup: Na základě výsledků optimalizace exprese byly vybrány nejvhodnější podmínky pro přípravu proteinu pro purifikaci. K 900 ml TB média bylo přidáno 100 ml K-fosfátu, 25 ml 40 % glukózy a 1 ml sterilního kanamycinu (50 mg/ml). Poté bylo růstové médium inokulováno 70 µl expresního štoku. Růst probíhal 3 hodiny při teplotě 37 C a 200 otáčkách. Po dosažení OD byla zahájena indukce exprese přídavkem 0.5 mm IPTG. Exprese probíhala 3 hodiny při teplotě 22 C a 200 otáčkách za minutu. Po ukončení indukce byla kultura 20 minut centrifugována při 3220g a 4 C. Supernatant byl odebrán a pelet použit pro purifikaci Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP6 Přístroje: Sonikátor Ultrasonic Liquid Proccesor (Misonix) Ultracentrifuga Avanti J-30I (Beckamn) FPLC ÄKTA s automatickým sběračem frakcí Frac-950 (GE Healthcare) Kolony: HisTRAP (GE Healthcare), ResourceQ (GE Healthcare), HiLoad 16/60 Superdex75 prep grade (GE Healthcare) 48

49 Materiál: Sonikační pufr: 50 mm Tris ph 7.9, 300 mm NaCl, 10 % glycerol, 0.1 % Triton X- 100, 20 mm imidazol, 3.5 mm merkaptoethanol Ekvilibrační pufr (A) pro metalochelatační afinitní chromatografii: 50 mm Tris o ph 7.9, 300 mm NaCl, 10% glycerol, 3.5 mm merkaptoetanol, 20 mm imidazol Eluční pufr (B) pro metalochelatační afinitní chromatografii: 50 mm Tris o ph 7.9, 300 mm NaCl, 10 % glycerol, 3.5 mm merkaptoethanol, 500 mm imidazol Ekvilibrační pufr pro iontoměničovou chromatografii: 50 mm Tris ph 7.9, 5 mm DTT Eluční pufr pro iontoměničovou chromatografii: 50 mm Tris ph 7.9, 2 M NaCl, 5 mm DTT Pufr pro gelovou permeační chromatografii: 50 mm Tris 7.9, 200 mm NaCl, 5mM DTT Postup: Pelet z 1 l kultury byl rozsuspendován ve 30 ml sonikačního pufru a sonikován ultrazvukovými pulzy o výkonu 40 W po dobu 6 x 1 minutu za stálého chlazení ledem. Poté probíhala 30 minut centrifugace při g a teplotě 4 C. Supernatant byl odebrán a použit pro další purifikační kroky. Nejprve byla provedena metalochelatační afinitní purifikace na FPLC. Pro tento krok byla použita 5 ml kolona HisTrap a metoda jednoduchého lineárního gradientu. Supernatant byl před aplikací na kolonu přečištěn přes filtr s póry o velikosti 0,2 µm. Matrice v kolonce byla nejdříve ekvilibrována pufrem ekvilibračním (A). Poté proběhlo dávkování vzorku na kolonu. Po navázání proteinu byly nenavázané proteiny vymyty ekvilibračním pufrem A. Následně byl pomocí lineárního gradientu od 20 (pufr A) do 500 mm imidazolu (pufr B) eluován navázaný fúzní protein AHP4. Kontrola čistoty jednotlivých frakcí z purifikace proběhla pomocí 15 % SDS PAGE (viz. kapitola 3.1.2) a frakce obsahující protein byly zahuštěny na ultrafiltrační koloně s cut off 10 kda, při otáčkách g a teplotě 4 C. Dalším krokem byla purifikace na iontoměničové koloně, pro kterou byla použita anexová kolona ResourceQ a metoda využívající lineární gradient soli. Opět byla provedena kontrola čistoty jednotlivých frakcí z purifikace a frakce obsahující 49

50 protein byly zahuštěny na ultrafiltrační koloně s cut off 10 kda, při otáčkách g a teplotě 4 C. Byla ověřena čistota zahuštěného proteinu. Pro dosažení vyšší čistoty byl protein dále purifikován za využití gelové permeační chromatografie. Pro tento krok byla použita kolona plněná matricí HiLoad 16/60 Superdex75 a izokratická eluce. Proběhla kontrola jednotlivých frakcí z purifikace a frakce obsahující protein byly zahuštěny na ultrafiltrační koloně s cut off 10 kda, při otáčkách g a teplotě 4 C Štepení fúzního proeinu Ub3-His 6 -AHP6 pomocí S-TEV proteázy Přístroje: Termoblok Techne Dri-Block DB 20 Materiál: 10x S-TEV pufr: 500 mm Tris o ph 7.9, 1 M NaCl, 10 mm DTT, 5 mm EDTA S-TEV proteáza o koncentraci 1 mg/ml (připravena na našem pracovišti MCGPR CEITEC MU) Ub3-His 6 -AHP6 o koncentraci 6.08 mg/ml 0.4 % DDM Postup: Stejně jako pro protein Ub3-His 6 -AHP4 bylo i pro protein Ub3-His 6 -AHP6 optimalizováno množství S-TEV proteázy potřebné ke štěpení proteinu. Byly testovány dvě podmínky. V prvním případě (varianta A) byl použit poměr proteinu ku S-TEV proteáze 10:1. Vzorky byly připraveny tak, že k 20 µg proteinu byly přidány 3 µl 10x koncentrovaného S-TEV pufru, 2 µg S-TEV proteázy a vše bylo doplněno vodou do celkového objemu 30 µl. V druhém případě (varianta B) byl použit poměr proteinu ku S-TEV proteáze 2:1. Ke štěpení bylo použito 20 µg proteinu, 10 µg S-TEV proteázy, 3 µl 10x koncentrovaného S-TEV pufru a vše bylo doplněno vodou do celkového objemu 30 µl. Každý vzorek byl inkubován za využití teplotního šoku (tzn. že první hodinu byl vzorek ponechán na ledě, poté byl 16 hodin inkubován na laboratorní teplotě a nakonec opět jednu hodinu na ledě), při pokojové teplotě po dobu 18 hodin a při 17 C po dobu 18 hodin. Inkubace probíhaly za stálého míchání v termobloku. Ke každé variantě byly vždy připraveny dvě kontroly, které neobsahovaly S-TEV proteázu (místo 50

51 ní byl objem doplněn ddh 2 0). Jedna kontrola byla okamžitě zamražena na -20 C a druhá byla inkubována při stejných teplotách jako jednotlivé vzorky. Stupeň štěpení byl sledován pomocí 15% SDS PAGE. Dále byl testován vliv aditiva DDM (dodecylmaltozidu) na účinnost štěpení proteinu Ub3-His 6 -AHP6. Pro štěpení byl zvolen poměr proteinu ku S-TEV proteáze 2:1, tzn. že ke štěpení 20 µg proteinu bylo použito 10 µg S-TEV proteázy. Inkubace vzorků probíhala 18 hodin při teplotě 17 C, za stálého míchání v termobloku. Vzorek č. 1 byl připraven stejným způsobem jako v předchozím případě, bez přídavku DDM. K 3.3 µl proteinu byly přidány 3µl 10x TEV pufru, 10 µl S-TEV proteázy a 13.7 µl ddh 2 O. Vzorek č. 2 obsahoval přídavek 0.1% DDM, tzn. že k 3.3 µl proteinu byly přidány 3 µl 10x TEV pufru, 10 µl S-TEV proteázy a 7.25 µl 0.4% DDM. Směs byla doplněna ddh 2 O do celkového objemu 30 µl. Vzorek č. 3 obsahoval přídavek 0.01% DDM, tzn. že k 3.3 µl proteinu byly přidány 3 µl 10x TEV pufru, 10 µl S-TEV proteázy a 0.73 µl 0.4% DDM. Směs byla opět doplněna ddh 2 O do celkového objemu 30 µl. Ke každému vzorku byla také připravena kontrola bez S-TEV proteázy, která byla nahrazena ddh 2 O. Kontrola štěpení byla provedena pomocí 15% SDS PAGE. 3.6 Příprava PROTEINOVÝCH EXTRAKTŮ ze suspenzní buněčné kultury A. thaliana Přístroje: Centrifuga 5810R Materiál: Lyzační pufr o pracovní koncentraci 50 mm Tris-Cl o ph 7.5, 150 mm NaCl, 0.5mM EDTA, 0.5% Nonidet P40, 1mM PMSF, inhibitory proteáz (10 µg/ml leupeptin, 10 µg/ml aprotinin, 10 µg/ml SBTI, 5 µg/ml pepstatin, 5 µg/ml chymostatin, 1 µg/ml E64) Suspenzní kultury A. thaliana exprimující fúzní proteiny AHP: AHP1 -GFP, AHP2 -GFP, AHP3 -GFP, AHP4 -GFP, AHP5 -GFP, AHP6 -GFP (dar od Bc. Martiny Válkové, MCGPR CEITEC MU) 51

52 Kapalný dusík Postup: Zmrazené buňky byly pomocí třecí misky a tloučku nadrceny na jemný prášek, a to za stálého chlazení nástrojů i materiálu kapalným dusíkem, aby bylo zabráněno rozmrznutí buněk. Pomocí špachtličky bylo 0.5 g nadrcených buněk přeneseno do vychlazené ependorfky o objemu 2 ml a ependorfka byla postavena na led. K buňkám bylo přidáno 400 µl lyzačního pufru, k buňkám s obsahem AHP4-GFP bylo přidáno 500 µl tohoto pufru. Po promíchání byl roztok inkubován 30 minut na ledu, během kterých byl několikrát obsah ependorfky promíchán. Nakonec byla směs 10 minut stáčena při g a 4 C. Supernatant byl odpipetován do nové ependorfky, byla v něm změřena koncentrace proteinů (viz. kapitola 3.1.1) a použit na následné testovaní monoklonálních protilátek. 3.7 Testování monoklonálních protilátek namířených proti AHP4 a AHP6 pomocí western blotingu Přístroje: Zdroj napětí PowePac Basic (Bio-Rad) Aparatura pro mokrý westernový přenos (Bio-Rad) Termoblok Techne Dri-Block DB 20 Materiál: 4x SDS nanášecí pufr: 200 mm Tris-HCl ph 6.8, 400 mm DTT, 8 % SDS, 0.4 % bromfenolová modř, 35 % glycerol Protilátky: anti - Green Fluorescent Protein (GFP), mouse IgG κ monoclonal antibody (Roche), ředění 1:500 anti Mouse IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou (Sigma), ředění 1:10000 anti AHP4/B1, D2, E8, G4 a H3, ředění 1:500, 1:5000 (připraveny na našem pracovišti MCGPR ve spolupráci s VÚVEL Brno) anti AHP6/H4, H2, F6 a G5, ředění 1:500, 1:5000 (připraveny na našem pracovišti 52

53 MCGPR ve spolupráci s VÚVEL Brno) Lyzáty: 1. lyzát ze suspenzní buněčné kultury Arabidopsis thaliana exprimující fúzní proteiny AHP1-6-GFP 2. Bakteriální (E.coli) lyzát exprimující fúzní proteiny His 6 -AHP (dar od Bc. Martiny Válkové, MCGPR CEITEC MU) 3. Kvasinkový (Sac. cerevisiae) lyzát exprimující fúzní proteiny AD:HA- tag:ahp (dar od Mgr. Matěje Zábradyho, MCGPR CEITEC MU) V rámci diplomové práce byly v lyzátu ze suspenzní kultury A. thaliana, bakteriálním lyzátu a kvasinkovém lyzátu testovány monoklonální protilátky (MAb) proti proteinům AHP4 a AHP6. Proti proteinu AHP4 byly testovány MAb B1, D2, E8, G4 a H3, proti proteinu AHP6 byly testovány H4, H2, F6 a G5. Protilátky byly připraveny na našem pracovišti (MCGPR CEITEC MU) ve spolupráci s VÚVEL Brno Optimalizace množství proteinového extraktu ze suspenzní kultury Arabidopsis nanášených na gel V první fázi bylo optimalizováno množství proteinového extraktu ze suspenzní kultury A. thaliana, které bylo používáno pro další testování. Ke vzorkům byl přidán 4x SDS nanášecí pufr a následujících 10 minut probíhala denaturace v termobloku při 95 C. Po denaturaci byly vzorky naneseny do jamek 15% polyakrylamidového gelu a proběhla elektroforéza (viz. kapitola 3.1.2). Gel byl vyjmut z aparatury a použit pro mokrý westernový přenos. Byla připravena membrána PVDF, filtrační papíry Whatman i gel stejným způsobem, jako u polosuchého westernového přenosu (viz. kapitola 3.1.3). Poté byl poskládán sendvič v pořadí od katody k anodě: 2 filtrační papíry, gel, membrána a znovu 2 filtrační papíry. Sendvič byl vložen do aparatury pro mokrý westernový přenos, poté byl zapojen zdroj napětí a nastaven proud 100 V. Přenos probíhal 1.5 hodiny. Po dokončení přenosu proběhla imunodetekce stejným způsobem, jako tomu bylo u polosuchého westernového přenosu (viz. kapitola 3.1.3). Byla použita primární protilátka anti - Green Fluorescent Protein, mouse IgG κ monoclonal antipody (ředění 53

54 1:500) a sekundární protilátka anti Mouse IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou (ředění 1:10 000). K vyhodnocení výsledků byl použit program Quantity One od firmy Bio-Rad. Stejným způsobem bylo optimalizováno i množství proteinů v kvasinkovém a bakteriálním proteinovém extraktu Testování specifity protilátek Optimalizované množství jednotlivých vzorků proteinových extraktů z A.thaliana, E.coli a kvasinek Sac. cerevisiae bylo naneseno do jamek 15% SDS polyakrylamidového gelu. Proběhla elektroforéza, gely byly vyjmuty z aparatury a použity pro mokrý westernový přenos, který trval 1.5 hodiny při procházejícím elektrickém napětí 100 V. Poté byla provedena imunodetekce popsaná v kapitole 3.1.3, s rozdílem, že jako primární protilátky byly použity anti AHP4 B1, D2, E8, G4 a H3 a anti AHP6 H4, H2, F6 a G5. Ředění protilátek pro detekci v lyzátech ze suspenzní kultury A. thaliana bylo 1:500, ředění na detekci proteinů z bakteriálního lyzátu a kvasinek bylo 1:5000. Jako sekundární protilátka byla použita anti Mouse IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou, ředěná v poměru 1:

55 4 Výsledky 4.1 Optimalizace exprese proteinu AHP4 Pro expresi byl použit kmen E. coli BL21(DE3)pLysS, který umožňuje expresi genu pod T7 promotorem. Tento kmen je výhodný pro použití díky nízké hladině bazální exprese z T7 promotoru, která je způsobena přítomností inhibitoru T7 polymerázy (T7 lysozymu). Další výhodou je využití efektivní indukce pomocí IPTG (T7 lac protomotor). Protože se v naší laboratoři doposud nepodařilo připravit protein AHP4 v dostatečném množství v rozpustné formě, byl pro expresi použit konstrukt petm60-ub3::ahp, protein AHP4 se tak exprimuje ve fúzi s ubikvitinovou sekvencí Ub3 umístěnou na N - konci proteinu. Kotva Ub3 by měla zvyšovat expresi proteinů v rozpustné formě. Byly testovány tři kombinace teplotních podmínek růstu expresních buněk a indukce exprese: 22 C/22 C, 37 C/28 C a 37 C/22 C. Současně byla testována exprese proteinu ve dvou různých médiích, v LB médiu a TB médiu. Po expresi a následném lyzování buněk byly připraveny vzorky ze supernatantu (rozpustné proteiny) a peletu (nerozpustné proteiny). Taktéž byly ke každé podmínce připraveny stejným způsobem vzorky, u nichž nebyla exprese proteinu indukována pomocí IPTG. Na 15% polyakrylamidový gel s obsahem SDS bylo naneseno 20 µg proteinů ze supernatantu a stejný objem vzorku z peletu. Po skončení elektroforézy byl proveden western blotting a specifická detekce proteinů na blotovací membráně pomocí série dvou protilátek (obr. č. 14). Obsah proteinu v rozpustné a nerozpustné formě byl kvantifikován pomocí programu Quantity One. Výrazně vyšší procentuální zastoupení proteinu při všech testovaných teplotních podmínkách bylo v nerozpustné formě. Podíl nerozpustné formy se pohyboval od 72 do 93 %. (tab. č. 1). V bohatším TB médiu se protein exprimoval o něco lépe v rozpustné formě než v LB médiu u kombinací teplot 37/22 C a 22/22 C. U kombinace teplot 37/28 C byl zaznamenán pouze velmi malý rozdíl v expresi proteinu v LB a TB médiu. Celkově nejvyšší podíl exprese proteinu v rozpustné formě (28,4 %) a tedy nejnižší podíl exprese v nerozpustné formě (71,6 %) byl při kombinaci teplot 22/22 C v TB médiu. Nejnižší podíl exprese proteinu v rozpustné formě (7,8 %) a tedy nejvyšší podíl exprese proteinu v nerozpustné formě 55

56 (92,2 %) byl v TB médiu při teplotách 37 C pro růst a 28 C pro indukci exprese. Na základě těchto výsledků bylo rozhodnuto, že se protein bude exprimovat v TB médiu, při kombinaci teplot 37/28 C. Purifikace proteinu Ub3-His 6 -AHP4 pak bude provedena z nerozpustné formy. Obr. 14 Detekce rozpustné a nerozpustné formy proteinu Ub3-His 6 -AHP4, exprimovaného v LB médiu a TB médiu a za různých teplotních podmínek pro růst expresních buněk a indukci exprese, konkrétně 22 C/22 C, 37 C/28 C a 37 C/22 C. Detekce proteinu byla provedena po separaci buněčných extraktů na 15 % polyakrylamidovém gelu s obsahem SDS a westernovém přenosu pomocí protilátky anti poly His (ředění 1:10 000). Plusy značí indukovanou expresi pomocí IPTG a mínusy neindukovanou expresi (tj., bez přídavku IPTG na indukci exprese). 56

57 Tab. 1 Procentuální zastoupení rozpustné a nerozpustné formy proteinu Ub3-His 6 -AHP4, při různých teplotních podmínkách, v různém médiu, vyhodnocené v programu Quantity One. Teplotní podmínky růst/ exprese * C+ Médium Procentuální zastoupení proteinu v rozpustné formě Procentuální zastoupení proteinu v nerozpustné formě 22/22 LB 12.1 % 87.9 % TB 28.4 % 71.6 % 37/28 LB 12.9 % 87.1 % TB 7.8 % 92.9 % 37/22 LB 15.2 % 84.8 % TB 21.2 % 78.8 % 57

58 4.2 Optimalizace exprese proteinu AHP6 Pro expresi proteinu AHP6 byl použit stejný kmen jako pro expresi proteinu AHP4, kmen E. coli BL21(DE3)pLysS. Byly testovány dva konstrukty: petm60-ub2::ahp6 a petm60-ub3::ahp6. Jediný rozdíl mezi kotvami Ub2 a Ub3 je v tom, že u proteinů fúzovaných s Ub3 je optimalizovaná sekvence pro štěpení S-TEV proteasou a dochází tak méně k nespecifickému štěpení v porovnání s Ub2. Obrázek 15 ukazuje expresi proteinu v konstruktu petm60-ub2::ahp6 a obrázek 16 v konstruktu petm60- Ub3::AHP6. Stejně jako v předchozím experimentu byly i zde testovány tři kombinace teplotních podmínek růstu expresních buněk a indukce exprese: 22 C/22 C, 37 C/28 C a 37 C/22 C. Současně také byla testována exprese proteinu v LB médiu a TB médiu. Obsah proteinu v rozpustné a nerozpustné formě byl opět kvantifikován v programu Quantity One. Výsledky kvantifikace jsou uvedeny v tabulce 2 pro experimenty s kotvou Ub2 a v tabulce 3 pro experimenty s kotvou Ub3. Za použití obou ubiquitinů byla prokázána při teplotních podmínkách 37 C/28 C vyšší exprese proteinu v nerozpustné formě. Současně byla potvrzena vysoká exprese proteinu v LB i TB médiu v rozpustné formě při teplotních podmínkách 22 C/22 C a 37 C/22 C, exprese činila mezi 66% až 95%. V případě použití Ub2 byla exprese v TB médiu vyšší než v LB médiu o téměř 16%. V případě, kdy byl použit konstrukt s kotvou Ub3 činil rozdíl mezi expresí rozpustné formy proteinu v LB a TB médiu pouze 1 %. Celkově nejvyšší exprese proteinu v rozpustné formě (94.1 %) a tedy nejnižší exprese v nerozpustné formě (5.9 %) byla prokázána za použití kotvy Ub3 v TB médiu, pro teplotní podmínky 37 C/22 C. Na základě těchto výsledků bylo rozhodnuto, že pro další přípravu proteinu bude použit konstrukt petm60-ub3::ahp6 a protein se bude exprimovat v TB médiu, při kombinaci teplot 37/22 C. Purifikace proteinu Ub3-His 6 -AHP6 pak bude provedena z rozpustné formy. 58

59 Obr. 15 Detekce rozpustné a nerozpustné formy proteinu Ub2-His 6 -AHP6, exprimovaného v LB médiu a TB médiu a za různých teplotních podmínek pro růst expresních buněk a indukci exprese, konkrétně 22 C/22 C, 37 C/28 C a 37 C/22 C. Detekce proteinu byla provedena po separaci buněčných extraktů na 15% polyakrylamidovém gelu s obsahem SDS a westernovém přenosu pomocí protilátky anti poly His (ředění 1:10 000). Plusy značí indukovanou expresi pomocí IPTG a mínusy neindukovanou expresi (tj., bez přídavku IPTG na indukci exprese). 59

60 Obr. 16 Detekce rozpustné a nerozpustné formy proteinu Ub3-His 6 -AHP6 exprimovaného v LB médiu a TB médiu a za různých teplotních podmínek pro růst expresních buněk a indukci exprese, konkrétně 22 C/22 C, 37 C/28 C a 37 C/22 C. Detekce proteinu byla provedena po separaci buněčných extraktů na 15 % polyakrylamidovém gelu s obsahem SDS a westernovém přenosu pomocí protilátky anti poly His (ředění 1:10 000). Plusy značí indukovanou expresi pomocí IPTG a mínusy neindukovanou expresi (tj., bez přídavku IPTG na indukci exprese). 60

61 Tab. 2 Procentuální zastoupení rozpustné a nerozpustné formy proteinu Ub2-His 6 -AHP6, při různých teplotních podmínkách, v různém médiu, vyhodnocené v programu Quantity One. Teplotní podmínky růst/ exprese * C+ Médium Procentuální zastoupení proteinu v rozpustné formě Procentuální zastoupení proteinu v nerozpustné formě 22/22 LB 74.5 % 25.5 % TB 93.3 % 6.7 % 37/28 LB 19.8 % 80.2 % TB 37.6 % 62.4 % 37/22 LB 66.4 % 33.6 % TB 82.2 % 17.8 % Tab. 3 Procentuální zastoupení rozpustné a nerozpustné formy proteinu Ub3-His 6 -AHP6, při různých teplotních podmínkách, v různém médiu, vyhodnocené v programu Quantity One. Teplotní podmínky růst/ exprese * C+ Médium Procentuální zastoupení proteinu v rozpustné formě Procentuální zastoupení proteinu v nerozpustné formě 22/22 LB 89.3 % 10.7 % TB 61.0 % 39.0 % 37/28 LB 44.7 % 55.3 % TB 37.1 % 62.9 % 37/22 LB 93.0 % 7.0 % TB 94.1 % 4.9 % 61

62 4.3 Purifikace proteinu AHP Exprese fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 Pro expresi fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 byly zvoleny podmínky vyhodnocené na základě optimalizace exprese. Pro přípravu bylo vybráno TB médium, růst probíhal při teplotě 37 C a následná exprese při teplotě 28 C Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 Na základě výsledků optimalizace exprese proteinu bylo rozhodnuto, že protein bude purifikován z nerozpustné formy. Buněčný pelet byl nejdříve postupně dvakrát (vzorky S1 a S2 na obr. 17a) rozsuspendován v nativním lyzačním pufru. Cílem bylo odstranit co nejvíce proteinů v rozpustné formě. Poté byly proteiny, které zůstaly v nerozpustné formě rozpuštěny v pufru o vysokém ph (50 mm CAPS ph ~ 13). Došlo k rozpuštění téměř všech proteinů, což bylo ověřeno analýzou peletu po rozpuštění proteinů v pufru CAPS (vzorek P1 na obr. 17a). Po vysrážení síranem amonným, byl protein rozpuštěn v pufru o nižším ph (100 mm Tris ph 8), tento výsledek je ukázán na obrázku 17 b, vzorek A. Čistota tohoto vzorku byla cca 45 %. Takto bylo získáno 7.63 mg proteinu (25 ml proteinu o koncentraci mg/ml). Pro ověření čistoty byl vzorek zakoncentrován na objem 2 ml a koncentraci 8.12 mg/ml. Ukázalo se, že čistota vzorku je podstatně nižší (obrázek 17b, vzorek B) činila pouze 11 %. 62

63 Obr. 17 Kontrola čistoty proteinu Ub3-His 6 -AHP4 na 15% polyakrylamidovém gelu s obsahem SDS. a) Kontrola frakcí z purifikace: S1 - supernatant odebraný po prvním rozpuštění v sonikačním pufru, naneseno 5 µl; S2 supernatant odebraný po druhém rozpuštění v sonikačním pufru, naneseno 10 µl; P1 pelet odebraný po pročištění vzorku v roztoku CAPS o ph 13.4 a následné centrifugaci, naneseno 20 µl. b) Kontrola čistoty proteinu: A protein o koncentraci mg/ml, naneseno 30 µl; B protein zahuštěný na koncentraci 8.12 mg/ml, naneseno 20 µg proteinu. Za účelem zvýšení čistoty byla následně provedena purifikace takto získaného vzorku Ub3-His 6 -AHP4 metalochelatační afinitní chromatografií. Protein se dobře vázal na kolonu a byl eluován gradientem imidazolu (konkrétně při koncentraci imidazolu 40 mm 100 mm), jak ukazuje chromatogram na obr. 18. Kontrola frakcí z purifikace byla provedena pomocí 15% SDS PAGE (obr. 19). Obrázek gelu na první pohled ukázal, že k dalšímu výraznému přečištění vzorku nedošlo. Naopak, čistota proteinu byla nižší, dosáhla pouze 16%. 63

64 Obr. 18 Chromatogram purifikace Ub3-His 6 -AHP4 pomocí metalochelatační afinitní chromatografie na koloně HisTrap. Protein Ub3-His 6 -AHP4 byl eluován pomocí lineárního gradientu imidazolu (zaznamenán zeleně). Frakce X1 obsahuje nenavázané proteiny, fúzní protein AHP4 je obsažen ve frakcích odpovídajících vrcholu píku Černé šipky vyznačují frakce, které byly použity pro 15% SDS PAGE. Obr % SDS PAGE po purifikaci Ub3-His 6 -AHP4 na koloně HisTrap. A1 A5 znázorňují frakce z purifikace obsahující fúzní protein. X1 je vzorek nenavázaných protein. Bylo nanášeno vždy 30 µl příslušné neupravené frakce na jamku gelu. 64

65 Aby bylo ověřeno, zda se jedná o kontaminující formy proteinu nebo o různé formy proteinu Ub3-His 6 -AHP4 byly frakce tohoto proteinu z metalochelatační afinitní chromatografie zahuštěny a poté byla ověřena čistota proteinu na 15 % polyakrylamidovém gelu s obsahem SDS. Současně byl otestován vliv redukčního (DTT) a denaturačního činidla (UREA) na chování proteinu (obr. 20). Nebyl prokázán výrazný vliv obou činidel na redukci různých multimerních forem proteinu. Čistota proteinu v přitomnosti DTT činila 21%, v přítomnosti UREA pouhých 13%. Ověření, zda se jedná o různé formy téhož proteinu, bylo provedeno také pomocí westernového polosuchého přenosu s následnou specifickou detekcí proteinu pomocí protilátek proti histidinové kotvě (obr. 21a) a proteinu AHP4 (obr. 21b). Tato analýza jasně ukázala, že kontaminace viditelná na gelech je způsobena různými formami téhož proteinu spíše než cizími proteiny. Jedná se tedy o silně mikroheterogenní vzorek. Obr. 20 Kontrola čistoty purifikovaného proteinu Ub3-His 6 -AHP4. Na 15% polyakrylamidový gel s obsahem SDS bylo naneseno 20 µg proteinu Ub3-His 6 -AHP4 na jamku, protein Ub3-His 6 -AHP4 s přídavkem DTT a protein Ub3-His 6 -AHP4 s přídavkem 4M UREY. Byl testován vliv redukčního (DTT) a denaturačního (UREA) činidla na chování proteinu. 65

66 Obr. 21 Ověření forem proteinu Ub3-His 6 -AHP4 pomocí polosuchého westernového přenosu. Bylo naneseno 20 µg proteinu Ub3-His 6 -AHP4 na jamku 15% polyakrylamidového gelu, který byl po proběhnutí elektroforézy použit pro polosuchý westernový přenos. a) K detekci proteinů na blotovací membráně byla použita primární protilátka antipolyhistidinová myšší jakožto protilátka proti histidinové kotvě (ředění 1:10 000) a sekundární protilátka anti Mouse IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou (ředění 1:10 000). b) Detekce proteinů na blotovací membráně byla provedena pomocí primární protilátky E8, jakožto protilátky proti proteinu AHP4 (ředění 1:500) a sekundární protilátky anti Mouse IgG konjugované s alkalickou fosfatázou (ředění 1:10 000) Štěpení kotvy u fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 pomocí S-TEV proteázy Byla testována řada podmínek, které by vedly k dostatečnému štěpení kotvy u fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4, které byly již dříve stanoveny pro štěpení např. proteinu AHP2. Bylo testováno množství S-TEV proteázy potřebné ke štěpení proteinu. Byl vybrán poměr proteinu ku S-TEV proteáze 10:1, který se jevil jako nejvhodnější. Použití vyššího množství S-TEV proteázy, např. poměr proteinu ku S-TEV proteáze 2:1, nepřineslo zlepšení štěpení proteinu. Dále byly v malém objemu testovány teplotní podmínky, při kterých by bylo dosaženo rozštěpení co nejvyššího množství proteinu. Byla vyzkoušena inkubace vzorku s S-TEV proteázou při teplotě 30 C a na pokojové teplotě. Dále bylo provedeno štěpení za podmínek teplotního šoku (vzorek štěpení na obr. 22). Inkubace za podmínek teplotního šoku vedla k rozštěpení malé části proteinu. Další optimalizace podmínek nepřinesla zlepšení štěpení proteinu. Na 15% polyakrylamidovém gelu s obsahem SDS byla provedena kontrola štěpení. 66

67 Obr. 22 Kontrola štěpení kotvy fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 pomocí 15% SDS PAGE. Vzorek štěpení obsahuje 20 µg proteinu. K jeho štěpení byl použit poměr proteinu ku S-TEV proteáze 10:1. Kontrola neobsahuje S-TEV proteázu. Vzorky byly inkubovány za podmínek teplotního šoku. Teoretická molekulová hmotnost fúzního proteinu je asi 25 kda, štěpeného proteinu 13 kda. Na závěr byl proveden pokus rozštěpit kotvu u fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 ve velkém objemu. Byl použit poměr proteinu ku S-TEV proteáze 20:1. Vzorek byl inkubován za podmínek teplotního šoku. Byla však rozštěpena jen malá část proteinu (vzorek štěpení na obr. 23). Kontrola štěpení byla provedena pomocí 15% SDS PAGE. Obr. 23 Kontrola štěpení kotvy fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP4 ve velkém objemu pomocí 15% SDS PAGE. Na štěpení 2000 µg proteinu bylo použito 100 µg S-TEV proteázy, vzorek štěpení. Kontrola neobsahuje S-TEV proteázu. Inkubace proběhla za podmínek teplotního šoku. Na jamku 15% polyakrylamidového gelu s obsahem SDS bylo naneseno 30 µl vzorku štěpení i vzorku kontrola. 67

68 4.4 Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP Exprese fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP6 Pro expresi fúzního proteinu AHP6 byly zvoleny podmínky vyhodnocené na základě optimalizace exprese. Pro přípravu bylo vybráno TB médium, růst probíhal při teplotě 37 C a následná exprese při teplotě 22 C Purifikace fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP6 Na základě výsledků optimalizace exprese proteinu bylo rozhodnuto, že protein bude purifikován z rozpustné formy. V první fázi byla provedena metalochelatační afinitní chromatografie, byla použita 5 ml kolona HisTrap a metoda jednoduchého lineárního gradientu imidazolu. Získaný chromatogram (obr. 24a) ukazuje, že protein AHP6 byl na koloně zachycen a eluuje se na počátku gradientu imidazolu přibližně ve 14 frakcích (obr. 24b). Kontrola těchto frakcí a analýza jejich čistoty byla provedena nanesením 30 µl vybraných frakcí na 15% SDS PAGE (obr. 25). Čistota vybraných frakcí nanesených na gel se pohybovala mezi 32% až 51%. Nejvyšší čistotu (51.2 %) vykazovala frakce C12. U frakce C10 byla vyhodnocena čistota nejnižší (32.1 %). Frakce obsahující protein Ub3-His 6 -AHP6 o čistotě vyšší než 32 % byly zahuštěny a použity pro následné přečištění na iontoměničové koloně. 68

69 Obr. 24 Purifikace Ub3-His 6 -AHP6 pomocí metalochelatační afinitní chromatografie na koloně HisTrap. a) Protein Ub3-His 6 -AHP6 byl eluován pomocí lineárního gradientu imidazolu (zaznamenán na chromatogramu zeleně). Fúzní protein je obsažen ve frakcích odpovídajících vrcholu píku. X1 obsahuje nenavázané proteiny. b) Zvětšený pík, v němž jsou označeny frakce obsahující fúzní protein. Černé šipky v chromatogramu vyznačují frakce, které byly použity pro 15% SDS PAGE. 69

70 Obr % SDS PAGE po purifikaci Ub3-His 6 -AHP6 na koloně HisTrap. Na gel bylo nanášeno 30 µl neupravených frakcí z metalochelatační purifikace. Dalším krokem byla purifikace proteinu na iontoměničové koloně. Chromatogram (obr. 26) zobrazuje průběh purifikace na anexové koloně ResourceQ. Proteiny byly eluovány pomocí lineárního gradientu NaCl. Kontrola frakcí z purifikace a analýza jejich čistoty byla provedena pomocí 15% SDS PAGE (obr. 27). Do jamek gelu byly naneseny frakce znázorněné na chromatogramu černými šipkami. Protein byl obsažen pouze v šesti frakcích, tj. B1 B6. Ve frakcích B4 a B5 se nacházel protein v největším množství a o nejvyšší čistotě. Frakce B4 obsahovala protein o čistotě % a frakce B5 o čistotě %. Čistota proteinu ve frakcích B1, B2, B3 a B6 se pohybovala mezi 20% do 31%. 70

71 Obr. 26 Purifikace Ub3-His 6 -AHP6 pomocí iontoměničové chromatografie na anexové koloně ResourceQ. Protein Ub3-His 6 -AHP6 byl eluován pomocí lineárního gradientu NaCl (zaznamenán na chromatogramu zeleně). Fúzní protein je obsažen ve frakcích odpovídajících vrcholu píku. Černé šipky vyznačují frakce, které byly použity pro 15% SDS PAGE. Obr % SDS PAGE po purifikaci Ub3-His 6 -AHP6 na anexové koloně ResourceQ. Na gel bylo nanášeno 30 µl neupravených frakcí z purifikace A4 - A6 a B1 B6. Protein byl obsažen ve frakcích B1 B6. 71

72 Na základě čistoty eluovaných vzorků byly vytvořeny dva vzorky obsahující protein Ub3-His 6 -AHP. První vzorek vznikl smícháním a zahuštěním frakcí B4 a B5 a druhý vzorek smícháním a zahuštěním frakcí B2, B3 a B6. U obou zahuštěných vzorků pak byla analyzována čistota pomocí 15% SDS PAGE (obr. 28). U prvního vzorku byla stanovena čistota Ub3-His 6 -AHP6 60 %, bylo získáno 528 µg proteinu. Druhý vzorek obsahoval menší množství proteinu Ub3-His 6 -AHP6 a více nečistot. Čistota proteinu je pouze 20 %, byl získán výtěžek 465 µg. Obr. 28 Analýza čistoty proteinu Ub3-His 6 -AHP6 pomocí 15% SDS PAGE. Na jamku gelu bylo naneseno 20 µg obou vzorků. Vzorek 1 byl vytvořen smícháním frakcí s nejvyšší čistotou, B4 a B5. Vzorek 2 vznikl smícháním frakcí B1, B2, B3 a B6. Ub3-His 6 -AHP6 (frakce B4 a B5 z iontoměničové chromatografie) byl dále purifikován pomocí gelové permeční chromatografie za účelem dosažení vyšší čistoty nutné pro další analýzy. Chromatogram (obr. 29) zobrazuje průběh izokratické eluce. Kontrola frakcí z purifikace byla provedena pomocí 15% SDS PAGE (obr. 30). Frakce A5 a A6 obsahovaly protein zájmu a byly společně zahuštěny. Bylo získáno 720 µg výsledného proteinu AHP6 o čistotě vyšší než 90 %, který byl použit pro další experimenty. 72

73 Obr. 29 Purifikace Ub3-His 6 -AHP6 pomocí gelové permeační chromatografie na koloně plněné matricí HiLoad 16/60 Superdex75. Protein Ub3-His 6 -AHP6 byl eluován pomocí izokratické eluce (na chromatogramu zaznamenána zeleně). Fúzní protein je obsažen ve frakcích odpovídajících vrcholu píku. Černé šipky vyznačují frakce, které byly použity pro 15% SDS PAGE. Obr. 30 Analýza čistoty proteinu Ub3-His 6 -AHP6 po gelové permeační chromatografii pomocí 15% SDS PAGE. Na jamku gelu bylo naneseno 30 µl neupravených frakcí z purifikace A3 A9. Protein Ub3- His 6 -AHP6 byl obsažen pouze ve frakcích A5 a A6. 73

74 4.4.3 Štepení kotvy fúzního proteinu Ub3-His 6 -AHP6 pomocí S-TEV proteázy Štěpení kotvy u proteinu Ub3-His 6 -AHP6 bylo provedeno při dvou poměrech množství proteinu a S-TEV-proteázy, konkrétně 10:1 (varianta A na obr. 31) a 2:1 (varianta B na obr. 31). U obou poměrů proteinu a S-TEV proteázy byly testovány různé teplotní podmínky, konkrétně teplotní šok (obr. 31 a), pokojová teplota (obr. 31 b) a 17 C (obr. 31 c). Nebyly zaznamenány větší rozdíly ve štěpení v rámci jednotlivých podmínek. Ve všech případech bylo rozštěpeno pouze malé množství proteinu. Obr. 31 Kontrola štěpení proteinu Ub3-His 6 -AHP6 na 15% polyakrylamidovém gelu s obsahem SDS. Pro štěpení 20 µg proteinu byly použity 2 µg S-TEV proteázy (vzorky A1, A2 a A3), nebo 10 µg S-TEV proteázy (vzorky B1, B2 a B3). Inkubace probíhala za využití teplotního šoku (a), při pokojové teplotě (b) a při 17 C (c). Modrá šipka znázorňuje fúzní protein o relativní molekulové hmotnosti 25 kda, červená šipka ukazuje štěpený protein o relativní molekulové hmotnosti kolem 14 kda. Dále byl testován vliv dvou koncentrací (0,1 a 0,4 %) aditiva dodecylmaltozidu na štěpení proteinu Ub3-His 6 -AHP6. Dodecylmaltozid byl použit jako neiontový detergent, který by neměl ovlivňovat aktivitu S-TEV proteázy a naopak by mohl snížit potenciální agregaci proteinu a zpřístupnit tak S-TEV proteázové místo pro štěpení. Pro testování vlivu DDM byl použit poměr proteinu ku S-TEV proteáze 2:1 a inkubace vzorku probíhala při teplotě 17 C. Bylo prokázáno (obr. 32), že DDM nezlepšuje štěpení fúzního proteinu. 74

75 Obr. 32 Kontrola štěpení proteinu Ub3-His 6 -AHP6 v přítomnosti dodecylmaltozidu na 15% polyakrylamidovém gelu s obsahem SDS. Pro štěpení 20 µg proteinu bylo použito 10 µg S-TEV proteázy. Vzorek AHP6 byl štěpen bez přítomnosti aditiv, k dalším dvěma vzorkům bylo přidáno 0.1 % DDM a 0.4 % DDM. Ke každému vzorku byla připravena kontrola bez přítomnosti S-TEV proteázy. Modrá šipka znázorňuje fúzní protein o relativní molekulové hmotnosti 25 kda, červená šipka ukazuje štěpený protein o relativní molekulové hmotnosti kolem 13 kda. 75

76 4.5 Testování monoklonálních protilátek namířených proti AHP4 a AHP6 pomocí western blotingu Optimalizace množství proteinového extraktu ze suspenzní kultury A. thaliana nanášeného na gel Pro testování protilátek bylo nejdříve nutné, aby bylo na gel nanášeno stejné množství všech proteinů AHP-GFP obsažených v jednotlivých proteinových extraktech získaných ze suspenzní kultury A. thaliana. Toho bylo dosaženo tak, že nejdříve bylo naneseno 50 µg každého proteinového extraktu na jamku polyakrylamidového gelu. Poté byl proveden western blotting a specifická detekce všech proteinů AHP-GFP (AHP1-AHP6) pomocí protilátky proti GFP. Získané signály pro jednotlivé proteiny AHP-GFP na blotovacích membránách byly kvantifikovány pomocí programu Quantity One a porovnány (obr. 33a). Na základě těchto výsledků bylo upraveno dávkování proteinu na gelu. Proteiny AHP1-GFP, AHP2-GFP, AHP3-GFP a AHP5-GFP ukazovaly přibližně stejný a dostatečně silný signál při nanesení 50 µg proteinu na jamku. Proteiny AHP4- GFP a AHP6-GFP reagovaly slaběji (obr. 33a), což ukazuje na jejich slabší expresi. Bylo tedy dále upraveno množství těchto proteinů tak, že bylo naneseno 100 µg a 200 µg proteinu na jamku polyakrylamidového gelu (obr. 33b). Kvantifikace signálu na blotovací membráně ukázala, že odezva proteinů AHP4-GFP a AHP6-GFP je téměř shodná pro obě množství proteinového extraktu (100 i 200 ug). Pro další experimenty bylo tedy na jamku gelu nanášeno 100 µg proteinového extraktu obsahujících AHP4- GFP a AHP6-GFP a 50 µg proteinového extraktu s obsahem AHP1-GFP, AHP2-GFP, AHP3-GFP a AHP5-GFP. Stejným způsobem byly optimalizovano i množství proteinů u bakteriálního a kvasinkového proteinového extraktu. 76

77 Obr. 33 Optimalizace množství proteinového extraktu nanášeného na gel. Na 15% polyakrylamidový gel bylo naneseno 50 µg proteinů AHP1 - AHP6 (a) a 100 a 200 µg proteinů AHP4 a AHP6 (b). Po proběhnutí elektroforézy byly gely použity pro polosuchý westernový přenos a následně byla provedena imunodetekce. Byla použita primární monoklonální protilátka anti-green Fluorescent Protein (GFP), mouse IgG (ředění 1:500) a sekundární protilátka anti Mouse IgG konjugovaná s alkalickou fosfatázou (ředění 1: ). Teoretická molekulová hmotnost proteinu v komplexu s GFP činí kolem 40 kda, volné GFP má teoretickou molekulovou hmotnost asi 25 kda Testování specifity protilátek Pomocí western blotingu byly testovány monoklonální protilátky připravené již dříve v naší laboratoři proti proteinům AHP4 a AHP6. Byla zkoumána specificita těchto protilátek v lyzátech připravených ze suspenzní kultury A.thaliana, bakterií E. coli a kvasinek Sac. cerevisiae. Všechny lyzáty obsahovaly exprimované fúzní proteiny AHP1- AHP6. Výsledky western blottingu s použitím protilátek anti AHP4 B1, D2, E8, G4, H3 a anti AHP6 H4, H2, F6, G5 jsou uvedeny na obrázcích Protilátky namířené proti AHP4 reagovaly odlišně v jednotlivých lyzátech. U protilátky B1 nebyl zaznamenán specifický signál s proteinem AHP4 a ani s dalšími proteiny AHP v extraktu z A. thaliana. Naopak byly zaznamenány nespecifické signály s rostlinnými proteiny. V bakteriálním lyzátu reaguje protilátka B1 polyspecificky se všemi proteiny AHP. V kvasinkovém lyzátu nedetekuje protilátka B1 žádné proteiny (obr. 34). Protilátka D2 detekuje nespecificky proteiny z A. thaliana a kvasinek a specificky všechny proteiny AHP v bakteriálním lyzátu (obr. 35). G4 detekuje všechny proteiny AHP polyspecificky v rostlinném a bakteriálním lyzátu. Naopak detekuje pouze AHP4 protein v kvasinkovém extraktu (obr. 36). Protilátka H3 reaguje polyspecificky se 77