GENOTYPOVÁ REKLASIFIKACE KMENŮ Staphylococcus intermedius jako Staphylococcus pseudintermedius

Transkript

1 Konzultační den NRL pro stafylokoky, SZÚ Praha, GENOTYPOVÁ REKLASIFIKACE KMENŮ Staphylococcus intermedius jako Staphylococcus pseudintermedius Pavel Švec 1, Roman Pantůček 2, Petr Petráš 3 1 Česká sbírka mikroorganismů, Ústav experimentální biologie, PřF MU, Brno 2 Katedra genetiky a molekulární biologie, Ústav experimentální biologie, PřF MU, Brno 3 SZÚ - CLČ -OML -OBRaSBI. 1

2 Staphylococcus intermedius (SIN) byl popsán r prof. Václavem Hájkem z Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci, který byl do června 1991 vedoucím NRL pro stafylokoky. 2

3 Staphylococcus intermedius (SIN) Byl to druhý koaguláza-pozitivní stafylokok. Nachází se nejčastěji u psů, ale i koček, koní a dalších savců i ptáků. Je přítomen bezpříznakově, ale může být příčinou infekčních onemocnění. Vzácně se může vyskytnout jako agens u člověka, většinou ve spojení se zvířetem (psí kousnutí, ad.) 3

4 FENOTYPOVÉ ODLIŠENÍ KOAGULÁZAPOZITIVNÍCH KMENŮ Staphylococcus intermedius x S. aureus Charakteristika S. intermedius S. aureus pigment + ( ) hemolyzin beta-hemolyzin alfa (delta,, beta) volná koaguláza /+ / + + / + / + clumping-faktor d (obvykle ) + hyaluronidáza + PYRtest + 4

5 VÝSLEDKY NRL pro stafylokoky IDENTIFIKACE 3815 KMENŮ non S. aureus Z KLINICKÉHO MATERIÁLU 4 nejčastější : 73,8 % S.epidermidis 30,4 % S.haemolyticus 21,7 % S.hominis subsp. novobiosepticus 10,1 % S.hominis subsp. hominis 11,6 % 5

6 VÝSLEDKY NRL pro stafylokoky IDENTIFIKACE 3815 KMENŮ non S. aureus Z KLINICKÉHO MATERIÁLU = 12 nejčastějších : 92,9 % ostatní (21 druhů) 7,1 % S.epidermidis S. xyl osus S.intermedius S.ca pi ti s s. ur eol yti cus S. simulans S. sci ur i sp. S.lugdunensis S.warneri S. sap. s. saprophyticus S.haemolyticus S.hominis s. novobiosepticus S.hominis s. hominis 6

7 VÝSLEDKY NRL pro stafylokoky IDENTIFIKACE 3815 KMENŮ non S. aureus Z KLINICKÉHO MATERIÁLU 11. nejčastější: S.intermedius: 59 kmenů 1,5 % S.intermedius 1,5 % ostatní (21 druhů) 7,1 % S. xyl osus S.epidermidis S.capitis s. ureolyticus S. simulans S. sci ur i sp. S.lugdunensis S.warneri S. sap. s. saprophyticus S.haemolyticus S.hominis s. novobiosepticus S.hominis s. hominis 7

8 IJSEM 2005; 55(4 July): S. pseudintermedius 4 kmeny izolovány z klinického veter. materiálu (kočka, pes, kůň, papoušek) pseud = falešný S. intermedius Luc A. Devriese, M.Vancaneyet, M. Baele, et al. Gent, Belgie fenotypově prakticky shodné s S. intermedius včetně produkce sfingomyelinázy, beta-hemolyzinu, s pozitivním CAMPtestem a cold efektem. 8

9 IJSEM 2005; 55(4 July): S. pseudintermedius fenotypově prakticky shodné s kmeny S. intermedius Charakteristika S. intermedius S. pseudintermedius clumping-faktor d (obvykle ) Voges-Proskauer test (produkce acetoinu) /w + maltóza /w + 9

10 RNDr. Pavel Švec, Ph.D. Česká sbírka mikroorganismů CCM Ústav experimentální biologie, PřF MU, Brno Identifikace bakterií metodou rep-pcr s primerem (GTG)5 Na lodi v Atlantickém oceánu rep-pcr metody jsou založeny na shlukové analýze PCR produktů získanými s primery komplementárními k rozptýleným repetitivním sekvencím.

11 RNDr. Pavel Švec, Ph.D.; CCM Brno Rozptýlené repetitivní sekvence (Interspersed Repetitive Sequences) < 500 bp, nekódující, rozšířeny v genomech prokaryot v různé orientaci a poloze. V bakteriální taxonomii nejčastěji využívané primery ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus), REP (repetitive extragenic palindromic sequence) BOX a (GTG)5 - popsán původně u Salmonella spp., Shigella spp., primer: 5'-GTG GTG GTG GTG GTG-3' 11

12 RNDr. Pavel Švec, Ph.D.; CCM Brno PCR produkty o velikostech 200 až 5000 bp (4-5 kb limit Taq polymerázy) PCR reakce gelová ELFO genomová DNA shluková analýza HC21 HC22 HC6 HC10 IR13 IR21 IR23 IR26 IR12 IR20 IR25 12

13 RNDr. Pavel Švec, Ph.D.; CCM Brno Výhody rep-pcr: dobrá diskriminační schopnost - druhově až kmenově specifická dobrá reprodukovatelnost - nutná optimalizace a standardizace jednoduché provedení, časová nenáročnost a rychlost, nízká cena Nevýhody rep-pcr: velký vliv metodiky provedení na výsledný profil -> problematická mezilaboratorní reprodukovatelnost a přenositelnost výsledků vliv metody izolace DNA, použitého termocykleru, 13

14 PRVNÍ SOUBOR KMENŮ SIN PRO rep-pcr srpen 2010 Č. č. NRL DRUH MATERIÁL BAKTERIOLOG LOKALITA HEMOLYZIN poznámka 1 93/0601 SIN rána Lambe Johnson City, USA β 2 93/0896 SIN pes Hájek Olomouc β 3 94/0455 SIN pes Hásková Hořovice β 4 94/0489 SIN pes Petráš Praha α, β 5 02/179 SIN krev Horová Bulovka 6 02/438 SIN rána Balejová Č. Budějovice β 7 03/131 SIN moč Šimečková Strakonice α, β 8 03/464 SIN potkan Černá SZÚ, Praha β 9 05/902 SIN liquor Knotková Martin, SK β 10 06/526 SIN pes Rousková Benešov β 11 09/493 SIN rána Jurčová Uherské Hradiště 14

15 PRVNÍ SOUBOR KMENŮ SIN PRO rep-pcr srpen 2010 Č. č. NRL DRUH MATERIÁL BAKTERIOLOG LOKALITA HEMOLYZIN VÝSLEDEK rep-pcr 1 93/0601 SIN rána Lambe Johnson City, USA β S. pseudintermedius 2 93/0896 SIN pes Hájek Olomouc β S. pseudintermedius 3 94/0455 SIN pes Hásková Hořovice β S. pseudintermedius 4 94/0489 SIN pes Petráš Praha α, β S. pseudintermedius 5 02/179 SIN krev Horová Bulovka S. pseudintermedius 6 02/438 SIN rána Balejová Č. Budějovice β S. pseudintermedius 7 03/131 SIN moč Šimečková Strakonice α, β S. pseudintermedius 8 03/464 SIN potkan Černá SZÚ, Praha β?? 9 05/902 SIN liquor Knotková Martin, SK β S. pseudintermedius 10 06/526 SIN pes Rousková Benešov β S. pseudintermedius 11 09/493 SIN rána Jurčová Uherské Hradiště 15 S. pseudintermedius

16 doc. RNDr. Roman Pantůček, CSc. Katedra genetiky a molekulární biologie, Ústav experimentální biologie, PřF MU, Brno rpob sekvenace doc. Pantůček bude podrobně hovořit ve své přednášce Identifikace stafylokoků prostřednictvím sekvenace Na lodi v Tichém oceánu I touto metodou byla u všech 10 kmenů, které vyšly pomocí rep-pcr jako Staphylococcus pseudintermedius tato identifikace potvrzena. 16

17 DRUHÝ SOUBOR KMENŮ SIN PRO rep-pcr září 2010 Č. č. NRL DRUH MATERIÁL BAKTERIOLOG LOKALITA HEMOLYZIN 12 93/892 SIN kůže Hájek Olomouc β 13 94/085 SIN pes Petráš Praha β 14 94/441 SIN krk Petráš Praha β 15 94/822 SIN kožní defekt Eliášová Č. Budějovice β 16 94/921 SIN kůže Petráš Praha β 17 00/227 SIN rána Audesová Plzeň β 18 00/470 SIN rána (pes) Ježek Příbram 19 00/621 SIN krev Votava Brno β 20 00/892 SIN rána Ježek Příbram 21 00/984 SIN rána (pes) Ježek Příbram β 22 01/719 SIN stěr z vředu Ježek Příbram β 23 01/777 SIN ucho Pivoňka Plzeň β 24 01/824 SIN vřed Ježek Příbram β 25 01/900 SIN vřed Fryštátská Příbram β 17

18 DRUHÝ SOUBOR KMENŮ SIN PRO rep-pcr září 2010 Č. č. NRL DRUH MATERIÁL BAKTERIOLOG LOKALITA HEMOLYZIN VÝSLEDEK rep-pcr 12 93/892 SIN kůže Hájek Olomouc β S. pseudintermedius 13 94/085 SIN pes Petráš Praha β S. pseudintermedius 14 94/441 SIN krk Petráš Praha β S. pseudintermedius 15 94/822 SIN kožní defekt Eliášová Č. Budějovice β S. pseudintermedius 16 94/921 SIN kůže Petráš Praha β S. pseudintermedius 17 00/227 SIN rána Audesová Plzeň β S. pseudintermedius 18 00/470 SIN rána (pes) Ježek Příbram S. pseudintermedius 19 00/621 SIN krev Votava Brno β S. pseudintermedius 20 00/892 SIN rána Ježek Příbram S. pseudintermedius 21 00/984 SIN rána (pes) Ježek Příbram β S. pseudintermedius 22 01/719 SIN stěr z vředu Ježek Příbram β S. pseudintermedius 23 01/777 SIN ucho Pivoňka Plzeň β S. pseudintermedius 24 01/824 SIN vřed Ježek Příbram β S. pseudintermedius 25 01/900 SIN vřed Fryštátská Příbram β 18 S. pseudintermedius

19 TŘETÍ SOUBOR KMENŮ SIN PRO rep-pcr září 2010 Č. č. NRL DRUH MATERIÁL BAKTERIOLOG LOKALITA HEMOLYZIN 26 02/013 SIN ložisko brada Šimečková Strakonice β 27 02/139 SIN vřed Ježek Příbram β 28 02/172 SIN zvukovod Šimečková Strakonice β 29 02/218 SIN absces Šimečková Strakonice β 30 02/264 SIN píštěl Balejová Č.Budějovice β 31 02/423 SIN furunkl Balejová Č.Budějovice β 32 02/589 SIN píštěl Prokůpková Kladno β 33 02/682 SIN kožní defekt Šimečková Strakonice β 34 02/718 SIN vřed Ježek Příbram β 35 03/033 SIN kožní defekt Šimečková Strakonice β 36 03/087 SIN spojivka Havlová Duchcov δ 37 03/215 SIN rána Balejová Č.Budějovice β 38 03/378 SIN rána Eliášová Č.Budějovice β 19

20 TŘETÍ SOUBOR KMENŮ SIN PRO rep-pcr září 2010 Č. č. NRL DRUH MATERIÁL BAKTERIOLOG LOKALITA HEMOLYZIN VÝSLEDEK rep-pcr 26 02/013 SIN ložisko brada Šimečková Strakonice β S. pseudintermedius 27 02/139 SIN vřed Ježek Příbram β S. pseudintermedius 28 02/172 SIN zvukovod Šimečková Strakonice β S. pseudintermedius 29 02/218 SIN absces Šimečková Strakonice β S. pseudintermedius 30 02/264 SIN píštěl Balejová Č.Budějovice β S. pseudintermedius 31 02/423 SIN furunkl Balejová Č.Budějovice β S. pseudintermedius 32 02/589 SIN píštěl Prokůpková Kladno β S. pseudintermedius 33 02/682 SIN kožní defekt Šimečková Strakonice β S. pseudintermedius 34 02/718 SIN vřed Ježek Příbram β S. pseudintermedius 35 03/033 SIN kožní defekt Šimečková Strakonice β S. pseudintermedius 36 03/087 SIN spojivka Havlová Duchcov δ S. intermedius 37 03/215 SIN rána Balejová Č.Budějovice β S. pseudintermedius 38 03/378 SIN rána Eliášová Č.Budějovice β S. pseudintermedius 20

21 SHLUKOVÁ ANALÝZA VÝSLEDKŮ rep-pcr 21

22 SHLUKOVÁ ANALÝZA VÝSLEDKŮ rep-pcr vrchní část dendrogramu 22

23 SHLUKOVÁ ANALÝZA VÝSLEDKŮ rep-pcr spodní část dendrogramu 03/087 23

24 V CCM byly metodě rep-pcr s primerem (GTG)5 podrobeny i 3 kmeny S. intermedius z jedné renomované evropské sbírky. VÝSLEDEK: 2 kmeny vyšly jako S. pseudintermedius 1 kmen vyšel jako S. schleiferi subsp. coagulans

25 ZÁVĚR Všechny identifikace S. pseudintermedius metodou rep-pcr byly potvrzeny metodou rpob sekvenace. Kmeny olomouckého taxonu pana prof. Hájka S. intermedius jsou zřejmě vzácné. Je pravděpodobné, že velká část našich záchytů, původně určených jako S. intermedius budou kmeny S. pseudintermedius.

26 GENOTYPOVÁ REKLASIFIKACE KMENŮ Staphylococcus intermedius jako Staphylococcus pseudintermedius Pavel Švec, Roman Pantůček, Petr Petráš Děkuju za pozornost!