Univerzita Karlova v Praze. Farmaceutická fakulta v Hradci Králové. Laboratorní průkaz infekce Pneumocystis jiroveci

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Laboratorní průkaz infekce Pneumocystis jiroveci (bakalářská práce) Autor práce: Petra Lišková Vedoucí práce: PharmDr. Barbora Voxová Hradec Králové, 2012

2 Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. datum podpis

3 Ráda bych tímto poděkovala svojí školitelce PharmDr. Barboře Voxové za pomoc, vlídný přístup a odborné vedení během zpracování mé bakalářské práce, dále svým přátelům a rodině za podporu.

4 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biologických a lékařských věd Kandidát: Petra Lišková Školitel: PharmDr. Barbora Voxová Název bakalářské práce: Laboratorní průkaz infekce Pneumocystis jiroveci ABSTRAKT Cílem této bakalářské práce je seznámení se s problematikou onemocnění způsobené Pneumocystis jiroveci. Zabývá se nejenom přenosem infekce, moţnostmi léčby a prevence, ale hlavně laboratorními metodami stanovení. Diagnostické metody zde jsou podrobně popsány a následně zhodnoceny podle výsledků z FNHK za období Výsledky zhodnocení jsou v závěru práce porovnány i s jinými autory zabývající se tímto tématem. Charles Univerzity in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biological and Medical Sciences Candidate: Petra Lišková Supervisor: PharmDr. Barbora Voxová Title of batchelor thesis: Laboratory proof of infection Pneumocystis jiroveci ABSTRACT The aim of this bachelor thesis is familiarization with the issue of diseases caused by Pneumocystis jiroveci. It deals with the transmission of infection not only, options of treatment and prevention, but primarily with laboratory methods of determination. Diagnostic methods are described in detail and then evaluated according to the results from FNHK for the period Results of the evaluation are compared with other authors at the end of the work.

5 OBSAH 1. ÚVOD CÍL PRÁCE TEORETICKÁ ČÁST Pneumocystis jiroveci jako původce pneumocystové pneumonie Historie Biologické vlastnosti Pneumocystis jiroveci Epidemiologie PJ Patologie infekce PJ Klinické příznaky PCP Léčba PCP Cotrimoxazol Pentamidin Dapson Eflornithin Trimetrexat Atovaquon Kortikosteroidy Profylaxe PCP Vznik rezistence na chemoprofylaktika PCP Diagnostika PCP Zobrazovací metody Rentgen Výpočetní tomografie (CT) Mikrobiologické vyšetření Materiál pro vyšetření Odběr materiálu Mikroskopie a diagnostické barvení Imunofluorescenční stanovení Řetězová polymerázová reakce (PCR) EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Vyšetření BAL na přítomnost PJ barvícími technikami Gram-Weigert, Giemsa- Romanovski a Grocott... 21

6 Zpracování materiálů Zpracování materiálu v mikrobiologické laboratoři Zpracování materiálu v histologické laboratoři Barvení Gram-Weigert Barvení Giemsa-Romanowski Barvení dle Grocotta Vyšetření BAL na přítomnost PJ pomocí PCR VÝSLEDKY Úvod Rozdělení pacientů s pozitivní diagnostikou PJ Dle pohlaví Dle věku Dle oddělení Rozdělení dle vyšetření a pozitivních/negativních pacientů Dle počtu vyšetření Dle počtu vyšetřených pacientů Určení hodnoty cut-off Koncentrace DNA u vzorků pozitivních metodou PCR i mikroskopicky Koncentrace DNA u vzorků pozitivních metodou PCR a negativních mikroskopicky Tabulka diagnóz DISKUSE ZÁVĚR SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK... 41

7 1. ÚVOD Pneumocystis carinii (jiroveci) je v dnešní době povaţována za původce pneumonie u osob s oslabenou imunitní funkcí. V mojí bakalářské práci se budu zabývat nejenom tím, jak tato houba v minulosti zamotala hlavu mikrobiologům, ale hlavně její laboratorní diagnostikou v dnešní době. V teoretické části bude pojednáno o tomto patogenu, o moţné léčbě a prevenci. Dále se zaměřuji na metody stanovení, které budou podrobněji popsány i v části experimentální. Zhodnocení dat získaných z ÚKM FNHK je věnována část s výsledky a diskuse. 2. CÍL PRÁCE Seznámit se s laboratorními metodami detekce Pneumocystis jiroveci. Zpracovat teoretickou část o patogenezi onemocnění Pneumocystis jiroveci. Vypracovat literární rešerši zaměřenou na dané téma. Zpracovat výsledky laboratorních vyšetření za období

8 3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1. Pneumocystis jiroveci jako původce pneumocystové pneumonie Historie Prvok nebo houba? To byl v minulém století velký otazník pro vědce - mikrobiology, kteří se touto problematikou zabývali. První identifikoval Pneumocystis na začátku dvacátého století brazilský vědec Carlos Chagas v plicní tkáni morčat. Pouze o rok déle také jeho kolega mikrobiolog A. Carini u krys. A právě v této době došlo k mylnému zařazení Pneumocystis mezi prvoky. Oba mikrobiologové se totiţ domnívali, ţe jde o bakterii příbuznou trypanozomy, jelikoţ právě tímto kmenem infikovali svá pokusná zvířata. Další objevy provedli ve Francii o několik let později pan a paní Delanoe, kteří izolovali Pneumocystis z krys a popsali nový rod. Jako poctu jihoamerickému vědci pojmenovali tohoto ne moc známého prvoka Pneumocystis carinii. Záhadu se podařilo objasnit aţ v 70. letech dvacátého století, kdy aţ prozkoumání molekulární struktury organismu odhalilo, ţe se všichni mýlili a Pneumocystis carinii byla zařazena mezi houby. Ta se v některé literatuře nazývá také Penumocystis jiroveci po českém mikrobiologovi Jírovci. Spolu s Vaňkem vyšetřovali příčinu smrtelné pneumonie u nedonošených kojenců a podařilo se jim prokázat stejný patogen jako o půl století později u pacientů s HIV. V roce 1953 obdrţeli za tento objev státní cenu. Můţe se naskytnout otázka, jaký je rozdíl mezi Pneumocystis jiroveci a Pneumocystis carinii? Votava (2010) uvádí, ţe pro zvířecí kmeny se zachoval název Pneumocystis carinii, pro lidské zase Pneumocystis jiroveci. Tento fakt objasnil i otázku, ţe PJ patří do jednoho samostatného kmene s velkým počtem hostitelů. Největší rozsah pneumocystové pneumonie, jak se tato plicní choroba začala nazývat, vědci zaznamenali s příchodem epidemie viru HIV, kde se nákaza touto houbou stala hlavní smrtelnou komplikací nemoci. Další velká epidemie se datuje do 80. let, kdy se nejenom rozšířil počet pacientů s HIV, ale 7

9 fatální pneumonie se začala objevovat i u ostatních s oslabenou funkcí imunitního systému, jako jsou nemocní po chemoterapii nebo lidé po transplantaci, kdy je nutností nasadit imunosupresivní léčbu. Díky prevenci se v posledních letech počet nakaţených pneumocystovou pneumonií sníţil, a to hlavně podáváním léků k posílení imunity. (Cantwell, 1986), (Kovacs, a další, 2001), (Skřičková, 2005), (Votava, a další, 2010) Biologické vlastnosti Pneumocystis jiroveci PJ se řadí mezi askomycety. Svými vlastnostmi se velice podobá mykotickým organismů v první řadě díky struktuře rrna, v druhé řadě tím, ţe obsahuje téměř totoţné enzymy. Jde o eukaryontní organismus, který díky mitochondriím vyuţívá kyslík k produkci energie. Malou odlišností od ostatních mykotických organismů je obsah cholesterolu místo ergosterolu v buněčné membráně, coţ je zřejmě i důvod, proč je PJ odolná vůči většině antimykotik, které dokáţou ovlivňovat právě ergosterolovou sloţku membránového systému, a tím narušit strukturu mykotické buňky. PJ se vyskytuje ve třech formách: cysty, trofozoiti a precysty. V první fázi hostitel vdechuje cysty, které se v plicích rozpadají na jednotlivá tělíska, ze kterých se vyvíjejí trofozoiti. Ti se rozmnoţují příčným dělením a spojením dvou různých haploidních trofozoitů vznikne zygota, která se vyvine v precystu a následně v cystu. Celý cyklus se následně opakuje. Kaţdé stadium PJ má svůj specifický tvar, velikost i počet jader, podle čehoţ můţeme rozlišit stupeň infekce v klinických vzorcích. (Kovacs, a další, 2001), (Svoboda, 1996), (Votava, a další, 2010) Epidemiologie PJ Mikroorganismus PJ je rozšířen po celém světě. Nejvíce však v Severní Americe a Evropě, kde často dochází ke kombinaci s různými infekcemi, a tím k váţnějšímu průběhu pneumocystové pneumonie. 8

10 Skřičková (2005) ve svém článku uvadí fakt, ţe dle výsledků sérologických vyšetření se většina naší populace setkala s PJ jiţ v prvních letech ţivota. Znamená to, ţe jsme proti infekci PJ celoţivotně chráněni. Pokud se ovšem nedostaneme do stavu, kdy bude patologicky nebo cíleně oslaben náš imunitní systém. Předpokládá se, ţe PJ se přenáší kapénkovou cestou, coţ bylo prokázáno u pokusných zvířat jako nejčastější cesta přenosu. Zdrojem infekce nejsou pouze nakaţení, ale i zdraví jedinci, u kterých infekce nepropukla a slouţí pouze jako přenašeči. Pneumocystová pneumonie je oportunní infekce. PJ má schopnost se mnoţit a růst pouze u jedinců s oslabenou imunitou, kde proti invazivnímu mikroorganismu nemůţou dostatečně zasáhnout sloţky imunitního systému. Velmi ohroţenou skupinou jsou proto předčasně narozené děti, které ještě nemají dostatečně vyvinutou plicní tkáň, dále pak pacienti při podávání cytostatik nebo při imunosupresivní léčbě po transplantacích, kdy je imunitní systém cíleně potlačován, a v neposlední řade lidé s HIV infekcí ve stadiu AIDS. (Rozsypal, 1998), (Skřičková, 2005), (Votava, a další, 2010) Patologie infekce PJ Vdechnutím nejodolnějšího vývojového stadia PJ - cysty se patogen dostane do dýchacích cest, plic a následně aţ do plicních alveol. Pevně se přichytí na pneumocyty a začne se mnohonásobně dělit. U zdravých jedinců je infekce eliminována hned po usazení v plicních sklípcích pomocí makrofágů, ale u oslabených jedinců imunitní systém nemůţe adekvátně zareagovat. Pomnoţené cysty zaplní povrch alveolu a vytvoří zde velké mnoţství exudátu, které zabraňuje dostatečné výměně plynů mezi plicní tkání a krví. Při postiţení větší části plic pacient pociťuje charakteristické příznaky. (více viz kapitola Klinické příznaky PCP) Při kombinaci s cytomegalovirem, virem Ebstain-Baarové, atypickými mykobakteriemi nebo s rutinními bakteriálními infekcemi se předpokládá komplikovanější průběh nemoci s velkou pravděpodobností k recidivě. (Kovacs, a další, 2001), (Svoboda, 1996), (Votava, a další, 2010) 9

11 Klinické příznaky PCP PJ poškozuje plicní tkáň nejen nekontrolovaným mnoţením, ale především produkcí pěnovitého infiltrátu, který blokuje stěnu plicního sklípku. Tím nemůţe docházet k dostatečné výměně plynů, a to hlavně kyslíku. Pokud infekce rychle postupuje, dochází k hypoxii. Nedojde-li k časnému odhalení této nemoci, můţe pro pacienta skončit smrtí. Počáteční klinické příznaky PCP jsou totoţné s příznaky infekce virem HIV, proto se tento stav nedá jednoznačně rozpoznat. Pacient ztrácí váhu, má lehce zvýšenou teplotu, trpí dušností a suchým kašlem. Při podezření na PCP si lékař vyţádá nejenom rentgen plic pacienta, ale i mikrobiologické a imunologické vyšetření. Podle výsledku rozhodne, zdali bude nutné zahájit léčbu.(více o těchto metodách v kapitole 3.2. Diagnostika PCP) Klinický obraz PCP mohou ovlivňovat i jiné mykotické, bakteriální nebo virové infekce. Záleţí tedy na tom, jestli je PJ hlavním patogen poškozující alveoly, nebo zda jde o kombinovanou infekci. (Kovacs, a další, 2001), (Skřičková, 2005), (Svoboda, 1996) Léčba PCP První úspěchy zaznamenali Ivady a Paldy po parenterálním podání pentamidinu v roce 1958, tedy po pěti letech od doby, kdy byla tato infekce brána jako smrtelná. V dnešní době se jako lék první volby uvádí většinou cotrimoxazol. V minulosti se spíše pouţíval toxický pentamidin, kterým se také léčila trypanozomiáza. Záleţí však na lékaři, jaký lék zvolí, a v druhé řadě na stavu pacienta. Lék první volby se můţe lišit u pacientů s AIDS a u pacientů po imunosupresivní léčbě. Dalšími medikamenty mohou být dapson, eflornithin, trimetrexat nebo atovaquon. (Skřičková, 2005), (Svoboda, 1996) 10

12 Cotrimoxazol Nejčastější lék první volby. Podává se buď perorální cestou, nebo intravenózně cestou u pacientů s těţkými průjmy. Aţ u 50% nemocných se po podání objeví alergická reakce a u 30% z nich je to důvod k přerušení léčby cotrimoxazolem. Alergie se můţe projevit jako těţké koţní a slizniční vyráţky, mírné sníţení renální funkce. V krvi se můţe nacházet neutropenie, anemie či trombocytopenie. Jde o dvousloţkový lék. Podává se většinou 20 mg/kg/den trimethoprimu a 100 mg/kg/den sulfamethoxazolu ve třech aţ čtyřech dávkách. Terapii je dobré kombinovat s 50 mg acidum folinicum (folinová kyselina) za týden. Úspěšnost léčby cotrimoxazolem se odhaduje na 80%. (Svoboda, 1996) Pentamidin Dříve se pouţíval k léčbě spavé nemoci (trypanozomiázy). Od roku 1958 se však začal dávkovat nakaţeným PCP, coţ vedlo k vysokému sníţení mortality. Pentamidin se u těţkých forem podává intravenózně po dobu tří týdnů v dávce 3 mg/kg/den. U lehčích forem se podává v podobě aerosolu. Podmínkou je, aby pacient při inhalaci aerosolu leţel. Dosáhne se tak vysoké koncentrace léčiva v plicích a bez váţnějších vedlejších účinků jako jsou hypotenze a následné kolapsové stavy, indukce pankreatitidy, hypoglykémie, hypokalcémie, křeče. Anemie nejsou tak rozsáhlé jako u cotrimoxazolu. Předcházet vedlejším účinkům můţeme pouze včasným podáním netlumivých léků proti alergiím. Pokud se jedná o pacienta ve velmi váţném stavu, je moţné podávat první dny léčby pentamidin s cotrimoxazolem současně, obvykle i s kortikosteroidy. (Svoboda, 1996) 11

13 Dapson Obvykle je tento lék podáván v kombinaci s trimethoprimem (dapson 100mg/den, trimethoprim 20mg/den). Oba tyto přípravky mohou způsobovat řadu vedlejších účinků. Trimethoprim v kombinaci s dapsonem nebo jiným léčivem můţe způsobovat váţnou hyperkalémii, která v některých případech můţe končit i smrtí. Neţádoucí účinky dapsonu na lidský organismus jsou anémie a methemoglobinémie, coţ je zvýšený výskyt oxidovaného hemoglobinu v krvi. To má za následek sníţenou vazbu kyslíku na erytrocyty a následnou hypoxii tkání. Účinnost kombinace dapson trimethoprim se udává kolem 65%. (Svoboda, 1996) Eflornithin Dříve pouţívaný jako lék proti spavé nemoci trypanozomiázy. Principem působení eflornithinu je inhibice ornithindekarboxyláz. Dávkování po šesti hodinách intravenózně v koncentraci 100 mg/kg v prvních dvou týdnech terapie. Posléze moţnost perorálního podávání v mnoţství 300 mg/den. Jako hlavní vedlejší účinek se uvádí trombocytopenie. Účinnost léčby 60%. (Svoboda, 1996) Trimetrexat Podává se pacientům, u kterých předchozí preparáty neúčinkovaly z důvodu vyvinuté rezistence PJ. Jedná se tedy o celkem toxický lék způsobující inhibici dihydrofolátreduktázy, a proto se mezi neţádoucí účinky řadí jak trombocytopenie, tak patologické zvýšení aminotransferáz. Jde o rizikový faktor, proto se doporučuje v průběhu terapie provádět kontrolní testy. Klasické dávkování je 30 mg/m 2 /den intravenózně. (Svoboda, 1996) 12

14 Atovaquon Ve srovnání s cotrimoxazolem je tento přípravek daleko lépe snášen, ale s niţším účinkem. K tomu přispívá i jeden z hlavních vedlejších účinků, a to častý průjem. Tím se sníţí vstřebávání tohoto perorálního léčiva. (Svoboda, 1996) Kortikosteroidy U těţkých forem PCP se zavedlo pouţívání kortikosteroidů. S terapií se však musí začít ve správný čas. K tomu nám můţe dopomoci vyšetření krevních plynů. Pokud se hodnota PaO 2 pohybuje nad 70 mmhg, léčba pomocí kortikosteroidů ještě není nutná. U hodnot mezi 50 aţ 70 mmhg volíme perorální uţívání. U velmi těţkých PCP s hodnotou PaO 2 pod 50 mmhg se kortikosteroidy z počátku podávají intravenózně. Účinnost léčby se hodnotí hlavně podle klinického obrazu pacienta. Hlavní je rentgenový snímek plic a test na krevní plyny PaO2. Nelze hodnotit dle vyšetření perzistence vzorku BAL. To se provádí pouze na začátku onemocnění pro stanovení diagnózy. Pokud terapie kortikosteroidy není účinná, neexistuje v podstatě jiţ ţádný přípravek, který by zabránil ireverzibilní fibróze plic. Zhoršení stavu můţe být způsobeno například jinou infekcí v organismu, a tím většímu oslabení imunity. (Svoboda, 1996) Profylaxe PCP Vzhledem ke stoupajícímu počtu pacientů s PCP bylo nutné zahájit preventivní opatření profylaxi. Dělíme ji na primární, kdy se preventivní léčba zahajuje ještě před nákazou PJ. Hlavním signálem pro zahájení primární profylaxe je sníţení CD4+ T lymfocytů pod 0,2 x 10 9 /l. Sekundární je doporučena aţ po prodělání PCP. Dále musí lékař nutně zohlednit stav pacienta a příčinu nákazy PJ. Poté zvolí rozdílnou preventivní léčbu pro pacienty s HIV, rakovinou nebo po transplantaci. 13

15 Nejčastěji se podává cotrimoxazol. Tedy dvousloţkový lék skládající se z sulfamethoxazolu a trimethoprimu. Malou nevýhodou je zatím neprokázaná účinnost proti Toxoplazmě gondii. Při takové profylaxi se pravidelně kontroluje krevní obraz pacientů, kvůli riziku leukopenie. Sporadicky se objevují vedlejší nepříznivé účinky v podobě vyráţek na kůţi a sliznicích. Jako další alternativa pro prevenci PCP se uvádí dapson. Pacienty je lépe tolerován, aţ na riziko methemoglobinémie, a navíc je účinnou prevencí i proti Toxoplazmě gondii. Pokud v průběhu profylaxe vedlejší účinky neustupují, můţeme zvolit aplikaci léčiva pomocí aerosolu. Tato terapie by měla probíhat výhradně v poloze v leţe pomocí inhalátorů. Ve většině případů se jako inhalační léčivo pouţívá pentamidin nebo kombinovaný přípravek sulfadoxinu a pyrimethaminu. Tato profylaxe však nemůţe zabránit klinickým projevům extrapulmonární infekce PJ. Účinnost preventivní profylaxe se v dnešní době pohybuje okolo 90%. Dalším způsobem, jak ochránit rizikovou skupinu pacientů, je zvýšit odolnost jejich imunitního systému pomocí podpůrné léčby různého druhu. (Kovacs, a další, 2001), (Skřičková, 2005), (Svoboda, 1996) Vznik rezistence na chemoprofylaktika PCP Většinovou sloţku terapie i profylaxe tvoří sulfonamidy. Podávají se jako dvě účinné látky: sulfamethoxazol a trimethoprim. Při zkouškách účinnosti terapie na zvířatech však došlo k zjištění, ţe druhá sloţka trimethoprim na PJ nepůsobí. Proto vědci došli k názoru, ţe dvousloţková léčba je vlastně pouze léčba sulfamethoxazolem. Ten působí na PJ enzymem DHPS, který negativně ovlivňuje syntézu kyseliny listové. Rezistentní na sulfonamidy je řada mikrobů. Uplatňuje se přitom bodová mutace v oblasti genu pro DHPS. Proto se předpokládá, ţe při časté profylaxi si vyvine rezistenci i PJ. Dnešní rezistence PJ má poměrně nízký dopad na účinnost terapie. Dá se ale předpokládat, ţe vlivem časté sulfonamidové profylaxe se bude síla rezistence PJ zvyšovat. Největší měrou se na tom budou podílet další bodové mutace v genomu PJ, a proto se část výzkumu v laboratořích molekulární 14

16 biologie zaměřuje i na tuto problematiku. Snaţí se sekvenovat genetickou informaci, a tím přispět k lepší terapii pacientů s PCP. (Kovacs, a další, 2001) 3.2. Diagnostika PCP Odhalit nákazu PJ můţe být na počátku onemocnění poněkud obtíţné. U pacientů s AIDS je průběh PCP pozvolný a subakutní, naopak u jedinců po transplantaci nebo chemoterapii bývá nástup rychlý a komplikovaný. V dnešní době se k diagnostice PCP pouţívají metody pro zobrazení plic pacienta a speciální mikrobiologické testy pro odhalení PJ v biologickém materiálu. (Kovacs, a další, 2009) Zobrazovací metody Pomocí zobrazovacích metod u pacientů se sníţenou imunitní funkcí můţeme potvrdit nebo vyloučit porušení plicní tkáně a určíme i velikost poškození plicního parenchymu. Dále se tyto metody vyuţívají ke sledování stavů pacientů během léčby. (Cetkovský, a další, 2009) Rentgen Snímání hrudníku se provádí z přední a zadní strany. Pacient musí stát a mít zadrţený dech. Popřípadě lze doplnit i snímky zleva a zprava. V některých případech, kdy je pacient ve váţném stavu a není schopen vyšetření ve stoje, se můţe pouţít přenosný přístroj, který je součástí vybavení některých oddělení. Dále je moţné nemocného převést na radiologii a provést vyšetření vleţe. Pomocí rentgenu hrudníku můţeme rozlišit patologické změny v plicním parenchymu, rozvinutí plicních křídel, a také lze potvrdit nebo vyvrátit tekutinu v pleurální dutině. 15

17 Kaţdá diagnostická metoda má samozřejmě své pro a proti. Mezi výhody rentgenu patří snadná dostupnost, rychlost, poměrně nízká cena, a tudíţ i moţná opakovatelnost. Jako nevýhodu spatřujeme velké riziko radiačního záření, zvláště u mladších pacientů nebo u těhotných ţen. Při vyhodnocení snímku u pacientů s PCP často nalezneme infiltráty, které později napadají alveoly. Jedná se většinou o symetrické, intersticiální nebo retikulogranulární útvary. (Cetkovský, a další, 2009), (Kovacs, a další, 2009) Výpočetní tomografie (CT) CT neboli computed tomography se také pouţívá k získání snímků hrudníku pacienta, ale jedná se o snímky rozdílné od těch rentgenových. Jde totiţ o kombinaci klasického rentgenového vyšetření a výpočetní techniky. Princip metody se zakládá na postupném snímání těla v transverzální rovině, kdy dostáváme podrobnou informaci o sloţení jednotlivých tkání. Nejčastěji se vyuţívá k vyšetření mozku, páteře, hrudníku i orgánů v břišní dutině, a to většinou k odhalení nádorového bujení. Pro lepší zobrazení struktury cévního systému se můţe pacientovi před vyšetřením intravenózně aplikovat kontrastní látka. Tím lékař přesněji rozpozná cévy od patologických loţisek. V dnešní době je při onemocnění plic moţné vyšetření s vysokou schopností rozlišení. U této metody jsou jednotlivé vrstvy široké 1 aţ 2 mm, ale mají mezi sebou mezeru 10 aţ 20 mm, coţ můţe zapříčinit chybu v detekci malého loţiska. Jedinou výhodou je sníţená radiační zátěţ. Při porovnání s klasickou rentgenovou technikou se CT řadí mezi ty citlivější, ale cena je samozřejmě mnohonásobně vyšší. (Cetkovský, a další, 2009) Mikrobiologické vyšetření Rutinní vyšetření jako je analýza krve, moči, základní biochemická stanovení nebo rentgenové snímky hrudníku nemohou s určitostí potvrdit infekci 16

18 způsobenou PJ. Proto se vyuţívá mikrobiologické vyšetření materiálu, který přímo souvisí s plicní tkání. Další moţností důkazu jsou histologické techniky, které prokáţou po vhodném obarvení PJ přímo v tkáňovém řezu. (Skřičková, 2005) Materiál pro vyšetření Při průkazu PJ rozlišujeme různé druhy biologického materiálu. Mezi ty nejčastější patří bronchoalveolární tekutina, indukované sputum, neindukované sputum, plicní tkáň získaná biopsií a další. Senzitivita záchytu je u kaţdého materiálu rozdílná. Viz tabulka č. 1. (Skřičková, 2005) Tab. 1. Porovnání senzitivity záchytu PJ u různých materiálů (Skřičková, 2005) Materiál Senzitivita transbronchiální biopsie + BAL % otevřená plicní biopsie 99% transbronchiální biopsie 88-97% BAL - bronchoalveolární laváţ 79-97% indukované sputum + imunofluorescence 94% laváţ nebronchoskopickou cestou 83-88% indukované sputum 55-80% bronchiální výplach 79% bronchiální brushing 39-79% neindukované sputum 30% Odběr materiálu Nejsnáze získaný biologický materiál pro diagnostiku PCP je neindukované sputum. Tento typ sputa pacient samovolně vykašlává do plastové zkumavky, poté je vzorek centrifugován, nabarven a zkušeným laborantem odečten výsledek. Jde o materiál, ze kterého zachytíme PJ s opravdu malou pravděpodobností. Viz. Tab. 1. Postupem doby se odebírání vzorků zdokonalilo. Zlepšení se projevilo při odebírání sputa, bronchoalveolární tekutiny, a také u biopsie plicní tkáně. 17

19 V dnešních nemocničních zařízeních se provádí odběr indukovaného sputa. Jde o techniku, kdy se pacientům nebulizátorem před odběrem navlhčí dýchací cesty. Díky tomu se získá kvalitnější materiál a moţnost záchytu PJ se zvýší. BAL neboli bronchoalveolární laváţ je poněkud nepříjemná procedura, při které se nemocným zavádí do dýchacích cest hadička. Tou se nejdříve plíce naplní daným objemem fyziologického roztoku a poté se zpátky odsaje do připravených zkumavek. Metoda je často vyuţívaná pro svou specifičnost i nízké náklady na provedení. Mezi nejdokonalejší a nejnáročnější metody odebrání materiálu patří biopsie. Náročnost je nejenom na provedení, ale jde také o velký zásah do organismu pacienta. V minulosti byly pouţívány obyčejné bronchoskopy, neţ se přešlo na modernější ohebné. Díky nim jsou dnes do histologických laboratoří přijímány vzorky lepší kvality a s téměř stoprocentní senzitivitou pro odhalení PJ. (Kovacs, a další, 2001), (Kovacs, a další, 2009), (Skřičková, 2005) Mikroskopie a diagnostické barvení Hlavní materiály pro barvení jsou bronchoalveolární tekutina, indukované sputum nebo bioptická tkáň. Můţeme je rozdělit na přirozeně sterilní materiál, kde neočekáváme ţádné jiné antigeny a kam řadíme právě bronchoalveolární laváţ. Mezi přirozeně nesterilní materiály patří sputa, která fyziologicky obsahují širokou řadu mikroorganismů, které nám mohou zkreslovat výsledek vyšetření, a proto není tolik specifické jako například BAL. Pokud máme dostatek materiálu, můţeme se rozhodnou, zda budeme pozorovat nativní nebo obarvený preparát. Oba nám poskytnou poměrně rychlou odezvu o tom, co se v organismu děje. Protoţe ale tato technika není dostatečně citlivá, musíme mikroskopii doplnit o další vhodně zvolená vyšetření nebo specifické barvení. Je zřejmé, ţe různá stadia PJ se budou barvit různě a bude tedy potřeba pouţít dobré barvící techniky. V praxi se nejčastěji pouţívá barvení dle Giemsy-Romanowského, Gram-Weigerta nebo stříbření dle Grocotta pro obarvení histologických řezů. Další moţností je imunofluorescence, která zvyšuje 18

20 nejen senzitivitu stanovení, ale i pravděpodobnost pozitivního záchytu PJ. (Viz Imunofluorescenční stanovení) Správná volba diagnostického barvení závisí na celém výsledku stanovení. V dnešní době není klasické mikrobiologické barvení povaţováno za nejlepší diagnostický postup, ale pro svou jednoduchost a rychlost se stále pouţívá. Ovšem doplněno o další metody, jako je například řetězová polymerázová reakce. (Cetkovský, a další, 2009), (Kovacs, a další, 2001), (Kovacs, a další, 2009), (Kultan, a další, 2008), (Skřičková, 2005) Imunofluorescenční stanovení Ve většině zdrojů se metoda imunofluorescence uvádí jako nejcitlivější. Začala se pouţívat kolem roku 1986 pro odhalení cystických i trofozoitových stadií PJ v biologickém materiálu. I kdyţ trofozoiti nejsou ve vzorku tolik rozpoznatelné. Hlavní princip spočívá ve vyuţití monoklonálních protilátek, které reagují s lidskými kmeny PJ. Tento postup se postupem času zdokonaloval a například při pouţití protilátek 2G2 se dají odhalit i dříve problematická trofozoitová stadia. Jde o metodu poměrně jednoduchou na provedení a velice citlivou. Uvádí se, ţe senzitivita se pohybuje okolo 90-95% a specificita aţ 100%. Odborníci v oboru však vţdy doporučují doplnit stanovení nepřímou fluorescencí i cytologickým vyšetřením. (Kovacs, a další, 2001), (Kovacs, a další, 2009), (Skřičková, 2005) Řetězová polymerázová reakce (PCR) Řetězovou polymerázovou reakci řadíme do molekulárně-biologických metod. V dnešní době je široce vyuţívána nejenom v laboratořích zaměřených na molekulární biologii, ale i v ostatních vědních oborech. Principem je několikanásobné zmnoţení úseku nukleové kyseliny ve třech teplotních skocích. Přitom dochází k postupné denaturaci dvouvláknové 19

21 nukleové kyseliny a k rozpletení na dva jednotlivé řetězce. Následně se pomocí oligonukleotidových primerů označí úseky na nukleové kyselině, které se v následujícím kroku namnoţí. Díky tomu lze odhalit pozitivní nález i v mikroskopických mnoţstvích vzorku. Další výhodou je moţnost rychlého vyhodnocení. Vyuţívá se nejenom k detekci daného agens, ale také k typizaci a identifikaci. Nezbytnou součástí reakční směsi musí být řada specifických látek. Patří mezi ně enzym DNA-polymeráza, která katalyzuje syntézu vznikající DNA. Kvůli velkým teplotním změnám se pouţívá termostabilní Taq-polymeráza, izolovaná z Thermus aquaticus. Odolá teplotám do 98 C. V mikrozkumavce, ve které probíhá PCR, nesmí dále chybět hořečnaté ionty s katalytickou funkcí, deoxynukleotidtrifosfáty na stavbu nové DNA a pufr pro udrţení stabilního ph. Jednou z nevýhod klasické PCR je nemoţnost kvantifikace v průběhu reakce, jelikoţ se vyhodnocuje aţ výsledný produkt. Zavedení takzvané real-time PCR umoţnilo měřit koncentraci produktu za jednotku času. (Cetkovský, a další, 2009), (Průša, 1997) 20

22 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1. Vyšetření BAL na přítomnost PJ barvícími technikami Gram- Weigert, Giemsa-Romanovski a Grocott Zpracování materiálů Zpracování materiálu v mikrobiologické laboratoři 1) Necháme odstředit při ot/min po dobu 10 minut. 2) Naneseme sediment na 6 podloţních sklíček a rozetřeme do velikosti pokrývající asi dvě třetiny plochy sklíčka. (5x k barvení, 1x na úschovu) 3) Sušíme dle hustoty materiálu 2-24 hodin v uzavřené papírové krabičce. (k zabránění náhodného kontaktu s hmyzem apod.) 4) Barvíme dle Giemsy-Romanowského (GR). 2 sklíčka 5) Barvíme dle Gram-Weigerta (GW). 2 sklíčka 6) Barvíme dle Grama (G). 1 sklíčko 7) Původní BAL uschováme v chladničce do uzavření výsledku, poté umístíme předepsaným způsobem do biologického odpadu Zpracování materiálu v histologické laboratoři 1) Připravíme 3 podloţní sklíčka, která si popíšeme.(2x 200μl, 1x400μl) 2) Sklíčka umístíme do speciálního svěráku, na kaţdé vloţíme filtrační papír s otvorem 5 mm a speciální nálevku na tekutý vzorek. Svěrák utáhneme. 3) Do kaţdé nálevky nadávkujeme daný objem vzorku. (2x200μl, 1x400μl) Příprava preparátu Foto: Petra Lišková 4) Vloţíme do přístroje Cytospin 4, vhodně vyváţíme. 5) Necháme točit při 400 ot/min, 5 minut. 21

23 6) Po dotočení vyndáme svěráky z přístroje, sklíčka uvolníme ze svěráků, necháme zaschnout a obarvíme Barvení Gram-Weigert Cytospin 4 Foto: Petra Lišková 1) Připravíme roztěry na podloţní sklíčka, necháme řádně zaschnout při pokojové teplotě, fixujeme metanolem (3-5 minut), necháme zaschnout. 2) 1% eosin Y po dobu 5 min. 3) Barvivo spláchneme pod proudem vody mírně tekoucí. 4) Roztok krystal violeti 5 min. Barvení Gram-Weigert Archiv ÚKM FNHK 5) Barvivo smyjeme Gram-jódovým roztokem odchází jako lesklé obláčky. 6) Gram-jódový roztok nechat převrstvený po dobu 5 minut 7) Roztok opatrně opláchneme pod proudem mírně tekoucí vody (vodovodní), necháme zaschnout. 8) Po zaschnutí preparáty diferencujeme roztokem anilin-xylenu (na sklíčka kapeme roztok anilin-xylenu tak dlouho, dokud odchází modré barvivo), odbarvování ukončíme opláchnutím sklíčka v xylenu. 9) Po usušení prohlíţíme mikroskopem (imerzí). 10) Odečtené preparáty uchováváme v označené krabičce Barvení Giemsa-Romanowski 1) Zaschlý preparát fixujeme metylalkoholem 5 min, poté sklopíme sklíčko a necháme Barvení Giemsa-Romanowski 22

24 uschnout. 2) Preparáty umístíme do barvicí kyvety 3) Barvíme roztokem Giemsy-Romanowského, ředěným 1:10 pufrovanou vodou ph 7,2-7,6. 15 min 25 min, dle vybarvení leukocytů při prvním barvení danou šarţí. (K přípravě pracovního roztoku 1 : 10 pouţíváme plastový odměrný válec 100 ml, na kterém jsou vyznačeny fixem dvě značky. Ke spodní značce nalijeme pufrovanou vodou, pak se k horní značce dolije roztok Giemsy- Romanowského). 4) Asi 2 minuty před koncem doby barvení dolijeme kyvety pufrovanou destilovanou vodu a 1-2 minuty jemně poklepáváme kyvetou tzv. probarvování. 5) Opláchneme proudem vodovodní vody jemně vpouštěným do rohu kyvety tak, aby barvivo s případnými artefakty odtékalo vrchem aţ do odtékání čisté vodovodní vody. 6) Preparáty necháme uschnout při pokojové teplotě, příp. osušíme v digestoři proudem vzduchu odtah. 7) Preparáty se prohlíţí imerzním systémem při zvětšení ) Zhodnocené preparáty se ukládají do kontejnerů a uchovávají se v laboratoři po dobu 3 let Barvení dle Grocotta Toto barvení se pouţívá výjimečně pro barevní histologických řezů většinou plicní tkáně při podezření na nákazu PJ Postup 1) Vzorek odparafinujeme a opláchneme destilovanou vodou. 2) Pouţijeme kyselinu jodistou (5%vodný roztok) a necháme působit 10 minut. 3) Vypereme v tekoucí vodě a poté oplachujeme v destilované vodě po dobu 10 minut. Barvení dle Grocotta anapath-paris7.aphp.fr 23

25 4) Naneseme kalium metabisulfit (1%) a necháme působit 1 minutu a opláchneme pitnou vodou. 5) Opláchneme destilovanou vodou (3x vyměníme) po dobu 5 minut. 6) Vloţíme vzorky do impregnačního roztoku ve vodní při 60 C na dobu minut. Po tomto kroku následuje kontrola barvení v mikroskopu. 7) Opláchneme destilovanou vodou ve vodní lázni při 60 C. 8) Nakapeme chlorid zlatitý 0.1% (1ml 10% chloridu zlatitého + 98ml destilované vody) a necháme působit 5 minut. 9) Opláchneme v destilované vodě. 10) Nakapeme sirnatan sodný 2% (2g doplnit do 100ml destilovanou vodou) a necháme působit 1 minutu. 11) Opláchneme v destilované vodě po dobu 3 minut. 12) Pouţijeme jádrovou červeň a necháme působit 5-10 minut. 13) Opláchneme v destilované vodě. 14) Odvodníme a montujeme Hodnocení výsledků Plísně se barví černě, vnitřní části mycelií a hyf starorůţově, mucin černě, jádra buněk červeně Vyšetření BAL na přítomnost PJ pomocí PCR Princip K průkazu a kvantifikaci DNA PJ se pouţívá metoda rtpcr (real-time PCR) s vyuţitím primerů a hydrolytické sondy z oblasti mitochondriální rrna na přístroji RotorGene Sonda je na jednom konci značena fluorescenčním barvivem FAM (6- karboxyfluorescein) a na druhém konci BHQ (Black Hole Quencher), který slouţí jako nefluorescenční zhášeč. Kontrola inhibice DNA polymerázy je zajištěna koamplifikací DNA inhibiční kontroly, která je součástí Digestoř pro přípravu master mixu Foto: Petra Lišková amplifikační směsi QuantiFast Pathogen PCR + IC. DNA inhibiční kontroly je 24

26 syntetická DNA unikátní sekvence, která není homologní s jinou sekvencí z GenBank databáze. Sonda pro inhibiční kontrolu je značena fluorescenční barvou MAX NHS Ester, která má detekční profil JOE. Detekce PJ je umoţněna on-line záznamem fluorescence reporteru na konci kroku o teplotě 60 C univerzálního teplotního profilu pro hydrolytické sondy, tzn. měření fluorescence na kanálu JOE (555 nm). Velikost produktu pro mitochondriální rrna je 232 bp Postup 1) Izolace DNA Pneumocystis jiroveci Izolace DNA se provádí komerčním kitem. Zpracování materiálu, izolace DNA a její uchování se provádí ve speciální místnosti určené pro tuto činnost. Vyizolovaná DNA je skladována do provedení rtpcr a výdeje výsledku v lednici v 1,5ml zkumavkách označených štítkem, na kterém je uvedeno jméno pacienta, typ materiálu a datum odběru. V případě potřeby je DNA skladována při - 20 C nebo - 70 C v označených krabičkách. Autosampler s PCR zkumavkami Foto: Petra Lišková 2) Amplifikace metodou PCR Pro amplifikaci DNA se pouţívá metoda real-time PCR na přístroji RotorGene 3000, primery a sonda z oblasti mitochondriální rrna. Během reakce dochází zároveň ke koamplifikaci inhibiční kontroly (QuantiFast Pathogen PCR + IC). Příprava amplifikační směsi ( master mixu ) probíhá podle návodu a surovin dodaných od výrobce. Pipetujeme 10 μl připravené směsi a přidáme směs RotorGene 3000 Foto: Petra Lišková primery/sonda/voda o objemu 10 μl (dle tabulky). 25

27 Primer 1 (Reverse) 0,3 μmol/l 0,75 μl Primer 2 (Forward) 0,3 μmol/l 0,75 μl Sonda 0.25 μmol/l 0,625 μl Voda ad 10 μl 7,875 μl Celkem 10 μl Amplifikační směs se připravuje v laminárním boxu ve speciální místnosti. 3) K 20 μl připravené směsi přidáme ve speciální místnosti templátovou DNA 5 μl. 4) Amplifikace probíhá na přístroji RotorGene 3000 určeném pro real-time PCR. Denaturace: 95 C 5 min. Annealing: 96 C 15 s Elongace: 60 C 30 s 45x 5) Fluorimetrická detekce s on-line záznamem na počítači. Odečet fluorescence se provádí na kanále JOE na konci kroku o teplotě 60 C. Nastavení thesholdu je prováděno softwarem na základě vyhodnocení kalibrační křivky vytvořené pomocí standardů, připravených desítkovým ředěním zásobního roztoku o koncentraci kopií/μl Výsledky Vysokoškolský pracovník provede odečet výsledků a analytickou kontrolu, u pozitivních vzorků s poţadavkem na kvantifikaci provede přepočet výsledku z kopií/μl na kopie/ml dle daného vzorce. Forma výsledku DNA prokázána/ DNA neprokázána, v případě kvantifikace je zapsána číselná hodnota v kopiích plazmidové DNA/ml. 26

28 Počet pacientů s PCP 5. VÝSLEDKY 5.1. Úvod Zde jsou zhodnoceny výsledky praktické části tj. výsledky vyšetření pomocí metody PCR a barvícími metodami. Tyto metody budu porovnávat a dále rozdělovat vyšetřené pacienty dle různých aspektů. Podkladový materiál tzn. diagnózy, oddělení a výsledky vyšetření jsem získala z Ústavu klinické mikrobiologie FNHK a z Ústavu klinické biochemie a diagnostiky FNHK. Výsledky jsou zpracovány za období Rozdělení pacientů s pozitivní diagnostikou PJ Dle pohlaví Rozdělení nemocných s PCP dle pohlaví Celkový počet pacientů s PCP Muţi s PCP Ţeny s PCP Procentuální zastoupení můţů a ţen s PCP Muţi Ţeny 41% 59% 27

29 Počet pacientů Závěr: Výsledky zpracovány za období Z dosaţených dat vyplývá, ţe zastoupení muţů a ţen s diagnostikovanou PCP je podobné. Nedá se tedy o PCP jasně říci, zdali je typická pro muţskou nebo ţenskou skupinu populace Dle věku Rozloţení pacientů s PCP mezi věkové skupiny < 30 let 30 aţ 40 let aţ 50 let aţ 60 let aţ 70 let 70 aţ 80 let 4 > 80 let < 30 let 30 aţ 40 let 40 aţ 50 let 50 aţ 60 let 60 aţ 70 let 70 aţ 80 let > 80 let Věková skupina Procentuální rozloţení věkových skupin 28% 3% 2% 6% 7% < 30 let 30 aţ 40 let 23% 40 aţ 50 let 50 aţ 60 let 60 aţ 70 let 70 aţ 80 let > 80 let 31% Závěr: Nejvíce pozitivních pacientů spadá do skupiny mezi 60 aţ 70 lety, následovány jsou věkovými skupinami let a let. Nejméně jich nalezneme ve skupině mladších 30-ti let. 28

30 Dle oddělení Rozdělení pozitivních pacientů dle oddělení INT 2.INT Plicní klinika KARIM KOR KGM KCH 23 Chirurgie OKH Odd. TRN nem. Jičín Hem. por. PCE Hemodial. středisko Náchod Neurologie Náchod 1.INT - 1.Interní klinika; 2.INT - 2.Interní klinika; KARIM - Klinika anesteziologie, resuscitace a intenzivní medicíny; KOR - Klinika onkologie a radioterapie; KGM - Klinika gerontologická a metabolická; KCH - Kardiochirurgická klinika; OKH - Oddělení klinické hematologie Závěr: Nejvíce vzorků pozitivních na PJ bylo do laboratoře zasláno z plicní kliniky FNHK. 29

31 Počet vyšetření Počet vyšetření 5.3. Rozdělení dle vyšetření a pozitivních/negativních pacientů Dle počtu vyšetření Mikroskopická vyšetření PJ Počet vyšetření Počet pozitivních vyšetření Rok Vyšetření PJ metodou PCR Počet vyšetření Počet pozitivních vyšetření Rok Závěr: Zatímco mikroskopicky bylo pozitivních 10 vyšetření z Metodou PCR bylo pozitivních 138 vzorků z Všechny hodnoty sečteny za období

32 Počet pacientů Počet pacientů Dle počtu vyšetřených pacientů Počet pacientů vyšetřených mikroskopicky Počet vyšetřených pacientů Počet pozitivních pacientů Rok Počet vyšetřených pacientů metodou PCR Počet vyšetřených pacientů Počet pozitivních pacientů Rok Závěr: Mikroskopicky bylo vyšetřeno celkem 872 pacientů a z toho 9 s pozitivním výsledkem. Metodou PCR se vyšetřilo pacientů a pozitivní výsledek mělo 119. Veškeré výsledky sečteny za období Určení hodnoty cut-off V této kapitole se pokusím odhadnout hodnotu cut-off, tedy hodnotu koncentrace, při které je PJ moţno odhalit nejenom metodou PCR, ale i barvícími technikami. 31

33 Počet kopií DNA/ml Počet kopií DNA/ml Koncentrace DNA u vzorků pozitivních metodou PCR i mikroskopicky Kvantifikace PCR u pacientů mikroskopicky pozitivních 4,00E+07 3,50E+07 3,47E+07 3,00E+07 2,50E+07 2,24E+07 2,00E+07 1,50E+07 1,00E+07 7,61E+06 1,41E+07 5,00E+06 0,00E+00 6,00E+05 4,00E+02 1,43E+05 5,20E+02 1,32E Pacienti Závěr: Jak je podle grafu patrné, hodnoty koncentrací se liší. Dle nejniţší koncentrace by se dala odhadovat hodnota, při které by byl moţný záchyt PJ mikroskopií. V tomto případě se jedná o hodnotu E+02 (10 2 ) Koncentrace DNA u vzorků pozitivních metodou PCR a negativních mikroskopicky Kvantifikace PCR u pacientů mikroskopicky negativních 1,60E+05 1,50E+05 1,40E+05 1,20E+05 1,00E+05 8,00E+04 6,00E+04 4,00E+04 2,00E+04 0,00E+00 3,30E+04 2,70E+04 1,80E+04 1,91E+03 1,00E+02 2,04E+03 1,73E+04 4,46E Pacienti Závěr: Náhodně vybrané koncentrace pacientů s negativními mikroskopickými výsledky. Hodnoty jsou rozptýleny stejně jako v předešlém grafu. Tyto hodnoty ovšem nesplňují výše uvedenou podmínku, ţe pokud bude koncentrace nukleové kyseliny ve vzorku vyšší neţ E+02 (10 2 ), bude tento vzorek pozitivní i mikroskopicky. Nelze tedy určit 32

34 hodnotu cut-off, jelikoţ záchyt PJ mikroskopicky zřejmě není závislý na její koncentraci ve vzorku Tabulka diagnóz Kód dg. C341 C349 C504 C64 C712 C829 C833 C835 C839 C859 C911 C920 D467 D591 D598 D611 D693 D696 D70 D860 E240 I38 I460 I499 I500 I501 I652 I714 J029 J159 J180 J189 J209 J40 J42 J441 J448 J449 J450 J459 J47 Popis diagnózy Zhoubný novotvar průdušky - bronchu a plíce, Horní lalok, bronchus nebo plíce Zhoubný novotvar průdušky - průduška a plíce Zhoubný novotvar prsu - horní zevní kvadrant prsu Zhoubný novotvar ledviny mimo pánvičku Zhoubný novotvar mozku - spánkový lalok (lobus temporalis) Ne-Hodginův folikulární (nodulární) lymfom - N-H folikulární lymfom, NS Ne-Hodginův (difúzní) lymfom - (difúzní), velké (histiocytické) buňky, retikulocelulární sarkom Ne-Hodginův (difúzní) lymfom - (difúzní), imunoblastický Ne-Hodginův (difúzní) lymfom - (difúzní) lymfoblastický Ne-Hodginův lymfom, jiných a neurčených typů - NH lymfom, typ NS, maligní lymfom NS Lymfoidní leukémie - Chronická lymfocytární leukemie Myeloidní leukémie - Akutní myeloidní leukémie MDS - Jiné myelodysplastické syndromy Získané hemolytické anémie - Jiné autoimunní hemolytické anémie Získané hemolytické anémie - Jiné získané hemolytické anémie Jiné aplastické anémie - Aplastická anémie vyvolaná léky Purpura a jiné krvácivé stavy - Idiopatická trombocytopenická purpura, Evansův syndrom Purpura a jiné krvácivé stavy - Trombocytopenie, NS Agranulocytóza Sarkoidóza - sarcoidosis - Sarkoidóza plic Cushingův syndrom - Cushingův syndrom závislý na hypofýze Endokarditis neurčené chlopně Srdeční zástava - Srdeční zástava s úspěšnou resuscitací Jiné srdeční arytmie - Srdeční arytmie, NS Selhání srdce - Městnavé selhání srdce Selhání srdce - Selhání levé komory Uzávěr (okluze) a zúţení (stenóza) přívodných mozkových tepen nekončící mozkovým infarktem - Okluze a stenóza krkavice (karotidy) Výduť aorty - aneurysma aortae - a disekce - Aneurysma břišní aorty, bez zmínky o ruptuře Kutní zánět hltanu - Akutní zánět hltanu, NS Bakteriální zánět plic, nezařazený jinde - Bakteriální zánět plic, NS Pneumonie, původce NS - Bronchopneumonie, NS Pneumonie, původce NS - Pneumonie, NS Akutní zánět průdušek - bronchitis acuta - Akutní bronchitida. NS Zánět průdušek - bronchitis - neurčený jako akutní nebo chronický Neurčená chronická bronchitida Jiná chronická obstruktivní plicní nemoc - Chronická obstruktivní plicní nemoc s akutní exacerbací, NS Jiná chronická obstruktivní plicní nemoc - Jiná určená chronická obstruktivní plicní nemoc Jiná chronická obstruktivní plicní nemoc - Chronická obstruktivní plicní nemoc, NS Astma - Astma převáţně alergické Astma - Astma, NS Bronchiektazie - rozšíření průdušek 33

35 J82 J841 J848 J849 J90 J960 J989 K261 K558 K570 K709 K720 M313 M318 M319 M321 M332 M359 N033 N180 N189 R042 R05 R060 R074 R509 R570 R91 S720 Z000 Z940 Plicní eozinofilie, nezařazená jinde Jiné intersticiální plicní nemoci - Alveolární a parietoalveolární stavy Jiné intersticiální plicní nemoci - Jiné určené intersticiální plicní nemoci Jiné intersticiální plicní nemoci - Intersticiální plicní nemoc, NS Pohrudniční výpotek, nezařazený jinde Respirační selhání, nezařazené jinde - Akutní respirační selhání Jiné poruchy dýchací soustavy - Onemocnění dýchací soustavy Dvanáctníkový vřed - Akutní s perforací Vaskulární onemocnění střeva - Jiná vaskulární onemocnění střeva Divertikulární nemoc střeva - Divertikulární nemoc tenkého střeva s perforací a abscesem Alkoholické onemocnění jater - Alkoholické onemocnění jater, NS Selhání jater nezařazené jinde - Akutní nebo subakutní selhání jater Jiné nekrotizující vaskulopatie - Wegenerova granulomatóza Jiné nekrotizující vaskulopatie - Jiné určené nekrotizující vaskulopatie Jiné nekrotizující vaskulopatie - Nekrotizující vaskulopatie, NS Systémový lupus erytematosus - Systémový lupus erymatosus s postiţením orgánů a systémů Dermatopolymyositis - Polymyositis Jiné systémová postiţení pojivové tkáně - Systémová postiţení pojivové tkáně, NS Chronický nefritický syndrom - Difúzní mesangiální proliferativní glomerulonefritida Chronické selhání ledvin - Konečné stadium ledvinného onemocnění Chronické selhání ledvin - Chronické selhání ledvin, NS Krvácení z dýchacích cest - Hemoptýza Kašel Nepravidelné dýchání - Dušnost Bolest v hrdle a na hrudi - Bolest hrudi, NS Horečka neznámého původu - Horečka, NS Šok, nezařazený jinde - Kardiogenní šok Abnormální nález při diagnostickém zobrazení plic Zlomenina kosti stehenní - fractura femoris - Zlpmenina krčku kosti stehenní - fractura colli femoris Celková prohlídka a vyšetření osob bez obtíţí nebo uvedené diagnózy - Celkové lékařské vyšetření Pacient s transplantovaným orgánem a tkání - Transplantovaná ledvina Závěr: Pacienti pozitivní na PJ trpí celou řadou onemocnění. Jsou to většinou pacienti s váţně oslabenou imunitou při léčbě rakoviny, po transplantaci nebo při onemocnění HIV. Nejvíce vyskytující se diagnózy jsou v tabulce označeny tmavě ţlutou barvou. 34

36 6. DISKUSE Hlavním úkolem této práce bylo zhodnocení výsledků vyšetření na přítomnost Pneumocystis jiroveci a porovnání obou diagnostických metod tedy mikrobiologické vyšetření, spojené s různými druhy barvení, a PCR. Na počátku zpracovávání výsledků pacientů s pneumocystovou pneumonií jsem získala základní přehled nejen o výskytu v různých věkových skupinách, ale i o široké řadě diagnóz pacientů. Hlavní věc, která mne upoutala na výsledcích, byly neshody mezi některými pacienty, u kterých byla prokázána nákaza PJ metodou PCR, ale výsledky z mikrobiologické laboratoře byly negativní. Pacientů diagnostikovaných jako pozitivní metodou PCR bylo dohromady 119/119, ovšem pozitivních mikroskopicky bylo z této skupiny pouze 9/119. Coţ by znamenalo, ţe senzitivita barvících metod by se v tomto výběrovém souboru rovnala pouze 7,6%. Otázkou je, co zapříčinilo takto malý záchyt PJ mikroskopií. Linssen et al.(2006) se domnívá, ţe hlavní překáţkou v neúspěšném stanovení PJ mikroskopií je lidská chyba personálu laboratoře a nezkušenost hodnotících laboratorních pracovníků. Dodává, ţe by měl být kladen větší důraz na proškolení laboratorních pracovníků v mikrobiologických metodách a práci s mikroskopem. Jako moţná budoucí pracovník v laboratoři tomu musím oponovat, jelikoţ si myslím, ţe odbornost českých mikrobiologů i laborantů je na velmi dobré úrovni, a ţe stanovení pozitivity/negativity u vzorku na podloţním sklíčku ovlivňuje řada faktorů nezávislých na laboratoři. Mezi tyto faktory bych zařadila preanalytické chyby v odběru materiálu, coţ je v dnešní době velký problém nejenom v mikrobiologických laboratořích, i přesto, ţe jsou sestry i další nemocniční personál na tyto chyby opakovaně upozorňovány. A právě u takového materiálu jako je bronchoalveolární laváţ je provedení odběru jeden z nejdůleţitějších faktorů pro správné stanovení. Odebírá se několik zkumavek bronchoalveolární tekutiky, u kterých se samozřejmě liší koncentrace patogenu tak, ţe v nejpozději odebrané zkumavce je koncentrace nejniţší. Pokud tedy taková zkumavka přijde do mikrobiologické laboratoře, můţe být stanovení patogenu o něco komplikovanější neţ v koncentrovanějším vzorku. 35

37 Další ovlivňující faktor při hodnocení preparátu můţe být kvalita nátěru. Zde bych porovnala nátěry z mikrobiologické a histologické laboratoře. Jak jsem se mohla na vlastní oči přesvědčit, je systém přípravy preparátu v histologické laboratoři v dokonalosti o něco dál neţ oddělení mikrobiologie, kde se připravují nátěry klasickým způsobem. Při kterém se nejprve provede zahuštění vzorku pomocí centrifugy a poté se nanese blíţe neurčený objemu sedimentu na sklíčko. V histologické laboratoři je princip podobný, ale podle mne jednodušší a přesnější. Pomocí přístroje cytospin, který funguje na principu odstředivé síly, se připraví koncentrovaný preparát z přesně definovaného mnoţství vzorku. Domnívám se tedy, ţe toto zařízení by usnadnilo práci klinickým mikrobiologům nejenom při přípravě, ale i při hodnocení. Jiným důvodem pro malý záchyt PJ mikroskopií můţe být, ţe se při PCR namnoţí DNA i z mrtvých PJ, které ovšem nejsou v nátěru viditelné. Dalším úkolem bylo porovnání obou metod a zhodnocení výsledků. Myslela jsem, ţe postačí vynést do grafu hodnoty koncentrací PCR u pacientů pozitivních mikroskopicky a odečíst nejniţší koncentraci, při které bylo ještě mikrobiologické vyšetření pozitivní. K mému překvapení se v tomto souboru pacientů koncentrace velice lišily. Nejniţší hodnoty se pohybovaly v řádech 10 2 a nejvyšší aţ Stejně taky byly rozptýleny i koncentrace u mikrobiologicky negativních pacientů. Stanovit tedy hodnotu cut-off, podle které by se hodnotila moţná úspěšnost při mikroskopickém stanovení bylo téměř nemoţné. Takovou hodnotu se mohu pokusit pouze hrubě odhadovat a porovnat ji s jinými studiemi. Z mého malého výběrového souboru obsahující 9 hodnot koncentrace samozřejmě nemohu určit přesnou hodnotu pro hodnocení výsledků, ale pokud bych ji tedy zkusila alespoň odhadovat, určila bych stejnou hodnotu jako před čtrnácti lety Ribes et al.(1997), a to 10 2, coţ by ideálně znamenalo, ţe pokud bude ve vzorku koncentrace nukleové kyseliny po proběhnuté PCR vyšší neţ 10 2, můţe být PJ pozitivně stanovena i mikroskopicky. Podle dostupných zdrojů se stanovená hodnota cut-off liší. Například nejstarší dohledaný zdroj Leigh et al.(1993) uvání hodnotu 10 4 aţ 10 6 kopií nukleových kyselin PJ, nejnovější zdroj Flori et al.(2004) hodnotu 10 4, z praxe mikrobiologů z FNHK je PJ videtelná v mikroskpu při koncentraci 10 4, ale pouze vyjímečně. Kaţdé měření, ať uţ v hematologické, mikrobiologické nebo molekulárněbiologické laboratoři, je zatíţeno určitou chybou. Torres et al. (2000) to 36