Přednáška pro mediky 2. LF UK Motol STAFYLOKOKY. Petr Petráš, NRL pro stafylokoky SZÚ - CEM

Transkript

1 Přednáška pro mediky 2. LF UK Motol STAFYLOKOKY Petr Petráš, NRL pro stafylokoky SZÚ - CEM 1

2 OSNOVA PŘEDNÁŠKY 1. Historie stafylokokologie 2. Laboratorní diagnostika stafylokokových infekcí v NRL pro stafylokoky v CEM - SZÚ 3. Kmeny MRSA 4. Stafylokoky koaguláza-negativní 5. MALDI-TOF MS v identifikaci stafylokoků 2

3 STAFYLOKOKY jsou gram-pozitivní, kataláza-pozitivní koky v preparátu tvoří hrozníčkovité klastry Na Petriho misce s krevním agarem Preparát ve světelném mikroskopu 3

4 STAFYLOKOKY v elektronovém mikroskopu Ø 0,5-1,5 um nepohyblivé netvoří spóry preferují aerobní atmosféru fakultativně anaerobní (výjimkou jsou S.saccharolyticus a S. aureus subsp. anaerobius, které rostou mnohem lépe anaerobně. 4

5 Současná "velká" taxonomie TAXONOMIC OUTLINE OF THE PROKARYOTES Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edition May 2004) Nadříše: Prokaryotní Říše: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Bacillales Čeleď: Staphylococcaceae Rod: Staphylococcus Druh: Staphylococcus aureus Poddruh: Staphylococcus aureus subsp. aureus

6 HISTORIE LÉKAŘSKÉ MIKROBIOLOGIE Zakladatelem mikrobiologie jako vědního oboru je Louis Pasteur ( ) Francouzský přírodovědec, profesor chemie na univerzitě ve Štrasburku (stereochemie). Objevy např.: Kvašení jako projev mikrobů Dokázal, že infekce jsou způsobeny mikroorganismy Vakcina proti vzteklině Pasterizace 6

7 1. HISTORIE STAFYLOKOKOLOGIE souvislost mezi kokovitými bakterie a hnisem Louis Pasteur a skotský chirurg Sir Alexander Ogston ( ) Ogston: STAPHYLOCOCCUS [řecky staphulê = hrozny] Rosenbach Staphylococcus aureus 7

8 HISTORIE RODU STAPHYLOCOCCUS souvislost mezi kokovitými bakterie a hnisem - OGSTON (skotský chirurg) a PASTEUR STAPHYLOCOCCUS - OGSTON Staphylococcus aureus - ROSENBACH druhý popsaný stafylokok : Staphylococcus epidermidis albus - Welch Staphylococcus epidermidis - Evans 8

9 HISTORIE RODU STAPHYLOCOCCUS dualita S. aureus (KPS) x S. epidermidis (KNS) podle produkce enzymu KOAGULÁZA Staphylococcus saprophyticus - KNS původce infekcí močových cest vyd. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology 3 druhy stafylokoků 9

10 HISTORIE RODU STAPHYLOCOCCUS 1975 v časopise International Journal of Systematic Bacteriology vyšly dvě publikace: SCHLEIFER (Mnichov), KLOOS (NC, USA) 1. 3 nové druhy : S.cohnii S.haemolyticus S.xylosus 2. 4 nové druhy : S.warneri S.capitis S.hominis S.simulans 10

11 HISTORIE RODU STAPHYLOCOCCUS druhý koagulázapozitivní (KPS) stafylokok : S.intermedius HÁJEK (LFUP Olomouc) ed Bergey s Manual of Systematic Bacteriology (Vol.2).. 19 druhů stafylokoků (včetně 3 poddruhů) 11

12 HISTORIE RODU STAPHYLOCOCCUS vyd. Manual of Clinical Microbiology SOUČASNOST 40 stafylokoků 2019 (III.) stafylokoků validně popsaných 1976 byl popsán S. caseolyticus - v r > Macrococcus caseolyticus 1994 : S. pulvereri = S. vitulinus 12

13 Počty nově popsaných taxonů rodu Staphylococcus do března počet taxonů počet kumulativně kumulativně

14 V SOUČASNOSTI je v rodu 64 stafylokoků. 12 stafylokoků je koagulázapozitivních Kromě kmenů S. aureus subsp. aureus se mohou vyskytnout v humánním klinickém materiálu Staphylococcus intermedius Staphylococcus pseudintermedius Nejčastější záchyt je v ráně po kousnutí psem. S. argenteus (2015) S. cornubiensis (2018) 14

15 DALŠÍ KOAGULÁZAPOZITIVNÍ STAFYLOKOKY SE VYSKYTUJÍ VE VETERINÁRNÍM MATERIÁLU : S. hyicus (var. KOA) prase S. aureus subsp. anaerobius ovce S. delphini delfín S. schleiferi subsp. coagulans pes S. lutrae vydra říční S. agnetis (var. KOA) kráva S. schweitzeri (2015) opice 15

16 VÝSKYT stafylokoků Stafylokoky jsou naprosto UBIKVITERNÍ v přírodě. Nejčastěji na pokožce nebo sliznicích člověka, ale i dalších savců a ptáků. Typické jsou např. 3 druhy u psů : S. intermedius S. pseudintermedius S. schleiferi subsp. coagulans 16

17 VÝSKYT stafylokoků Stafylokoky jsou naprosto UBIKVITERNÍ i v prostředí. V potravinách (zrající sýry, salámy, marinované ryby, sojová omáčka). 17

18 VÝSKYT stafylokoků Stafylokoky jsou naprosto UBIKVITERNÍ i v prostředí. Z posledních (2015 a 2018) S. argensis byl izolován ze sedimentů řeky Argen, S. edaphicus z kamenné drtě a písku v Antarktidě. Nejzajímavější výskyt : S. succinus subsp. succinus přežil milionů let zakonzervován v třetihorním jantaru 18

19 2. Laboratorní diagnostika stafylokokových infekcí v NRL/St Dominantním druhem je Staphylococcus aureus. Zlatý stafylokok Patří k nejúspěšnějším lidským patogenům. Asi u třetiny lidí žije na sliznicích a kůži bez příznaků. Při poruše odolnosti dovede způsobit velké spektrum onemocnění. 19

20 Staphylococcus aureus (Zlatý stafylokok) může vyvolat : 1. infekce kůže a podkoží 2. hluboké a systémové infekce 3. toxikózy 20

21 Staphylococcus aureus 1. infekce kůže a podkoží - povrchové (impetigo, folikulitida, furunkl, panaricium) - podkožní (karbunkl, absces, flegmóna, mastitida) 21

22 Staphylococcus aureus 2. hluboké a systémové infekce - infekce kostí a kloubů - osteomyelitida, artritida, (kloubní náhrady ) spodylodiscitida, aj. ) - infekce krevního řečiště (infekční endokarditida, katétrové sepse, infekce trombu, aj. ) - infekce močových cest - pneumonie 22

23 Staphylococcus aureus 3. toxikózy exfoliativní dermatitidy pemphigus neonatorum syndrom opařené kůže syndrom toxického šoku enterokolitidy pneumonie vyvolané Pantonovým Valentinovým leukocidinem Alimentární intoxikace stafylokoková enterotoxikóza 23

24 VIRULENCE vyjadřuje stupeň patogenity určitého kmene. Je dána přítomností faktorů virulence (FV), nebo schopností je produkovat. Třídění faktorů virulence: Podle fáze FV: 1. kolonizační 2. průnikové 3. obranné (útočné) Podle chemické povahy FV : povrchové extracelulární : enzymy toxiny 24

25 FAKTORY VIRULENCE Staf. podle chemické povahy ENZYMY - plasmakoaguláza - katalyzuje polymeraci rozpustn. fibrinogenu na pevný fibrin (fibr. lem -> absces) - fibrinolyzin (stafylokináza) - termonukleáza - (fosfodiesteráza) rozrušuje DNA i RNA (nuc gen) - DNÁza - termolabilní nukleáza - hyaluronidáza - (spreading factor) - - fosfatáza, lipáza, ß-laktamázy... 25

26 JEDNODUCHÝ TEST K ODLIŠENÍ KMENŮ S. aureus : Průkaz hyaluronidázy (dekapsulační test) s kmenem Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Výsledky NRL: Dosud testováno (konec 2017) kmenů stafylokoků KNS : vše negativní S.aureus většina pozitivní 115 kmenů SAU negativních (1.01 %) 26

27 TOXINY - hemolyziny (alfa, beta, gama, delta) - superantigeny :. exfoliatiny. enterotoxiny. TSST-1 - Pantonův - Valentinův leukocidin 27

28 TOXINY - hemolyziny alfa-toxin : asi u 2/3 kmenů S. aureus cytolytický efekt na membránu buněk beta-toxin : sfingomyelináza B rovněž poškozuje tkáně a příspívá k tvorbě abscesů gama-toxin : dvousložkový (x agar) delta-toxin : většina kmenů S. aureus je toxický na makrofágy a lymfocyty 28

29 STAFYLOKOKOVÉ HEMOLYZINY Zjišťování produkce hemolyzinů: alfa-hemolyzin, (S.aureus) beta - (S.intermedius) delta - řada KNS 29

30 CAMP TEST (Christie, Atkins, Munch-Petersen; 1944) synergie stafylokokového beta - hemolyzinu (S. aureus, S.intermedius, a d. ) s CAMP faktorem beta-hemolytických streptokoků skupiny B Streptococcus agalactiae 30

31 Produkce alfa, beta, delta hemolyzinu u kmenů S. aureus Výsledky NRL : přibližně kmenů S. aureus z let beta + delta 1 kmen alfa + beta 2% beta 2% delta 13% negativní 18% alfa (+delta) 65% 31

32 FAKTORY VIRULENCE St. podle chemické povahy TOXINY - hemolyziny (alfa, beta, gama, delta) - superantigeny. enterotoxiny. exfoliatiny. TSST-1 - Pantonův - Valentinův leukocidin 32

33 BAKTERIÁLNÍ SUPERANTIGENY (většinou) exoprodukty bakterií jednoduché látky (polypeptidy rel. mol. hmotnost kda) prototypem stafyl. enterotoxin B, který vyvolává proliferaci lymfocytů a produkci cytokínů ještě v koncentraci až molu/ litr 33

34 BAKTERIÁLNÍ SUPERANTIGENY Nevyžadují pro svou interakci s imunitním systémem zpracování antigen prezentující buňkou. Přímou vazbou na receptory T lymfocytů aktivují imunitní systém v podstatě nekontrolovanou reakcí. Patří mezi největší aktivátory T lymfocytů. Dochází k produkci velkého množství cytokinů (tumornecrosis faktor, interleukin 1, gama-interferon) Mají pyrogenní vlastnosti a zvyšují účinek endotoxinu gramnegativních bakterií 34

35 BAKTERIÁLNÍ SUPERANTIGENY Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Clostridium perfringens Yersinia pseudotubeculosis enterotoxiny TSST-1 exfoliatiny (?) pyrogenní toxiny A, C streptokokové superantigeny SSA-1, SSA-2 (nejsou exoprod.) enterotoxin mitogenní toxin ad. 35

36 BAKTERIÁLNÍ SUPERANTIGENY podílejí se na řadě onemocnění: syndrom toxického šoku toxické epidermolýzy stafylokoková enterotoxikóza streptokokový syndrom toxického šoku spála hrají nepřímou roli i v dalších onemocnění: artritida, atopická dermatitida, Kawasakiho syndrom, revmatická horečka, kolitida ad. 36

37 Stafylokoková enterotoxikóza Nejtypičtější a zřejmě nejčastější alimentární intoxikace. Od 2-6 hodin po konzumaci kontaminované potraviny. Velice dramatický začátek, zvracení, průjem, bolesti svalů, bez teploty. 37

38 MEZINÁRODNÍ KLASIFIKACE NEMOCÍ MKN revize A05 = ALIMENTÁRNÍ INTOXIKACE A05.0 stafylokoková enterotoxikóza (termostab. En - potr.) A05.1 botulismus (Clostr. botulinum - neurologické příznaky) A05.2 intoxikace vyv. Clostridium perfringens (termolabilní En, tvoří se ve střevu) A05.3 intoxikace vyv. Vibrio parahaemolyticus (Enterotoxin se tvoří v potravině) A05.4 int. vyv. Bacillus cereus (umí produkovat oba typy enterotoxinů termostabilní i termolabilní) 2 formy s ink.dobou 1-6 hodin a 6-16 hodin 38

39 Staf. enterotoxin je exoprodukt kmenů S.aureus velice jednoduchý polypetid rel. m. hm. = asi 30 kda (asi 270 AK) Je značně TERMOREZISTENTNÍ (x několikaminutový var) a CHEMOREZISTENTNÍ (x trypsin, chymotrypsin, papain)! K vyvolání enterotoxikózy stačí 1 10ug čistého toxinu. rtg-strukturní analýza En B

40 Stafylokokové enterotoxiny - historie : 1884 první hypotéza o otravě bakteriálním toxinem: popsaná alimentární intoxikace u 300 lidí v Michiganu po konzumaci sýru ČEDAR 1884 Rosenbach Staphylococcus aureus 1930 Dack sterilní filtrátem vyvolal enterotoxikózu u dobrovolníků 1959 Casman připraveny první purifikované toxiny : enterotoxin A enterotoxin B 1965 Bergdoll enterotoxin C (dva subtypy C1 a C2 )

41 Stafylokokové enterotoxiny - dnes : Skupina pěti klasických enterotoxinů : A, B, C, D a (E) nejčastěji uváděny jako příčina onemocnění (5) Enterotoxiny : G, H, I; R, S, T (6) zřídka, ale existují publikace Enterotoxiny-like : J, K,.Q, U a V (11 -> celkem 22) emetické aktivity (zatím) nepotvrzeny

42 Stafylokokové enterotoxiny - geny : Skupina klasických enterotoxinů : umístění genů En gen lokalita A sea profág B seb ostrov patogenity C sec ostrov patogenity D sed plasmid E see chromozom G seg chromozom (spolu s I, K, M, N) H seh chromozom

43 SLEDOVÁNÍ STAFYLOKOKOVÉ ENTEROTOXIGENITY V NRL pro stafylokoky (25 let) metoda difúzního testu v gelu na mikrosklíčku (MSGDT) Specifická antiséra prof. Bergdolla z Madisonu Citlivost byla cca 1 ug toxinu / ml Enterotoxiny A - E

44 POČTY KMENU S.AUREUS S PRODUKCÍ ENTEROTOXINU A, B, C, D a E metoda MSGDT, celkem kmenů z let NRL/ST A B C D E AB AC AD AE BC BD CE ACE

45 SLEDOVÁNÍ STAFYLOKOKOVÉ ENTEROTOXIGENITY V NRL pro stafylokoky > metodou latexové aglutinace (RPLA) sety RPLA japonská fy. Denka Seiken Citlivost je cca 1 ng toxinu / ml Enterotoxiny A - D(E)

46 POČTY KMENŮ S.AUREUS S PRODUKCÍ ENTEROTOXINU A, B, C, D (E ) metoda RPLA, celkem kmenů z let počet kmenů A B C D AB AC AD BC BD CD ABC ABD ACD BCD

47 SLEDOVÁNÍ STAFYLOKOKOVÉ ENTEROTOXIGENITY V NRL pro stafylokoky > metodou PCR zjišťujeme přítomnost genů pro produkci Enterotoxiny A, B, C, D, E, G, H, I Like enterotoxiny J, K, L, M, P

48 STAFYLOKOKOVÁ ENTEROTOXIKÓZA patří mezi hlášené infekční onemocnění - dg. A05.0 Díky dr. Šebestové máme z EPIDATu k dispozici počty nahlášených alimentárních intoxikací A05, (bez případů botulismu A05.1) a A05.0 v letech Rok Dg. A05.0 staf. enterotoxikóza Dg. A05 - nevyšetřeno Je zřejmé, že většina případů staf. enterotoxikóz zůstává nevyšetřena. Do NRL/St se k průkazu staf. enterotoxinu jsou každý rok zaslány kmeny z 1 3 epidemií. V roce 2018 bylo do ISINu nahlášeno 237 případů dg. A05 48

49 KEBABOVÁ epidemie v Hradci Králové v červnu t.r. Celkem bylo postiženo 82 lidí, kteří jedli kebabové potraviny v jedné provozovně s občerstvením v HK. 44 pacientů bylo hospitalizováno! První den onemocnělo 23 osob (vydáno 170 porcí tj, attack rate = 13,5 % Druhý den onemocnělo 59 osob (vydáno 60 porcí) t.j. attack rate = 98,3 %. Příznaky : průjem, zvracení, bolesti břicha, křeče, únava Průběh středně těžký. Začátek onemocnění od 1 hodiny do několika hodin. 49

50 KEBABOVÁ epidemie v Hradci Králové v červnu t.r. Laboratorní vyšetření prováděna ve ZÚ se sídlem v Ústí n.l., pracoviště HK SVÚ Praha NRL pro stafylokoky Do NRL/St byly zasláno 31 kmenů S. aureus, které byly podrobeny fenotypové a genotypové typizaci. 15 kmenů od pacientů - 13 pozitivních na EnA 8 kmenů z inkriminovaných potravin - 8 pozitivních na En A 5 kmenů ze stěrů rukou personálu - 4 pozitivní na En A 3 kmeny ze stěrů prostředí provozovny - 3 pozitivní na EnA. 50

51 KEBABOVÁ epidemie v Hradci Králové v červnu t.r. Kmeny byly podrobeno makrorestrikční analýze (PFGE) Všechny kmeny pozitivní na enterotoxin A patřily stejnému pulzotypu, zatímco ostatní kmeny (negativní nebo pozitivní na enterotoxin C) měly pulzotyp odlišný. Potvrzeno, že tato epidemie byla způsobena klonálně shodným kmenem S.aureus s produkcí enterotoxinu A 51

52 FAKTORY VIRULENCE STAFYLOKOKŮ podle chemické povahy ENZYMY TOXINY - hemolyziny (alfa, beta, gama, delta) - superantigeny. enterotoxiny. exfoliatiny. TSST-1 - Pantonův - Valentinův leukocidin 52

53 Toxické epidermolýzy L00 historie : 1878 baron Gotfried Ritter von Rittershainu popsal 297 případů PUCHÝŘNATÉHO ONEMOCNĚNÍ NOVOROZENCŮ v pražských útulcích pro nalezence (dermatitis exfoliativa neonatarum) 1884 popsán Rosenbachem Staphylococcus aureus 53

54 Původcem kmeny S.aureus s produkci specifického toxinu EXFOLIATIN - ( epidermální toxin ) u lidí se vyskytují typy A, B a D čtyři typy Exfoliatin C je původcem dermolýz u koní Staph. hyicus též produkuje exfoliatiny (infekce u vepřů) 54

55 TOXICKÁ EPIDERMOLÝZA (exfoliativní dermatitida) 3 FORMY : PUCHÝŘNATÉ ONEMOCNĚNÍ NOVOROZENCŮ (PON) (pemphigus neonatorum u dětí do 10 let) Bulózní impetigo i u dospělých Rašový typ toxické epidermolýzy Syndrom opařené kůže = Skin Scaled Staphylococcal Syndrome = Ritterova choroba 55

56 TOXICKÁ EPIDERMOLÝZA (exfoliativní dermatitida) 3 FORMY : Syndrom opařené kůže = Skin Scaled Staphylococcal Syndrome = Ritterova choroba Závažné onemocnění až s 20% smrtností. Exfoliatiny vyvolávají odloučení epidermis pod stratum granulosum -> puchýře, až odlupování kůže v cárech. Nikolského příznak x Lylleova choroba toxická epidermální nekrolýza vyvolaná léky 56

57 SLEDOVÁNÍ PRODUKCE EXFOLIATINŮ v NRL/ST metoda RPLA, 3918 kmenů S.aureus z let pozitivních = 470 kmenů, tj. 12,0 % Ex A 8,3 % bez produkce Ex A a B 88% Ex A + B 2,9 % Ex B 0,8 % 57

58 Typizace kmenů S.aureus - epidemie puchýřnatého onemocnění novorozenců v jihočeské nemocnici Číslo sestra, matka, dítě, prostředí MATERIÁL hemol. enterotoxin y EXOPRODUKTY TSST-1 exfoliatiny FAGOTYPIZACE 1 dítě 1, holka puchýř a exa hyper 47,75 2 dítě 2, kluk puchýř a exa hyper 47,75 3 dítě 2, kluk stěr z oka a exa hyper 47,75 4 sestra 1 výtěr z nosu A hyper TSST-1 hyper 29 5 sestra 2 výtěr z nosu b NT 6 sestra 3 výtěr z nosu a 94,96 7 lékař 1 výtěr z nosu a D w NT 8 sestra 4 výtěr z nosu a exa hyper 47,75 58

59 Typizace kmenů S.aureus - epidemie puchýřnatého onemocnění novorozenců v jihočeské nemocnici 2. vlna Číslo sestra, matka, dítě, prostředí MATERIÁL hemol. enterotoxin y EXOPRODUKTY TSST-1 exfoliatiny FAGOTYPIZACE 9 sestra 5 výtěr z nosu A hyper TSST-1 hyper dítě 3, kluk puchýř a exa hyper 47,75 11 dítě 4, holka puchýř a exa hyper 47,75 12 dítě 5, holka puchýř a exa hyper 47,75 13 lékař 2 výtěr z nosu a 94,96 14 sestra 6 15 sestra 7 stěr z perinea stěr z perinea a exa hyper 47,75 a B hyper NT 16 dítě 5, holka oko a exa hyper 47,75 59

60 FAKTORY VIRULENCE Staf. podle chemické povahy ENZYMY TOXINY - hemolyziny (alfa, beta, gama, delta) - superantigeny. enterotoxiny. exfoliatiny. TSST-1 - Pantonův - Valentinův leukocidin 60

61 Toxin syndromu toxického šoku TSST-1 Vyvolává onemocnění syndrom toxického šoku (STŠ) Toxikóza vyvolaná toxinogenními kmeny S. aureus, kromě TSST-1 mohou ji vyvolat i kmeny s produkcí enterotoxinu (ale též Streptococcus pyogens s produkcí pyrogenního toxinu) Onemocnění popsáno až v roce 1978 Toddem 61

62 KLINICKÉ PŘÍZNAKY STŠ (Case definition - CDC 1980) 1. vysoká teplota (>= 38.9 o C] 2. vyrážka 3. hypotenze (<= 90 mm syst.) 4. odlupování vrchních vrstev pokožky (1-2 týdny po začátku onemocnění) + další abnormality (minimálně 3) z : 62

63 Klinické příznaky STŠ II. (Case definition - CDC 1980) Další příznaky (minimálně 3): zvracení nebo průjem silná bolest svalů hyperémie sliznic renální problémy zvýšené jaterní testy snížení počtu krevních destiček poruchy CNS 63

64 Existují dvě různé FORMY STŠ : menstruální STŠ (tampóny!) rizikové faktory : toxinogenní kmen užívání tamponů imunitní nedostatečnost nemenstruální STŠ = komplikace jakéhokoliv stafylokokového onemocnění INKUBAČNÍ DOBA řádově hodiny (8 -> ) incidence 0.5 příp./ obyv.rok; smrtnost 2 5% 64

65 SYNDROM TOXICKÉHO ŠOKU V NRL pro stafylokoky zjišťujeme produkci TSST-1 i stafylokokových enterotoxinů pomocí latexových testů RPLA Výsledky NRL metodou RPLA vyšetřeno v letech celkem 6312 kmenů S.aureus z těch 680 toxinogenních tj 10,8 % bez produkce 89% T 3% T+ X 7% T + XY 1% T + XYZ 0%

66 Registrované případy STŠ v NRL /St podle formy stafylokokového onemocnění (celkem 229 případů, z toho 28 +) jiné infekce moč. a gynek. pneumonie inf.krev.řečiště popálenina RI *) - pooperační RI *) - poúrazová pyodermie menstruální STŠ

67 SYNDROM TOXICKÉHO ŠOKU V NRL/St bylo od roku 1983 do konce 2018 (35 let) zaregistrováno 229 případů STŠ ( ǿ 6,1/rok) (klinická zpráva + toxinogenní kmen SAU) Z toho 86 případů bylo menstruálních. 28 pacientů zemřelo, při vyloučení 8 případů (staré osoby + stafylokokové endokarditidy a meningitidy) zbývá 20 úmrtí, tj. smrtnost 9,9 %!

68 Toxin syndromu toxického šoku TSST-1 Na syndrom toxického šoku by se mělo pomýšlet při netypické kombinaci příznaků : obraz gastroenteritidy + exantém obraz spály nebo akutní virové infekce + hypotenze obraz gastroenteritidy + obraz disseminované intravaskulární koagulopatie DIC 68

69 U menstruální formy Syndromu toxického šoku jsou rizikové faktory : toxinogenní kmen S. aureus imunitní nedostatečnost užívání tamponů INTERNET : MUDr. Radim Uzel :Tampóny versus vložky :... Kolem použití tampónů přežívá mnoho mýtů Také obávaný toxický šok, je hudbou minulosti... NENÍ TO PRAVDA! Za poslední tři roky jsme zaznamenali 27 případů STŠ, z toho bylo 18 menstruálních (2/3). VŽDY BYLY V ANAMNÉZE TAMPÓNY! Někdy i hospitalizace JIP. 69

70 FAKTORY VIRULENCE STAFYLOKOKŮ podle chemické povahy ENZYMY TOXINY - hemolyziny (alfa, beta, gama, delta) - superantigeny. enterotoxiny. exfoliatiny. TSST-1 - Pantonův - Valentinův leukocidin 70

71 PANTONŮV VALENTINŮV LEUKOCIDIN Historie: 1880 A. Ogston a L. Pasteur - objev stafylokoka 1884 Fridrich Julius Rosenbach - Staphylococcus aureus 1894 Van de Velde (Louvan, B) popsal schopnost některých kmenů S. aureus lyzovat leukocyty. Pojmenoval tento toxin LEUKOCIDIN M.Neisser a F.Wechsberg potvrdili leukotoxickou aktivitu u sterilního filtrátu 1922 Louis Juliannne (Phiadelphia, USA) oddělil hemolytickou a leuokotoxickou aktivitu stafylokoků. 71

72 PANTONŮV VALENTINŮV LEUKOCIDIN 1932 Philip Panton a Francis Valentin (Londýn - UK) zjistili souvislost leukocidinu s akutními vážnými infekcemi, především měkkých tkání J. Wright pojmenovává leukocidin podle nich A.M.Woodin (Oxford, UK) purifikoval PVL a zjistil, že se skládá ze dvou složek (F a S). Éra molekulární biologie 1972 Van der Vijver (Rotterdam, NL) zjistil, že produkce PVL je kódována dvěma geny, které jsou uloženy na profágu. 72

73 PANTONŮV VALENTINŮV LEUKOCIDIN 1995 První články o PVL pozitivních kmenech S. aureus, které vyvolaly vážná kožní onemocnění - furunkly, nekrózy. Ale i závažné pneumonie Přibývají články popisující nekrotizující pneumonie s velkou smrtností u zdravých mladých osob, vyvolané PVL pozitivními SAU, často CA-MRSA. 73

74 PANTONŮV VALENTINŮV LEUKOCIDIN PVL patří do skupiny synergohymenotropních toxinů. (Podobně tam patří i stafylokokový gama-hemolyzin.) Dvousložkový exotoxin - skládá se ze dvou proteinů: LukS-PV (32 kda) a LukF-PV (34 kda). ( ETA 33 kda) Samotné separované složky nemají žádnou biologickou aktivitu Při společném účinku se synergicky doplňují. 74

75 PANTONŮV VALENTINŮV LEUKOCIDIN Velice účinný cytotoxin! způsobuje destrukci leukocytů a nekrózu tkání (pore-forming) Vytváří póry v neutrofilech a makrofázích lyzují. Pacient se nemůže bránit infekci fagocytózou. Podle literatury je většina infekcí získána komunitně : CA-MRSA!! U nemocničních infekcí nebývá popisován. 75

76 PANTONŮV VALENTINŮV LEUKOCIDIN Infekce kůže (furunkly, kožní abscesy, nekrózy), též osteomyelitidy popsány i sepse a hluboké flebitidy 76

77 PANTONŮV VALENTINŮV LEUKOCIDIN ABSCEDUJÍCÍ NEKROTIZUJÍCÍ PNEUMONIE. Obvykle je zaznamenána respirační viróza. ( flu-like ) Toxigenní PVL + S. aureus nasedá na poškozený epitel dolních cest dýchacích, rozvíjí se sekundární pneumonie. Dochází ke vzniku abscesů, a tvorbě hnisu (empyem). Postupně dochází k sepsi, až k septickému šoku, to progreduje v mutliorgánové selhávání. 77

78 PANTONŮV VALENTINŮV LEUKOCIDIN (PVL) Život ohrožující jsou především ABSCEDUJÍCÍ NEKROTIZUJÍCÍ PNEUMONIE. V literatuře je popsáno i několik onemocnění mladých imunokompetetních jedinců (sportovců), která skončila exitem - po velice rychlém průběhu. 78

79 Pantonův Valentinův leukocidin VÝSLEDKY NRL/St: Do konce 2018 bylo celkem vyšetřeno kmenů S. aureus z různého klinického materiálu Pozitivních na PVL bylo 918 kmenů (7,4 %) Z těch bylo 190 MRSA což činí 20,7 %. 79

80 Materiál, z kterého bylo v letech izolováno 918 PVL pozitivních kmenů abscedující pneumonie 3 % operační ranná infekce (NN) hnis 2% 2% léze 40% furunkl 7% Z celku 918 kmenů bylo 190 MRSA tj. 20,7 % kožní absces 10% ranná infekce 36% 80

81 ZAZNAMENANÉ PŘÍPADY NEKROTIZUJÍCÍCH PVL PNEUMONIÍ v ČR Do NRL bylo zasláno za 12 let 25 kmenů S. aureus z případů nekrotizujích pneumonií. Z těchto 25 případů 15 skončilo úmrtím pacienta. Z 25 kmenů byly 6 MRSA a 19 MSSA. U většiny z 10, které skončily uzdravením, byl použit linezolid. Většina jich proběhla v zimních měsících. 81

82 PŘÍPAD 2. - ÚMRTÍ - 22letý muž; Kladno prosinec 2007 Hospitalizován na chirurgii pro 4 dny trvající bolesti na hrudi, se zvracením, s teplotou oc. dg.: oboustranná pneumonie dochází k ledvinovému, později plicnímu selhání zástavě krevního oběhu a přes kardiopulmonální resuscitaci Mladík umírá po 6 dnech nemoci a necelých 2 dnech hospitalizace Původce: CA-MRSA (dále rez. TET), PVL+ z hem. a nos 82

83 PŘÍPAD 5. - ÚMRTÍ - 21letá žena; Příbram, leden 2009 V anamn. respir. infekce a pásový opar - hospitalizována pro nehojící se léze - pův.dg. herp. meningoencefalitis Terapie: Acyklovir, Ceftriaxon, antipyretika Stav se zhoršoval a během několika hodin dochází k akutní respirační insuficienci. Přeložena na ARO. Na CT plic zjištěna oboustranná abscedující pneumonie. Změna ATB: MER, GEN, OXA, VAN Při probíhající sepsi dochází k respiračnímu selhávání a pacientka musí být intubována. 83

84 PŘÍPAD 5. - ÚMRTÍ - 21letá žena; Příbram, leden 2009 Sepse těžká sepse vše progreduje v septický šok. Leukopenie, tachykardie, elevace jaterních testů. Dochází ke kritickému stavu oběhu a je potvrzen ve sputu S.aureus Změna v ATB terapii : linezolid (pozdě...) Dívka umírá po 6 dnech nemoci a necelých 2 dnech hospitalizace. Původce: PVL+ citlivý SAU (rez. AMC) 84

85 ZÁVĚR I. Toxinogenní kmeny S. aureus s produkcí PVL jsou velice virulentní a vyvolávají závažná onemocnění, především těžko se hojící kožní infekce. Velice nebezpečné jsou abscedující pneumonie. V celku 25 zaznamenaných případů (březen) v NRL/ST 15 letálních! ( 60 %) Velice důležitá je včasná diagnostika a urychlené nasazení odpovídajícího antibiotika. 85

86 ZÁVĚR II. Lékem volby je LINEZOLID! i v případě MSSA 1) má výborný průnik do plicního parenchymu, do plicního sekretu a polymorfonukleárů (skup. leukocytů) 2) výrazně inhibuje proteosyntézu - tvorbu toxinu PVL (Blokáda tvorby toxinu je důležitější než baktericidie. Při nízkých hladinách ATB se tvorba toxinu i zvyšuje!) 3) linezolid je účinný i na kmeny MRSA 86

87 3. MRSA methicilin rezistentní kmeny S. aureus 1928 Fleming objevil penicilin. (působení produktu plísně Penicillium notatum na inhibici růstu stafylokoků) 1940 penicilin klinicky vyzkoušen (Florey a Chain) Záhy kmeny stafylokoků získaly schopnost produkovat enzym beta-laktamáza (penicilináza), který penicilin rozkládá. Dnes asi 90% kmenů S. aureus rezistentních k PEN. 87

88 MRSA - methicilin rezistentní kmeny S. aureus Na začátku 60. let se začala používat polosyntetická antibiotika, odolná k rozkladnému účinku betalaktamázy. Prvním z nich byl METHICILIN. V současnosti se používá jak k terapii, tak k laboratornímu průkazu rezistence OXACILIN. (stejné spektrum účinnosti, ale je stabilnější.) Opět velice záhy se objevily kmeny rezistentní : MRSA = tradiční pojmenování x MSSA kmeny S. aureus citlivé k MET/OXA 88

89 MRSA - methicilin rezistentní kmeny S. aureus MRSA jsou velice často rezistentní i k dalším skupinám antibiotik: aminoglykosidům (GEN), makrolidům (ERY) a d. tj. KMENY JSOU MULTIREZISTENTNÍ MRSA Kmeny MRSA nejsou virulentnější než MSSA, často naopak (infekční dávka, toxiny) Většinou se jedná o nemocniční kmeny. H-MRSA 89

90 KMENY MRSA rezistence způsobena produkcí alterované transpeptidázy PBP 2a (penicilin-binding protein 2a) rezistenci kóduje gen meca předpokládá se, že tento gen získaly kmeny MRSA od KNS meca gen lokalizován v mobilním elementu SCCmec ECDC : EARS-Net European Antimicrobial Resistance Surveillance Network, dlouhodobý projekt surveillance antibiotické rezistence invazivních izolátů, mj. kmenů S. aureus NRL pro antibiotika SZÚ 90

91 MRSA v ČR ,8% MRSA v ČR ,3% MRSA v ČR ,8% MRSA v ČR ,8% Podíly MRSA z hemokultur v Česku v letech

92 EARS Net databáze 2017: četnost kmenů MRSA z hemokultur; průměr EU : 16,9 %; Česko : 13,2 % Slovensko: 29,2 % Slovensko: 29,2 % Norsko: 1,0 % Rakousko: 5,9 % Německo : 9,1 % Polsko : 15,2 % Itálie : 33,9 % Řecko: 38,4 % Rumunsko: 44,4 % 92

93 U MRSA jsou lékem volby : glykopeptidy (vankomycin, teikoplanin) selhání léčby vankomycinem v Japonsku (1995 Francie?) -> VISA vankomycin intermediant resistant SAU GISA (glykopeptide intermediant první izolát VRSA v USA (vankomycin resistant též k TEI, tj. vlastně GRSA ) společný záchyt s rezistentním kmenem E. faecalis léze na noze diabet. pacienta (přenos genu vana?) LINEZOLID, QUINOPRISTIN/DALFOPRISTIN 93

94 4. Stafylokoky koaguláza-negativní (KNS) nejběžnější součást kožní mikroflóry S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis Podmíněné patogeny - u oslabených lidí mohou vyvolat jakékoliv onemocnění, které působí S. aureus (s výjimkou toxikóz). 94

95 Kmeny koaguláza-negativních stafyloků Neoplývají takovým spektrem faktorů virulence, jako kmeny S. aureus - neprodukují nebezpečné toxiny PVL, TSST-1 a další superantigeny). Některé druhy jsou producenty delta (vzácně i beta) hemolyzinu. Produkce slizu v podstatě extracelulární polysacharidy > tvorba biofilmu. Bakteriální buňky jsou v něm do určité míry chráněny proti antibiotikům, proti imunitním reakcím pacienta i proti dezinfekčním látkám. 95

96 KNS - O jejich etiologickém uplatnění rozhoduje stav celkové odolnosti makroorganismu. U OSLABENÝCH LIDÍ BYLY IDENTIFIKOVÁNY I JAKO PŮVODCI TĚŽKÝCH, AŽ SMRTELNÝCH INFEKCÍ. Tři skupiny pacientů 1. imunitně oslabení (léky, věkem) 2. dlouhodobě nemocní 3. intravenózní narkomané 96

97 2. dlouhodobě nemocní (kovové a plastové pomůcky) KNS jsou častou příčinou nemocničních infekcí především krevního řečiště. Nozokomiální infekce v USA

98 VÝSLEDKY NRL pro stafylokoky IDENTIFIKACE 3891 KMENŮ KNS Z KLINICKÉHO MATERIÁLU 4 nejčastější : 74,5 % S.epidermidis 32% S.hominis s.novobiosepticus 10% S.haemolyticus 23% S.hominis s. hominis 12% 98

99 VÝSLEDKY NRL pro stafylokoky IDENTIFIKACE 3891 KMENŮ KNS Z KLINICKÉHO MATERIÁLU 10 nejčastějších : 92,0 % ostatní (20 druhů) 8% S.epidermidis 32% S.capitis s.ureolyticus 1% S. simulans 2% S. warneri 2% S.sciuri 3% S. lugdunensis 3% S. saprophyticus 4% S.h.s.novobiosepticus 10% S.h. s. hominis 12% S.haemolyticus 23% 99

100 VÝSLEDKY NRL pro stafylokoky IDENTIFIKACE 3891 KMENŮ KNS Z KLINICKÉHO MATERIÁLU vzácnější ( pozice) 11. S. xylosus 52 kmenů 12. S. capitis s. capitis 13. S. pasteuri 14. S. cohnii s. urealyticus 15. S. cohnii s. cohnii 16. S. caprae 17. S. lentus 18. S. schleiferi s. schleiferi 19. S. auricularis 20. S. petrasii 21. S. vitulinus 22. S. equorum 4 kmeny ostatní (20 druhů) 8% S.h.s.novobiosepticus 10% S.h. s. hominis 12% S.epidermidis 32% S.haemolyticus 23% 100

101 NEJVZÁCNĚJŠÍ IDENTIFIKACE KNS - po jednom kmenu: 28. S. felis Příbram kousnutí kočkou 29. S. hyicus Strakonice výtěr ucha, otitis 30. S. arlettae Pardubice moč 31. S. nepalensis Hořovice moč

102 Nejvzácnější identifikace - dourčení v brněnské sbírce CCM a PřF MU - genotypizace (dr. Pavel Švec, doc. Roman Pantůček, doc. Ivo Sedláček, dr. Dana Nováková) 31. S. nepalensis (stafylokok z himalájských koz) Hořovice (dr. Hásková) - 76letý M, moč - cystitida

103 Stafylokoky koaguláza-negativní S. saprophyticus subsp. saprophyticus časté agens infekcí močových cest, především u mladých žen (komunitní infekce) S. hominis subsp. novobiosepticus původce infekcí krevního řečiště (nemocniční nákazy) 103

104 MATERIÁL, Z KTERÉHO BYLY KMENY S.hominis subsp novobiosepticus IZOLOVÁNY (celkem 385 kmenů z 35 laboratoří ) ostatní 5% likvor 1% kanyla 6% krev 69% rána, hnis, drén 6% katétr 13%

105 PODÍLY REZISTENCE U KMENŮ S. hominis subsp. novobiosepticus (celkem 385 izolátů z 35 laboratoří) % rezistence OXA ERY COT CMP TET CLI GEN AMC TEI VAN CIP RIF

106 5. Identifikace stafylokoků metodou MALDI-TOF MS 106

107 MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight Mass Spectrophotometry Hmotnostní spektrometrie s využitím ionizace laserem za přítomnosti matrice v kombinaci s detektorem doby letu (průletovým analyzátorem) Směs vzorku s matricí (kyselinou skořicovou) na podložce je zasažena nanosekundovým pulzem laseru. Vzorek je ionizován a částice urychlené elektrickým polem (30 kv) vlétají do vysokého vakua (10 e-6 mbar) 107

108 MALDI-TOF MS Směs vzorku s matricí (kyselinou skořicovou) na podložce je zasažena nanosekundovým pulzem laseru. Vzorek je ionizován a částice urychlené elektrickým polem (30 kv) vlétají do vysokého vakua (10 e-6 mbar) 108

109 MALDI-TOF MS Rychlost letu částice závisí na hmotnosti a náboji. Detektorem TOF se změří doba letu a z toho se vypočte poměr molekulové hmotnosti a náboje částice m/z. 109

110 V SZÚ jsme měli od zapůjčený a od ledna 2013 zakoupený přístroj Microflex fy. Bruker Daltonics K identifikaci bakterií používáme software MALDI Biotyper Real Time Standardní databáze verze 5627 resp. Vojenská databáze SRL Security Relevant Library 110

111 Microflex fy. Bruker Daltonics naměřené spektrum 111

112 Kromě samotného přístroje je k měření potřeba pouze bambusové parátko a 1 ul roztoku kyseliny skořicové 112

113 Naprosto jednoduchý postup 1. Vzorek stafylokoka byl bambusovým párátkem nanesen na měřící ocelovou destičku (terčík). 2. Po zaschnutí byla přidána matrice, tzn. roztok kyseliny skořicové v objemu 1,0 ul. 3. Po zaschnutí byla u nanesených vzorků proměřena spektra na přístroji Microflex a zanalyzována programem MALDI Biotyper, resp. Biotyper RT 113

114 Ve sporných případech byla v Ústavu experimentální biologie PřF MU v Brně identifikace ověřena metodou rep-pcr s primerem (GTG)5. U řady kmenů je ještě nutno tuto analýzu provést. Doporučené čtyřstupňové rozmezí hodnot score value, je v programu tabelováno : RANGE DESCRIPTION SYMBOLS highly probable species identification ( +++ ) secure genus identification, probable species identification ( ++ ) probable genus identification ( + ) not reliable identification ( - ) 114

115 CELKEM BYLO NA MICROFLEXU IDENTIFIKOVÁNO a výsledky analyzovány u 337 KMENŮ klinických izolátů 34 různých druhů a poddruhů stafylokoků. dobře identifikováno slabě identifikováno not reliable identification špatně nutno prověřit VÝSLEDEK IDENTIFIKACE STAFYLOKOKŮ celke m kmen ů > 2,3 2,3-2,0 2,0-1,9 1,8-1,7 < 1, ne?? CELKEM KMENŮ v procentech 32,9% 45,4% 8,0% 7,4% 3,0% 0,0% 3,2% ÚSPĚŠNOST : 86,3% 7,4% SHODA 93,7% 115

116 ZÁVĚR Stafylokoky, především kmeny Staphylococcus aureus, mají dominantní postavení v humánních infekcích. Lze konstatovat, že patří k nejúspěšnějším patogenům. Z hlediska terapie jsou obávané především kmeny MRSA, i methicilin-rezistentní kmeny KNS. 116