Seminář 6: Diagnostika

Transkript

1 DIAGNOSTIKA AUTOIMUNITNÍCH CHOROB Seminář 6: Diagnostika autoimunitních chorob I Anamnéza plemenná predispozice, stáří (spíše zvířata středního věku), akutnost x chronicita, teplota a jiné léky (antibiotika x kortikoidy) a jejich účinnost, Klinické vyšetření temperament, výživný stav, nespecifické, trias, specifické pohybový aparát, kůže a sliznice, vnitřní orgány, klinické poruchy krevních buněk Paraklinické a laboratorní vyšetření zobrazovací metody hematologické biochemické imunologické Testy autoimunity TEST CIRKULUJÍCÍCH IMUNOKOMPLEXŮ Pomocné vyšetření testy imunologického profilu cirkulující imunokomplexy Stanovení autoprotilátek antinukleární protilátky (ANA) revmatoidní faktor (RF) protilátky proti erytrocytům (Coombs) imunohistochemie Sérum se naředí s 1:2 borátovým pufrem Předředěné sérum (150 µl) se smíchá s 1,5 ml roztoku polyetylenglykolu nebo borátového pufru Inkubace 45 min při pokojové teplotě Hodnotí se spektrofotometricky při 540 nm Vyhodnotí se proti vzorku o známé koncentraci Interpretace: Cirkulující imunokomplexy jsou zvýšené (nad 70) při hypersenzitivních reakcích III. Typu (včetně autoimunitních chorob), ale i při chronických zánětech Uveďte stručnou charakteristiku choroby Systémový lupus erythematosus Jakým laboratorním testem se potvrzuje? DIAGNOSTICKÁ KRITERIA SLE HLAVNÍ KRITERIA artritida glomerulonefritida polyomyositida dermatitida (symetrické léze, depigmentace) anémie trombocytopenie neutropenie VEDLEJŠÍ KRITERIA horečka neovlivnitelná antibiotiky, ale kortikoidy lymfadenopatie, splenomegalie pleuritida perikarditida nervové LABORATORNÍ PRŮKAZ ANA test Definitivní diagnóza = 3 hlavní kriteria + ANA test min. 1:100

2 TEST ANTINUKLEÁRNÍCH PROTILÁTEK substrát Rat Liver Liver,, příp. HEp2 (Binding Site) Imunofluorescence v ANA testu zrnitá homogenní séra vyředěná PBS 1:40, 1:100 a více inkubace 30 min. při 25 oc ve vlhké komůrce opláchnutí a promytí PBS konjugát anti Dog Ig/FITC (Binding Site) inkubace 30 min. při 25 oc ve vlhké komůrce opláchnutí a promytí PBS zamontování pod krycí sklo s 80% glycerolem fluorescenční mikroskop NIKON při 480 nm Imunofluorescence v ANA testu mitochondriální VÝSLEDKY VYŠETŘENÍ ANA PROTILÁTEK Celkem vyšetřeno negativní Homogenní, zrnitá, membránová 43 %, Pozitivní s dohledanými údaji 54 Systémový lupus je provázen pozitivním ANA testem s vyšším titrem (1:300 a více) U většiny případů SLE je jedním z klinických příznaků neerozivní artritida Pozittivní ANA test do 1:100 je (asi v 15 %) i u jiných autoimunitních chorob (revmatoidní artritida, polymyositida) Pozitivní ANA test do 1:100 je (asi v 10 %) i u chorob jiné etiologie (chronická zánětlivá onemocnění, pneumonie, epilepsie) 8,3 % 55 %, Pravděpodobně ne autoimunitní 5 9,2 % Pravděpodobně jiná autoimunita 9 16,7 % Pravděpodobná diagnóza SLE DIAGNOSTICKÝ VÝZNAM ANA PROTILÁTEK ZÁVĚRY 1143 sér (cca 200 ročně) Z toho pozitivních (titr 1:100 a více) ,4 % Definitivní diagnóza SLE 5 16,7 % Celkově ze všech vzorků 16 2,1 % Diskoidní lupus erythematosus 2%

3 Jaká je charakteristika imunitních artritid a jak se odlišují od ostatních artropatií? Jaké laboratorní testy se používají k diagnostice imunitních artritid? ROZDĚLENÍ ARTROPATIÍ nezánětlivé degenerativní, traumatické, neoplastické zánětlivé infekční neinfekční imunitně prostředkované IMUNITNÍ ARTRITIDA ZÁKLADNÍ CHARAKTERISTIKA IMUNITNÍCH ARTRITID Symetrická polyartritida Chronické zánětlivé změny Počet buněk v kloubu 8 50 tis /µl Menší množství výpotku Mikrobiologicky negativní DD: leishmanióza, borelióza, erlichióza Reaguje příznivě na kortikoidy IMUNITNĚ ZPROSTŘEDKOVANÉ ARTRITIDY typ artritidy onemocnění autoprotilátky erozivní revmatoidní artritida ANA - RF + polyartritida greyhoundů ANA - RF - neerozivní idiopatická polyartritida ANA - RF - polyartritis / polymyositis polyartritis / meningitis SLE ANA + RF - ± erozivní Sjögrenův syndrom ANA ± RF - DIAGNOSTICKÁ KRITERIA RA Strnulost po odpočinku Bolestivost a citlivost na tlak přinejmenším v jednom kloubu Otok alespoň jednoho kloubu Otok nejméně jednoho dalšího kloubu v průběhu 3 měsíců Symetrický otok kloubů Podkožní uzlíky nad výstupky kostí Destruktivní změny typické pro revmatoidní artritidu Pozitivní aglutinační test séra na revmatoidní faktor Špatná precipitace mucinu ze synoviální tekutiny Charakteristické histologické změny v synoviální membráně Charakteristické histologické změny v podkožních uzlících

4 TESTY NA STANOVENÍ RF Rose-Waalerův aglutinační test Latex-fixační test Turbidimetrie / Nefelometrie ELISA TESTY NA STANOVENÍ RF Rose-Waalerův aglutinační test / Latex-fixační test aglutinační sérologické metody Erytrocyty / latexové částice se senzibilizují anti-ig protilátkami daného druhu Částice reagují ve zkumavce / na plotně s vyšetřovaným sérem V pozitivním případě vzniká aglutinace Detekuje RF-IgM Turbidimetrie / Nefelometrie precipitační sérologické metody po smíchání IgG s vyšetřovaným sérem vzniká imunoprecipitát množství imunoprecipitátu je přímo úměrné koncentraci RF turbidimetrie spektrofotometricky stanovuje úbytek světla prošlého prostředím s imunoprecipitátem nefelometrie hodnotí rozptyl paprsků procházejících prostředím s imunoprecipitátem detekují RF-IgM ELISA NA STANOVENÍ RF-IgM Na mikrotitrační desku Nunc MaxiSorp se naváže D IgG (psí IgG) Inkubace 1 h při 37 C a přes noc při 4 C, destička 3x promyta v promývacím roztoku Přidá se vyšetřované sérum a pozitivní a negativní kontroly ředěné 100x, 1 000x a x Inkubace 1 h při 37 C, destička 3 x promyta v promývacím roztoku Převrství se protilátkami proti psímu IgM konjugovanými s enzymem (kozí protilátka proti psímu IgM značená křenovou peroxidázou) ředěná x inkubace 1 h při 37 C a 1 h při 4 C, 3 x promytí Reaguje se substrátem (H 2 O 2 ) s chromogenem Výsledkem je barevná reakce hodnotí se za 15 min jako absorbance při 450 nm IZOTYPY RF izotypy RF-IgM, RF-IgA, RF-IgG RF-IgM se vyskytuje v humánním i v psím séru v nejvyšším množství; hraje významnou roli v patogenezi RA; jeho titr narůstá u psů s RA i s OA RF-IgA má v raných fázích RA u lidí i psů vyšší diagnostický a prognostický význam; u psů jeho titr roste hlavně u RA RF-IgG u lidí klesá titr s věkem, význam v patogenezi RA u lidí a u psů stále diskutabilní; technicky nejobtížnější stanovení ze všech izotypů RF REVMATOIDNÍ FAKTOR U RŮZNÝCH SKUPIN ONEMOCNĚNÍ I. Ortopedičtí ANA+ 55,6 ± 22,4 II. III. IV. Ortopedičtí ANA - 52,1 ± 27,3 Chronický zánět 44,6 ± 19,0 Zdraví 35,3 ± 23,2 PACIENT 1260 retrívr fena stáří 5 let dlouhodobé pohybové problémy, občasné průjmy Mírně zvýšená teplota Pohybové potíže, výrazný otok a bolestivost 3 kloubů Při pohmatu citlivé, bolestivé břicho ANA test 1:1000 +, homogenní imunofluorescence

5 PACIENT 1260 retrívr fena stáří 5 let dlouhodobé pohybové problémy, občasné průjmy Mírně zvýšená teplota Pohybové potíže, výrazný otok a bolestivost 3 kloubů Při pohmatu citlivé, bolestivé břicho ANA test 1:1000 +, homogenní imunofluorescence Idiopatická artritida III. typu? PACIENT 2120 Chronické objevující se opakovaně dalmatin fena stáří 5 let Kulhání, otoky a bolestivost 4 kloubů Svalová bolestivost, polymyositida? ANA test 1:40+, 1:100 -, RF - PACIENT 2120 Chronické objevující se opakovaně dalmatin fena stáří 5 let Kulhání, otoky a bolestivost 4 kloubů Svalová bolestivost, polymyositida? ANA test 1:40+, 1:100 -, RF - Polyartritida / polymyositida? PACIENT 2060 N.O fena stáří 7 let problémy přetrvávající min. 1/2 roku Kulhání postižení cca 5 proximálních kloubů polymyositida kožní eflorescence megaesophagus ANA test 1:1000 +, homogenní imunofluorescence, RF - PACIENT 2060 N.O fena stáří 7 let problémy přetrvávající min. 1/2 roku Kulhání postižení cca 5 proximálních kloubů polymyositida kožní eflorescence megaesophagus ANA test 1:1000 +, homogenní imunofluorescence, RF - Systémový lupus erythematosus PACIENT 2082 kříženec pes stáří 3 roky Pohybové problémy, celkové, onemocnění probíhá cca 14 dní Výrazná horečka Otoky a bolestivost více (6-7) kloubů ANA test -, RF +

6 PACIENT 2082 kříženec pes stáří 3 roky PACIENT 4462 pudl, fena, stáří 5 let Pohybové problémy, celkové, onemocnění probíhá cca 14 dní Výrazná horečka Otoky a bolestivost více (6-7) kloubů Mikrobiologické vyšetření? ANA test -, RF + Septická artritida? přetrvávající pohybové problémy bez horečky artritida distálních kloubů bolestivá flexe problémy zejména po době klidu, během pohybu se zlepšuje bez dalších klinických příznaků a změn krevního obrazu erozivní artritida imunologie ANA test 1:100 slabě +, zrnitá imunofluorescence, RF + DIAGNÓZA: PACIENT 4462 přetrvávající pohybové problémy pudl, fena, stáří 5 let bez horečky artritida distálních kloubů bolestivá flexe problémy zejména po době klidu, během pohybu se zlepšuje bez dalších klinických příznaků a změn krevního obrazu erozivní artritida imunologie ANA test 1:100 slabě +, zrnitá imunofluorescence, RF + DIAGNÓZA: Revmatoidní artritida TERAPIE SLE kortikosteroidy - imunosupresivní a protizánětlivé účinky prednison (začít 2-5 mg/kg, jedenkrát denně, pak 2-4 mg/kg ob den cca 2 měsíce, pak přerušit) dexametason (0,1-0,3 mg/kg, jednorázově až 1 mg/kg) jiná imunosupresiva azathioprin (50 mg/m 2 ) cyklofosfamid ( mg/m 2 jedna dávka, 50 mg/m 2 ob den) imunostimulační látky levamisol (3-7 mg/kg /max.140 mg/ ob den po 4 měsíce