Vývoj automatizace v imunohematologii. Absolventská práce

Transkript

1 Vývoj automatizace v imunohematologii Absolventská práce Barbora Hejduková Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: Mgr. Hermine-Kateřina Oswaldová Datum odevzdání práce: 23. dubna 2019 Datum obhajoby: červen 2019 Praha 2019

2 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracoval(a) samostatně a všechny použité prameny jsem uvedl(a) podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů informací. Praha, 23. dubna 2019 Podpis:

3 Poděkování Děkuji magistře Hermine-Kateřině Oswaldové za odborné vedení absolventské práce. Dále děkuji kolektivu Oddělení krevní banky Fakultní nemocnice v Motole za poskytnutí materiálu a prostoru pro psaní absolventské práce.

4 Souhlas s použitím práce Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována v knihovně Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis:

5 ABSTRAKT HEJDUKOVÁ, Barbora. Vývoj automatizace v imunohematologii. Praha, Absolventská práce. VOŠZ a SZŠ Praha 1. Vedoucí absolventské práce Mgr. Hermine-Kateřina Oswaldová. Vyšetřování krevních skupin v AB0/RhD systému v imunohematologii prošlo vývojem od manuálního provedení až po automatizaci. V dnešní době je kompletní automatizace v laboratoři imunohematologie zaváděna postupně a je vítaným přínosem. Na začátku se práce věnuje základním imunohematologickým pojmům, historii objevu základních krevních skupinových systémů a tématu automatizace v oboru imunohematologie. Díky velkému rozsahu tématu se tato práce zaměřuje pouze na metodiky vyšetřování krevních skupin v AB0/RhD systému. Postupně práce přechází k praktickému provedení vyšetřování krevních skupin v AB0/RhD systému ve zkumavkách a gelových kartách. Metodu sloupcové aglutinace v gelových kartách lze využít v automatizovaných imunohematologických analyzátorech. Veškerá použitá vyšetření jsou v souladu s doporučením České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně. Cílem této práce je srovnání použitých metod pro vyšetření krevních skupin v AB0/RhD systému z různých hledisek. Klíčová slova: krevní skupina, automatizace, analyzátor, imunohematologická laboratoř

6 ABSTRACT HEJDUKOVÁ, Barbora. Automation development in Immunohaematology. Praha, Graduate work. VOŠZ a SZŠ Praha 1. Tutor Mgr. Hermine-Kateřina Oswaldová. Investigation of blood groups in AB0/RhD system in Immunohaematology came through development from manual practice to full automation. Nowadays, a complete automation in the Laboratory of Immunohematology is being introduced gradually and it is a welcomed benefit. The beginning of the thesis includes basic Immunohaematology concepts, the history of discovery of the blood group systems and the automation in Immunohaematology in general. Thanks to a wide range of this subject, this thesis will only include methods of the investigation blood groups in AB0/RhD system. Gradually the work continues in test tube investigation blood groups in AB/RhD system and in a Column agglutination method. Column agglutination method can be use in automation analyzer. In this thesis all used investigations correspond to recommendation of Česká lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně. The aim of this thesis is to compare used methods for investigation of blood groups in AB0/RhD system from different aspects. Key words: blood group, automation, analyzer, laboratory of Immunohaematology

7 Seznam použitých zkratek STL ČLS JEP HIT KS NAT PAT Rh FUT1 GalNac Ig TP EMT LIS NIS Společnost pro transfuzní lékařství České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně inhibice hemaglutinace krevní skupina nepřímý antiglobulinový test přímý antiglobulinový test Rhesus faktor fukosyltransferáza N-acetyl-galaktosamin imunoglobulin transfuzní přípravek/přípravky epitelo-mezenchymová tranzice laboratorní informační systém nemocniční informační systém

8 Obsah 1 ÚVOD 10 2 TEORETICKÁ ČÁST Imunohematologie Základní pojmy Reakce antigen protilátka Krevní skupiny Objev AB0 systému Objev Rh systému Určování a dědičnost krevních skupin Metody vyšetřování krevních skupin Vyšetření krevní skupiny zkumavkovým testem Vyšetření krevní skupiny metodou sloupcové aglutinace Vyšetření krevní skupiny orientačně Další způsoby vyšetření krevní skupiny Hodnocení vyšetření krevních skupin Zkumavková metoda Metoda sloupcové aglutinace Automatizace v imunohematologii Analyzátor Erytra Analyzátor Erytra Eflexis METODICKÉ POSTUPY Zkumavkový test Metoda sloupcové aglutinace Analyzátor Erytra Analyzátor Eflexis Laboratorní vyšetření krevních skupin Materiál a vzorky Vyšetření krevní skupiny zkumavkovou metodou manuálně Vyšetření krevní skupiny metodou sloupcové aglutinace manuálně Vyšetření KS na analyzátoru Erytra 39

9 4.5 Vyšetření krevní skupiny na analyzátoru Eflexis Shrnutí výsledků DISKUSE ZÁVĚR 47 SEZNAM TABULEK A OBRÁZKŮ 48 SEZNAM INTERNETOVÝCH ZDROJŮ 49 CITOVANÁ LITERATURA 50

10 1 Úvod Objev krevních skupin patří k jednomu z nejdůležitějších okamžiků v oboru imunohematologie. A to nejen proto, že v tomto revolučním objevu figuruje i jméno českého lékaře Jana Jánského. Díky objevu krevních skupin došlo k zodpovězení otázek a vyřešení problémů při transfuzích krve, což vedlo k záchraně mnoha lidských životů. Dnes je vyšetřování krevních skupin nejdůležitější součástí základního předtransfuzního vyšetření. Součástí předtransfuzního vyšetření je dále screening nepravidelných protilátek a test kompatibility. V případě že screening nepravidelných protilátek vyjde pozitivní, musí se dále provést identifikace protilátek. Předtransfuzní vyšetření je nutné provádět vždy řádně a správně, neboť podle výsledků těchto vyšetření se určuje podání správného transfuzního přípravku. Základní transfuzní přípravky jsou erytrocytové, plazmatické nebo trombocytové a vždy je nutné se při jejich podání řídit krevní skupinou. V tomto směru v imunohematologii existují tzv. univerzální dárci a příjemci erytrocytů a plazmy. Univerzálním dárcem erytrocytů je krevní skupina 0 a plazmy krevní skupina AB. Krevní skupina AB obsahuje aglutinogeny A i B. Krevní skupina 0 obsahuje aglutininy anti-a i anti-b. Tohoto principu lze za nezbytných podmínek využít bez obavy o bezprostřední ohrožení života pacienta, např. při nedostatku potřebné krevní skupiny. V České republice působí Společnost pro transfuzní lékařství České lékařské společnosti Jana Evangelisty Purkyně (STL ČLS JEP). Tato společnost sestává z dobrovolníků pracujících ve zdravotnictví. Hlavním záměrem STL ČLS JEP je rozšiřování odborných znalostí především v oblasti transfuzního lékařství, dodržování správných zásad při odběrech krve, při jejím zpracování a použití v lékařství a propůjčuje poskytované informace institucím odborného zaměření v České republice i zahraničí. Doporučenými postupy STL ČLS JEP se řídí všechny imunohematologické laboratoře v České republice (JEP, 2019). Cílem práce je porovnání metod vyšetřování krevních skupin v AB0/RhD systému, jak manuálních tak automatických, pomocí metody zkumavkové i metody sloupcové aglutinace a dále zhodnocení užitečnosti zavedení automatizace v oboru imunohematologie. 10

11 2 Teoretická část 2.1 Imunohematologie Obecně se obor imunohematologie zabývá otázkami normální a patologické imunologie krve a jejích součástí, především antigeny a protilátkami skupinových systémů krve. Věnuje se jejich tvorbě, dědičnosti, struktuře, výskytu, diagnostice a významu (Bartůňková, 2011) Základní pojmy Některé druhy cizorodých látek vyvolávají v živém organismu imunitní (obranné) reakce. Tyto reakce se projevují tvorbou specifických obranných protilátek. Látky vyvolávající tvorbu protilátek, které mají zároveň schopnost s nimi reagovat, se nazývají antigeny. Po chemické stránce se jedná především o proteiny nebo glykoproteiny. Hapten je malá molekula schopná vyvolat imunitní reakci po vazbě na makromolekulární nosič. Malá antigenní oblast, kterou rozeznávají antigenně specifické receptory, se nazývá epitop. Antigeny mohou pocházet z vnějšího prostředí nebo vznikají v těle (Bartůňková, 2011). Protilátky, jiným názvem imunoglobuliny, jsou tvořeny plazmatickými buňkami a jsou součástí krevního séra nebo plazmy. Jedná se o konečné stádium B lymfocytů. Jejich struktura je tvořena z tzv. dvou lehkých a dvou těžkých řetězců do tvaru písmene Y, které jsou navzájem spojené disulfickými můstky. Každý řetězec má konstantní (Fc) a variabilní (Fab) část. Část konstatní (Fc) určuje vždy jednu z pěti tříd imunoglobulinů IgG, IgE, IgM, IgD a IgA. Touto částí se také imunoglobuliny váží na buněčné Fc receptory. Část variabilní (Fab) pak určuje vazebné místo pro antigen, taktéž specifitu. Hlavní funkcí protilátek je vazba antigen protilátka. Tím dochází k aktivaci komplementu nebo neutralizaci antigenů (Hořejší, 2009). Protilátky typu IgM se vyskytují ve formě pentamerů a aktivují komplement, čímž mohou způsobit hemolýzu. Mají velkou molekulu a nemohou tak procházet přes placentu. Také mají dobrou aglutinační schopnost a váží se na Fc receptory jiných buněk. Tento typ protilátek může za určitých podmínek vytvořit již plod (např. během infekce) (M. Penka, 2012). Protilátky typu IgG obsahují nejpočetnější podtřídy imunoglobulinů (podtřídy IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) a v séru tvoří 80 % všech imunoglobulinů. Vyskytují se ve formě monomerů, přecházejí přes placentu a např. se dobře navazují na tzv. protein A některých kmenů 11

12 stafylokoků. Podtřídy IgG1 a IgG3 dobře aktivují komplement. Zajišťují pasivní imunizaci dítěte v jeho prvních měsících života (Hořejší, 2009), (Penka, 2012). Protilátky typu IgA se vyskytují jako dimery v sekretech. Podílejí se na ochraně proti mikroorganismům na povrchu sliznic. Neprochází placentou a neaktivují komplement (Penka, 2012). Protilátky typu IgD se vyskytují na povrchu B buněk, kterým slouží jako receptor pro antigen (Jílek, 2014). Protilátky typu IgE se vyskytují u zdravých lidí v séru v nepatrných koncentracích. Uplatňují se hlavně v obranných reakcích proti mnohobuněčným parazitům na sliznicích a jsou hlavní příčinou alergických reakcí (Hořejší, 2009). Autoprotilátky jsou takové protilátky, které reagují se součástmi vlastního organismu. Fyziologicky se vyskytují v nízkých koncentracích, ty ovšem stoupají spolu s věkem. Pokud se vyskytují patologicky ve zvýšených koncentracích, značí autoimunitní onemocnění (Bartůňková, 2011). Aloprotilátky jsou takové protilátky, které se nevyskytují na erytrocytech daného jedince. Protilátky rozdělujeme podle několika kritérií. - podle původu na: zvířecí; lidské; rostlinné; - podle specifity na: specifické, které reagují s jedním antigenem; nespecifické, které reagují s většinou buněk; - podle způsobu jejich vzniku na: imunní, které se tvoří po kontaktu s antigenem; přirozené, které se vyskytují i bez kontaktu s cizími látkami; autoprotilátky, které jsou zaměřené proti antigenům vlastního organismu; - podle tepelného optima reakce na: tepelné, reagující při teplotě 37 C; chladové, reagující optimálně při teplotě 4 C (Pecka, 2005). 12

13 2.1.2 Reakce antigen protilátka Reakce antigenu s protilátkou se antigen účastní ve dvou možných formách, a to jako antigen rozpustný a nerozpustný. Rozpustný antigen bývá v roztoku: precipitován (vyvločkován); aglutinován (vysrážen); neutralizován vytvořením komplexu antigen protilátka. Při aglutinaci označujeme protilátku jako aglutinin a antigen jako aglutinogen. Pokud dochází k aglutinaci erytrocytů, nazýváme tento jev hemaglutinací. Autoaglutinace pak označuje děj, kdy dochází ke shlukování tělu vlastních krvinek působením autoprotilátek. Shlukování erytrocytů jiného člověka působením aloprotilátek se označuje jako aloaglutinace Existuje ale více typů aglutinace: aglutinace přímá; aglutinace nepřímá; přímá hemaglutinace; inhibice hemaglutinace (HIT); aglutinace na nosičích; precipitace (Pecka, 2005). Na povrchu erytrocytu jsou vázány nerozpustné antigeny. Jejich přítomnost má dva projevy lýzu buněk a cytotoxicitu. Lýzou buněk je myšlena reakce, kdy protilátky vazbou na antigen na povrchu buňky způsobí rozpad krvinek. Dochází li k rozpadu erytrocytů, jedná se o hemolýzu (Whitlock, 2010). Protilátky se spojují s antigeny přes nekovalentní vazby. Do nekovalentních vazeb se řadí: van der Waalsovy síly; vodíkové vazby; iontové vazby; hydrofobní síly. Vazebné místo je komplementární k povrchu antigenu podle svého tvaru a rozložení nábojů. Tyto komplexy jsou reverzibilní, tzn. vratné a nazývají se imunokomplexy (Hořejší, 2009). Vazbu při reakci antigen protilátka ovlivňuje několik faktorů, mezi které se řadí: koncentrace jedná se o poměr množství antigenu a protilátky, který musí být 13

14 vyvážený, protože má vliv na počet vznikajících komplementů; ph neboli acidita optimálně 5,5 8,5; teplota, při které protilátka optimálně reaguje s antigenem, která také určuje klinický význam protilátek; iontová síla reakčního média, která určuje, zda má protilátka schopnost reagovat s jedním nebo s více než jedním epitopem; doba inkubace, což je čas nutný k dosažení rovnováhy mezi antigenem a protilátkou (Penka, 2012). Krevní skupiny (KS) se vyšetřují imunohematologickými testy na principu aglutinace. Při vyšetření KS vyšetřujeme antigeny na erytrocytech. Během přímé aglutinace se navazují protilátky, které překonají vzdálenost mezi erytrocyty a přes své fragmenty se spojují s antigeny dalších erytrocytů. Ty jsou od sebe odpuzovány silami vzniklými rozdílem elektrického potenciálu mezi záporně nabitými erytrocyty a kationty z okolního prostředí. Tento potenciál se nazývá zeta-potenciál. Tento způsob je typický pro protilátky IgM, které se uplatňují jako monoklonální či polyklonální protilátky při vyšetřování krevních skupin, a které reagují při nízké teplotě. Oproti tomu protilátky IgG erytrocyty aglutinují přímo, pokud mají erytrocyty více antigenních míst blízko u sebe a mohou se tak spojit s jinými erytrocyty v blízkém okolí. To jsou např. protilátky anti-a nebo anti-b (Penka, 2012). Provádí se také testy vyšetření KS u lůžka pacienta, tzv. Bedside testy, na principu aglutinace (Penka, 2012). 14

15 2.2 Krevní skupiny Krevní skupina je geneticky determinovaná vlastnost erytrocytů, charakterizovaná přítomností specifických antigenů na erytrocytární membráně. Na základě souhlasné nebo odlišné přítomnosti specifických antigenů na membráně erytrocytů známe několik krevních typů, podle kterých můžeme lidskou krev rozdělit na příslušné skupiny (Eckstein, 1994), (Fábryová, 2012). Krevní skupiny vyšetřujeme v AB0 systému z toho důvodu, že se v AB0 systému vyskytují tzv. přirozené protilátky anti-a a anti-b. Tyto protilátky jsou namířené vždy proti tomu antigenu, který je přítomný na vlastních erytrocytech (Fábryová, 2012). Součástí určování KS je i vyšetření antigenu D, který je nejdůležitějším antigenem Rh systému. K jeho vyšetření se používají dva klony diagnostických protilátek, a to monoklonální IgM anti-d a polyklonální IgM a IgG anti-d protilátky. Podle výsledné reakce se sérem pacienta se poté rozlišuje pozitivní nebo negativní reakce. Existují také variantní typy D antigenu, a to kvalitativního a kvantitativního charakteru. Jejich určení je součástí vyšetření KS dárců krve a k jejich rozlišení se může použít nepřímý antiglobulinový test (NAT), který detekuje variantu D variant (Penka, 2012) Objev AB0 systému Krevní skupiny v AB0 systému jsou nejstarší ze všech skupinových systémů. Objeveny byly v roce 1901 vídeňským lékařem Karlem Landsteinerem, který přišel s poznatkem, že sérum člověka je schopno často shlukovat erytrocyty jiného člověka. Aby svůj poznatek vysvětlil, odebral krev sobě i svým spolupracovníkům a proprané erytrocyty poté nechal reagovat s každým jednotlivým sérem z odebraných krví. Své výsledky si zapisoval do tabulky, podle které potvrdil existenci tří KS, které označil A, B a C. Zjistil také, že sérum určitého člověka nikdy neshlukuje své vlastní erytrocyty. Tento poznatek označil jako Landsteinerovo pravidlo. Podle tohoto pravidla v roce 1902 objevili pánové Alfred von Decastello a Adriano Struli, spolupracovníci Karla Landsteinera, čtvrtou KS, kterou nazvali AB (Schott, 1994). Avšak v roce 1907 český psychiatr Jan Jánský publikoval práci, ve které nezávisle na Landsteinerových závěrech, dospěl ke stejným závěrům pouze s tím rozdílem, že určil KS čtyři. Označil je I, II, III a IV. K tomuto objevu dospěl během svého výzkumu, ve kterém se snažil objevit příčinu duševních chorob v krvi (Schott, 1994), (Porter, 2001). Různé označení KS bylo matoucí, a proto bylo mezinárodně dohodnuto používání jednotného 15

16 označení A, B, AB, 0 (Fábryová, 2012) Objev Rh systému Druhým nedůležitějším skupinovým systémem je systém Rh. Tento systém byl objeven v roce 1939 Karlem Landsteinerem a Alexandrem Weinerem. Objevili protilátku proti paternálnímu antigenu plodu v séru matky po porodu, která byla příčinou hemolytické reakce po transfuzi krve od jejího manžela. Současně imunizovali králíky krvinkami opice Macacus rhesus. Těmito experimenty získali séra s novou imunní protilátkou, která shlukovala lidské erytrocyty nezávisle na KS. Za pomoci této nové imunní protilátky odhalili jak v lidských erytrocytech, tak v erytrocytech Macacus rhesus nový antigen, který označili jako faktor rhesus, čili Rh faktor (Penka, 2012) Určování a dědičnost krevních skupin Krevní skupiny se určují podle typu antigenu, který se vyskytuje na membráně erytrocytu, tzv. aglutinogenu. Ty v příslušných reakcích způsobují shlukování krve, tzv. aglutinaci. Nejdůležitějšími jsou již zmíněné aglutinogeny A a B. V plazmě jsou naopak přítomny protilátky, tzv. aglutininy anti-a a anti-b. Podle typu aglutinogenu navázaného na erytrocytu a podle typu aglutininu v plazmě pak určujeme čtyři KS: skupina A je přítomen aglutinogen A a aglutinin anti-b; skupina B je přítomen aglutinogen B a aglutinin anti-a; skupina AB přítomen je aglutinogen A i B, není přítomen ani jeden aglutinin; skupina 0 není zde přítomen ani jeden aglutinogen, zato jsou přítomny oba aglutininy anti-a i anti-b (viz Obrázek 1) (Penka, 2012). U KS 0 můžeme na erytrocytu najít aglutinogen H, což je prekurzor pro aglutinogeny A a B (Penka, 2012). 16

17 Obrázek 1 určování krevních skupin v AB0/RhD systému Zdroj obrázku - Dědičnost KS se řídí Mendelovskými pravidly dědičnosti. Alely jsou dominantní nebo recesivní, kdy dominantní alela potlačuje projev recesivní alely. Pokud se projeví dvě alely, které se vzájemně neovlivňují, jedná se o tzv. kodominanci (Penka, 2012). Dědičnost genů se projevuje expresí, pro kterou jsou potřeba dva na sobě nezávislé lokusy lokus AB0 a lokus H, který obsahuje dva geny H, h. Exprese je proces, kdy se DNA uložená v genu transformuje do struktury proteinu. Hlavními produkty obou lokusů jsou glykosyltransferázy (enzymy), v případě H lokusu se jedná o fukosyltransferázu (FUT1) (Panczak, 2013). Vlivem genu H dochází ke vzniku prekurzorového H aglutinogenu. Ten je dominantním pro KS 0 a prekurzorem pro aglutinogeny A a B (Penka, 2012). Dědičnost AB0 systému určují 4 alely A 1, A 2, B, 0. Alely A 1, A 2, B jsou dominantní, alela 0 je recesivní. Krevní skupina zůstává po celý život stejná (Jílková, 2009). Klasickým příkladem jsou aglutinogeny A a B, které jsou k sobě vzájemně kodominantní a projevují se jako KS AB. Aglutinogen 0 je pak vůči aglutinogenům A a B recesivní. Člověk, který zdědí stejné alely (např. AA, BB, 00), je tzv. homozygot. Heterozygot je člověk, který zdědí nestejné alely (např. A0, B0) (Penka, 2012). 17

18 Produktem genu A je A transferáza, která připojuje N-acetyl-galaktosamin (GalNac) k H antigenu za vzniku antigenu A. Gen B kóduje B transferázu, která připojuje D-galaktózu k antigenu H, čímž vzniká antigen B. Gen 0 produkuje krátký inaktivní protein, který nemůže přenášet žádnou transferázu (Panczak, 2013). Z chemického hlediska jsou antigeny oligosacharidy složené z jednoduchých cukrů, např. D- glukózy, D-galaktózy, D-manózy nebo L-fruktózy. Antigeny jsou součástí membrány erytrocytů a také jsou obsaženy v různých sekretech v rozpustné formě. Rozeznáváme 4 typy oligosacharidových řetězců, kdy řetězce typu 3 a 4 odlišují podskupiny A 1 a A 2 (Penka, 2012). 2.3 Metody vyšetřování krevních skupin Krevní skupiny se vyšetřují v AB0/RhD systému. Toto vyšetření je součástí předtransfuzního vyšetření, jehož cílem je eliminovat nežádoucí účinky transfuze. Předtransfuzní vyšetření má zajistit pacientovi podání takové krve, která v jeho krevním oběhu nezapříčiní destrukci jeho vlastních erytrocytů. Principem předtransfuzního vyšetření je nepřítomnost aglutinace nedojde k reakci mezi protilátkou a antigenem. Předtransfuzní vyšetření sestává ze stanovení KS v systému AB0/RhD u příjemců transfuzních přípravků, screeningu nepravidelných protilátek u příjemců transfuzních přípravků a vyšetření kompatibility transfuzního přípravku s krví příjemce (Matějček, 2012), (Indrák, 2014). U novorozenců do 4 měsíců života se v AB0/RhD systému nevyšetřuje tzv. zadní řada. Nevyšetřuje se, protože se u takto starých dětí zatím nevyvinuly vlastní protilátky. Jejich KS se zjišťuje vyšetřením tzv. přední řady. Vyšetření přední řady se provádí 2x opakovaným vyšetřením erytrocytů dvěma odlišnými klony diagnostických sér anti-a a anti-b. Současně se u novorozenců vyšetřuje i přímý antiglobulinový test (PAT) (STL, 2011) Vyšetření krevní skupiny zkumavkovým testem Jedná se o vyšetření KS ve zkumavkách, kdy vyšetřujeme tzv. přední a zadní řadu. V přední řadě vyšetřujeme erytrocyty pacienta s diagnostickými séry anti-a a anti-b. V zadní řadě pak zjišťujeme přítomnost přirozených protilátek anti-a a anti-b v séru pacienta pomocí známých typových erytrocytů A1 a B. Výsledkem metody je aglutinace erytrocytů specifickými diagnostickými séry a aglutinace typových erytrocytů s vyšetřovaným sérem pacienta. Přítomnost aglutinace uvádí pozitivní reakci, nepřítomnost pak negativní reakci (viz Tabulka 1). Při této metodě je správnost vyšetření aglutininů potvrzována správností vyšetření 18

19 aglutinogenů. Pokud dochází k aglutinaci erytrocytu s diagnostickým sérem anti-a nemůže tak dojít k aglutinaci typové erytrocyty A1 se sérem pacienta (Fábryová, 2012). Tabulka 1 reakce séra s typovými erytrocyty v zadní řadě typové erytrocyty A 1 typové erytrocyty B krevní skupina plazma pacienta (v nadbytku proti typovým erytrocytům) - + A + - B AB Vyšetřováním Rh faktoru prokazujeme přítomnost antigenu D na erytrocytech pomocí aglutinace diagnostickým sérem anti-d. K vyšetření se používají 2 klony diagnostického séra anti-d anti-d IgM (monoklonální) a anti-d IgM + IgG (polyklonální) a náplav erytrocytů pacienta ve fyziologickém roztoku (Linhartová, 2008). Pozitivní reakce se projevuje aglutinací. Pokud dojde k aglutinaci oběma diagnostickými séry, vyšetřované antigeny jsou D pozitivní. Slabší reakce D antigenu se projeví slabou aglutinací a je zapotřebí doplňující vyšetření, např. nepřímým antiglobulinovým testem (NAT) (viz Tabulka 2) (Linhartová, 2008). Tabulka 2 - reakce erytrocytů s diagnostickými séry pro vyšetření RhD antigenů diagnostické sérum anti-d IgM diagnostické sérum anti-d IgM + IgG RhD 5% náplav + + RhD pozitivní erytrocytů ve - - RhD negativní fyziologickém + - RhD w/v roztoku - + RhD w/v RhD w/v RhD weak/variant, označení varianty antigenu D 19

20 2.3.2 Vyšetření krevní skupiny metodou sloupcové aglutinace Toto vyšetření se provádí v kartě DG Gel AB0/Rh (2D), která sestává z 8 mikrozkumavek. Každá zkumavka je tvořena gelovým sloupcem s reakční komůrkou. První sloupce pro vyšetření antigenů přední řady obsahují specifické protilátky v roztoku gelu, zbylé sloupce pro vyšetření zadní řady obsahují pouze neutrální gel. Díky tomu lze v kartách vyšetřit kompletní KS i s Rh faktorem (viz Obrázek 2). Do mikrozkumavek obsahujících protilátky se přidávají promyté erytrocyty, do mikrozkumavek neobsahující protilátky přidáváme pacientovu plazmu a typové erytrocyty dodávané spolu s kartou. Po přidání krevních složek se nechá karta centrifugovat a po centrifugaci můžeme pozorovat aglutinaci ve sloupcích (Fábryová, 2012), (Masopust, 2016). Obrázek 2 karta DG Gel AB0/Rh (2D) pro sloupcovou aglutinaci od firmy Grifols Vyšetření krevní skupiny orientačně Jedná se pouze o orientační vyšetření, které slouží jako ověření správnosti vyšetření KS. Vyšetřuje se plná krev i transfuzní přípravky (TP) na podložním sklíčku, popřípadě na reakční desce. Principem této metody je vyšetření antigenů pomocí známých diagnostických sér anti-a, anti-b a anti-d (Linhartová, 2015). 20

21 2.3.4 Další způsoby vyšetření krevní skupiny V dnešní době existuje více možností vyšetření KS, založených na různých principech. Lze uvést například vyšetření KS vyšetření v mikrotitračních destičkách, metodou pevné fáze Capture, metody založené na elektromagnetickém principu (EMT) nebo na genetickém principu (Masopust, 2016). 2.4 Hodnocení vyšetření krevních skupin Zkumavková metoda Výsledkem metody je aglutinace erytrocytů diagnostickými séry, což se hodnotí jako pozitivní reakce. Nepřítomnost aglutinace se hodnotí jako negativní reakce. Podle toho, s kterým diagnostickým sérem vyšetřované erytrocyty aglutinují, rozdělujeme vyšetřovanou krev na jednotlivé skupiny (viz Tabulka 3, 4) (Fábryová, 2012). Při odečítání výsledků aglutinace ve zkumavkách se síla reakce odečítá podle charakteru sraženiny, která se ve zkumavce projeví po lehkém roztřepání dna zkumavek. Výsledky se odečítají semikvantitativně, tzv. na kříže, od 4+ po 1+. Reakce na 4 kříže (4+) vypadá jako jeden shluk erytrocytů, tvz. pecka. Síla na 3+ se jeví jako několik shluků erytrocytů. Reakce na 2+ jsou malé shluky, místy malý počet volných nezaglutinovaných erytrocytů a reakce na 1+ se projevuje více malými shluky a mnoha volnými nezaglutinovanými erytrocyty (Masopust, 2016). Tabulka 3 reakce erytrocytů s diagnostickými séry anti-a, anti-b diagnostické sérum diagnostické sérum anti-a anti-b krevní skupina + - A - + B erytrocyty pacienta + + AB 21

22 Tabulka 4 reakce erytrocytů s diagnostickými séry anti-d diagnostické sérum diagnostické sérum anti-d IgM anti-d IgM + IgG RhD erytrocyty + + RhD pozitivní pacienta - - RhD negativní Metoda sloupcové aglutinace Během odečítání výsledků sloupcové aglutinace pozitivní reakce nastává, když jsou aglutináty erytrocytů zachyceny na povrchu nebo uvnitř gelového sloupce. Negativní reakce se pak projeví, když erytrocyty procházejí gelem ke dnu sloupce. Síla reakce se hodnotí podobně jako síla reakce ve zkumavkách, od reakce na 4+ po negativní reakci. Při reakci na 4+ zůstávají erytrocyty zachyceny ve vrchní části gelu v jamce. Reakce na 3+ zachycuje erytrocyty v horní části gelového sloupce. Při reakci na 2+ jsou erytrocyty zachyceny v celém sloupci. Reakce na 1+ se projevuje erytrocyty ve spodní části sloupce a při negativní reakci erytrocyty prochází až na dno gelového sloupce (viz Obrázek 3). U sloupcové aglutinace se můžeme setkat i s reakcí dvojí populace (viz Obrázek 3). Jedná se o reakci, kdy pozorujeme erytrocyty zachycené jak v horní části gelového sloupce, tak propuštěné na dno gelového sloupce. Dvojí populace značí přítomnost různých typů antigenně odlišných erytrocytů (Penka, 2012), (Masopust, 2016). Obrázek 3 výsledek sloupcové aglutinace v gelu (DG Gel CLEAR GUIDE) D.P. dvojí populace 22

23 2.5 Automatizace v imunohematologii O automatizaci v oboru imunohematologie se první informace objevila již v 60. letech 20. století v rozvojových zemích. Automatizace je stále častěji přejímána dalšími laboratořemi, ve kterých se stává velmi přínosným standardem, stejně jako metoda vyšetřování ve zkumavkách. Bohužel i ona má ale řadu omezení (Bajpai, 2012). Během předtransfuzního vyšetření je nezbytně nutné zajistit co nejmenší počet potencionálních chyb s jasným cílem - nedovolit chyby žádné. Pro zlepšení bezpečnosti a efektivity předtransfuzního vyšetření byly v posledních několika letech vyvinuty nové testovací technologie jako např. technologie sloupcové aglutinace nebo sestrojení automatických analyzátorů (South, 2012). Automatizace poskytuje výhodu ve zlepšení kvality prováděných testů z hlediska: omezení chyby lidského faktoru během identifikace vzorku pacienta, provádění testů a interpretace výsledků; zabránění chybného zápisu do dokumentace pacienta; zlepšení reprodukovatelnosti, objektivity, ukládání a vyhledávání výsledků provedených testů; umožnění lepšího sledování všech odlišností během testů, včetně sledování vzorků pacientů, reagencií a obsluhy; kratší doby testování (Bajpai, 2012). Výběr správného analyzátoru pro imunohematologickou laboratoř by se měl řídit především podle pracovního vytížení laboratoře, finančních zdrojů laboratoře, volného místa v laboratoři nebo také typem prováděných vyšetření v imunohematologické laboratoři. Dostupné analyzátory pro imunohematologické laboratoře jsou poloautomatické nebo plně automatické. Mezi hlavní výrobce těchto analyzátorů patří např. firma BIO-RAD (Švýcarsko), IMMUCOR (USA) nebo firma Grifols (Španělsko). Analyzátory firem BIO-RAD a Grifols jsou založeny na principu sloupcové aglutinace, kdežto analyzátory firmy IMMUCOR jsou založeny na metodě pevné fáze (Bajpai, 2012). Pořízení automatických analyzátorů do imunohematologických laboratoří umožňuje větší bezpečnost při provádění vyšetření. Analyzátory také přebírají úlohu automatické identifikace vzorků pacientů, dokumentaci reagencií a krevních vzorků, kontrolu expiračních dob reagencí, kontrolu hladin reagencií a stav gelových karet používaných během vyšetření a také uložení výsledků a barevných fotografií testovaných karet (Strobel, 2011). 23

24 Postupné a pomalé zavádění automatizace do imunohematologických laboratoří je však jedním z důvodů, proč pracovní postupy související s předtransfuzním vyšetřením mají i nadále větší chybovost (South, 2012). Při vybírání vhodné technologie automatického analyzátoru je důležité zvažovat řadu aspektů. Nejdůležitějším aspektem je, zda zvolit poloautomatický nebo plně automatický analyzátor. Imunohematologické laboratoře s menší pracovní zátěží mohou spíše volit poloautomatické analyzátory. I když je u těchto analyzátorů snížený počet pracovních kroků, je zde stále vysoký počet manuálních zásahů. Poloautomatické analyzátory umožňují zlepšit objektivitu a reprodukovatelnost výsledků a čas provedení jednotlivých testů. Největším nedostatkem poloautomatických analyzátorů je větší možnost chyby lidského faktoru kvůli manuálním krokům, jako jsou označování vzorků pacientů, ředění vzorků, přidávání reagencií a interpretace výsledků. Dále je důležitá také finanční stránka laboratoře. Automatické analyzátory jsou velmi drahé a tím pádem je nutná vysoká počáteční investice. Výrobce často poskytuje vybavení a údržbu analyzátoru zdarma oplátkou za příslib používání výhradně jeho reagencií. Do ceny analyzátoru by také měla být zahrnuta cena hardwaru a softwaru nezbytného pro propojení analyzátoru s laboratorním, případně nemocničním informačním systémem (LIS/NIS). Důležitá je i zpětná vazba ostatních automatizovaných imunohematologických laboratoří. Zpětná vazba může laboratoři poskytnout užitečné informace o uvažovaném analyzátoru, především o potížích souvisejících s instalací analyzátoru, různých uživatelských potížích nebo o dodavatelském řetězci reagencií. Velmi podstatným aspektem je i zálohování analyzátoru. Analyzátor má svou určitou záruční dobu pro fungování, a proto je vždy nutné mít záložní analyzátor. Ten je potřeba udržovat v pracovním procesu a personál laboratoře by měl ovládat oba dva. Toho lze docílit např. přiřazením určitých druhů vyšetření záložnímu analyzátoru (Bajpai, 2012). V neposlední řadě je nutné mít analyzátor zvalidovaný. Validace slouží jako ujištění o dodržování přesnosti vyšetření a bezpečnostních standardů. Validace všech výsledků automatických analyzátorů nemůže být nikdy vynechána, pokud je analyzátor v pracovním procesu. Validace se provádí v souladu s doporučením společnosti, která analyzátor dodala a zároveň doporučením STL ČLS JEP (Strobel, 2011). Pořízením automatického analyzátoru se předpokládá přínos velkých změn v předtransfuzním vyšetření. Nicméně hlavním cílem je získat optimální podmínky pro automatizaci a zajištění bezpečných krevních transfuzí pro pacienty (Bajpai, 2012). I v případě automatických analyzátorů je nezbytné zajistit nízké riziko možných chyb pro 24

25 ochranu pacientů. Mnohé studie ukázaly, že nejvíce chyb bylo způsobeno lidským faktorem během manuálních zásahů. Tyto chyby by teoreticky měly být odstraněny používáním plně automatických analyzátorů. Značné výhody plné automatizace v předtransfuzním vyšetření zahrnují např.: snížení počtu manuálních zásahů lidskou obsluhou; standardizaci metod pro testování; zajištění objektivních, stabilních a lehce čitelných výsledků; zlepšení dokumentace výsledků, dat a ochrana informací o pacientech; možnost zkontrolovat nejasné výsledky před jejich uvolněním do systému zpětně dohledat výsledky vyšetření v databázi (South, 2012). Jiné studie dosahují stejných závěrů ohledně vyhodnocování a odečtu výsledků analyzátorem i laborantem. Nicméně vysoká citlivost automatického vyhodnocování a interpretace rušivých faktorů, jako jsou chybné výsledky, způsobují rozšíření citlivosti na ostatní rušivé faktory, jako například prachové částice nebo sraženiny reagencií v gelových kartách (Strobel, 2011) Analyzátor Erytra Analyzátor Erytra je vysokokapacitní, plně automatický analyzátor pro automatizaci imunohematologických testů krve za pomoci karty DG Gel AB0/Rh (2D) od firmy Grifols. Na analyzátoru se může provádět vyšetření KS včetně typování antigenů, screening nepravidelných protilátek, testy kompatibility, přímý antiglobulinový (Coombsův) test a identifikace protilátek. Všechny tyto testy jsou prováděny v imunohematologických laboratořích nebo krevních bankách kvůli zjištění slučitelnosti transfuzních přípravků mezi příjemci a dárci a kvůli případné neslučitelnosti krve mezi matkou a plodem. Základním principem všech vyšetření na analyzátoru Erytra je aglutinace erytrocytů, která je pozorována přes gelové mikrozkumavky (Grifols Diagnostic, 2015). Smyslem analyzátoru Erytra je automatizace všech potřebných metod a postupů při používání gelových karet: zvýšit bezpečnost vyšetření při manipulaci se vzorky pacientů; eliminovat možné chyby v identifikaci a interpretaci vzorků pacientů; zvýšit spolehlivost analytických metod standardizováním všech postupů; snížit nebezpečí kontaminace; zmenšit rozsah zásahu lidského faktoru během analytické části vyšetření. 25

26 Lidský faktor je u analyzátoru omezen jen na vkládání a vyjmutí vzorků pacientů a reagencií z a do analyzátoru. Analyzátor Erytra je také schopen přizpůsobit se potřebám v různých provozech imunohmatologických laboratoří směnný nebo rutinní provoz (Grifols Diagnostic, 2015). Analyzátor Erytra provádí zcela automaticky pozitivní identifikaci vzorku pacienta, reagencií a gelové karty, přenos karet mezi jednotlivými jednotkami analyzátoru, ředění vzorku, dávkování reagencií a vzorku pacienta do mikrozkumavek v kartě, inkubace karty, centrifugace karet, čtení, vyhodnocování a interpretace výsledků vyšetření. Analyzátor také obsahuje zabudovanou funkci kontroly kvality a jeho systém je propojen s laboratorním informačním systémem (LIS), do kterého se zadávají identifikační údaje vzorku pacienta a požadované metody vyšetření. Analyzátor pak provede požadavky podle identifikačních údajů načtených pomocí čtečky čárového kódu (Grifols Diagnostic, 2015). Do analyzátoru Erytra lze vložit až 96 vzorků najednou a umožňuje jak postupné vkládání vzorků pacientů, tak nouzovou manipulaci se vzork. Pro vzorky od pacientů lze použít plastové nebo skleněné zkumavky s přesně zadanými parametry, minimální objem vzorku musí být 250 μl. Prostor pro reagencie obsahuje 54 míst, reagencie analyzátor načítá pomocí čárových kódů na etiketách reagencií. Do analyzátoru lze umístit 400 gelových karet Grifols. Analyzátor Erytra obsahuje 4 na sobě nezávislé inkubátory, který každý pojme až 12 karet a 2 na sobě nezávislé centrifugy, každou také na 12 karet. Analyzátor Erytra oproti analyátoru Eflexis obsahuje navíc 2 sací jehly, které umožňují vyšetření 2 vzorků současně (Grifols Diagnostic, 2015). 26

27 Obrázek 4 analyzátor Erytra (Grifols) Analyzátor Erytra Eflexis Analyzátor Erytra Eflexis (dále jen Eflexis) je plně automatizovaný analyzátor střední kapacity, určený pro imunohematologická vyšetření za pomoci gelových karet od firmy Grifols. Stejně jako analyzátor Erytra se analyzátor Eflexis může používat k vyšetření krevních skupin, vyšetření antigenů, screeningu nepravidelných protilátek, testu kompatibility nebo identifikaci protilátek. Oba analyzátory jsou schopny pracovat zcela samostatně i bez napojení na LIS. Analyzátor umožňuje automatické provedení a vyhodnocení základních imunohematologických testů v gelových kartách. Díky tomu imunohematologická laboratoř může provádět požadovaná vyšetření s velmi přesnými výsledky ve velmi krátkém čase, zajistit bezpečnost vyšetření a zamezit možným chybám během identifikace vzorku pacienta, zajistit spolehlivost analytické části vyšetření, zabránit případným kontaminacím vzorků nebo reagencií. Analyzátor Eflexis je flexibilní, díky tomu je přizpůsoben různým potřebám a 27

28 různým postupům laboratorního provozu v imunohematologických laboratořích nebo transfuzních stanicích (Grifols Diagnostic, 2018). Analyzátor Eflexis automaticky identifikuje vzorky pacienta podle čárových kódů, nachází a připravuje správné reagencie a karty pro požadované vyšetření, ředí a dávkuje vzorky pacientů do gelových karet, v případě potřeby inkubuje gelové karty, centrifuguje karty a následně je fotografuje a vyhodnocuje výsledky vyšetření. Stejně jako analyzátor Erytra i analyzátor Eflexis disponuje funkcí kontroly kvality a jeho operační systém bývá propojen s LIS (Grifols Diagnostic, 2018). Analyzátor Eflexis je oproti analyzátoru Erytra schopen pojmout najednou pouze 72 zkumavek se vzorky a umožňuje plynulé vkládání vzorků i nouzovou manipulaci se vzorky. Identifikace vzorku pacienta analyzátorem je automatická pomocí čtení čárového kódu, popřípadě manuálně identifikací laborantkou. Minimální objem vzorku pro vyšetřování je 250 μl. Prostor pro reagencie obsahuje až 46 míst, reagencie jsou analyzátorem čteny pomocí čárového kódu na etiketě. Do analyzátoru lze umístit 200 gelových karet Grifols. Analyzátor obsahuje také 3 na sobě nezávislé inkubátory, každý pro 12 karet a 2 na sobě nezávislé centrifugy, z nichž každá pojme najednou také 12 karet. Analyzátor má software, díky kterému je před každým vyšetřením kontrolován stav reagencií a gelových karet, pro zjištění jejich vhodnosti k požadovanému vyšetření. Pokud reagencie nebo gelová karta nevyhovují, analyzátor ohlásí potřebu nevhodnou reagencii či kartu vyměnit, přičemž pozastaví vyšetření vzorku pacienta, dokud není závada odstraněna (Grifols Diagnostic, 2018). Obrázek 5 analyzátor Erytra Eflexis (Grifols) 28

29 3. Metodické postupy 3.1 Zkumavkový test Pro provedení zkumavkového testu je zapotřebí správných laboratorních pomůcek, přístrojů, reagencií a vzorek krve pacienta. Z laboratorních pomůcek a přístrojů se používají: plastové laboratorní zkumavky; laboratorní nerezový stojan; Pasteurovy pipety; centrifuga. Potřebné reagencie pro zkumavkový test jsou: vzorek krve pacienta; 0,9% NaCl; diagnostické sérum anti-a; diagnostické sérum anti-b; diagnostické sérum anti-d IgM (polyklonální); diagnostické sérum anti-d IgM + IgG (monoklonální); diagnostické sérum pro Rh kontrolu; diagnostické erytrocyty A 1 a B. Po obdržení vzorku pacientovy krve se provede první kontrola, kdy se kontroluje, zda údaje o pacientovi souhlasí jak na štítku zkumavky, tak na žádance. Následně se zkumavka od pacienta nechá centrifugovat 5 minut při 1160G. Do laboratorního stojanu se připraví plastové zkumavky, 5 pro přední řadu, 2 pro zadní řadu, 1 pro odsátí plazmy z pacientova vzorku a 1 pro přípravu erytrocytární suspenze. Každá z těchto zkumavek se řádně označí jménem a přijímením pacienta, popř. jeho iniciály a použitou reagencií (viz Obrázek 6). Z centrifugovaného vzorku pacienta pak pomocí Pasteurovy pipety odebereme co největší množství pacientovy plazmy do připravené označené plastové zkumavky. Do zkumavek přední řady se přidává po 1 kapce séra anti-a a anti-b od firmy ImuMed, séra anti-d IgM, anti-d IgM + IgG a séra pro Rh kontrolu od firmy Immucor (viz Obrázek 7). Do zadní řady se nakape po 1 kapce diagnostických krvinek A 1, B od firmy Immucor, které je třeba před každým použitím řádně promíchat, aby se usazené erytrocyty rozptýlily do celého obsahu lahvičky. 29

30 Ze zbytku centrifugované krve se připraví 5% erytrocytární suspenze Pasteurovou pipetou se převede 1 malá kapka erytrocytů pacienta do připravené plastové zkumavky a naředí se dostatečným množstvím 0,9% NaCl. Do celé přední řady se přidá po 1 kapce erytrocytární suspenze pacientova vzorku, do zadní řady pak po 2 kapkách séra pacienta. Všechny zkumavky se inkubují při laboratorní teplotě jen po nezbytně nutnou dobu, poté se centrifugují 1 minutu při 1776G a následně makroskopicky odečítají lehkým rozklepáním dna zkumavek (viz Tabulka 3,4) (Linhartová, 2008). Obrázek 6 řádně popsané zkumavky pro vyšetření KS zkumavkovou metodou Obrázek 7 diagnostická séra anti-a, anti-b, anti-d IgM, anti-d IgM+IgG, Rh kontrola 30

31 3.2 Metoda sloupcové aglutinace Metoda sloupcové aglutinace se provádí ve speciálních vyšetřovacích kartách. Před začátkem vyšetření se připraví pracovní plocha a nutný spotřební materiál. Z laboratorních pomůcek a přístrojů jsou potřeba: Karta DG Gel AB0/Rh (2D); laboratorní stojan pro zkumavky i kartu; pipeta s vhodnými špičkami; Pasteurovy pipety; plastové zkumavky; centrifuga DG Spin. Jako reagencie se při této metodě používají: vzorek krve pacienta; diagnostické erytrocyty Serigrup Diana A 1 a B; DG Gel Sol od firmy Grifols (viz Obrázek 8, 9). Do laboratorního stojanu se připraví zkumavky, které je třeba popsat jménem a příjmením pacienta popř. jeho iniciály. Po centrifugaci vzorku krve pacienta se ze zkumavky pomocí Pasteurovy pipety odebere co největší množství pacientova plazma (bez příměsi erytrocytů) a převede se do předem připravené a řádně označené zkumavky. Ze zbytku centrifugované krve se do druhé plastové zkumavky připraví 5% erytrocytární suspenze v diluentu DG Gel Sol 1 kapka erytrocytárního sedimentu se Pasteurovou pipetou převede do připravené zkumavky a naředí se 1 ml DG Gel Sol. Do druhého laboratorního stojanu se připraví vyšetřovací karta DG Gel AB0/Rh (2D), kterou je třeba také řádně popsat. Z gelové karty DG Gel AB0/Rh (2D) se opatrně odstraní svrchní fólie přes jamky, aby nedošlo k vylití obsahu aglutinačních jamek nebo ke kontaminaci. Vyšetřovací karta obsahuje mikrozkumavky A, B, AB, D IV-, D IV+, Ctl, N/A 1 a N/B. Do mikrozkumavek A, B, AB, D IV-, D IV+ a Ctl se postupně napipetuje 10 μl 5% erytrocytární suspenze. Do mikrozkumavek N/A 1 a N/B se napipetuje 50 μl diagnostických krvinek Serigrup Diana A 1 a B a 50 μl pacientovy plazmy. Karta se nechá v centrifuze DG Spin 9 minut centrifugovat (viz Obrázek 10). Následně se karta DG Gel AB0/Rh (2D) odečítá makroskopicky proti světlu (viz Obrázek 3) (Linhartová, 2008). 31

32 Obrázek 8 diagnostické erytrocyty Serigrup Diana A 1 /B od firmy Grifols Obrázek 9 DG Gel Sol (roztok o nízké iontové síle usnadňující aglutinaci) od firmy Grifols 32

33 Obrázek 10 centrifuga DG Spin (Grifols) 3.3 Analyzátor Erytra Vyšetření začíná umístěním vzorku krve pacienta do analyzátoru a přípravou pracovního listu. Po načtení vzorků pacientů analyzátorem jsou k vzorkům přiřazena požadovaná vyšetření. Dle standardních postupů analyzátor Erytra ředí a dávkuje reagencie a vzorky pacientů do příslušných mikrozkumavek v DG Gel kartách. Následně je provedena těchto inkubace karet, pokud si to dané vyšetření žádá, a nastává centrifugace karet. Po centrifugaci jsou karty ramenem v analyzátoru přesunuty do čtečky, kde dochází k odečítání výsledků pomocí vytvoření fotografií gelových karet. Výsledky jsou z fotografie odečítány pomocí vizualizačního algoritmu, který odečítá stupeň reakce. Použité karty jsou po importaci výsledků do počítačového programu automaticky vyřazeny nebo uloženy do zabudovaných stojanů k pozdějšímu makroskopickému odečtu laborantkou (Grifols Diagnostic, 2015). 33

34 3.4 Analyzátor Eflexis Vyšetření se zahájí umístěním vzorku krve pacienta do analyzátoru a propojením čárových kódů vzorků s LIS. Analyzátor podle čárových kódů přiřadí správným vzorkům požadovaná vyšetření. Obdobně jako u analyzátoru Erytra dochází k ředění a dávkování reagencií a vzorků do příslušných mikrozkumavek v DG Gel kartách podle odpovídajících postupů. Během vyšetření analyzátor kontroluje, zda jsou všechna potřebná příslušenství k vyšetření v pořádku a v odpovídajícím množství a případně včas ohlásí nedostatky či chybějící komponenty. Po provedení vyšetření jsou gelové karty identifikovány pomocí vytvoření barevných fotografií, ze kterých analyzátor automaticky odečítá výsledek vyšetření. Po vyhodnocení výsledků obsluha analyzátoru zkontroluje a validuje výsledky vyšetření, uloží, popřípadě vytiskne výsledky vyšetření a vyjme z analyzátoru vyšetřené vzorky (Grifols Diagnostic, 2018). 34

35 4. Laboratorní vyšetření krevních skupin 4.1 Materiál a vzorky Před začátkem vlastní práce jsem byla poučena o bezpečnosti práce, jak správně zacházet s biologickým materiálem, s centrifugami i analyzátory a o ochraně osobních a citlivých dat pacientů. Pro vlastní práci byly použity anonymizované vzorky krve pacientů z Oddělení krevní banky Fakultní nemocnice v Motole. Jednotlivé vzorky byly vyšetřovány po jednotlivých sériích v několika různých dnech. 4.2 Vyšetření krevní skupiny zkumavkovou metodou manuálně Při příjmu vzorků od pacientů, byly centrifugací při 1 160G po dobu 5 minut separovány erytrocyty a plazma. Po centrifugaci byla ze vzorku krve pacienta odebrána oddělená plazma a převedena do připravené označené zkumavky. Z erytrocytů byla připravena 5% erytrocytová suspenze. Do zkumavek přední řady bylo postupně nakapáno po 1 kapce diagnostických sér anti-a, anti-b, anti-d IgM, anti-d IgM + IgG a kontrolu. Do zadní řady bylo nakapáno po 1 kapce diagnostické erytrocyty A 1 a B. Do přední řady bylo přidáno po 1 kapce erytrocytární suspenze ze vzorku pacienta a do zadní řady po 2 kapkách pacientovy plazmy (viz Obrázky 6,7). Zkumavky byly lehce promíchány a centrifugovány 1 minutu při 1776G. Po centrifugaci byly zkumavky makroskopicky odečítány lehkým roztřepáním dna zkumavek. Pro dosažení stanovených cílů práce byly zvoleny vzorky v počtu 1, 5 a 12 najednou (viz Tabulka 5). 35

36 Tabulka 5 vyšetření KS ve zkumavkách počet vzorků údaje pacienta KS P. R. ročník 1968 S. S. ročník 1955 L. CH. ročník 2007 B. L. ročník 1960 B. F. ročník 1976 V. P. ročník 1949 N. H. ročník 1975 N. T. ročník 1979 V. K. ročník 1958 M. K. ročník 1957 B. B. ročník 1944 Z. P. ročník 1951 H. O. ročník 1985 J. P. ročník 1962 A. P. ročník 1971 V. J. ročník 1985 B. G. ročník 1991 A. V. ročník 1943 začátek vyšetření konec vyšetření doba trvání 0 pozitivní 10:57 11:06 9 minut B negativní B pozitivní 0 pozitivní A negativní AB negativní AB pozitivní B pozitivní A negativní / A w/v B pozitivní 0 pozitivní A negativní 0 pozitivní 11:41 12:14 33 minut 8:38 9:37 59 minut Vyšetřování KS zkumavkovou metodou začalo jedním vzorkem. V druhé sérii se počet vzorků navýšil na 5 a v poslední sérii na 12. Do celkové doby vyšetření byl zařazen popis všech zkumavek identifikačními údaji pacienta, příprava vzorku, kapání reagencií a vzorku, centrifugace a konečný odečet výsledku se zápisem výsledku do pacientovy žádanky. Inkubace zkumavek byla pouze minimální dobu při laboratorní teplotě, u většího počtu vzorků po dobu dokapání poslední zkumavky posledního pacienta. 36

37 Bylo tak učiněno proto, že v praxi se za určitých podmínek, např. pokud je větší množství vzorků nebo vyšetření spěchá, může doba inkubace zkrátit na minimum. Všechny dosažené výsledky vyšetření KS včetně doby trvání jednotlivých sérií vyšetření shrnuje Tabulka Vyšetření krevní skupiny metodou sloupcové aglutinace manuálně Při příjmu vzorků byly centrifugací při G po dobu 5 minut separovány erytrocyty a plazma. Po centrifugaci byla ze vzorku pacienta odebrána pacientova plazma a převedena do připravené označené zkumavky. Ze vzorku pacienta byla do druhé připravené popsané zkumavky odebrána jedna malá kapka erytrocytů pacienta a za pomoci DG Gel Solu byla vytvořena 5% erytrocytární suspenze. V gelové kartě bylo do jamek A, B, AB, D IV-, D IV+ a Ctl napipetováno 10 μl 5% erytrocytární suspenze. Do jamek A 1 a B bylo nejprve přidáno po 1 kapce diagnostických krvinek Serigrup Diana A 1 a B a následně byly Pasteurovou pipetou přidány 2 kapky pacientova séra. Poté byly gelové karty DG Gel AB0/Rh (2D) vloženy do centrifugy DG Spin na 9 minut při 128,1G a po centrifugaci makroskopicky odečítány výsledky (viz Obrázek 3). Pro dosažení stanovených cílů práce byly zvoleny vzorky v počtu 1, 5 a 12 najednou (viz Tabulka 6). 37

38 Tabulka 6 vyšetření KS metodou sloupcové aglutinace manuálně počet vzorků údaje pacienta KS V. I. ročník 1985 T. K. ročník 1989 M. D. ročník 1944 D. K. ročník 1975 E. M. ročník 1955 A. M. ročník 1941 L. O. ročník 1970 L. F. ročník 1957 J. S. ročník 1965 J. J. ročník 1946 P. L. ročník 1966 J. N. ročník 1939 H. H. ročník 1933 P. K. ročník 1943 O. T. ročník 1970 F. M. ročník 1939 V. B. ročník 1948 L. N. ročník 1959 začátek vyšetření konec vyšetření doba trvání B pozitivní 11:26 11:42 16 minut AB pozitivní AB negativní 0 pozitivní B pozitivní 0 pozitivní 0 pozitivní B pozitivní B pozitivní 8:53 9:20 27 minut 9:55 10:33 38 minut Vyšetřování KS metodou sloupcové aglutinace začalo jedním vzorkem. V druhé sérii byl počet vzorků navýšen na 5 a v poslední sérii na 12. Do celkové doby vyšetření byl zařazen popis všech zkumavek a gelových karet identifikačními údaji pacienta, příprava vzorku, kapání reagencií a vzorku, centrifugace a konečný odečet výsledku s jeho zápisem do žádanky pacienta. 38