Vícebarevná průtoková cytometrie v klinice

Transkript

1 Vícebarevná průtoková cytometrie v klinice EXBIO seminář Miroslav Benko EXBIO Praha a.s. Nad Safinou II Vestec

2 Vícebarevná průtoková cytometrie v klinice EXBIO seminář Miroslav Benko EXBIO Praha a.s. Nad Safinou II Vestec

3 Recept pro vícebarevnou cytometrii 1. Fluorescence 2. Laser/y 3. Optika 4. Fluorochrom 5. Více fluorochromů / kompenzace

4 Fluorescence - stav excitace Emise světla po absorpci elektromagnetického záření Je formou luminiscence

5 Fluorescence - Stokesův posun

6 Pro rozzáření potřebujeme Seřízený cytometr je Nutnost! Zkontrolujte si fluorochromy: 1. Mám pro danou barvičku laser? 2. Mám na to optiku?: Filtry a zrcadla: Chceme je přeci pochytat všechny! (Fotony) Kalibrace cytometrů je nesmírně důležitá pro získání srovnatelných fluorescencí mezi experimentami.

7 Optika - Lasery Běžné zdroje záření: Modrý laser (jedno- a více laserové cytometry) Červený laser (většina IVD certifikovaných cytometrů) Fialový laser (moderní IVD certifikované cytometry Další barvy laserů (zelená, žlutá, UV ) sortry a RUO cytometry

8 Vhodný laser Fluorescein: Absorpční 494 nm Emisní 521 nm Excitation source? 488 nm Argon laser 530/30 nm filter

9 Vhodný laser R-Phycoerythrin: Absorpční 566 nm Emisní 575 nm Excitation source? 488 nm Argon laser 543 nm He-Ne laser 561 nm DPSS laser 585/42 nm filter

10 Optika - Filtry K detektoru umožní přístup záření pouze s definovanou vlnovou délkou Bandpass filter Longpass filter Shortpass filter

11 Správný filtr Bandpass filter % získaných fotonů z emise záření 530/30 47,0 530/40 60,4 525/50 71,3 Images acquired from BD Biosciences Spectra viewer,

12 The right filter Bandpass filter % získaných fotonů z emise záření % získaných FITC fotonů Poměr získaných fotonů z PE a FITC 585/42 70,4 20,1 3,5 575/26 55,9 17,0 3,3 580/30 61,0 16,5 3,7 Images acquired from BD Biosciences Spectra viewer,

13 Optika - Zrcadla Dichroické zrcadlo: Funguje podobně jako filtr, vybrané spektrum záření se dostane k filtru, zbytek je odražen k dalšímu zrcadlu a filtru

14 Fluorescenční barvičky Z Leva do Prava: Pacific Blue Fluorescein Yellow Phycoerythrin R-Phycoerythrin DyLight594

15 Barevné spektrum Excitation wavelength R-PE Emission wavelength Höechst dyes FITC R-PE APC PE-Cy7 DAPI AlexaFluor 488 Pacific Orange PE-Cy5 APC-Cy7 Pacific Blue DyLight 488 PE-TexasRed PerCP Cascade Blue PerCP-Cy5.5 Am Cyan Ethidium Bromide 7-AAD Propidium Iodide DRAQ-5 UV Violet Blue Green Yellow- Green Red

16 Co je při výběru barviček důležité? Záleží od aplikace : Absorpční a Emisní spektra Intenzita fluorescence - Slabá nebo silná barvička? Vzájemná kombinace barev - jedna je málo Nespecifické vázání barvičky

17 Malé barvičky Malé barvičky: FITC, Alexa Fluor dyes, Cy Dyes, DyLight dyes, Rhodamine, Pacific dyes etc. Většinou NHS ester navázaný na Ig přes volné -NH 2 skupiny lysinu Fluorochrom/Protein (F/P) poměr závisí od barvičky Můžou ovlivnit vazebné místo protilátky

18 Fluorescence [AFU] Vliv F/P poměru na fluorescenci konjugátu Antibody FITC conjugate Dye/Protein ratio

19 Vliv F/P poměru na specificitu konjugátu F/P poměr Obětování specificity pro fluorescenci

20 Fluorescenční proteiny Vysoká intenzita fluorescence (R-PE má jednu z nejvyšších) Na molekulu IgG je navázaná pouze jedna molekula PE, APC, nebo jejich tandemů Fluorescenční proteiny jsou navázány na protilátku na místo, které neovlivňuje její afinitu Výborné pro povrchové imunofenotypizace, horší pro intracelulární značení Konjugáty NIKDY neobsahují volnou protilátku nebo fluorochrom

21 Fluorescenční proteiny - spektrální vlastnosti R-Phycoerythrin: Absorpční a Emisní spektra Allophycocyanin: Absorpční a Emisní spektra

22 Tandemové fluorochromy Kombinace fluorescenčního proteinu a malé barvičky Např. PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7, APC-Cy5.5, APC- Cy7, PerCP (přírodní tandem), PerCP-Cy5.5 (tandem tandem)

23 FRET - dvojitá excitace Förster Resonance Energy Transfer - FRET Přenos energie mezi 2 chromofory Nefluorescenční přenos energie Extrémně citlivý na vzdálenost Funguje na max. vzdálenost 10 nm

24 Tandemové fluorochromy - spektra R-Phycoerythrin (PE) 576 nm PE-Cy5 670 nm PE-Cy7 778 nm Images acquired from BD Biosciences Spectra viewer,

25 Tandemové fluorochromy - spektra Allophycocyanin (APC) APC-Cy7 BD APC-H7 Images acquired from BD Biosciences Spectra viewer,

26 PerCP přírodní tandem and PerCP- Cy5.5 tandem PerCP je přírodní tandem složený z komplexu peridinin protein a chlorofyl Peridinin Absorbuje při 482 nm Chlorofyl Absorbuje při 670 nm Cy5.5 zde funguje jako doplněk chlorofylu Images acquired from BD Biosciences Spectra viewer,

27 Tandemové fluorochromy - rizika Ve všem je háček : FRET nefunguje na 100% = přisvěcování volného proteinu (PE, nebo APC) Pro snížení přisvěcování volného proteinu je nutno použít při přípravě tandemu víc malé barvičky = zvyšuje se nespecifické vázání tandemu monocyty(e.g. Cy5, Cy7 ) Některé tandemové fluorochromy se rozkládají v čase rychleji

28 Tandemové fluorochromy - skladování Skladujte tandemy v temnu Nevystavujte je zbytečně světelnému záření Každý tandem se časem rozpadá Kompenzační matice klinického SW jsou k tomuto faktu uzpůsobeny

29 Kompenzace APC-Cy7 APC fluorescenční kompenzace 6,2%

30 Kompenzace 3 Hlavní problémy vícebarevné cytometrie 1. Kompenzace 2. Kompenzace 3. Kompenzace Základní 2-barevný koktejl Bandpass filter % of all PE emitted photons collected % of FITC emitted photons collected 580/30 61,0 16,5

31 Kompenzace Kompenzace fluorescence FITC v PE kanálu Optimal Nekompenzované data 2% kompenzace fluorescence 4% kompenzace fluorescence 6% kompenzace fluorescence 8% kompenzace fluorescence 10,7% kompenzace fluorescence 15% kompenzace fluorescence Kompenzace fluorescence FITC v PE kanálu

32 Kompenzace Kompenzace fluorescence PE v kanálu FITC Optimal Nekompenzované data 1,33% kompenzace fluorescence 3,00% kompenzace fluorescence Kompenzace fluorescence PE v kanálu FITC

33 Kompenzace - dvoubarevná cytometrie Základní 2-barevná kombinace dvou protilátek: CD3/FITC CD4/PE Nekompenzováno Kompenzováno Kompenzační matice Detekce fluorescence FITC (530/30) Detekce fluorescence PE (585/42) Zdroj fluorescence - FITC Zdroj fluorescence - PE ,70 % 1,33 % 100

34 Chyby způsobené kompenzací Aneb Bůh nám dal světlo a ďábel přesvity. Kompenzace není ideální: Falešná pozitivita/vysoké pozadí narůstají - proto se používají kontroly FMO Objevují se buňky s negativní fluorescencí Čím je fluorescence kompenzované populace vyšší, tím se víc po kompenzaci roztáhne

35 Velké Finále Čím více barev, tím je to při stavbě nového panelu těžší : 1. Nutno posoudit vhodnou barvu podle hustoty zastoupení antigenu 2. Připravte si kompenzační zkumavky a FMO kontroly 3. Používejte vždy ten samý materiál pro vzorek i pro kontroly a kompenzace 4. U nového panelu je nutností citlivě titrovat protilátky do optimální koncentrace 5. 2-barevná reagence Vám dá 4 populace 6. 6-barevná reagence Vám dá 15 2-barevných značení

36 Mnoho barev cytometrie DALŠÍ 2-barevná kombinace: CD3/FITC CD4/PE 8-barevná Euroflow ALOT zkumavka: CyCD3/Pacific Blue CD45/Pacific Orange Myeloperoxidase/FITC CD79a/PE CD34/PerCP-Cy5.5 CD19/PE-Cy7 CD7/APC SmCD3/APC-Cy7 Určeno pro 1 laser - modrý Určeno pro 3-laserový cytometr

37 Mnoho barev cytometrie 17 a víc barev podle Maria Roederera: V450: Cascade Blue/Pacific Blue V545: QD545/Pacific Orange V565: QD565 V585: QD585 V605: QD605 V655: QD655 V705: QD705 V800: QD800 B515: FITC/Alexa488/DyLight488 B710: PerCP/PerCP-Cy5.5 G560: R-PE G610: PE-Texas Red/Ax610/DL594 G660: PE-Cy5 G710: PE-Cy5.5/PE-Alexa700 G780: PE-Cy7 R660: APC/Alexa647/DyLight650 R710: APC-Cy5.5/APC-Alexa700 R780: APC-Cy7/APC-H7 etc. Ref: Mahnke, Roederer: Optimizing a Multi-colour Immunophenotyping Assay, Clin Lab Med Potřebujete alespoň 4-laserový cytometr

38 Barvy nabízené v EXBIO Praha a.s. Fialový laser (405 nm): Pacific Blue (403/455 nm) Pacific Orange (403/551 nm) Červený laser (633 nm): APC (650/660 nm) AlexaFluor 647 (652/658 nm) AlexaFluor 700 (696/719 nm) APC-Cy7 (650/778 nm) Modrý laser (488 nm): FITC (492/519 nm) AlexaFluor 488 (499/519 nm) R-Phycoerythrin (498, 566/576 nm) PE-DyLight594 (498, 566/616 nm) PE-Cy5 (498, 566/670 nm) PE-Dyomics 647 (498, 566/670 nm) PerCP (482/672 nm) PerCP-Cy5.5 (482/696 nm) PE-Cy7 (498, 566/778 nm)

39 Pár slov na závěr 1. Tmavá laborka je v našem případě výhodou 2. Každý fluorochrom se vysvěcuje 3. Každá nová barva v kombinaci znamená víc informací ze vzorku 4. Pravidelný servis a kalibrace: Λ a Ω 5. Mějte vždy kontroly 6. V případě, že Váš cytometrický SW automatickou kompenzaci neumožňuje, nepropadejte panice

40 Děkuji moc za pozornost! ZA TÝM EXBIO PRAHA MIROSLAV BENKO