Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin Vliv syřidla na kvalitu sýření mléka

Transkript

1 Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin Vliv syřidla na kvalitu sýření mléka Diplomová práce Vedoucí práce: prof. Ing. Květoslava Šustová, Ph.D. Vypracovala: Bc. Pavlína Koláčková Brno 2017

2

3

4

5 PODĚKOVÁNÍ Výsledky a výstupy závěrečné práce byly zpracovány na přístrojovém vybavení financovaném z projektu OP VaVpI CZ.1.05/4.1.00/ Výukové a výzkumné kapacity pro biotechnologické obory a rozšíření infrastruktury. Dovoluji si tímto poděkovat prof. Ing. Květoslavě Šustové, Ph.D. za její odborné vedení při vypracování diplomové práce, za poskytnutí cenných rad a odborných informací k práci. Dále bych ráda poděkovala panu Ing. Romanu Pytlovi za cenné rady a čas, který mi věnoval při laboratorním měření k praktické části. A poděkování také patří družstvu Kojál Krásensko, které mi poskytovalo mléko po celou dobu experimentu.

6 ABSTRAKT Diplomová práce se zabývá vlivem syřidel na kvalitu sýření mléka. Teoretická část obsahuje základní informace o složení mléka. Dále se zaměřuje na sýření, druhy syřidel a princip srážení mléka. Poslední kapitola teoretické části je věnována syrovátce, jejím složením, významem a barvou. Praktická část je zaměřena na parametry, které ovlivňují kvalitu sýření mléka. Mezi tyto parametry byly zařazeny rozbor mléka, čas koagulace, kvalita sýřeniny dle Gajdůška, objem uvolněné syrovátky, sušina syrovátky a barva syrovátky. Tyto parametry byly mezi sebou porovnávány i z hlediska použití rozdílného syřidla. Zjišťovala jsem také faktory, které ovlivňují sýření mléka. Z výsledků vyplívá, že rozbor mléčných složek byl srovnatelný s výsledky z centrální laboratoře. Dále bylo zjištěno, že množství přidaného syřidla mělo vliv na čas koagulace a objem uvolněné syrovátky. Větší množství a typ syřidla mělo vliv na kvalitu sýřeniny a sušinu syrovátky. Množství syřidla nemělo vliv na barvu. Avšak typ použitého syřidla a jeho objemu může mít vliv na jednotlivé parametry barvy syrovátky. Klíčová slova Mléko, srážení mléka, syřidlo, syrovátka, CIELab, sýřenina ABSTRACT The topic of my diploma thesis deals with influence rennet to quality coagulation of milk. The theoretical part consists of general information about milk and milk composition. I also focused on curdling, types rennet and principle of milk coagulation. Last topic of theoretical part is about whey, whey composition and nutrition and whey colour. The practical part was focused on parameters, which influence quality coagulation of milk. Among them includes analysis of milk, clotting time, quality curd, volume released whey, dry matter of whey, colour whey. These parameters are compared using different rennet. I also investigated the factors that influence milk curdling. The results suggest that composition of milk was comparable with results of the central laboratory. It was also found, that amount of rennet had an influence on coagulation time and volume of whey. More rennet had an influence of quality of curd and dry matter of whey. Amount of rennet did not infulence on whey colour. Type and amount of rennet may affect on individual parameters of whey colour. Key words Milk, coagulation of milk, rennet, whey, CIELab, curd

7 OBSAH 1 ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Základní složení mléka Mléčný tuk Sacharidy mléka Bílkoviny mléka Kaseiny a syrovátkové bílkoviny Nebílkovinné N-látky Minerální látky Biokatalyzátory Plyny v mléce Technologicky významné vlastnosti mléka Kyselost Syřitelnost Kysací schopnost mléka Termostabilita Srážení mléka a problematika syřidel Druhy syřidel Rostlinná syřidla Živočišná syřidla Geneticky získaná syřidla Mikrobiální syřidla Princip srážení Syřitelnost a faktory ovlivňující syřitelnost Syrovátka Složení... 21

8 3.4.2 Význam syrovátky Měření barvy potravin Barva syrovátky MATERIÁL A METODIKA Stanovení základních složek mléka Stanovení obsahu tuku Stanovení obsahu bílkovin dle Kjeldahla Stanovení mléčného cukru polarimetricky Stanovení vápníku titrační metodou N-test Stanovení ph a titrační kyselosti mléka Stanovení sušiny Přídavek syřidla Stanovení kvality sýřeniny dle Gajdůška Spektrofotometrické stanovení barvy syrovátky VÝSLEDKY A DISKUZE Výsledky rozboru základních složek mléka Vliv množství použitého syřidla na čas syřitelnosti Posouzení kvality sýřeniny Množství uvolněné syrovátky Pozorování sušiny syrovátky vzniklé použitím různých syřidel Vliv přídavku syřidla na barvu syrovátky ZÁVĚR PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ SEZNAM TABULEK SEZNAM ZKRATEK PŘÍLOHY... 59

9 1 ÚVOD Mléko je jednou z nejlépe vyvážených potravin, a tvoří vysoce hodnotnou složku potravy. Je také nejlepším zdrojem vápníku. Mléko má jednu unikátní vlastnost, a to, že přirozeně se vyskytující mikroflóra, která využívá živiny z mléka, a dokáže svými různorodými produkty zabezpečit širokou skálu senzoricky odlišných vlastností. Z technologického hlediska pro mléčný průmysl jsou nejdůležitější a nejcennější mléčné kaseiny. Hlavními mléčnými výrobky jsou mléko, sýry a jogurty. Mléčný kasein lze nahradit rostlinným, to vede k odlišným vlastnostem výrobku, především odlišná textura a senzorická kvalita. Bílkoviny jsou obecně nezbytnou složkou stravy a jejich denní příjem je zásadní pro vyváženou stravu. Škála výrobků, které lze z mléka vyrobit je pestrá. Velkou skupinu tvoří sýry. Z mléka se za pomocí syřidel (sladké srážení) vyrábí sýry. Druhotným produktem při výrobě je syrovátka. Výroba sýrů v EU se odhaduje na 8,6 milionu tun ročně a roční produkce kaseinu v rámci EU je tun. V současné době je roční produkce syrovátkových produktů přibližně 1,5 až 2 miliony tun. Produkce sýrů, a tím i vzniklé syrovátky se každým rokem zvyšuje o 1,5 až 2 %. Syrovátka jako sekundární produkt při výrobě sýrů se může dále zpracovat. Mezi výrobky ze syrovátky patří syrovátkové sýry (Ricotta), sušená syrovátka, nápoje atd. V dnešní době je syrovátka hojně využívána v potravinářském průmyslu a přidává se například i do pekařských výrobků. Druhým způsobem výroby sýrů, je kyselé srážení. Zde dochází k okyselení mléka pomocí kyselin (např. citronová kyselina, octová kyselina) na hodnotu ph 4,6, kdy se vysráží kasein. Tento způsob se používá při výrobě tvarohů. Aby mohl být vyroben kvalitní sýr, je třeba mít zvládnutou technologii a faktory, které mohou kvalitu ovlivňovat. Mezi ně patří například množství syřidla, kvalita a zpracování sýřeniny a další. 8

10 2 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo: - prostudovat dostupnou odbornou a vědeckou literaturu o problematice sýření mléka; faktory, které ovlivňují syřitelnost; typy syřidel; možnosti hodnocení sýření mléka, - vybrat vhodné metody k posouzení kvality sýření mléka, - výsledky statisticky a popř. graficky vyhodnotit a diskutovat s jinými autorskými pracemi. 9

11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Základní složení mléka Mléko je komplexní a dynamický systém, který poskytuje nutriční a funkční výhody. Zpracování má vliv na jeho vlastnosti. Bílkoviny v mléce jsou velmi složité a náchylné při zpracování na mléčné výrobky (Patel a Patel, 2015). Zimák (1991) a Gajdůšek (1985) uvádí, že mléko je sekret mléčné žlázy savců, určený pro výživu novorozenců. Základní složkou mléka je voda, jejíž obsah se podle druhu mléka (jeho původu) pohybuje v širokém rozmezí. V tab. 1 můžeme najít rozdílná složení mléka v porovnání mezi mlékem mateřským, kravským a kozím. Zastoupení jednotlivých složek v mléce je ovlivňováno genetickými faktory, mezi něž patří: plemeno dojnice, zdravotní stav, krmení a vnější vlivy. Další kapitoly práce budou zaměřeny na mléko kravské. Tab.1 Složení různých druhů mlék (Patel a Patel, 2015; Samková, 2012) Složky (%) Mateřské mléko Kravské mléko Kozí mléko Voda 87,5 87,3 85,2 Sušina 12,5 12,7 14,8 Tuk 4,0 3,9 5,6 Bílkoviny 0,9 3,3 3,8 kasein 0,3 2,6 3,1 syrovátkové 0,6 0,7 0,7 Laktosa 7,0 4,6 4,8 Minerální látky 0,2 0,7 0, Mléčný tuk Kravské mléko obsahuje v průměru 4 % mléčného tuku. Mléčný tuk je lehce stravitelný a má energetickou a ochrannou funkci. V tuku kravského mléka je široké zastoupení MK, je jich více než 400. Poměr nasycených a nenasycených MK je 2:1. Obsah přirozeně se vyskytujících transmastných kyselin je 1 8 %. Plnotučné mléko obsahuje 0,3 g těchto kyselin na 100 ml mléka (Kadlec et.al., 2009; Kopáček, 2014). 10

12 Mléčné lipidy tvoří z 98 % triacylglyceroly a zbytek zahrnuje di- a monoacylglyceroly, volné mastné kyseliny, steroly, estery sterolů, uhlovodíky a v tucích rozpustné vitamíny (Walstra et al., 2006). Tuk se v mléce nachází ve formě tukových globulí. Průměr globulí se pohybuje v rozmezí 0,1 25 μm. Jsou obaleny membránou fosfolipidů, která má ochrannou funkci. Mezi složky mléčného tuku patří cholesterol. Jeho množství v mléce se pohybuje kolem mg/kg mléka. Patří do skupiny sterolů spolu s ergosterolem, který se v mléčném tuku nachází v menší míře (Gajdůšek, 2003). Největší skupinu mléčných lipidů tvoří fosfolipidy. Největší zastoupení má fosfatidylcholin (lecitin), fosfatidylethnolamin (kefalin) a sfingomyelin, v menší míře fosfatidylserin (Gajdůšek, 2003) Sacharidy mléka Mléčný cukr neboli laktosa je disacharid (glukosa + galaktosa), jehož obsah se u zdravých dojnic pohybuje okolo 4,7 %. Laktosa spolu s mléčnými bílkovinami ovlivňují jakost a výživovou hodnotu mléka. Její hodnota je prakticky neměnná a málo ovlivnitelná. Pro technologickou a nutriční kvalitu mléka není hodnota laktosy rozhodující. Kromě laktosy se v mléce vyskytuje v menším množství D-glukosa a řada různých volných oligosacharidů (Samková, 2012). Laktosa se vyskytuje jen v mléce, její tvorba probíhá v mléčné žláze. V tenkém střevě dochází za přítomnosti enzymu β-galaktosidasy, ke štěpení na jednotky D-glukosu a D-galaktosu (Walstra, 1999). Laktosa je důležitým zdrojem energie v potravě a zvyšuje intestinální absorpci vápníku. Při výrobě sýrů slouží jako snadno dostupný substrát pro fermentaci bakteriemi na kyselinu mléčnou. Ta ovlivňuje ph žaludku a tenkého střeva (Kleibeuker, 2006) Bílkoviny mléka Dusíkaté látky tvoří nejkomplexnější složku mléka. Určují základní chemické a fyzikální vlastnosti mléka. Bílkoviny jsou součástí složitého komplexu N-látek. Pro technologické zpracování jsou významné čisté bílkoviny. Obsah těchto bílkovin se pohybuje v rozmezí 3,2 3,5 %. Jako hrubé bílkoviny označujeme čisté bílkoviny spolu s nebílkovinnými N-látkami (Kadlec et.al., 2009; Samková, 2012). 11

13 V bílkovinách mléka je obsaženo asi % dusíku. Nejvýznamnější složku tvoří kasein, který tvoří 80 % z čistých bílkovin. Zbylých 20 % tvoří sérové bílkoviny. Do syrovátky v sýrařské výrobě přechází mimo syrovátkové bílkoviny také nebílkovinné N-látky, kterých je obsaženo 5 7 %. Největší podíl nebílkovinných N-látek připadá na močovinu (50 %) a albuminy tvoří přibližně také 50 % (Gajdůšek, 2003; Samková, 2012) Kaseiny a syrovátkové bílkoviny Nejen kravské, ale i ostatní druhy mlék se skládají ze dvou odlišných skupin bílkovin. Kaseinové bílkoviny jsou hlavní bílkovinou mléka definovány jako komplex fosfoproteinů. Z celkových mléčných bílkovin připadá 75 % na kaseinové bílkoviny, a tím je kasein hlavní bílkovinou zastoupenou v mléce. Kasein tvoří základ sýrařské výroby. Váže se na vápník a vzniká vápenatá sůl, kterou je možné vysrážet okyselením, při ph 4,6 a teplotě 20 C (izoelektrický bod kaseinu) (Law, 1997). Mléko obsahuje koloidní částice, mezi které patří kaseinové micely. Je jich velké množství a žádná studie zatím nesjednotila obraz jejich struktury a vlastností (De- Kruif et.al., 2012). Kaseinový komplex se skládá z těchto frakcí: α s1 -kasein, α s2 -kasein, β-kasein, κ-kasein, které se liší v primární struktuře a stupni post-translačním modifikace. Povrchová vrstva kaseinové micely je bohatá na κ-kasein, jádro je tvořeno převážně hydrofóbními frakcemi α-, β-kaseinu, vápenatými a fosforečnanovými ionty (DeKruif et al., 2012; Samková, 2012). Syrovátkové nebo sérové bílkoviny představují přibližně % z čistých bílkovin mléka a po vysrážení kaseinu zůstávají v roztoku (syrovátce). Díky vysokému obsahu cystinu, mají vyšší nutriční hodnotu než frakce kasein. Tyto bílkoviny denaturují již při teplotách nad 50 C (kaseinové frakce jsou proti denaturaci poměrně odolné) (Samková, 2012). Největší podíl syrovátkových bílkovin připadá na β-laktoglobulin, tvoří více než 50 % syrovátkových bílkovin. Známe 8 genetických variant β-laktoglobulinu: A, B, C, D, E, F, G, Dr. Dalším zástupcem je α-laktalbumin, na který připadá 20 % proteinů syrovátky a známe 3 genetické varianty. α-laktalbumin velmi pevně váže dva atomy vápníku. Sérový albumin je totožný se sérumalbuminem krve a představuje 5 % celkových syrovátkových bílkovin. Je syntetizován v játrech a do mléka se dostává skrze sekreční buňky (Robinson, 2005). 12

14 V minoritním avšak biologicky významném množství (10 %) jsou zastoupeny imunoglobuliny. Zajišťují přenos imunity z matky na mládě a ve zvýšené koncentraci je nalezneme v mlezivu (kolostru). Obsah sérumalbuminu, proteoso-peptonů a fosfoglykoproteinů, tvoří malý podíl syrovátky a to proto, že jsou tepelně stálé do 100 C a jsou rozpustné při ph 4,6 (Gajdůšek, 1985; Samková, 2012) Nebílkovinné N-látky Jsou to látky, které zůstávají v roztoku po vysrážení veškerých bílkovin mléka 12% kyselinou trichloroctovou. Mají rozdílný význam i strukturu. Koncentrace se u zdravých a dobře krmených dojnic pohybuje v rozmezí mg N v 1 litru mléka. Močovina jako produkt metabolismu bílkovin tvoří největší podíl nebílkovinných N-látek. Její fyziologická úroveň leží mezi mg na litr mléka (Gajdůšek, 2003; Samková, 2012). Mezi další nebílkovinné N-látky, které se v mléce vyskytují, patří peptidy, volné aminokyseliny, dusičnany, dusitany, nukleotidy, kreatin, amoniak a v neposlední řadě vitamíny skupiny B (Gajdůšek, 2003; Samková, 2012) Minerální látky Obsah minerálních látek v mléce není konstantní. Je ovlivňován mnoha faktory (zdravotním stavem dojnice, výživou, stádiem laktace). Jsou významné z technologického hlediska, jelikož ovlivňují fyzikální i technologické vlastnosti mléka. Plní funkci aktivátoru enzymů a také se podílí na udržení acidobazické rovnováhy v organismu. Mají i katalytickou funkci a mohou se podílet na oxidaci mléčného tuku (Janštová a Navrátilová, 2014). Obsah minerálních látek se dělí na mikroelementy, které jsou zastoupeny v množství Na (42 mg/100 g mléka), K (134 mg/100 g mléka), Ca (106 mg/100 g mléka), P (83 mg/100 g mléka). Mezi mikroelementy patří Fe (0,07 mg/100 g mléka), Zn (0,37 mg/100 g mléka), I (0,034 mg/100 g mléka), Mn (0,0004 mg/100 g mléka) a Cu (0,009 mg/100 g mléka) (Pennington et.al., 1987) Biokatalyzátory Vitamíny jsou organické látky, které přijímáme v potravě v malém množství, protože si je lidsky organismus nedokáže syntetizovat. Řídí a regulují funkce v živém 13

15 organismu. Vitamíny v metabolických pochodech neslouží k výstavbě orgánů či tkání a ani nejsou zdrojem energie. Rozdělují se na endogenní, ty vznikají přímo v organismu, patří sem hormony a enzymy. Ty, které musí organismus přijímat potravou, se nazývají exogenní a patří sem vitamíny (Keresteš et al. 2016) Obecně se vitamíny dělí na: vitamíny rozpustné ve vodě vitamíny skupiny B (B 1, B 2, B 6, PP, B 12, kyselina pantotenová), vitamín H, C vitamíny rozpustné v tucích A, D, E, K (Fuquay et al., 2011). Hormony jsou látky produkované žlázami s vnitřní sekrecí a řídí metabolické procesy v živém organismu. Jsou vylučovány do mléka. V určitých aspektech působí jako katalyzátory (Gajdůšek, 2003). Enzymy jsou látky bílkovinné povahy. Mnoho z nich se syntetizuje ze sekrečních buněk, ostatní z krve (př. plasmin), ty nazýváme nativní. Některé enzymy nalezneme i v leukocytech (př. katalasa). Mohou být přítomny i enzymy mikrobiálního původu, neboli enzymy druhotné (Walstra et al., 2006). Podle typu katalyzované reakce rozdělujeme enzymy do šesti skupin: oxidoreduktasy, lyasy, hydrolasy, transferasy, ligasy a isomerasy. Z technologického hlediska jsou významné, neboť mohou detekovat určité změny mléka, které nejsou pro výrobu mléčných výrobků žádoucí (Janštová a Navrátilová, 2014) Plyny v mléce Průměrný obsah plynů v čerstvě nadojeném mléce se pohybuje okolo 6 9 obj. %, z nichž převážná část, přibližně 5 7 % připadá na CO 2. Po styku se vzduchem se do mléka dostává část plynů. Po určité době dojde v důsledku ustanovení rovnováhy mezi mlékem a ovzduším k poklesu množství CO 2 a zvýšení O 2 a N 2 (Gajdůšek, 2003). 3.2 Technologicky významné vlastnosti mléka Mezi technologicky významné vlastnosti mléka patří především kyselost (ph, SH), syřitelnost, kysací schopnost a termostabilita. 14

16 3.2.1 Kyselost U mléka se kyselost vyjadřuje dvěma způsoby. Zásadní význam má při hodnocení jakosti syrového mléka titrační kyselost. Jako aktivní kyselost, kde se měří aktivita H + iontů. Průměrná hodnota aktivní kyselosti čerstvě nadojeného mléka, je při teplotě 25 C ph 6,6 ± 0,1. Hodnota aktivní kyselosti do značné míry závisí na teplotě mléka. Odlišné hodnoty vykazuje mlezivo (ph < 6) a při onemocnění mléčné žlázy se ph pohybuje v alkalickém prostředí (ph > 7,5) (Walstra et al., 2006; Janštová a Navrátilová, 2014). Druhým způsobem je stanovení titrační kyselosti, kterou definujeme jako pufrační kapacitu mléka, která se pohybuje mezi hodnotou ph mléka (6,6) a ph 8,3, která je bodem ekvivalence indikátoru fenolftaleinu (Walstra et al., 2006). V ČR se stanovuje metodou podle Soxhlet-Henkela a titrační kyselost je dána spotřebou odměrného roztoku 0,25 M NaOH (ml) potřebného k neutralizaci mléka (100 ml) na fenolftalein. ČSN doporučuje hodnotu titrační kyselosti u bazénového vzorku čerstvě nadojeného mléka v rozmezí 6,2 7,8 ml NaOH na 100 ml mléka (Janštová a Navrátilová, 2014) Syřitelnost Udává se jako množství syrového mléka (ml) s určitou kyselostí (ph 6,6), které koaguluje při teplotě 35 C a tvoří gel po přidání 1 ml (1 g) syřidla v průběhu 40 minut (Landfeld et al., 2002). Kadlec et al. (2009) uvádí, že syřitelností mléka je schopnost enzymového srážení. Mléko srážením přechází z koloidního roztoku do stavu, kdy se tvoří kompaktní sraženina (gel). Největší význam zde mají bílkoviny, zejména kasein a srážení může probíhat různým způsobem (Janštová a Navrátilová, 2014). Více v kapitole a Kysací schopnost mléka Kysací schopnost mléka vyjadřuje technologické vlastnosti mléka, při výrobě fermentovaných mléčných výrobků, popřípadě sýrů (Kadlec et al., 2009). 15

17 3.2.4 Termostabilita Je schopnost mléka, resp. kaseinu, zachovat si své původní koloidní vlastnosti působením vysokých teplot. Udává se jako čas, který je potřebný k dosažení počátku koagulace bílkovin při určité teplotě (120 C, 140 C). Optimální termostabilitu má mléko při ph 6,5 6,6 (Kadlec, 2009). 3.3 Srážení mléka a problematika syřidel Syřidlo je proteolytický enzym, který specificky štěpí vazbu mezi fenylalaninem a methioninem z kravského κ-kaseinu a patří do skupiny kyselých proteas. Mezi tyto enzymy, které se tradičně používají při výrobě sýrů, patří chymosin a pepsin. Tvoří se v telecích, jehněčích žaludcích a v žaludcích staršího dobytka. Nicméně v posledních letech se používají enzymy vytvořené mikroorganismy (Fox, 1993) Druhy syřidel Syřidla se rozdělují, podle toho z čeho jsou vyrobena. Existují syřidla rostlinná, živočišná, mikrobiální a geneticky získaná syřidla Rostlinná syřidla Rostlinné výtažky se ke koagulaci mléka používaly již ve starověku, ačkoli je o jejich činnosti známo poměrně málo. Extrakty z rostlin, které mají koagulační účinky, mají také proteolytickou aktivitu. Proteasy jako například ficin z Ficus sp., papain z Carica papaya a další. Látky jsou získávány především z květů a listů, ale jsou součástí i kořenů a semen (Roseiro et al., 2003). Rostlinné enzymy jsou extrahovány z vodného výluhu částí rostlin, které byly zkoumány jako potencionální koagulanty (Mandy et al., 2011). Podle výzkumu, který vedl Roseiro et al. (2003) a potvrzuje i Mandy et al. (2011) je patrné, že rostlinná syřidla mají nižší koagulační i proteolytickou aktivitu. Toto tvrzení však neplatí pro výtažky Cynara cardunculus, která se po staletí používala v tradiční výrobě sýrů na Pyrenejském poloostrově Živočišná syřidla Živočišná syřidla se tradičně vyrábí extrakcí slezu čtvrtého žaludku mladých přežvýkavců, zejména telat. Dříve se enzym extrahoval z vyčištěných a vysušených 16

18 žaludků v roztoku syrovátky. Dnešní, moderní výroba žaludky hned po porážce zmrazí. Bylo zjištěno, že takto získaný chymosin vyšší aktivitu (Mandy et al., 2011). Původně se syřidla používala jako extrakt získaný z žaludků sajících telat, který obsahuje převážně enzym chymosin. Ten koaguluje z rozpustné formy na nerozpustnou (parakapakasein) (Landfelf et al., 2002). Živočišné syřidlo obsahuje chymosinové i pesinové frakce, jejichž obsah závisí na stáří zvířete při porážce. Chymosin je známý svou vysokou specifitou pro odštěpení kaseinomakropeptidu z κ-kaseinu, spouští destabilizaci kaseinové micely a vyvolává srážení mléka. Pepsin má nižší specifitu než chymosin a hydrolyzuje vazby s fenylalaninem, tyrosinem, leucinem a valinem. (Mandy et al., 2011). Naturen Premium 145 firmy Chr. Hansen je přírodní tekuté živočišné syřidlo, které je vyráběno z žaludků telat a skotu. Syřidlo je vhodné pro výrobu dlouhohrajících sýrů. Je nažloutlá nebo jantarově zbarvená kapalina s charakteristickou vůní. Obsahuje přirozeně obsažený enzym chymosin. Má významný vliv na sýrovou příchuť výrobku ( 2007) Geneticky získaná syřidla Geneticky vyrobený chymosin vzniká umělým spojením dvou druhů DNA a má geneticky nejvýraznější srážlivost. Po zabudování do DNA se přenesou do vhodných podmínek s mikroorganismy jako například Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger a mnohé další. Výroba mikrobiálních syřidel je výhodná z hlediska nižších výrobních nákladů. Avšak záleží na postupu výroby, zda MO uvolní chymosin přímo do média nebo jsou uzavřeny do inkluzních tělísek a před dalším použitím musí být buňky lyzovány. Lepší produkci chymosinu má vláknitá houba Aspergillus niger a to má za následek zvýšení výtěžnosti více než 100 % ve srovnání s nativním enzymem (Mandy et al., 2011) Mikrobiální syřidla Proteasy mikrobiálního původu působí podobně jako nativní chymosin. Získavají se fermentací a jsou snadno dostupné a izolované z různých MO. Enzymy jsou čistě mikrobiálního původu, takže nehrozí přenos BSE a jsou tak i vhodné pro vegetariány. Mandy et al. (2011) uvádí, že vyšší proteolytická aktivita může vést ke ztrátě proteinů, které odchází do syrovátky a tím negativně ovlivňuje výtěžnost sýra. 17

19 Syřidlo Chy-Max M200 tvoří 100% čistý chymosin mikrobiálního původu, který je vyprodukován fermentací plísní Aspergillus niger var. awamori. Takto vyrobený chymosin je strukturou totožný s přirozeně získaným chymozinem z telecích žaludků (z hlediska enzymatické aktivity) ( 2017). Toto syřidlo má velice malou proteolytickou aktivitu, což má příznivý vliv na průběh zrání sýrů. Minimální riziko hořkosti i lámavosti sýrů. Jeho srážecí schopnost je velmi dobrá. Výsledná sýřenina je pevná, bez vyšší míry sýrařského prachu. Chy-Max je vhodný pro výrobu všech druhů sýrů a tvarohů ( 2017) Princip srážení Srážení kaseinu je základní proces při výrobě sýrů. Lze ho z mléka vysrážet snížením ph na hodnotu izoelektrického bodu (ph 4,6), mluvíme o tzv. kyselém srážení. Uplatňuje se při výrobě tvarohů a sýrů typu Cottage. Druhý typ srážení, tzv. sladké, je realizováno za pomoci enzymů (syřidel) (Kadlec et al., 2009). Koagulace mléka syřidlem je obecně rozdělena do tří fází, primární a sekundární a terciální. Primární fáze označována také jako enzymatická, se vyznačuje rozdělením peptidů z κ-kaseinu. Jeho účinek na fyzikální struktuře kaseinových micel nebyl zatím zcela objasněn. V průběhu sekundární fáze se kaseinové micely shlukují v přítomnosti vápenatých iontů a po přidání syřidla je viditelná koagulace (Guthy, 1977). Primární fáze zahrnuje enzymatickou hydrolýzu řetězce κ-kaseinu mezi Phe 105 a Met 106. Štěpením nám vzniknou 2 řetězce. Do 105 AMK vzniká para-κ-kasein, který přechází do sýřeniny. Kaseino-makropeptid (CMP) je řetězec složený ze AMK a odtéká do syrovátky (Tamime, 2006). Štěpení vidíme na obr. 1. V sekundární fázi, někdy také označované jako koagulační fázi, dochází k tvorbě gelu (Kadlec et al., 2009). Je možná pouze v přítomnosti vápenatých iontů a teplota musí být vyšší než 20 C. Kaseinové micely se v průběhu tvorby gelu řadí do řetězců, které přechází v trojrozměrnou mřížku. K synerezi, smršťování gelu a vytužování sýřeniny dochází vytvořením vápenatých můstků (Černý, 2003). Nevysrážená část je hydrofilní a přechází do syrovátky (Šustová a Sýkora, 2013). Terciální fáze je u většiny sýrů významná, avšak je možné ji vynechat. Vynechání této fáze se využívá např. u bílých sýrů, kdy je zrání předběžně ukončeno a sýr 18

20 je naložen v solném nálev. Díky enzymům však tato fáze u většiny sýrů probíhá. V této fázi dochází k proteolýze kaseinu a vznikají polypeptidy dipeptidy AMK amoniak, těkavé látky a sirovodík (Šustová a Sýkora, 2013). Obr.1 Štěpení k-kaseinu pomocí syřidla (mendelu.cz, 2015) Syřitelnost a faktory ovlivňující syřitelnost Syřitelnost je schopnost mléka srážet se syřidlem a vytvářet sýřeninu, která bude mít požadované vlastnosti. Syřitelnost je považována za nejdůležitější technologickou vlastnost mléka (Polák et al., 2010). Ikonen (2000) uvádí, že krátká doba srážení je asociována nižším ph, vyšším obsahem bílkovin a tuku v mléce. Také faktory jako jsou stádium laktace a pořadí laktace ovlivňují syřitelnost vlivem změn chemického složení mléka jak uvádí Tyriseva et al. (2004). Další faktory ovlivňující dobu srážení je koncentrace kaseinu. Při vyšší koncentraci vede k rychlejšímu zasýření a pevnější a tužší sraženině. Důležité jsou především poměry zastoupení jednotlivých frakcí kaseinu (Teplý, 1976). Polák et al. (2010) dále poznamenává, že významný vliv na kvalitu sýřeniny má obsah, bílkovin, kaseinu a vápníku. Trend je takový, že při nižším obsahu bílkovin v mléce dochází k prodloužení času syřitelnosti. Toto tvrzení platí i pro mléčný tuk. Mezi faktory ovlivňující hydrolýzu κ-kaseinu patří především aktivní kyselost, která by se měla v první fázi zasýření pohybovat okolo 6,0 ph. Dalším důležitým faktorem je teplota mléka, která by se za předpokladu použití chymosinového syřidla, měla při ph 6,6 pohybovat okolo 45 C. Vliv na štěpení má i iontová síla a genotyp (Lath, 2012). 19

21 Podle výzkumu, který vedl Polák et al. (2010) je patrné, že množství tuku má jen mírný vliv na kvalitu sýřeniny. Ostatní složky nijak kvalitu neovlivňují. Castillo et al. (2002) se zabýval, zda použitý enzym má vliv na srážení mléka. Zjistil, že při použití dvou odlišných enzymů, nebyl na hladině p < 0,05 zjištěn statisticky významný rozdíl. Studie z roku 2012 (Kozelková) uvádí, že délka skladování syřidla má vliv na čas syřitelnosti pro chymosin přírodní (v našem případě Naturen). Čas koagulace mléka se s delší dobou skladování prodlužoval. Použití syřidla po půlročním skladování se na čase syřitelnosti odrazil téměř dvojnásobnou délkou koagulace. Nájera et al. (2003) vedl studii, kde zjistili, že pokud se zvyšuje koncentrace enzymu tak se snižuje doba srážení, z důvodu vyšší úrovně proteolýzy κ-kaseinu. Dále uvádí, že koagulace mléka je silně závislá na teplotě, avšak pouze do teploty 42 C. Pokud je teplota vyšší srážení se zpomaluje. Dalším faktorem, který silně ovlivňuje srážení mléka je jeho ph. Pokud se ph pohybuje mezi 5,2 7,0 má to za následek snížení času syřitelnosti. Optimální ph pro hydrolýzu kaseinu je 5,1 5,3. Přídavek Ca 2+ snižuje čas koagulace, ale při vysokých koncentracích může být doba srážení delší. Landfeld et al. (2002) se shoduje s Nájerou et al. (2003), že se zvyšující se teplotou se zkracuje doba koagulace, ale pouze do 50 C. Pokud je teplota vyšší než 50 C, doba koagulace je delší. Čas syřitelnosti také záleží na druhu použitého syřidla. Teplý (1976) uvádí, že ředěním vysoce aktivního mikrobiálního preparátu se zvyšuje počet částeček ochranných globulinů na jednu částečku enzymu. Tím musí nutně u enzymů inhibovaných globuliny klesat neúměrně aktivita preparátu. Zkušenosti tuto domněnku potvrdily. Pokud klesne koncentrace enzymu natolik, že doba sýření při 35 C působením 1 ml preparátu stoupá přes 300 až 400 sekund, tak se neúměrně snižuje aktivita některých preparátů. Yuksel (2013) vedl studii, ve které zjišťoval, zda má čas syřitelnosti vliv na texturu. Zjistil exponenciální vztah mezi časem sýření a hodnotami tvrdosti sýřeniny u vzorků s různou koncentrací CaCl 2. Předpokládá se, že teplené zpracování mléka má vliv na delší dobu koagulace mléka a snižuje se pevnost sýřeniny (Singh a Waungana, 2001). Šustová a Sýkora (2013) uvádí, že kvalitu sýřeniny a její výtěžnost, ovlivňuje jakost syřidla. 20

22 3.4 Syrovátka Syrovátka je cenný, vedlejší, tekutý produkt, který vzniká jako vedlejší produkt při výrobě sýrů, nebo při odstranění tuku a kaseinu z kravského mléka. V dnešní době je používán pro širokou škálu produktů nejen potravinářského průmyslu a to díky výživovým vlastnostem. Syrovátka totiž obsahuje asi 50 % z živin, které jsou obsaženy v mléce, včetně mléčného cukru, sérových proteinů, minerálních látek, malého množství tuku (Kucheryavskiy a Lomborg, 2014). Vzhledem k tomu, že se syrovátka může získávat rozdílnými principy srážení, dochází i k rozdílnému složení výsledné syrovátky. Při výrobě tvarohu a čerstvých sýrů se z mléka vysráží kaseinové bílkoviny pomocí kyseliny mléčné, kterou produkují bakterie mléčného kysání. Jako vedlejší produkt při výrobě vzniká kyselá syrovátka (Kleibeuker, 2006). Do syrovátky, která pochází z výroby sýrů, přechází rozpustný kaseinomakropeptid působením syřidla. Kyselá syrovátka obsahuje více popelovin, především vápníku (Suková, 2006). Tab. 2 uvádí typy syrovátky a jejich původ. Tab.2 Typy a původ syrovátky (Kleibeuker, 2006). Druh sýra/kaseinu Typ syrovátky Sýr Sladká Tvaroh Kyselá Čerstvý/nezrající sýr Kyselá Kasein Kaseinová syrovátka Složení Syrovátku můžeme získat různými způsoby, podle toho také vznikne produkt s určitými vlastnostmi, jak ukazuje tab. 3. Syrovátkové bílkoviny zastupují 20 % celkového obsahu bílkovin v mléce. V nativní formě je rozpustný při ph 4,6 nebo v nasyceném roztoku NaCl (Tamime, 2006). Na celkovém obsahu bílkovin se v syrovátce podílí 5,5 % kaseinových a 94,4 % sérových bílkovin. Z mléka přechází i většina nebílkovinných dusíkatých látek. Jedná se především o puriny (příměsi močoviny, xantinu, guaninu, hypoxantinu, amoniaku, aj.) (Suková, 2006). 21

23 Tab. 3 Složení sladké, kyselé a kaseinové syrovátky (Law a Tamime, 2010; Benitez a Ortergo, 2012, Kleibeuker, 2006). Složka Sladká syrovátka Kyselá syrovátka Kaseinová syrovátka Voda (%) 93,2 93,8 93,9 Sušina (%) 6,8 6,2 6,1 Bílkoviny (%) 0,8 0,7 0,5 Tuk (%) 0,05 0,04 0,01 Laktosa (%) 4,6 4,0 4,7 Minerální látky (%) 0,5 0,8 0,9 Kyselina mléčná (%) < 0,1 0,8 - ph 5,9 6,3 4,3 4,6 4,4 Suková (2006) dále uvádí, že syrovátka také obsahuje i jiné proteiny a růstové faktory jako jsou imunoglobulin A, laktoferin, laktoperoxidasa, insulin. β-laktoglobulin a α-laktalbumin jsou zapojeny do vstřebávání vitamínů a minerálních látek. Syrovátková bílkovina je bohatá na AMK, typický profil těchto AMK je uveden v tab. 4 Tab. 4 Typické AMK obsaženy v syrovátce v g/100 proteinu (Kleibeuker, 2006) AMK Obsah (g/100g) AMK Obsah (g/100g) Lysin 7,6 Arginin 2,4 Methionin 1,5 Fenylalanin 3,3 Cystein 1,9 Histidin 1,6 Threonin 5,4 Tyrosin 2,4 Tryptofan 1,5 Alanin 4,3 Glutamová kys. 15,5 Aspargová kys. 9,1 Leucin 8,9 Glycin 2,0 Izoleucin 5,1 Prolin 5,5 Valin 4,9 Serin 4,4 β-laktoglobulin je hlavní složkou syrovátkového proteinu, tvoří asi 50 % celkového obsahu syrovátkových bílkovin. Je syntetizován z epitelu v mléčné žláze a skládá se ze 162 monomerních zbytků. Izoelektrický bod β-laktoglobulinu je při ph 5,1 a je v mléce obsažen ve formě dimeru. Denaturuje při teplotě vyšší než 65 C a disociuje na monomery (Tamime, 2006; Navrátilová et al., 2012). 22

24 α-laktalbumin je druhý nejhojněji zastoupený syrovátkový protein v mléce a tvoří 20 % z celkového obsahu syrovátkových bílkovin. Polypeptidový řetězec se skládá ze 123 aminokyselinových zbytků a jeho izoelektrický bod je při ph mezi 4,70 4,92. Je syntetizován v endoplazmatickém retikulu a odsud transportován do Golgiho aparátu, kde má důležitou funkci při syntéze laktosy (Tamime, 2006; Navrátilová et al., 2012). Walstra (1999) udává v tab. 5 obsah jednotlivých složek syrovátkových bílkovin v mléce. Tab. 5 Obsah syrovátkových bílkovin v mléce (Walstra, 1999) Syrovátkový protein Obsah v g/kg mléka Obsah v g/100 g proteinu Celkový obsah 6,3 19 Syrovátkový protein Obsah v g/kg mléka Obsah v g/100 g proteinu β-laktoglobulin 3,2 9,8 α-laktalbumin 1,2 3,7 Sérový albumin 0,4 1,2 Proteoso-peptony 0,8 2,4 Imunoglobuliny 0,8 4,2 IgG 1, IgG 2 0,65 1,8 IgA 0,14 0,4 IgM 0,05 0,2 Minoritní proteiny 0,9 2,5 Laktoferin 0,1 - Obsah mléčného cukru (laktosy), je v syrovátce obsažen v téměř stejném množství jako v mléce (Suková, 2006). Šiman (1950) potvrzuje to, co je v tab. 3, a to, že obsah tuku bývá v syrovátce obsažen v nepatrném množství. Více tuku obsahuje syrovátka získaná při výrobě vysokotučných sýrů. Syrovátka je bohatá i na kyseliny. Suková (2006) uvádí, že se zde vyskytují především kyseliny: citronová, octová, mravenčí, propionová a mléčná. Nejvyšší obsah bývá u kyseliny citronové, kde je obsah kolem 150 mg/100g a u kyseliny mléčné je obsah mg/100g. Po výrobě tvarohu je nejvyšší obsah kyselin v kyselé syrovátce. Syrovátka obsahuje cenné minerální látky, jako jsou vápník, fosfor, hořčík 23

25 a draslík. Obsažené minerály mají vysokou biologickou dostupnost a to v důsledku přítomnosti minerálních proteinových komplexů (Kleibeuker, 2006). Obsah minerálních látek v syrovátce ukazuje tab. 6. (Suková, 2006). Tab. 6 Obsah minerálních látek v syrovátce (Kleibeuker, 2006; Suková, 2006) Makroelement Obsah (mg/kg) Mikroelement (mg/kg) Draslík Železo 67 Vápník Jód 8,6 Sodík Měď 1,0 Hořčík 8 10 Kobalt 0,8 Zinek 0,03 Syrovátka je také bohatá na vitamíny. Z mléka do ní přechází převážný podíl vitamínů rozpustných ve vodě. Veškeré množství riboflavinu přechází z mléka do syrovátky, dále thiamin v množství 88 %, kyselina askorbová 78 %, kobalaminu až 60 % a 90 % kyseliny nikotinové. V syrovátce se vyskytují především vitamíny skupiny B, vit.c ( µg/100g) a vit.a (Suková, 2006). Detekcí částic po ultrafiltraci syrovátky se ve svém výzkumu zabýval Lyndgaard (2014). Uvádí, že UV spektroskopie je schopná detekovat množství syrovátkové složky až na ppm pro syrovátkové bílkoviny, 5 9 ppm pro tuk a ppm pro netukové a nebílkovinné částice. Studie také poukazuje na to, že UV záření má vysoký potenciál v mlékárenském průmyslu Význam syrovátky Syrovátka je velmi významná kvůli příznivým vlivům na lidské zdraví. Patří sem především regulace hmotnosti, regulace hypertenze, zvyšování imunity, zmírnění metabolického stresu, protirakovinné účinky, detoxikace organismu, podpora činnosti ledvin, zlepšení absorpce živin a celkově všeobecné zlepšení zdravotního stavu (Suková, 2006, Berry, 2004). Berry (2005) uvádí, že četné využití má syrovátka i v potravinářském průmyslu vzhledem ke své funkčnosti. Má stabilizační a emulgační schopnost, čehož se využívá v pekařském a cukrářském průmyslu. Biologická hodnota syrovátkové bílkoviny je mimořádně vysoká. Syrovátkový protein obsahuje všechny esenciální aminokyseliny v poměrech, které tělo potřebuje. Má nejvyšší biologickou hodnotu (104), čímž předčí i vejce, které mají hodnotu

26 Pro osoby s intolerancí na laktosu, je užívání sladké syrovátky nevhodné. Obsah laktosa z mléka přechází do syrovátky, tudíž se zde nachází ve velkém množství ( Měření barvy potravin Obecně platí, že barva a tvar jsou hlavní vlastnosti. Pokud jde o potraviny, dalšími faktory, které ovlivňují celkovou kvalitu výrobků, jsou vůně, chuť a strukturní vlastnosti. Nicméně v mnoha případech je barva prvním kriteriem, které je spotřebitelem vnímáno (Kneifel et.al., 1992). Měření barvy potravin se řadí mezi velmi důležité parametry senzorické analýzy. Porovnává se odstín jednotlivých typů potravin se standardem. Mezi nejstarší metody hodnocení barvy patří subjektivní hodnocení pouhým okem, kdy se porovnává odstín vzorku oproti standardu. Tuto metodu postupně nahradily metody objektivním měřením, kolorimetrem či spektrofotometrem. Naměřené spektrum, které se nachází ve viditelné oblasti ( nm), je transformováno do speciálně vytvořeného barevného prostoru (Kadlec et al., 2015). Kadlec et al. (2015) uvádí, že se spektrofotometry a fotometry používají pro měření absorbance a transmitance. Spektrofotometr je přístroj, který umožňuje libovolně nastavit vlnovou délku monochromatického světla, nebo měřit část absorpčního spektra v určitém úseku vlnových délek. Systém barev RGB, který znázorňuje obr. 2, byl použit jako základ pro tvorbu CIE barevného prostoru XYZ. Grafické znázornění systému XYZ můžeme vidět na obr. 3. Systém CIE je založen na aditivním mísením tří vhodně zvolených světel. Tím dojede k vzbuzení dojmu jakékoliv barvy (Vik, 1995). 25

27 Obr. 2 Model RGB ( Obr.3 CIE prostor XYZ (Vik, 1995) Díky pravoúhlému systému souřadnic X, Y a Z můžeme jednotkovou rovinu, která v prostoru vytíná rovnostranný trojúhelník, promítnout do roviny XY. Získáme tak dvojrozměrný diagram s osami x a y, kterému se říká CIE x,y diagram a můžeme ho vidět na obr

28 Obr.4 CIE x,y diagram (Vik, 1995) Jako standard CIE a ISO byl Mezinárodní komisí pro osvětlení (CIE) v roce 1976, přijat vzorec CIELab. Totální barevná diference (ΔE * ) je mírou velikosti barevného rozdílu mezi vzorkem a standardem. Povahu barevné diference poskytuje rozdělení ΔE * do tří složek. V systému CIELab je můžeme vyjádřit dvěma způsoby, a to pomocí pravoúhlých nebo cylindrických souřadnic, které jsou znározněny na obr. 5. Systém Lab má 3 složky: L * je světlost (jas), a * červeno-zelená škála a parametr b * modro-žlutá škála barev (Vik, 1995; ). Parametr L * nabývá hodnot v intervalu od 0 (černá barva) do 100 (bílá). Hodnota a * je souřadnice barevnosti, která představuje barevné směry. Udává vztah mezi červenou barvou a zelenou. Kladná osa a * se barví do červena a záporná osa a * směřuje do zelena. Poslední složkou systému je parametr b *. Udává směr mezi modrou a žlutou barvou. Kladná osa b * vyjadřuje směr do žluta a záporná osa b * má modré zbarvení. Střed diagramu je achromatický a je vyjádřen hodnotou 0. Sytost barvy se zvyšuje, pokud se bod pohybuje od středu a hodnoty a * b * se snižují (Jůzl, 2014). 27

29 Obr. 5 Pravoúhlé a cylindrické souřadnice CIELab prostoru (Vik, 1995) Z potravin je právě med zástupcem, u kterého se měří barva. Na základě L * a * b * barevných parametrů rozdělujeme medy na dvě skupiny. Med světlý a tmavý. Parametr b * je u všech druhů medů vyšší než 0 (žlutá složka). Barva medu závisí hlavně na květinovém zdroji, které se liší od světlé až po velmi tmavé barvy. Barevné souřadnice systému CIELab jsou užitečné jako podpora pro identifikaci nebo klasifikaci medu (Kuś et.al., 2014). Ramiréz-Navas a Rodriguez de Stouvenel (2012) uvedli, že žluté tukové globule jsou zodpovědné za barvu mléka a mléčných výrobků., Podle velikosti tukových kuliček mají různý odstín žluté barvy. Za pigment mléčného tuku jsou zodpovědné karotenoidy, především β-karoten, které se do mléka dostávají z krmiva dojnice Barva syrovátky Typickou žluto-zelenou fluorescenci dává syrovátce vitamín B 2 (riboflavin). Je v syrovátce nejvíce zastoupen a jeho množství se liší podle typu syrovátky. Sladká syrovátka obsahuje 2,40 mg/100 g a kyselá syrovátka 2,00 mg/100 g syrovátky. Ri- 28

30 boflavin se světelným zářením rozkládá, a proto po několika hodinách na světle ztrácí své původní zabarvení. Při výrobě sýrů přechází téměř všechen riboflavin do syrovátky (Pešek, 1989). Vyšší dávky syřidla způsobují rychlejší proteolýzu a tvoří tak tuhou sýřeninu. Do syrovátky může přecházet více sýrařského prachu a syrovátka může být až mléčně bílá (Zimák, 1988). Dvořáček et al. (2014) uvádí, že pro zakalené a kašovité vzorky (mléko, syrovátka) se používají transmitanční metody. U suchých vzorků se používají metody reflektance. Transmitance se měří jako poměr zářivého toku, který prošel absorpčním prostředím, které obsahuje stanovovanou látku a zářivého toku, který prošel roztokem, který stanovovanou látku neobsahuje (Volka, Tkadlecová a Záruba, 2006). Reflektance je veličina, která charakterizuje míru schopnosti látky odrážet optické záření. Je definována jako podíl výkonu optického záření odraženého od tělesa a výkonu záření dopadající na těleso ( 2017). Podle Michálkové (2016) na barvu uvolněné syrovátky nemá vliv obsah vápníku. Na světlost syrovátky nemá vliv obsah bílkovin v mléce. Světlost neovlivňují ani hodnoty ph a titrační kyselosti. Vliv na světlost syrovátky mají pouze tři faktory: sušina mléka, obsah tuku a obsah laktosy. 29

31 4 MATERIÁL A METODIKA Vzorky syrového kravského mléka byly získány z Kojál Krásensko, kde chovají Holštýnský skot. Odběr vzorků byl realizován v období od října do prosince V tomto období bylo provedeno celkem 6 opakovaných měření. Každé měření mělo celkem 30 vzorků a v souhrnných tabulkách jsou uvedeny průměrné hodnoty z měření. Jednotlivé vzorky byly zasýřeny syřidly Chymax a Naturen o koncentraci 15 %, v objemech 1 ml, 2 ml a 5 ml. K zasýření jednotlivých vzorků mléka o objemu 100 ml se používala dvě různá syřidla o odlišné síle. Používalo se syřidlo přírodní a mikrobiální, abychom mohli zjistit, zda vykazují odlišnosti u daných parametrů. Obě syřidla byla zředěna na 15% roztok, protože každé z nich má jinou sílu a bylo potřeba, aby se čas syřitelnosti pohyboval v rozmezí s. Při experimentu jsme zasyřovali vzorky mléka o objemu 100 ml syřidlem, o různých objemech. Syřidlo se přidávalo v množství 1 ml, 2 ml a 5 ml. První syřidlo, které se používalo, byl Chy-Max M200, který je tvořen 100% čistým chymozinem mikrobiálního původu. Fermentací ho produkuje plíseň Aspergillus niger var. awamori. Výrobce Chr. Hansen, Dánsko. Minimální trvanlivost 5/2017. Syřidlo Naturen Premium 145 firmy Chr. Hansen, Dánsko, je přírodní chymosinové syřidlo, které je vyrobené z žaludků telat a skotu. Minimální trvanlivost 4/2017. Syřidla se musí uchovávat v chladu a temnu, při teplotě 0 +8 C. 4.1 Stanovení základních složek mléka Mléko bylo v termostatu vytemperováno na teplotu 40 C a následně zchlazeno na 20 C, aby bylo dosáhnuto rovnoměrného rozložení mléčného tuku. Teplota byla měřena ponorným teploměrem. U každého odběru mléka byla provedena laboratorní analýza, kde byl stanoven obsah tuku, bílkovin, laktosy, vápníku, ph, SH a N-test. Po laboratorní analýze bylo mléko rozděleno pomocí pipety (100 ml) do kádinek a vytemperováno na 35 C. Vzorky 1 15 byly zasýřeny Chymaxem (vzorky ml syřidla; ml syřidla; ml syřidla). Stejným způsobem byly zasýřeny i vzorky pomocí syřidla Naturen. Následně se vzorek vložil na jednu hodinu do termostatu, kde byla nastavena teplota 35 C. Po vyjmutí se hodnotila kvalita sýřeniny dle Gajdůška a měřil se objem uvolněné syrovátky. 30

32 Barva syrovátky se měřila na spektrofotometru Konica Minolta CM-3500d. Po změření barvy bylo odváženo 10 g syrovátky, a stanovila se sušina syrovátky Stanovení obsahu tuku Obsah tuku v mléce je podíl tuku, který se oddělí v butyrometru po rozpuštění fosfolipidového obalu tukových kuliček za působení kyseliny sírové za podmínek metody. Obsah tuku odečtený v g na 100 ml mléka je následně nutno přepočítat na obsah tuku v g na 100 g mléka (ČSN ) Stanovení obsahu bílkovin dle Kjeldahla Celkový obsah dusíku v mléce je množství dusíku bílkovinné i nebílkovinné povahy, vyjádřené v g ve 100g mléka. Vzorek mléka je mineralizován směsí koncentrované kyseliny sírové a síranu draselného za použití síranu měďnatého jako katalyzátoru. Přítomný organický dusík je převeden na síran amonný a stanovuje se destilační metodou. Přídavkem nadbytku NaOH se uvolní amoniak a předestiluje se do předlohy se známým nadbytečným množstvím standardního roztoku kyseliny borité (ČSN EN ISO ) Stanovení mléčného cukru polarimetricky Toto stanovení se používá k rychlému stanovení laktosy v mléce a je založeno na měření optické otáčivosti laktosy ve vzorku mléka po odstranění bílkovin (ČSN ) Stanovení vápníku titrační metodou Vápník v mléce se stanovuje pomocí komplexometrické titrace s fluorexinem (barevný indikátor) podle ČSN Pro stanovení vápníku se využívá výpočet: obsah Ca (g/l) = spotřeba 1. faktor. 0,401 kde spotřeba 1 je množství Chelatonu III v ml, který přidáváme do vymizení žlutozelené fluorescence (Černá a Cvak, 1986). 31

33 4.1.5 N-test Vlivem činidla, které obsahuje povrchově aktivní látku a fenolovou červeň jako acidobazický indikátor, dochází k prasknutí buněčné stěny somatických buněk v mléce, tvorbě solí NK a despiralizaci jaderné DNA. Tyto sloučeniny tvoří rosolovitou sraženinu. Intenzita vzniklé sraženiny je přímo úměrná počtu somatických buněk a vyhodnocuje se podle tab. 7 (Janštová a Navrátilová, 2014). Tab. 7 Vyhodnocení N testu (Šustová, 2005; Janštová a Navrátilová, 2014) N test Reakce a vzhled filmu 0,0 Beze změny viskozity, film se netvoří, v kolmém pohledu nepozorujeme tvorbu závoje na dně misky, směs se při krouživých pohybech rozprostírá s nezměněnou konzistencí po obvodu misky. + 1,0 Závojovitý, opožděně stékající film při střídavém naklonění misky; v kolmém pohledu nepozorujeme tvorbu závoje na dně misky; směs se krouživými pohyby stejnoměrně rozprostírá po obvodu misky. ++ Při naklánění misky pozorujeme odlišitelný, na dně ulpívající a opožděný film se 2,0 zvlněným povrchem; na dně misky pozorujeme tvorbu závoje; směs se krouživými pohyby stejnoměrně rozprostírá po obvodu misky. +++ Tvorba reliéfu ulpívajícího a opožděně stékajícího na dně misky; v kolmém pohledu 3,0 je výrazný závoj; směs je při krouživých pohybech stejnoměrně rozprostírána po obvodu misky Pozorujeme velmi výraznou tvorbu filmu, který ulpívá a opožděně stéká; v kolmém 4,0 pohledu je výrazný závoj; při krouživých pohybech se směs shlukuje uprostřed misky Stanovení ph a titrační kyselosti mléka Kyselost mléka se muže vyjádřit jednak jako titrační kyselost nebo hodnotou ph. V běžné praxi se stanovení ph používá zřídka, jelikož hodnota ph mléka od zdravých dojnic velmi málo kolísá (Šustová, 2005). Aktivní kyselost (ph) mléka je dána koncentrací vodíkových iontů v mléce a měří se ph metrem. Je to bezrozměrná veličina. Principem stanovení titrační kyselosti je vyjádření spotřeby roztoku NaOH (0,25 mol/l) spotřebovaných při titraci 100 ml mléka za přídavku fenolftaleinu jako indikátoru. Výsledná hodnota se přepočítá, udává se ve stupních Soxlet-Henkelových SH (Šustová, 2005). 32

34 4.1.7 Stanovení sušiny Mezinárodní norma ČSN ISO 6731 specifikuje referenční metodu sušení na stanovení obsahu celkové sušiny mléka, smetany a neslazeného zahuštěného mléka. Vzorky byly sušeny při 102 ± 2 C do konstantní hmotnosti. 4.2 Přídavek syřidla Síla syřidla dle Soxhleta je definována jako množství mléka v ml, které se srazí 1 ml (1g) syřidla, za 40 minut (2400 s) při teplotě 35 C. Zjišťuje se čas, za který dojde k vytvoření prvních vloček sýřeniny (filmu) na stěně baňky za podmínek metody (Šustová, 2015). 4.3 Stanovení kvality sýřeniny dle Gajdůška Kvalita sýřeniny byla hodnocena po 60-ti minutové inkubaci zasýřeného vzorku mléka v termostatu při 35 C a posouzena dle tab. 8, která hodnotí vzhled vzniklé sýřeniny a syrovátky. Tab. 8 Vyhodnocení kvality sýřeniny dle Gajdůška (Gajdůšek, 1998) Třída jakosti Vzhled sýřeniny a syrovátky I Sýřenina je velmi dobrá, po vyklopení zachovává tvar. Syrovátka je čirá, žlutozelené barvy. II Sýřenina je dobrá, je poněkud méně pevná, méně dobře zachovává tvar. Vylučování syrovátky není dokonalé, je bělavé, nazelenalé barvy. III Sýřenina je špatná, měkká, částečně nedrží pohromadě. Syrovátka je mlékovitě bílá. IV Sýřeniny je velmi špatná, vůbec nedrží pohromadě. Syrovátka je mlékovitě bílá. V Nezřetelné nebo žádné vyvločkování kaseinu. 4.4 Spektrofotometrické stanovení barvy syrovátky Barva syrovátky se měřila na přístroji Konica Minolta CM 3500d, který má software SpectraMagic verzi NX, na kterém byla data analyzována. Jak zařízení vypadá, můžeme vidět na obr. 6 a obr. 7. Měření bylo prováděno při osvětlení D65 (představuje průměrné denní světlo). Vzorky byly měření pomocí transmitance ve skleněné kyvetě. 33

35 Obr. 6 Spektrofotometr Konica Minolta (Autorka) Obr. 7 Konica Minolta se vzorky a kyvetou (Autorka) 34

36 5 VÝSLEDKY A DISKUZE Pro posouzení kvality sýření mléka byly vybrány následující parametry: mléko jako surovina, čas syřitelnosti, kvalita sýřeniny, objem uvolněné syrovátky, sušina syrovátky a barva syrovátky. Výsledky, které jsou v příloze 1 a 2 byly zpracovány pomocí programu MS Excel 2007 a Statistica Výsledky rozboru základních složek mléka V tab. 9 jsou uvedeny průměrné hodnoty základních parametrů mléka, která jsme stanovovali. Na obr. 8, 9 a 10 můžeme vidět, jak se jednotlivé parametry v průběhu experimentu lišily. Obsah bílkovin neklesl pod hodnotu 3,45 %, což podle Gajdůška (2003) odpovídá průměrné hodnotě 3,20 %. Podle Samkové (2012) by měl být obsah tuku v kravském mléce 3,8 %. Naměřená průměrná hodnota je 3,85 %, avšak hodnoty kolísaly v rozmezí 3,34 % až 4,11 %. Z těchto hodnot lze usoudit, že tuk byl nejvíce proměnlivou složkou při analýze. Obecně se udává, že mléčný cukr je nejvíce stabilní složkou mléka. Průměrná hodnota podle Gajdůška (2003) je 4,7 % a při našem měření se hodnoty pohybovaly v rozmezí 4,65 % až 4,81 %, což koreluje s uvedenými výsledky. Podle Foxe (2000) se pohybuje obsah vápníku v mléce okolo 1200 mg/l mléka. Průměrné množství vápníku u všech vzorků bylo 1226 mg/l mléka, což odpovídá hodnotě, kterou uvádí Fox (2000). Nižší obsah vápníku byl naměřen u prvních dvou vzorků a jeho hodnota byla 1193 mg/l. Maximální obsah vápníku byl 1323 mg/l mléka. Pokud je obsah vápníku snížen, dochází k prodloužení doby zasýření mléka. Použité mléko mělo v průběhu měření stejné složení, což prokazují i nízké hodnoty S x v tab 9. Tab. 9 Základní laboratorní analýza základních složek mléka Složka Průměr Minimum Maximum S x R x Tuk (%) 3,85 3,34 4,11 0,28 7,39 Bílkoviny (%) 3,65 3,45 3,81 0,11 3,17 Laktosa (%) 4,73 4,65 4,81 0,07 1,52 Ca (g/l) 1,23 1,15 1,32 0,07 5,33 Sušina mléka (g) 13,15 12,89 13,41 0,17 1,26 ph 6,65 6,61 6,70 0,04 0,55 SH 6,67 6,35 6,88 0,22 3,32 35

37 Obr. 8 Množství tuku, bílkovin a laktosy v průběhu celého experimentu Obr. 9 Analýza aktivní a titrační kyselosti v průběhu celého experimentu 36

38 Obr. 10 Množství vápníku v průběhu celého experimentu Naměřené výsledky byly porovnávány s výsledky poskytnutými centrální laboratoří. Získané výsledky jsou srovnatelné s výsledky z centrální laboratoře. 5.2 Vliv množství použitého syřidla na čas syřitelnosti Úkolem bylo zjistit, zda použití odlišného množství syřidla má vliv na čas koagulace mléka. Z tab. 10 a 11 lze vyvodit, že množství přidaného syřidla bude mít vliv na čas syřitelnosti, což bylo prokázáno i statisticky dle Tukeyova testu. U obou syřidel byl zjištěn statisticky průkazný rozdíl pro parametr času syřitelnosti mezi 1 a 2 ml syřidla, 1 a 5 ml syřidla, 2 a 5 ml syřidla. Z toho vyplívá, že objem syřidla přidaného do mléka ovlivňuje čas, za který se mléko vysráží. S vyšším přídavkem syřidla, klesá doba srážení mléka, což uvádí i Teplý (1976). Obě syřidla byla ve stejném množství zředěna na 15% roztok. Každé z nich má jinou sílu a bylo potřeba, aby se čas syřitelnosti pohyboval v rozmezí s. Čas koagulace mléka se po přídavku 1 ml syřidla Chymax pohyboval v rozmezí s, průměrný čas koagulace při přídavku 2 ml byl 71,52 ± 3,39 s, a u 5 ml klesl ještě na poloviční hodnotu 36,16 ± 0,99 s. Po přídavku 1 ml syřidla Naturen byl průměrný čas koagulace 210,80 ± 15,91 s, a s přídavkem vyšších dávek syřidla byl čas kratší. Při přidání 2 ml se čas syřitelnosti pohyboval v rozmezí s. Přidáním 5 ml syřidla Naturen byla průměrná hod- 37

39 nota srážení 54,76 ± 1,74 s. U Chymaxu byl stanoven čas koagulace přesněji, což potvrzuje i nižší směrodatná odchylka. Na stanovení času koagulace měl vliv velikost vloček vysráženého kaseinu, tak jak uvádí i Pytel et.al. (2016). Bujko et.al. (2011) uvádí, že pokud se čas syřitelnosti pohybuje v rozmezí s, tak se jedná o dobrou syřitelnost mléka. Za méně dobrou syřitelnost se považuje čas s a jako nevhodnou dobu, pokud čas přesáhne 200 s. Tab. 10 Analýza závislosti času syřitelnosti na objemu syřidla Chymax Objem syřidla (ml) Průměr (s) Minimum (s) Maximum (s) R x 1 128,96 ± 3,62 a 124,00 136,00 2, ,52 ± 3,39 b 57,00 75,00 4, ,16 ± 0,99 c 35,00 39,00 2,72 a,b,c hodnoty s rozdílnými indexy ve sloupci se statisticky významně liší na hladině p < 0,05 Tab. 11 Analýza závislosti času syřitelnosti na objemu syřidla Naturen Objem syřidla (ml) Průměr (s) Minimum (s) Maximum (s) R x 1 210,80 ± 15,91 a 178,00 234,00 7, ,72 ± 0,48 b 99,00 125,00 5, ,76 ± 1,74 c 51,00 57,00 3,18 a,b,c hodnoty s rozdílnými indexy ve sloupci se statisticky významně liší na hladině p < 0, Posouzení kvality sýřeniny Další úkolem bylo posoudit, zda má množství syřidla vliv na kvalitu vzniklé sýřeniny. Kvalita se hodnotila dle Gajdůška. U obou použitých syřidel byla téměř srovnatelná kvalita sýřeniny. Vznikaly sýřeniny hodnocené třídou 1 (sýřenina je velmi dobrá, pevná, po vyklopení zachovává tvar) (obr.11), horší kvalita sýřeniny byla pozorována u syřidla Naturen, kde kvalita sýřeniny byla 2 (obr. 12), což znamená, že sýřenina byla méně pevná a méně dobře držela tvar. To samé platilo i při přídavku 2 ml syřidla. Přidáním 5 ml syřidla Naturen vznikaly sýřeniny i třídy 3 (sýřenina je špatná, měkká a částečně nedrží pohromadě). Lze tedy říct, že syřidlo Chymax tvoří sýřeniny lepší kvality, kdežto u Naturenu dochází k tomu, že s vyšším přídavkem syřidla vznikají sýřeniny horší kvality. To bylo podloženo i statisticky podle Tukeyova testu. U syřidla Chymax nemá množství přidaného syřidla vliv na kvalitu sýřeniny. Naopak u syřidla Naturen jsme 38

40 zjistili, že je statisticky významný rozdíl na hladině p < 0,05 mezi přidaným syřidlem o objemu 1 ml a 5 ml. Toto tvrzení dokládají i pořízené obrázky (11, 12) při měření. Kvalitu sýřeniny ovlivňuje i délka skladování syřidla jak uvádí Kozelková (2012) na obr. 13. Obr.11 Sýřenina vzniklá přídavkem Chymaxu 1 ml (dle Gajdůška třída jakosti 1) (Autorka) Obr. 12 Sýřenina vzniklá přídavkem Naturen 2 ml (dle Gajdůška třída jakosti 2)(Autorka) 39

41 Obr. 13 Vzhled sýřeniny po použití syřidla různého stáří (Kozelková, 2012) 5.4 Množství uvolněné syrovátky Při pozorování, zda má množství syřidla vliv na množství uvolněné syrovátky, bylo zjištění, že se zvyšujícím se množstvím použitého syřidla dochází ke zvýšenému uvolňování syrovátky. Přídavek vyššího množství syřidla je tedy vhodné např. pro výrobu technologicky náročnějších sýrů, kde požadujeme vyšší sušinu vyráběného sýru. Podle Tukeyova testu má množství přidaného syřidla vliv na objem uvolněné syrovátky. U obou syřidel byl statisticky významný rozdíl, mezi přidáním různého množství syřidla na hladině významnosti p < 0,05 pro tento parametr. Tab. 12 a 13 nám ukazují průměrné hodnoty množství syrovátky (ml) pro obě použitá syřidla. Tab. 12 Závislost uvolněné syrovátky na objemu přidaného syřidla Chymax Objem syřidla (ml) Průměr (ml) Minimum (ml) Maximum (ml) 1 20,88 ± 2,95 a 17,00 26,00 14, ,48 ± 3,02 b 19,00 32,00 12, ,64 ± 3,71 c 22,00 38,00 13,41 a,b,c hodnoty s rozdílnými indexy ve sloupci se statisticky významně liší na hladině p < 0,05 Tab. 13 Závislost uvolněné syrovátky na objemu přidaného syřidla Naturen Objem syřidla (ml) Průměr (ml) Minimum (ml) Maximum (ml) 1 19,36 ± 2,33 a 15,00 25,00 12, ,28 ± 3,45 b 16,00 28,00 15, ,24 ± 3,19 c 18,00 33,00 12,65 a,b,c hodnoty s rozdílnými indexy ve sloupci se statisticky významně liší na hladině p < 0,05 40 R x R x