Problematika syřidel Bakalářská práce

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin Problematika syřidel Bakalářská práce Vedoucí práce: doc. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D. Vypracovala: Iveta Šafářová Brno 2012

2 Zadání bakalářské práce

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Problematika syřidel vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne... podpis..

4 PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala vedoucí mé bakalářské práce doc. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D. za odborné vedení, pomoc a literární prameny, které mi během zpracování této práce poskytla. Ing. Monice Kozelkové za odborné vedení při zpracování praktického pokusu a také děkuji Ústavu technologie potravin.

5 ABSTRAKT Tato práce pojednává o problematice syřidel a o vlivu teploty na sýření. Cílem bylo z dostupných literárních pramenů zpracovat historii syřidel, vysvětlit, co je to syřidlo, popsat jejich rozdělení a specifika. Dále popsat mechanismus působení syřidel na kasein v mléce a faktory, které ovlivňují působení syřidlových enzymů. Nejvíce byl zpracován faktor teploty, kterému byla věnována i praktická část. V této části byl pozorován vliv teploty na čas koagulace a jakost sýřeniny. Výsledkem bylo zjištění optimální teploty z hlediska nejkratší doby koagulace i nejvyšší jakosti sýřeniny pro jednotlivá syřidla. Klíčová slova: syřidlo, enzym, mléko, kasein, teplota. ABSTRACT This work deals with the issue of rennets and the temperature effect on renneting. The aim was to process history of rennets from available literary sources, explain what the rennet is and describe their sorting and specifics, to describe mechanism of the action of rennet on casein in milk and factors which influence the action of rennet enzymes. The factor of temperature was processed most detaily and the practical part of the work deals with it too. It was observed the temperature effect on the time of coagulation and the quality of the curd. The overal outcome of the research was the determination of the temperature optimum for the shortest time of coagulation and the highest quality of the curd as well for different rennets. Keywords: rennet, enzyme, milk, casein, temperature

6 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Historie, vývoj syřidel a jejich používání Problematika syřidel Syřidla rostlinného původu Přírodní syřidla živočišného původu Chymosin Pepsin Koagulanty Mikrobiální syřidla Chymosin vyráběný fermentací (FPC) Syřidlo in vivo Mechanismus srážení mléka syřidly Primární fáze Sekundární fáze Analýza syřidel Síla syřidla Čas koagulace Faktory ovlivňující hydrolýzu κ-kaseinu Faktory ovlivňující čas koagulace Vliv teploty na sýření Vliv teploty na mikrobiální syřidla Vliv teploty na průběh koagulace MATERIÁL A METODIKA Materiál Metodika Měření Hodnocení jakosti sýřeniny Síla syřidla...33

7 5 VÝSLEDKY PRÁCE A DISKUSE ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK PŘÍLOHY...46

8 1 ÚVOD Mléko a mléčné výrobky jsou součástí potravy člověka již několik tisíc let a patří mezi nejdůležitější složky lidské potravy. Nezastupitelnou úlohu mají v prvních měsících a letech života. Jedním z nejstarších mléčných výrobků je sýr, který se vyrábí vysrážením mléčné bílkoviny kaseinu, působením syřidla nebo kyseliny. Většina sýrů se vyrábí sladkým srážením tj. za použití syřidla. Původně se k sýření mléka používala kopřiva, svízel syřišťový, artyčok, šťovík, šťáva z fíků nebo enzymy z dýně. Dnes se používají syřidla z hovězích nebo vepřových žaludků. Podle historických zdrojů lze předpokládat, že první sýr, který vznikl před několika tisíci lety, vznikl čistě náhodou. Kočovníci, kteří cestovali v horkých dnech, si mléko ukládali do vaků, které byly vyrobeny ze žaludků přežvýkavců. V těchto žaludcích došlo ke sražení mléka za vzniku sýřeniny a syrovátky. Syrovátka se vsákla do kůže nebo prosakovala skrz a následně se odpařila. Později bylo zjištěno, že nejaktivnější částí je poslední ze čtyř komor žaludku přežvýkavců slez. Slez mladých telat ve stáří čtyř dnů až tří měsíců je velice aktivní a obsahuje vysoký podíl chymosinu, zatímco slez dospělých zvířat, zejména vepřů a hovězího dobytka, obsahuje pepsin. Chymosin je nejpoužívanější enzym při výrobě sýrů, ale vzhledem ke stále se zvyšující spotřebě sýrů a snížení nabídky telecích žaludků, je jeho množství nedostačující. Proto je chymosin zastoupen syřidlovými náhražkami, kterými jsou mikrobiální syřidla nebo chymosin produkovaný fermentací. 8

9 2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je zpracovat dostupnou literaturu zabývající se problematikou syřidel, mechanismem působení syřidla na kasein, faktory, které ovlivňují sýření a na dané téma vypracovat literární rešerši. Praktická část měla za cíl zjistit vliv rostoucí teploty na čas koagulace a jakost sýřeniny u různých typů syřidel. 9

10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Historie, vývoj syřidel a jejich používání Sýr je jedním z prvních a nejpopulárnějších vyráběných potravin. Odhaduje se, že existuje více než 2000 druhů sýrů a seznam stále narůstá. Sýr je důležitou součástí potravin v mnoha zemích (Gunasekaran, Mehmet Ak, 2003). Syřidla jsou přípravky proteolytických enzymů, které se používají pro výrobu sýrů tisíce let. Nejstarší zmínka o výrobě sýrů pochází z jeskynních maleb z doby 5000 př. n. l. Většina enzymatických výrobků používaných pro výrobu sýrů jsou extrakty ze žaludků přežvýkavců, ale mikrobiální a rostlinná syřidla byla používána také již v časných dobách. Je pravděpodobné, že výroba sýrů byla vynalezena náhodou, když kočovníci cestovali v horkých dnech s mlékem uloženým ve vaku vyrobeném ze žaludku přežvýkavců. Tyto vaky byly s největší pravděpodobností velbloudí. V žaludku došlo ke sražení mléka v důsledku rozvinuté kyselosti, jakož to výsledek aktivity bakterií a pravděpodobně i díky přítomnosti srážecích enzymů pocházejících ze žaludků. V důsledku toho se vytvořila měkká sraženina a syrovátka byla absorbována do kůže, nebo prosakovala skrz a byla odpařena (Law, Tamime, 2010). Ve starém zákoně je uvedeno, že za časů vlády krále Davida byl v oblibě sýr vyrobený nejen z ovčího mléka, ale i z kravského mléka. V našich zemích se již v době bronzové používaly nádoby s dírkovaným dnem a v mladší době kamenné se používaly k výrobě sýrů hliněné cedníky. Staří Římané vyráběli sýr s použitím syřidla a kromě toho sýr také dováželi (Řecko, Sicílie, Egypt). V době císařského Říma se vyráběly sýry na způsob sýrů limburských. Některé sýry se udily a k jiným se přidávalo koření. V období 5. stol. př. n. l. se na Sicílii vyráběl sýr, který byl podobný dnešnímu de Brie. Řecký básník Homér se ve svém díle Illias a Odyssea zmiňuje o ovčím sýru. Ze 4. stol. př. n. l. podává Aristoteles zprávy o frygickém sýru, který se vyráběl z oslího a kobylího mléka. Ke srážení mléka se používala šťáva z fíků. V Řecku na ostrově Kythnos byl vyráběn ovčí sýr, který byl velmi oblíbený a stal se důležitým vývozním zbožím. Plinius vysvětluje dobrou jakost tohoto sýru tím, že ovce, které žily na ostrově, se živily keřem podobným zlatému dešti a tím mělo jejich mléko zvláštní chuť. V Itálii 10

11 se vyráběla celá řada sýrů, z nichž se nejvíce proslavil sýr, který měl tvar měsíce a měl chuť dnešního parmezánu. Egypťané znali ovčí sýry a dokonce je i vyváželi. Také u slovanských kmenů se sýrařství značně rozšířilo. Niederle dokazuje, že výrazy tvarog a sýr jsou výrazy všeslovanskými. Upozorňuje také na dírkované nádoby a dokládá, že jejich výskyt byl již v neolitu. Na vývoj Slovanského sýrařství měli vliv Skytové. Ti dojili kobyly a z jejich mléka připravovali opojný nápoj kumys. Starověká arabská pověst vypráví o jezdci, který si mléko uložil, místo do vaku z kůže, do telecího žaludku. Po několikahodinové jízdě byl jezdec překvapen, když v telecím žaludku nalezl místo mléka sražený sýr a syrovátku. Syrovátka mu posloužila jako osvěžující nápoj. Nejdříve se vyráběl kyselý sýr z přirozeně sraženého sýra, později sýr sladký vzniklý použitím rostlinného syřidla. Aristoteles se zmiňuje o syřidle ze žaludku jeleních kůzlat a zajíců a Cassianos Bassos, z byzantské říše, se ve svých sýrařských receptech zmiňuje o syřidlech ze žaludků mladých kozlů. Používaly se jistě i žaludky telat, kůzlat a jehňat (Teplý et al., 1976). Roku 1874 Chr. Hansen z Dánska zavedl první standardizované syřidlo a byl první, který ho uvedl k prodeji jako komerční enzymatický produkt (Law, Tamime, 2010). Koncem 19. století se telecí syřidla začala vyrábět průmyslově. Syřidlo byl první průmyslově vyrobený enzymatický přípravek, který měl standardizovanou enzymovou aktivitu. Tento přípravek byl vyvinut rakouským lékárníkem Franzem Soxhletem. Od té doby se Soxhletovy jednotky běžně používají pro charakteristiku síly syřidla. Každoroční a celosvětový nárůst výroby sýrů během dvacátého století má za následek nedostatek telecího syřidla, které je dnes široce nahrazeno chymosinem vyrobeným fermentací, syřidlem získaným ze žaludku dospělého skotu nebo syřidly mikrobiálními (Roginsiki et al., 2002). 11

12 3.2 Problematika syřidel Přestože je v mlékárenském průmyslu syřidlo pomocnou látkou, má klíčový význam při zpracování mléka. Jakost syřidla ovlivňuje jak kvalitu sýřeniny a výtěžnost, tak i výslednou jakost sýrů (Gajdůšek, 1998). Syřidlo je extrakt enzymatických látek, získaných ze slezu (čtvrtého žaludku) telat, případně jiných sajících mláďat ve stáří 4 dnů až 3 měsíců. Působením syřidel se z mléka oddělí část mléčné bílkoviny, která je základem pro výrobu sýrů. Lze proto říct, že bez syřidel by nebylo sladké srážení (Teplý, Friedrich, 1957). Syřidlo je obecný pojem pro proteinázy používané pro srážení mléka. Většina proteináz sráží mléko za vhodných podmínek, jako je ph a teplota. Syřidla jsou získávána z různých zdrojů a musí obsahovat jednu nebo více proteináz (Sweeney, 2007). Tradiční syřidlo se vyrábí extrakcí ze žaludků mladých telat. Extrakt je zpracován takovým způsobem, aby pro-chymosin byl přeměněn na chymosin. Extrakt se poté přečistí, ale vždy obsahuje nějaké množství pepsinu. Aktivita pepsinu je srovnatelná s chymosinem. Není-li obsah pepsinu vyšší než 25 %, tak se sýření, tvorba sýřeniny a zrání sýrů významně neliší v porovnání s použitím čistého chymosinu (Walstra et al., 2006). V nepřítomnosti telecího chymosinu se mohou využít jako syřidla proteinázy z jiných zdrojů. Mezi ně patří bílkovinné extrakty z rostlin, bakterií a plísní, nebo pepsin z různých zdrojů (například z prasat, krav a kuřat) (Tamime, 2007). Prasečí pepsin působí podobně jako hovězí chymosin, ale k dosažení rychlého sýření je zapotřebí snížit ph mléka. Nyní se využívají také technologie genového inženýrství: gen skotu je vložen do DNA mikroorganismů (bakterií, kvasinek nebo plísní), které pak produkují enzym a vylučují ho do prostředí (Walstra et al., 2006) Syřidla rostlinného původu Mezi první zaznamenané rostlinné koagulanty patří latex z fíkovníků. Tento extrakt se používá od dávných dob v místech, kde fíky rostou. Mnoho výtažku z rostlin má schopnost srážet mléko, ale některé jsou příliš proteolytické (např.: papain z papájí, bromelain z ananasu a ricin ze semen ricinového oleje) (Blech, 2004). Rostlinné proteázy jako je papain a bromelain se používají k výrobě sýrů, ale jejich nespecifický 12

13 účinek na kasein může vést k vytvoření nepřijatelné chuti v sýrech (Balasubramanian, 1996). Jako nejvhodnější enzym, ke srážení mléka se jeví enzym z Cynara cardunculus. Od dávných dob se květy této rostliny využívají při řemeslné výrobě sýrů zejména v Portugalsku u sýrů Serra a Serpa. Kardové koagulanty se široce nevyužívají, ale jsou vyráběny a používány lokálně v některých středomořských zemích (Law, Tamime, 2010). Mezi další rostlinná syřidla patří: Kopřiva dvoudomá (Urtica dioica), Bodlák nící (Carduus nutans), Pcháč rolní (Cirsium arvense), Pcháč obecný (Cirsium vulgare), Artyčok zeleninový (Cynara scolymus), Rosnatka okrouhlolistá (Drosera rotundifolia), Fíkovník smrkvoň (Ficus carica), Zemědým lékařský (Fumaria officinalis), Jestřabina lékařská (Galega officinalis), Svízel syřišťový (Galium verum), Šťavel kyselý (Oxlis acetosella), Tučnice obecná (Pinguicula vulgaris), Škumpa čínská (Rhus chinensis), Šťovík kyselý (Rumex acetosa), Proskurník lékařský (Althaea officinalis), Světlice barvířská, Popenec břečťanovitý (Glechoma hedercea), Sléz malva, Jetel trifolium nebo meloun. Z těchto rostlin se ke srážení mléka dají použít: sušené květy, listy, celé sušené nebo čerstvé rostliny. Všechna rostlinná syřidla sráží rostlinné mléko, některá syřidla sráží však i kravské mléko, např.: Artyčok zeleninový, Zemědým lékařský nebo Svízel syřišťový (Paukertová, 2009) Přírodní syřidla živočišného původu Přírodní syřidla jsou syřidla vyrobená z telecích nebo jehněčích žaludků. Tato syřidla se používala dlouhou dobu v alpských zemích a u nás v našich brynzařských salaších i v některých mlékárenských závodech. Hlavním předpokladem při výrobě přírodního syřidla je čistota. Přírodní syřidla obsahují mnoho škodlivých mikroorganismů, které jsou často hlavním zdrojem vad sýrů; zejména snižují jejich trvanlivost. Přírodní syřidla byla nahrazena syřidly průmyslovými, které se vyrábějí na základě nejnovějších vědeckých poznatků a působí přesně podle účinku, který se žádá při zrání sýrů. 13

14 Průmyslové syřidlo má oproti přírodnímu mnoho předností. Je vyrobeno za takových technických předpokladů, které zaručují jeho mikrobiologickou čistotu. Průmyslově vyrobené syřidlo je spolehlivější než jiné přípravky, neboť je trvanlivé a má příznivý vliv na tvorbu sýřeniny (Teplý et al., 1976). Syřidla se až do konce 20. století vyráběla hlavně ze slezu mladých telat. Důvodem je sekrece chymosinu, což je specifický enzym, který je schopen srážet mléko. Chymosin má dostatečnou proteolytickou aktivitu ke srážení mléka. Přežvýkavci vylučují kromě chymosinu také enzym pepsin a gastriscin. Pepsin má kromě schopnosti srážet mléko také silnou proteolytickou aktivitu v kyselém prostředí žaludku. Podíl chymosinu a pepsinu ve sliznici závisí na krmení a věku přežvýkavců. Od narození do 10. až 20. týdne je chymosin dominantní proteináza v žaludku telat (Roginsiki et al., 2002). Mladá telata mají vysoký podíl chymosinu (80 98 %) a malý podíl pepsinu (5 20 %) (Law, Tamime, 2010). Podíl chymosinu zůstává vysoký (75 %) i u býků, kteří jsou po dobu 6 měsíců na pastvě, ale mají možnost i sát mléko od matky. Pokud je tele odstaveno od matky a není krmeno mlékem, podíl chymosinu ve věku 6 měsíců telete klesá na 30 %. Dále podíl chymosinu klesá s věkem a u dospělého dobytka se nachází pouze stopy chymosinu (Roginsiki et al., 2002). U dospělého skotu má extrakt mnohem více pepsinu (80 90 %) (Law, Tamime, 2010) Chymosin Hlavní enzym používaný při výrobě sýrů je chymosin (Walstra et al., 2006). Chymosin (ES ) je preferovaným enzymem, který specificky hydrolyzuje vazbu Phe 105 -Met 106 v κ-kaseinu (Tamime, 2007). Funkcí chymosinu je srážet mléko v žaludku. Syřidla mohou být považována za funkční enzymatický přípravek, který je účinně a přirozeně uzpůsoben výrobě sýrů. Proteolytické enzymy mohou být klasifikovány na základě své katalytické aktivity do čtyř skupin: serin, cystein, kovové proteinázy a asparagové proteinázy. Chymosin je novorozenecká žaludeční asparagová proteináza, která má obchodní význam při výrobě sýrů (Fox et al., 2004). V žaludku telete je vyměšován pro-chymosin, který je působením proteolýzy přeměněn na aktivní formu (Walstra et al., 2006). 14

15 Molekula chymosinu obsahuje jeden řetězec, který obsahuje asi 323 aminokyselin, je složena ze dvou oblastí, které jsou odděleny trhlinou aktivního místa, ve kterém se nachází 2 katalyticky aktivní aspartylové skupiny (Fox et al., 2000). Byly identifikovány 3 genetické varianty chymosinu. Telecí syřidlo obsahuje hlavně chymosin A a B s menším množstvím chymosinu C. Chymosin A a B se od sebe liší pouze náhradou jedné aminokyseliny (Sweeney, 2007). Chymosin je nejvíce stabilní při ph 5,3 6,3. Ale je také stabilní při ph 2. V kyselém prostředí (ph 3 4) enzym ztrácí rychle aktivitu, což je pravděpodobně způsobeno autodegradací, zatímco v alkalickém ph (nad 9,8) je ztráta způsobena nevratnými konformačními změnami. Ztráta aktivity chymosinu A je vyšší než chymosinu B. Chymosin je stabilnější při teplotě o 2 C vyšší než při pokojové teplotě. Při teplotě 45 až 55 C dochází k rychlé ztrátě činnosti chymosinu (Fox et al., 2004) Pepsin Mezi pepsiny se řadí asparágové endopeptidázy. Pepsin A (ES ) a pepsin B (ES ) (Anonym, 2009). Pepsin A je převládající proteináza v žaludku dospělých savců, vyznačuje se nižší specifitou a vyšší závislostí na ph než chymosin (Law, Tamime, 2010). Přednostně štěpí peptidové vazby mezi dvěma aromatickými aminokyselinami (Anonym, 2009). Pepsin B je méně významná proteináza, která se nachází v žaludku prasat, je charakterizována nízkou schopností srážet mléko a všeobecnou proteolytickou aktivitou. Gastriscin je zvláštní druh asparágové proteázy, který se nazýval např.: pepsin B, C, I, II, III, 6 nebo 7. Nachází se v malém množství ve slezu skotu (Law, Tamime, 2010). Aktivita pepsinu je srovnatelná s chymosinem. Pokud obsah pepsinu v syřidle není vyšší než 25%, pak sýření, vznik sýřeniny a zrání sýrů se významně neliší ve srovnání s použitím čistého chymosinu (Walstra et al., 2006). Nejvíce používaný je hovězí pepsin, prasečí pepsin ztrácí stabilitu při hodnotách ph vyšší než 6. Dá se použít i kuřecí pepsin, i když je velmi proteolytický (Sweeney, 2007). 15

16 3.3 Koagulanty Vzhledem ke zvyšující se světové produkci sýrů (cca 2 3 % ročně v průběhu posledních 30 let) a snížení nabídky telecích žaludků (v důsledku snížení počtu telat a tendenci porážet telata ve starším věku) byla dodávka telecích syřidel po mnoho let nedostačující. To vedlo ke zvýšení ceny telecích syřidel a hledání syřidlových náhražek (Fox et al., 2000). Syřidlo vyrobené z dospělého skotu, ve kterém dominuje enzym pepsin a jehož výroba byla zahájena jako doplněk k syřidlu telecímu, se dá považovat za náhradní telecí syřidlo. Toto syřidlo je více závislé na ph a poskytuje nižší výtěžnost sýrů. Bylo vyvinuto mnoho syřidel, ale pouze 3 se udržely na trhu. Jsou to: Miehei koagulant (Rhizomucor miehei proteináza), Pusillus koagulant (Rhizomucor pusillus proteináza) a Parasitica koagulant (Cryphonectria parasitica proteináza). Miehei koagulant dominuje trhu pro mikrobiální koagulanty a je vyráběn ve dvou termolabilních formách, které mají nižší proteolytickou aktivitu než nativní forma. Parasitica koagulant má velmi proteolytické účinky a obvykle se využívá při výrobě sýrů s vysokodohřívanou sýřeninou (tepelně se zpracovává na teplotu 55 C) a proto je koagulant inaktivován už před zráním. Jedním z prvních náhražek syřidla byl pepsin prasat. Dříve se používal buď samostatně, nebo ve směsi 50:50 s telecím syřidlem. Nevýhodou tohoto pepsinu je jeho velká závislost na ph. Dnes se prasečí pepsin používá jen zřídka. Kuřecí pepsin se také používá jako náhražka syřidla, ale pro většinu druhů sýra je jeho proteolytická aktivita příliš vysoká (Roginsiki et al., 2002). Je nejméně vhodný jako komerční náhražka syřidla a byl používán často pouze v Izraeli, kde byl nahrazen mikrobiálním syřidlem (Fox et al., 2000). Obecně lze říci, že náhražky syřidel poskytují ve srovnání s telecím syřidlem nižší výnosy a dávají jinou chuť sýrům (Roginsiki et al., 2002) Mikrobiální syřidla Již od konce 19. století je známo, že některé mikroorganismy produkují enzymy srážející mléko. Teprve nutnost hledat náhražky klasického syřidla donutila vědce 16

17 zabývat se výzkumem možností praktického využití některých mikroorganismů k výrobě syřidla. K výrobě mikrobiálního syřidla lze použít: plísně, kvasinky a bakterie (Teplý et al., 1976). Všechna známá mikrobiální syřidla používaná pro výrobu sýrů jsou plísňového původu. Většina z bakteriálních proteináz, které sráží mléko, jsou nevhodné hlavně z důvodu jejich vysoké proteolytické aktivity. V sýrařství se používají nejvíce dvě mikrobiální syřidla, převažuje Rhizomucor miehei. Existuje ve 4 typech a všechny jsou výrazně proteolytičtější než chymosin. První: nativní typ, často označovaný jako typ L se označuje tím, že je velmi tepelně stabilní. Druhý: destabilizační produkt, často označovaný jako typ TL, vzniká oxidací nativního enzymu, je termolabilní, více závislý na ph a je méně proteolytický než typ L. Třetí: termolabilní forma, označovaná jako typ XL, vzniklý silnější oxidací než TL. Je termolabilní, více závislý na ph a o něco méně proteolytický než TL. Čtvrtý: chromatograficky čistá forma typu XL, označována jako XLG nebo XP, má funkční vlastnosti jak XL, ale obsahuje méně neenzymatických nečistot. Syřidlo z Cryphonectria parasitica se vyznačuje tím, že má velmi vysokou proteolytickou aktivitu, velmi dobrou formaci sýřeniny, nízkou závislost na ph a je velmi termolabilní. Díky svým vlastnostem se využívá při výrobě sýrů vyrobených při vysokých teplotách, jako např. ementál. Rhizomucor pusillus je produkt podobný Rhizomucor miehei a oproti Rhizomucor miehei nemá žádné výhody. (Law, Tamime, 2010) Chymosin vyráběný fermentací (FPC) FPC je chymosin produkovaný fermentací geneticky modifikovaných organismů (Law, Tamime, 2010). Během 90. let 20. století byla použita DNA technologie k rozvoji mikroorganismů, které jsou schopny produkovat chymosin pomocí DNA sekvence získané z buněk sleze telat (Roginsiki et al., 2002). Gen telecího chymosinu byl naklonován z Kluyveromyces lactis, Escherichia coli a Aspergillus niger (Fox et al., 2004). V současné době existují na trhu dva výrobky vyrobené z Aspergillus niger a Kluyveromyces lactis (oba produkují chymosin B). Vzhledem k tomu, že FPC je totožný s chymosinem, jeho vlastnosti jsou v zásadě stejné a nebyly pozorovány žádné 17

18 významné změny v porovnání s telecím chymosinem. Z tohoto důvodu je zavedení FPC na trhu velmi úspěšné. Zavedení FCP má i své nevýhody. První nevýhodou je, že spotřebiteli může vadit, že sýr je vyroben za použití produktu genového inženýrství. K tomuto problému je třeba říci, že k mléku je přidáno malé množství syřidla (30 ml do 100 kg mléka, tj. 0,03 %) a pouze jedna pětina z toho zůstane v sýru. Druhou nevýhodou je nulový obsah pepsinu. Nedostatek pepsinu však nemusí být problémem, protože pepsin se může jednoduše přidat a je obecně známo, že čím vyšší množství chymosinu je v syřidle, tím je výtěžnost sýru vyšší (Roginsiki et al., 2002). FPC obsahuje chymosin, který je stejný jako chymosin získaný ze zvířecích žaludků, což znamená, že má stejnou aminokyselinovou sekvenci jako chymosin z příslušného žaludku zvířete, ale je produkován účinnějšími prostředky. FPC produkty jsou na trhu od roku Hlavní FPC, který obsahuje hovězí enzym B, je dnes považován za nejlepší srážecí enzym, ke kterému se měří všechny ostatní enzymy. V současné době byla vyvinuta nová generace FPC, totožná s velbloudím chymosinem. FPC velbloudí je ještě účinnější koagulant v kravském mléce než FPC hovězí a vyznačuje se vysokou specifičností na kasein, což má za následek vysoké výnosy sýrů a nevytváří žádnou hořkost (Law, Tamime, 2010). Používání FPC neustále roste a dnes je aplikovaný ve více než polovině světové produkce. Hlavní důvod jeho úspěchu je vysoká specifičnost, čistota a dobré vlastnosti vzniklé sýřeniny. Cena tradičních syřidel získaných ze žaludků zvířat v průběhu let značně kolísala, kvůli proměnné dostupnosti žaludků a kvůli krizi, kterou způsobila nemoc šílených krav. Použití zvířecích syřidel se postupně snižuje a nyní se v první řadě používají pro tradiční druhy sýrů s chráněným označením původu. Mikrobiální syřidla, zvláště asparagová proteináza produkovaná Rhizomucor miehei, tvoří značnou část trhu a jsou dnes využívána ve větší míře než živočišná syřidla, především díky relativně nízké ceně (Law, Tamime 2010). 18

19 3.3.3 Syřidlo in vivo U výroby syřidla in vivo jde o získávání žaludečních šťáv sondou zavedenou do slezu telat sajících mléko. Z odebraných šťáv se pak připraví koncentrovaný enzym v tekuté nebo práškové formě, který je použitelný k sýření mléka při výrobě sýrů. Mezi hlavní problémy při získávání syřidla in vivo, tedy získávání chymosinu, patří konstrukce vhodné kanyly a její zavedení do žaludku telete. Tato kanyla musí umožňovat dlouhodobý odběr žaludečních šťáv. Dalším problémem je krmení. V první řadě je nutno dbát na takové složení krmení, aby nebyla vyvolávána sekrece pepsinu. Používá se nejčastěji mléko plnotučné nebo odstředěné, popřípadě mléko ředěné vodou nebo syrovátkou. Do krmení jsou přidávány minerální látky a vitamin D. Vliv má také způsob krmení. Při krmení plnotučným mlékem je možno nechat tele přímo sát od krávy. V případě krmení mlékem upraveným nebo syrovátkou, je nutno tele napájet nebo nechat sát z lahve. Vliv má i doba krmení a doba, kdy po počátku krmení je zahájen odběr žaludečních šťáv, který trvá většinou minut. Odběr je možno provádět několikrát denně, podle Fomina až 5krát (Teplý et al., 1976). Během 3 až 6 měsíců se dá tímto způsobem získat až 3 kg práškového syřidla, zatímco ze žaludku zabitého telete pouze g syřidla stejné síly. Sondou lze tedy ze žaludku jednoho telete získat tolik syřidla, kolik je možné získat z 200 žaludků mrtvých telat (Teplý, Friedrich, 1957). 3.4 Mechanismus srážení mléka syřidly Koagulace je krok, během kterého mléko prochází hlubokými fyzikálními i rheologickými změnami, a to je gelovatění. Gel vzniká agregací mléčné bílkoviny kaseinu. Toho lze dosáhnout: působením proteolytických enzymů snížením ph pod izoelektrický bod (4,6) ohřevem na 90 C při ph 5,2 (tj. vyšší než izoelektrický bod) Z těchto způsobů je enzymatická koagulace nejpopulárnější (Gunasekaran, Mehmet Ak, 2003). 19

20 Nejzákladnější krok v procesu výroby sýrů je konverze tekutého mléka na polotuhý gel. Následující synereze a odvod syrovátky od gelu má za následek tvorbu sýřeniny (Fox, 2004). Při přidání chymosinu k mléku je κ-kasein hydrolyzován v místě vazby Phe 105 -Met 106. Když je hydrolýza κ-kaseinu dostatečná, začne agregace, což má za následek vznik agregátů parakaseinových micel, které se postupně spojují a vzniká pevný viskoelastický gel (Law, Tamime, 2010). Obr. 1 Koagulace mléka syřidly (Fox et al., 2000) Při sladkém srážení vzniká více stabilní produkt než při kyselém srážení, proto se syřidla stala dominantní pro výrobu sýru. Syřidla se používají ze 75 % pro celosvětovou produkci sýrů (Fox et al., 2004). Srážení mléka syřidly má několik velkých výhod oproti kyselému srážení. Gely vzniklé sladkým srážením podstupují mnohem větší synerezi než gely vzniklé kyselým srážením. Srážení mléka lze rozdělit na primární a sekundární fázi, i když se tyto fáze překrývají (Roginski et al., 2002) Primární fáze Kasein v kravském mléce je složen ze 4 druhů známých jako α s1 -, α s2 -, β- a κ-kasein. Každá kaseinová frakce je polypeptid a každý má několik genetických variant, které způsobují drobné změny v primární struktuře proteinů. Všechny kaseiny jsou fosfoproteiny, obsahují fosfoserin, v některých případech i fosfothreonin (Robinson, Tamime, 1996). Kasein v kombinaci s nezanedbatelným množstvím micelárního nebo koloidního fosforečnanu vápenatého tvoří velké agregáty nazývané kaseinové micely. Oba α s i β-kasein jsou citlivé na srážení Ca 2+ v mléce, protože obsahují zbytky 20

21 fosfoserinu, který má vazebnou afinitu na vápník. Tyto kaseiny jsou chráněny κ-kaseinem, který se s vápníkem váže málo, protože obsahuje jen málo fosfoserinových zbytků. Molekuly κ-kaseinu jsou umístěny převážně na povrchu micely, kde hydrofilní C-terminální konec působí jako vrstva, která vytváří bariéru proti sdružení s jinými micelami (Roginski et al., 2002). V primární fázi dochází k hydrolýze κ-kaseinu, za vzniku dvou řetězců: para-κ-kaseinu a κ-kaseinomakropeptidu (Šustová, 2010). Kaseinomakropeptid je uvolněn a odchází se syrovátkou, zatímco para-κ-kasein zůstává připojený ke kaseinovým micelám (Fox et al., 2004). Obr. 2 Hydrolýza κ-kaseinu (Brooks, 2012) Jakmile dojde k rozštěpení κ-kaseinu, ten ztrácí schopnost stabilizovat kaseinový komplex (Gunasekaran, Mehmet Ak, 2003). Zdá se, že všechny hlavní typy syřidel hydrolyzují κ-kasein na vazbě mezi Phe 105 -Met 106, výjimkou je Cryphonectria parasitica, která štěpí vazbu Ser 104 -Phe 105 (Roginski et al., 2002). Vazba Phe-Met κ-kaseinu je mnohonásobně citlivější na účinek syřidla, než jakékoliv jiné vazby kaseinu. Nicméně Phe-Met vazba není sama o sobě zas až tak podstatná při hydrolýze. Význam vazby Phe-Met byl zkoumán studiem působení 21

22 chymosinu na krátké peptidy, se stejnou aminokyselinovou sekvencí jako má κ-kasein. Nejmenší peptid hydrolyzovaný chymosinem je úsek κ-kaseinu (Ser-Phe-Met-Ala-Ile), rozšíření tohoto úseku k N nebo C-terminálnímu konci (98 111) κ-kaseinu zvyšuje jeho náchylnost k syřidlu. Vazba Phe-Met je nechráněnou částí κ-kaseinu, což usnadňuje přístup aktivního místa proteinázy, jako je chymosin. To znamená, že konformace κ-kaseinu v oblasti činí z této části molekuly velmi citlivé místo vůči syřidlu (Sweeney, 2007) Sekundární fáze Pokud dojde k 85% hydrolýze κ-kaseinu, micely se začnou shlukovat a vytvářejí gel (Sweeney, 2007). Během prvních 60 % RCT (času koagulace) existují micely jako jednotlivé částice. Mezi % RCT se micely začnou shromažďovat bez náhlé změny typu nebo rozsahu agregace. Při 100 % RCT je většina micel seskupena do krátkých řetězců, které se pak začnou agregovat a tvořit síť (Fox et al., 2000). Vlivem primární fáze dojde ke snížení záporného náboje na kaseinové micele, což vede ke snížení elektrostatického odporu mezi micelami, dále ke snížení hydrodynamického průměru micel a ztrátě prostorové stability (Thompson et al., 2009). Povaha přitažlivých sil během agregace není známá, ale mohou se na ní podílet vápníkové můstky, van der Waalsovy síly a hydrofobní interakce. K agregaci micel dojde pouze v přítomnosti Ca 2+ a ke vzniku gelu dojde pouze v případě dostatku koloidního fosforečnanu vápenatého (Roginski et al., 2002). Zcela hydrolyzované micely zpočátku tvoří malé lineární řetězce a ty se hromadí ve formě shluků a nakonec tvoří systémově vedenou gelovou síť (Thompson et al., 2009) 22

23 Kaseinové micely Částečná hydrolýza κ-kaseinu Agregace micel Vznik sýřeniny Obr. 3 Schematický nákres jednotlivých procesů probíhajících při srážení mléka (Roginski et al., 2002). 3.5 Analýza syřidel Síla syřidla Od roku 1870 do roku 1950 byla charakterizace syřidel založena na stanovení síly syřidla. Síla syřidla v Soxhletových jednotkách byla původně definována jako množství čerstvého mléka, které může být sraženo jedním mililitrem syřidla za 40 min při 35 C. Vzhledem ke změnám ve srážlivosti mléka to není uspokojivá definice. Vylepšení analýzy srážení mléka bylo publikováno anglickým vědcem N. J. Berridgem v roce 1952, který navrhl použití standardizovaného sušeného mléka naředěného 0,01 mol/l CaCl 2. Jednotka Berridge neboli jednotka syřidla (RU) je definována jako aktivita syřidla, která je schopná srazit 10 ml standardizovaného mléka při ph 6,3 za 100 sekund při teplotě 30 C. Soxhletovy nebo Berridgeho jednotky jsou využívány téměř ve všech národních definicích pro zjištění síly syřidla a testů srážlivosti. Mnoho variant ve složení syřidel a koagulantů na dnešním trhu však 23

24 způsobuje, že tyto definice jsou nejisté a nepřesné. Jelikož aktivita srážení u pepsinu se zvyšuje, mnohem více než u chymosinu, se snižujícím se ph, je nutné provádět test aktivity při ph podobném mléku (6,5). V opačném případě je aktivita pepsinu nadhodnocena, jako v případě použití Berridgeho substrátu, který obsahuje 0,01 mol/l CaCl 2 a má ph 6,3 a příliš vysoký obsah vápníku. Koagulanty obsahují enzymy jiného původu a jejich aktivita srážení mléka se liší od pepsinu i chymosinu. Je zřejmé, že je potřeba mezinárodní standardní metody pro stanovení složení syřidel a síly syřidel a koagulantů. IDF má skupinu pracovníků, která se zabývá touto problematikou a zveřejnila tři mezinárodní standardy. První standard slouží ke zjištění složení pepsinu a chymosinu, druhý určuje sílu pepsinu a chymosinu a třetí nejpoužívanější koagulanty. AMAFE produkuje velké dávky pepsinového i chymosinového referenčního standardu v prášku. Aktivita sýření mléka těchto dávek je upravena na stejný standardizovaný substrát mléka (0,05 % CaCl 2 ) při ph 6,5 a 32 C: to stanovuje 1000 international milk-clotting units na gram (IMCU/g), které se používají od roku Celková aktivita sýření mléka daným syřidlem se měří ve vztahu k oběma referenčním standardům při ph 6,5 a při 32 C na standardizovaném substrátu (0,05 % CaCl 2 ). Výsledky se uvádí v IMCU/ ml nebo v IMCU/g. Stanovení celkové aktivity sýření FPC se vztahuje pouze k chymosinu, protože FPC obsahuje 100 % chymosinu. (Roginski et al., 2002) Čas koagulace Doba od přidání syřidla do začátku gelovatění je důležitý faktor při výrobě sýrů (Sweeney, 2007). Po přidání syřidla do mléka chvíli trvá, než začnou micely agregovat, ale od určité doby agregace rychle stoupá. V určitém okamžiku se dají malé agregáty zjistit pouhým okem. Čas koagulace je definován jako čas potřebný pro vznik agregátů v mléce a je nepřímo úměrný koncentraci enzymu (Walstra et al., 2006). Nejjednodušší laboratorní metodou pro měření času koagulace je sledovat čas od přidání známého množství zředěného syřidla ke vzorku mléka s regulovanou teplotou ve vodní lázni, např. 30 C do nástupu viditelné koagulace (Fox et al., 2000). 24

25 3.6 Faktory ovlivňující hydrolýzu κ-kaseinu Hydrolýza κ-kaseinu je ovlivněna mnoha faktory. Optimální ph chymosinu a pepsinu skotu pro malé syntetické peptidy je 4,7. Chymosin hydrolyzuje inzulin, kysele denaturuje hemoglobin a Na-kaseinát optimálně při ph 4 a 3,5. Optimální ph v primární fázi je okolo 6 při 4 C nebo 30 C. Optimální teplota pro koagulaci mléka telecím syřidlem při ph 6,6 je kolem 45 C. Pravděpodobně je optimum pro hydrolýzu κ-kaseinu kolem této hodnoty. Tepelné ošetření mléka při teplotách nad 65 C negativně ovlivňuje srážlivost. Pokud je tepelné zpracování velmi vysoké (nad 90 C po dobu 10 minut) mléko se nemůže srazit. Změny v rovnováze soli jsou dalším faktorem, hlavní faktor je mezimolekulární formace disulfidické vazby mezi κ-kaseinem a β-laktoglobulinem a/nebo α-laktalbuminem. Obě fáze, primární i sekundární jsou omezeny v zahřátém mléce, což se projevilo v rychlosti ztuhnutí sýřeniny a v pevnosti výsledného gelu. Nepříznivý efekt tepelného záhřevu může být změněn okyselením na hodnoty ph 6,6 6,0 před nebo po zahřátí nebo přidáním CaCl 2, který způsobuje snížení ph. Je zřejmé, že rychlost primární fáze je přímo úměrná použitému množství syřidla. V sýrařství se používá takové množství syřidla, aby srazilo mléko za minut ( ml standardního telecího syřidla na 1000 ml mléka). Z hlediska koagulace, by menší či větší množství syřidla nemělo mít nežádoucí účinky (kromě změny RCT). Nicméně množství syřidla v sýřenině je úměrné množství syřidlu přidanému do mléka (alespoň pro telecí syřidlo) a to má velký vliv na rychlost proteolýzy během zrání (Fox et al., 2000). 3.7 Faktory ovlivňující čas koagulace Mnoho faktorů ovlivňuje proces srážení mléka a konzistenci gelů, včetně ph, teploty, obsahu kaseinu, iontové síly, koncentrace enzymu, obsahu vápníku, přítomnosti homogenizovaných tukových kapének, koncentrace denaturovaných syrovátkových bílkovin (Thompson et al., 2009). Teplota Optimální teplota pro sýření mléka je okolo 40 C. Nicméně během výroby sýrů je teplota obvykle nastavena na 30 C kvůli startovacím kulturám. 25

26 Koagulace se nevyskytuje při teplotě pod 18 C v důsledku vlivu teploty na sekundární fázi, zatímco při vyšších teplotách je syřidlo tepelně denaturované (50 60 C), v závislosti na typu syřidla a ph. ph Rychlost koagulace se zvyšuje s klesajícím ph, při příliš vysokém ph se mléko nesráží. ph má tedy hlavní vliv na primární fázi koagulace. Koncentrace Ca 2+ Vysoká hladina Ca 2+ v mléce urychluje srážení (snižuje RCT). Vliv Ca 2+ je především na sekundární fázi sýření, ačkoli má i mírný dopad na primární fázi. Protože přídavek Ca 2+ má vliv na rovnováhu soli, způsobuje srážení koloidního fosforečnanu vápenatého a produkci H +, které snižuje ph. Chlorid vápenatý (CaCl 2 ) se často přidává do mléka pro zlepšení srážlivosti. Tepelná úprava (např. pasterace) Ohřev mléka při nízkých teplotách má za následek nepatrné snížení času koagulace. Dochází ke srážení rozpustného vápníku na koloidní fosforečnan vápenatý. To osvobozuje H +, tím dojde ke snížení ph. Teplota nad 70 C (v závislosti na čase působení) způsobuje denaturaci syrovátkových proteinů (zejména β-laktoglobulinu). Volné SH skupiny denaturovaného β-laktoglobulinu interagují s κ-kaseinem pomocí disulfidického spojení. To má hlavní negativní vliv na sekundární fázi. Proto je velice obtížné udělat kvalitní sýr z pasterovaného mléka a nelze tedy sterilovat mléko pro výrobu sýrů (a tím zabít bakteriofágy). Mléko je někdy vystaveno kombinaci vysoké teploty za krátký čas (vysoká pasterace), aby se zvýšila výtěžnost denaturované syrovátkové bílkoviny nebo došlo ke zničení Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Sweeney, 2007). Tepelná úprava mléka může vést k podstatným změnám sladkého srážení mléka. Tyto změny jsou závislé na výši použité teploty. UHT ošetření mléka ( C, 3 4 s) snižuje iontovou hladinu vápníku o %. Tyto změny mají značně negativní vliv na sýření, proto je taková úprava nežádoucí pro výrobu většiny druhů sýrů. Denaturace β-laktoglobulinu vyvolaná teplem nemá vliv na primární fázi koagulace. Nicméně tato denaturace vyvolaná teplem narušuje následnou agregaci parakaseinových micel. To má negativní vliv na formování gelu, který je slabší, má podstatně vyšší obsah vody zadržené denaturovaným β-laktoglobulinem a na porušení synereze gelu. Denaturovaný β-laktoglobulin je také v rozporu s následným zráním sýrů (Tamime, 2009). Koncentrace bílkovin Protože kasein tvoří strukturální matrici gelu, koagulace se zrychluje se zvyšujícím množstvím proteinu v mléce (Sweeney, 2007). 26

27 3.8 Vliv teploty na sýření Koagulace syřidlem je velmi závislá na teplotě. Kravské mléko se nesrazí při teplotě nižší než 18 C, pokud není zvýšená koncentrace Ca 2+ (Fox, 2000). Při sýření by mléko mělo mít požadovanou teplotu, která by během sýření měla být stálá. Optimální teplota sýření je C a typická koagulační teplota využívaná při výrobě sýrů je 31 C (Roginski et al., 2002). Teplota ovlivňuje především rychlost agregace, pevnost sýřeniny a zvyšuje rychlost zpevnění gelu. Rychlost tvorby sýřeniny se zvyšuje v rozmezí teplot C, při vyšších teplotách se rychlost sýření zpomaluje (Nájera et al., 2002). Když má mléko nízkou teplotu (10 C) dojde k rozštěpení κ-kaseinu, ale nedaří se vyvločkování. Pokud je mléko následně zahřáto, dojde velmi rychle ke sražení (Walstra, 2006). Nejrychlejší koagulace je dosaženo při vyšší teplotě a nízkém ph. Nejnižší pevnosti sýřeniny bylo dosáhnuto při teplotě 28 C při ph 6,8 a nejvyšší pevnosti při teplotě 44 C při ph 6,0 (Nájera et al., 2002). Delší chlazení mléka před sýřením může mít za následek delší čas koagulace a vznik horší sýřeniny, a to zejména v důsledku disociace β-kaseinu z micely. Teplota má hlavní vliv na sekundární fázi koagulace. U vyšších teplot se čas koagulace snižuje a minimum je při teplotách C, při vyšších teplotách se syřidlové enzymy denaturují. Běžně používaná teplota (31 C) je hodně pod optimální hodnotou. Nižší teplota je nezbytná k optimalizaci růstu mezofilních bakterií mléčného kvašení, které mají optimální teploty růstu asi C a nerostou ani nepřežívají teploty nad 40 C. Navíc struktura sraženiny se zvyšuje při nižší teplotě, která je proto používána dokonce pro sýry vyrobené s použitím termofilních kultur (Fox et al., 2000). Sýření mléka, jako rozhodující první krok v sýrařství, je velmi ovlivněn teplotou. Nejvíce je teplotou ovlivněna agregace micel. Teplota se může lišit od C v závislosti na typu sýru. Sýření mléka je výsledkem dvou reakcí: enzymatické hydrolýzy a fyzikální agregace kaseinových micel. Syřidla působí na kasein při nízkých teplotách a to kolem 0 C, ale mléko se nesráží při teplotách nižších než 18 C. Na rozdíl od toho je agregace velmi rychlá při vysokých teplotách (nad 55 C). Pro porovnání vlastností sýření byla použita rostlinná syřidla z Cynara cardunculus L., Cynara humilis L. a chymosin. U všech tří syřidel byl zjištěn stejný čas koagulace (19 min) při teplotě 32 C. Testy sýření byly provedeny při teplotách 25, 30, 27

28 32, 35 a 40 C a byly sledovány po dobu 16, 8,5, 6, 4 a 3 hodin od přidání syřidla do mléka. S rostoucí teplotou došlo ke snížení času koagulace, tento výsledek nastal u všech syřidel. T g (čas koagulace) byl stanoven pro všechna syřidla za 19 minut při 32 C. T g se měnil jinak při různých teplotách u rostlinných syřidel a jinak u chymosinu. Při teplotě 25 a 35 C byl T g pro chymosin významně delší než u obou rostlinných syřidel, která měla podobná T g. Při 30 C měla všechna syřidla podobný T g. Při 40 C měl chymosin nejdelší T g, Cynara humilis nejkratší a Cynara cardunculus byl mezi nimi. Pro všechna syřidla bylo sýření rychlejší se zvyšující se teplotou. Při 25 C byla nejpomalejší a při 40 C nejrychlejší. Pro všechna syřidla platí, že zvýšení teploty má za následek rychlejší tvorbu gelu. T g je kratší a gely měly rychlejší počáteční tempo růstu (G'). Velikost hodnoty G' závisí na počtu a síle vazeb mezi částicemi κ-kaseinu a také na struktuře a prostorovém uspořádání kaseinu v gelu. Teplota sýření má významný dopad na vlastnosti gelů produkovaných rostlinnými syřidly a chymosinem. Na začátku sýření měla rostlinná syřidla vyšší hodnoty G' než chymosin a T g hodnoty byly kratší u rostlinných syřidel. Mezi Cynara cardunculus a Cynara humilis bylo pozorováno jen pár rozdílů. Při nízké teplotě (25 C) bylo sýření mnohem rychlejší u rostlinných syřidel než u chymosinu. Rostlinná syřidla mohou být užitečná při výrobě sýrů, u nichž sýření probíhá za nízkých teplot, zatímco při vyšších teplotách může dojít k nadměrné proteolýze, což má negativní dopad na strukturu a chuť sýrů vyráběných pomocí rostlinných syřidel (Esteves et al., 2003). Je známo, že teplota ovlivňuje jak primární tak sekundární fázi koagulace. Pozorování difúzní odrazivosti koagulace kravského a kozího mléka pomocí optického čidla poznamenalo, že T max (čas maximálního sklonu odrazivosti) a T cut (čas krájení sýřeniny) se snížily se zvyšující se teplotou. Tempo růstu těchto parametrů se zvyšující se teplotou klesá. Toto pozorování lze přičíst nelineárnímu vztahu mezi teplotou a časovými parametry. Většina autorů popisuje nelineární vliv teploty na čas koagulace (Ramet, Weber 1980, Zoon et al. 1988). Cheryan (1983) vypočítal Q 10 hodnoty (teplotní koeficient) pro celý proces koagulace mezi C a C. Zjistil vyšší hodnoty Q 10 mezi C než mezi C, což může souviset 28

29 s pozorovaným nelineárním vlivem teploty na sýření. Toto chování lze vysvětlit tepelnou inaktivací chymosinu s rostoucí teplotou (Castillo et al., 2002). Optimální teplota sýření pro rekombinantní jehněčí chymosin je 40 C, pro rekombinantní telecí chymosin a hovězí syřidlo je 45 C a pro mikrobiální koagulanty 60 C. Tepelná nestabilita rekombinantního jehněčího chymosinu při teplotách vyšších než 45 C může být výhodou pří výrobě tvrdých sýrů (Rogelj et al., 2010) Vliv teploty na mikrobiální syřidla Vliv teploty na sýření byl hodnocen při 20, 30, 35, 40 a 50 C. Mléko obsahovalo přídavek 10 g CaCl 2 na 100 litrů mléka o kyselosti 7,2 SH. Bylo použito takové množství syřidla, které při teplotě 32 C začalo srážet mléko za 15 minut. Byla použita 4 syřidla: Syřidlo vyrobené ze 40 % těžkých a 60 % lehkých žaludků o síle 1: Rennilasa vyrobená z plísně Mucor miehei o síle 1: Mikrozym vyrobený z Bacillus subtilis o síle 1: Mikrozym vyrobený prof. Dr. Maškem o síle 1:500. Při teplotách C nebyl zaznamenán žádný podstatný rozdíl mezi chymosinovým syřidlem a mikrobiálními syřidly. Při teplotách 20 a 30 C vykazovala nejdelší dobu srážení Rennilasa, při teplotě 35 C byla u Mikrozymů doba srážení o něco kratší. Při 40 a 50 C se doba srážení u mikrobiálních syřidel zkrátila už podstatně. U chymosinového syřidla dochází naopak při teplotě 50 C k prodloužení doby sýření. Tuhost sýřeniny byla nejvyšší při teplotě 35 C a to u všech typů syřidel. Při nižších a vyšších teplotách se tuhost snižovala, podstatně nižší byla při 20 a 50 C. Celkově byla zjištěna vyšší tuhost u chymosinového syřidla. Organoleptické posouzení sýřenin ukázalo, že sýřenina z Rennilasy se nejvíce podobá sýřenině vyrobené chymosinovým syřidlem, která byla nejlepší ve všech případech. Sýřenina vyrobená použitím obou Mikrozymů byla měkčí, méně pružná a po rozetření více mazlavá a méně zrnitá. Tuhost, pružnost a zrnitost sýřeniny se 29

30 u všech syřidel do 35 C a u chymosinového syřidla do 40 C zvyšovala, při vyšších teplotách se začala opět snižovat. Synereze sýřeniny, která se hodnotila vážením vyloučené syrovátky, byla variabilní. Celkově se však množství vyloučené syrovátky zvyšovalo při teplotách do 40 C vyloučené za 1 hodinu od nakrájení sýřeniny, do 50 C vyloučené za 4 hodiny od nakrájení a za 20 hodin po nakrájení do 35 C. Sušina syrovátky byla nejnižší ve všech případech při 35 C. Obsah vápníku byl vysoký při teplotách do 35 C, nejnižší obsah byl při teplotě 50 C (Dvořák et al., 1971) Vliv teploty na průběh koagulace Teplota sýření je důležitým faktorem, který ovlivňuje vlastnosti sýřeniny. Teplota sýření má vliv na růst kultur a tudíž na vývoj ph, dále na rychlost tvorby a zpevnění sýřeniny a na synerezi. Teplotní koeficient (Q 10 ) je pro primární fázi 1,8 2,0 při ph 6,7 a teplotě od 1 do 30 C a pro sekundární fázi, která je citlivá na teplotu, je teplotní koeficient Se zvyšující se teplotou sýření se zvýšil G' (storage modulus skladovací modul) a G'' (loss modulus modul ztráty) pravděpodobně z důvodu vyšší aktivity syřidla a rychlejšího spojení kaseinových micel. Při vyšších teplotách došlo k rychlejšímu uvolnění vazeb. Při zvyšující se teplotě sýření z 29 na 32,2 C se σ y (yield stress maximální hodnota získaná za stresu, po níž se hodnoty začaly snižovat) zvyšoval zřejmě kvůli zvýšené rychlosti spojování kaseinových micel, což mělo za následek zvýšení pevnosti a počtu vazeb. Při vyšších teplotách (34 37 C) se σ y snížil. Tan δ (loss tangent koeficient dielektrických ztrát) se s rostoucí teplotou také zvyšuje, což znamená větší náchylnost k novému uspořádání sítě a spontánnímu rozštěpení vazeb. Podíl uvolněných vazeb se během určitého času zvyšuje, což může vysvětlovat zvýšení tan δ a menší σ y. Podle Kim a Kinsella (1989) se čas koagulace snižuje s rostoucí teplotou kvůli zvýšené frekvenci tepelných srážek mezi kaseinovými micelami a z tohoto důvodu je větší pravděpodobnost, že se kaseinové micely dříve shromáždí (Mishra et al., 2005). 30

31 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Materiál Měření probíhalo v laboratoři Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity v Brně. Vzorek čerstvého mléka pro analýzu byl odebrán v mléčném automatu v Kuřimi. Mléko pocházelo ze Zemědělského družstva Bořitov a byly odebrány 4 litry mléka do plastových lahví, které byly zakoupeny na místě. U zkoušeného mléka byly provedeny veškeré základní analýzy, aby se ověřilo, že mléko splňuje požadavky na jakostní surovinu. U mléka byla také provedena mikrobiologická analýza. Výsledky jsou uvedeny v Tab. 1. Před samotným stanovením bylo mléko zahřáto na 40 C a poté zchlazeno na 20 C. Tab. 1 Základní rozbor mléka Stanovení Výsledek ph 6,65 titrační kyselost 7,04 tuk 3,69 % laktosa 5,19 % N-test 2 sušina 12, 6393 % bílkoviny 3,36 % CPM KTJ/ml K laboratornímu pokusu bylo použito 30 odměrných baněk o objemu 100 ml, které byly řádně označeny použitým syřidlem a teplotou sýření. Do odměrných baněk bylo odměrným válcem odměřeno 50 ml zkoušeného mléka. Mléko bylo zasýřeno při teplotách 20 C, 25 C, 30 C, 35 C, 40 C, 45 C, 50 C, 55 C, 60 C a 65 C třemi syřidly: Přírodní pepsinové syřidlo Laktosin o síle 1: (Obr. 22, přílohy) Chymosinové přírodní syřidlo Naturen Premium o síle 145 IMCU/ml (Obr. 23, přílohy) Chymosinové mikrobiální syřidlo Chy-Max o síle 950 IMCU/ml (Obr. 24, přílohy) 31

32 Mléko bylo zasýřeno 0,5 ml 100% Laktosinu, 2 ml 5% Naturen Premium a 0,5 ml 2,5% Chy-Max. 4.2 Metodika Měření Vzorek mléka byl při dané teplotě, která byla udržována pomocí vodních lázní (Julabo Labortechnik, Německo a MLW, Německo), zasýřen a byl měřen čas koagulace. Čas koagulace byl měřen na stopkách od prvního přidání syřidla do vzniku prvních vloček sýřeniny na skle baňky. Poté bylo zasýřené mléko přeneseno do termostatu (BMT a.s, Česká Republika), kde bylo inkubováno jednu hodinu při teplotě 35 C. Po hodině inkubování byla hodnocena jakost sýřeniny. Na závěr byla vypočítána síla syřidla. Mléko bylo při jednotlivých teplotách zasýřeno všemi třemi syřidly a měření bylo prováděno 2krát. 32

33 4.2.2 Hodnocení jakosti sýřeniny Tabulky č.2. Jakost sýřeniny byla hodnocena po hodině inkubování v termostatu podle Tab. 2 Hodnocení kvality sýřeniny Třída Vzhled sýřeniny a syrovátky jakosti 1 Sýřenina je velmi dobrá, pevná, po vyklopení zachovává tvar. Syrovátka je čirá, žlutozelené barvy. 2 Sýřenina je dobrá, je poněkud méně pevná, méně dobře zachovává tvar. Vylučování syrovátky není dokonalé, je bělavé, nazelenalé barvy. 3 Sýřenina je špatná, je měkká, částečně nedrží pohromadě. Syrovátka je mlékovitě bílá. 4 Sýřenina je velmi špatná, vůbec nedrží pohromadě. Syrovátka je mlékovitě bílá. 5 Nezřetelné nebo žádné vyvločkování kaseinu. (Gajdůšek, 1997) Síla syřidla Síla syřidel byla vypočítána podle vzorce: Objem mléka ( ml) 2400 (40 min) x Síla syřidla (x) = čas koagulace ( s) (Gajdůšek, 1997) x ředící faktor 33