! " # $%&'() )*+,- 6) )*+,-

Transkript

1 ! " # $%&'() )*+,-./0120$34./012-)4#5%3 6) )*+,-

2 78 79,,6 :;<(= >>./012 " 4./ " 4 "./0120? " 6 ;<# ; 6 =(>4 ;<(= >; =( (;<=(= 4 >!! (> 78 79,,6! ;= (=(,1 ;*+@%*@1- ;A;<( ;A;< ;;< - =B;<( ;< - >./! > $;$ C! $!< (;! > 4$> =>D ; E(4;$ ;,6(<! ;;!!;< ; > =( ( ;,6 =; <= = >4! ;>4!< (,6!> A; 4A =$$ /F > $ ( < ;>7;<,6!;<== => G-/ H)*%% H%% H))H H)%**H ) )*%H H**H )%)%+H H+%*% H+%H H%+ H)H H**H? D I3 DD 596 ;<9 J %. /0 12 4B;<=><(

3 Obsah 1. Obsah Skladování Další potebné vybavení Všeobecná preventivní opatení Obecné údaje Princip testu Popis produktu Protokol Izolace DNA Píprava PCR Programování pístroje LightCycler Vyhodnocení ešení problém Specifikace Analytická senzitivita Analytická specificita Diagnostická senzitivita a specificita Zvláštní pokyny pro použití produktu Bezpenostní informace Kontrola kvality Literatura Vysvtlení symbol artus TPMT LC PCR Kit 04/2007 3

4 artus TPMT LC PCR Kit * Pro použití s pístrojem LightCycler. 1. Obsah Oznaení a obsah Kat. ís reakcí Modrá TPMT LC Master A 2 x 12 rxns Modrá TPMT LC Master B 2 x 12 rxns Žlutá TPMT LC Mg-Sol 1 x 400 µl ervená TPMT LC Control Aw 1 x 200 µl ervená TPMT LC Control Av 1 x 200 µl ervená TPMT LC Control B 1 x 200 µl Bílá Water (PCR grade) 1 x µl Mg-Sol = Roztok hoíku 2. Skladování Komponenty artus TPMT LC PCR Kit se skladují pi -20 C a mají trvanlivost do data uvedeného na štítku. Zabrate opakovanému rozmrazení a zmrazení (> 2 x), snižuje se tím senzitivita. Pi nepravidelném používání by proto mly být reagencie alikvotovány. V pípad, že je nutné komponenty skladovat pi teplot +4 C, skladujte je takto maximáln po dobu pti hodin. * TPMT = Thiopurin S-metyltransferáza 4 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

5 3. Další potebné vybavení Laboratorní rukavice bez pudru DNA-izolaní souprava (viz 8.1 Izolace DNA) Pipety (nastavitelné) Sterilní pipetovací špiky s filtrem Vortex mixer Stolní centrifuga s rotorem pro 2 ml zkumavky Color Compensation Set (Roche Diagnostics, kat ) pro vytvoení souboru Crosstalk Color Compensation LightCycler kapiláry (20 µl) LightCycler Cooling Block LightCycler pístroj LightCycler Capping Tool 4. Všeobecná preventivní opatení Uživatel by ml dbát na následující: Analyzujte v jednom PCR bhu maximáln dvanáct vzork. Paralelní analýza více než dvanácti vzork mže vést k technicky podmínnému netypickému prbhu kivky tání heterozygotní varianty nt 238. Používejte sterilní pipetovací špiky s filtrem. Skladujte, izolujte a pidávejte pozitivní materiál (vzorky, kontroly, amplifikáty) do reakce na jiném míst než ostatní reagencie. Všechny komponenty ped poátkem testu úpln rozmrazte pi pokojové teplot. Následn komponenty ádn promíchejte a krátce centrifugujte. Pracujte plynule na ledu nebo v LightCycler Cooling Blocku. artus TPMT LC PCR Kit 04/2007 5

6 5. Obecné údaje Krom vliv jako vk, pohlaví, výživa a komedikace je enzymová aktivita ovlivnna pedevším genetickými faktory. Je známo, že pacienti, kteí nevykazují žádnou resp. jen velmi redukovanou aktivitu enzymu thiopurin S- metyltransferázy (TPMT), mají pi léb 6-thioguaninem, 6-mercaptopurinem nebo azathioprinem zvýšené riziko výskytu vážných vedlejších úink (1 3, nap. hematologická toxicita, hepatotoxicita). Analýza genu TPMT umožuje odhad geneticky podmínného rizika vážných vedlejších úink. Nosii genetické varianty genu TPMT mohou být takto ped zaátkem terapie rozpoznáni a pop. léeni alternativní metodou nebo výrazn nižší dávkou. Enzymatická aktivita thiopurinu S-metyltransferázy je urena mj. zmnami v TPMT genu. Genetické modifikace mohou nap. zpsobit výmnu aminokyselin. Tímto zmnná konformace enzymu má vliv na aktivitu enzymu. Nejastjší genetické varianty genu TPMT postihují nukleotidy (nt) 238, 460 a 719. V literatue jsou popsány další genetické varianty, které jsou ovšem jen velmi vzácné pop. byly v populaci pozorovány jen jednou. Asi 10 % blošské populace má asi o 75 % redukovanou aktivitu TPMT, cca 0,3 % nevykazuje žádnou mitelnou aktivitu. Srovnávací výzkumy genotyp a fenotyp zjistily korelaci o 87 % mezi genotypem a enzymatickou aktivitou. Genotypizace mže pomoci individuáln optimalizovat medikamentózní terapie. Analýza genu TPMT je vhodná pedevším pi léb nádorových onemocnní pomocí thiopurinu, léb chronických zántlivých stevních onemocnní nebo po transplantaci, a mže omezit riziko a snížit náklady nežádoucích úink (delší pobyt v nemocnici ap.). 6. Princip testu Pi genetické diagnostice pomocí polymerázové etzové reakce (PCR) se amplifikují specifické oblasti lidského genomu. Detekce probíhá pi PCR v reálném ase pomocí fluorescenních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Analýza kivek tání bezprostedn po PCR amplifikaci umožuje identifikaci a 6 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

7 diferenciaci genových variant. Protože již není po PCR nutné znovu otevírat testovací kapiláry, výrazn se snižuje riziko kontaminace (Mackay, 2004). 7. Popis produktu artus TPMT LC PCR Kit umožuje jednoduché, rychlé a spolehlivé testování lidské DNA na pítomnost klinicky relevantních genetických variant v TPMT genu. Tato analýza umožuje odhad rizik spojených s terapií, nap. s lébou thiopurinem. Analýza se provádí s pomocí pístroje LightCycler na základ prkazu genetických variant v TPMT genu. Reagencie obsahují primery k amplifikaci úseku lidského TPMT genu a také fluorescenn znaené sondy k prkazu genetických variant na nukleotidových pozicích nt 238 v exonu 5, nt 460 v exonu 7 a nt 719 v exonu 10. Dodaten se v oddlené reakci provádí pozitivní kontroly A (Aw/Av) a B. Protože se test zakládá na amplifikaci lidské genomické DNA, musí být fluorescenní signály v úseku kivek tání rozpoznatelné nezávisle na pítomnosti alelické varianty. Absence detekovatelného signálu poukazuje na neefektivní extrakci DNA nebo PCR inhibici. Dodatená interní kontrola není tedy pi tomto genetickém testu zapotebí. Upozornní: Signály analýzy kivek tání jsou rozhodující pro vyhodnocení dat. Ve vtšin pípad nelze bhem bhu na pístroji LightCycler za užití artus TPMT LC PCR Kit pozorovat kvantitativní amplifikaci. To však nemá žádný vliv na analýzu kivek tání. artus TPMT LC PCR Kit 04/2007 7

8 8. Protokol 8.1 Izolace DNA Diagnostické soupravy k izolaci DNA z krve nabízejí rzní výrobci. V závislosti na protokolu zvoleného výrobce použijte dané množství vzorku a provete izolaci DNA podle návodu. Doporuujeme následující izolaní soupravy: Vzorek Izolaní souprava Katalogové íslo Výrobce krev QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) QIAGEN Pi izolaci využívající promývací pufr s obsahem etanolu bezpodmínen zajistte, aby byl ped elucí proveden ješt jeden centrifuganí krok (ti minuty, ot/min) a tím se odstranily zbytky etanolu. Pedejdete tak možným inhibicím PCR. artus TPMT LC PCR Kit není vhodný pro izolace na bázi fenolu. 8.2 Píprava PCR Upozornní: Analyzujte v jednom PCR bhu maximáln dvanáct vzork. Paralelní analýza více než dvanácti vzork mže vést k technicky podmínnému netypickému prbhu kivky tání heterozygotní varianty nt 238. Ovte, že je Cooling Block s uvnit obsaženými adaptéry (píslušenství pístroje LightCycler ) pedem vychlazen pibližn na +4 C. Do adaptér Cooling Blocku vložte takový poet kapilár LightCycler, který je potebný pro plánované reakce. Všechny reagencie se musí ped zaátkem testu zcela rozmrazit pi pokojové teplot, musí být dobe promíchány (opakovaný nábr pipetou a vypuštní pipety nebo krátký vortex) a následn centrifugovány. Dbejte na to, aby byla spolen s každým bhem PCR provedena alespo jedna pozitivní (TPMT LC Control Aw, TPMT LC Control Av a TPMT LC Control B) a jedna negativní kontrola (Water, PCR grade). 8 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

9 Pi píprav PCR reakcí používejte následující schéma pipetování (viz také schématický pehled na Obr. 1): 1. Píprava Master Mixu 2. Píprava PCRreakce Poet vzork 1 TPMT LC Master A nebo 16 µl TPMT LC Master B TPMT LC Mg-Sol 2 µl celkový objem 18 µl Master Mix 18 µl vzorek 2 µl celkový objem 20 µl Do plastikového zásobníku každé kapiláry pipetujte 18 µl Master Mixu. Následn pidejte 2 µl eluátu z izolace DNA. Podobn musíte pidat jako pozitivní kontrolu 2 µl TPMT LC Control A (Aw/Av) nebo TPMT LC Control B a jako negativní kontrolu 2 µl vody (Water, PCR grade). Uzavete kapiláry. Sms pevedete z plastikového zásobníku do kapiláry tak, že na stolní centrifuze centrifugujete adaptéry s uvnit obsaženými kapilárami po dobu deseti sekund pi maximáln 400 x g (2 000 ot/min). Upozornní: Aby se zabránilo kontaminacím, mla by se víka na kapiláry nasadit pomocí LightCycler Capping Tool. artus TPMT LC PCR Kit 04/2007 9

10 Píprava PCR Obr. 1: Schéma pracovního postupu. * Pi každém pipetovacím kroku je teba bezpodmínen dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované. 10 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

11 8.3 Programování pístroje LightCycler Pro detekci genetických variant v TPMT genu vytvote na pístroji LightCycler teplotní profil následujícími pti pracovními kroky (viz Obr. 2-6): A. Poátení aktivace Hot Start enzymu Obr. 2 B. Krok Touch Down Obr. 3 C. Amplifikace DNA Obr. 4 D. Kivka tání Obr. 5 E. Chlazení Obr. 6 Dbejte zvlášt na nastavení Analysis Mode, Cycle Program Data a Temperature Targets. Na obrázcích jsou tato nastavení zvýraznna ernými rámeky. Pokyny pro programování pístroje LightCycler naleznete v píruce LightCycler Operator s Manual. Obr. 2: Poátení aktivace Hot Start enzymu. artus TPMT LC PCR Kit 04/

12 Obr. 3: Krok Touch Down. Obr. 4: Amplifikace DNA. 12 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

13 Obr. 5: Kivka tání. Obr. 6: Chlazení. artus TPMT LC PCR Kit 04/

14 9. Vyhodnocení U vícebarevných analýz se mezi fluorimetrickými kanály vyskytují interference. Software pístroje LightCycler obsahuje soubor oznaený jako Color Compensation File, který tato záení kompenzuje. Tento soubor otevete ped, v prbhu nebo po skonení PCR aktivací pepínací plochy Choose CCC File resp. Select CC Data. Není-li instalován žádný soubor Color Compensation File, vytvote soubor podle návodu v LightCycler Operator s Manual. Po aktivaci souboru Color Compensation File se ve fluorimetrických kanálech F1, F2 a F3 objeví oddlené signály. Pro analýzu výsledk PCR, které byly získány pomocí artus TPMT LC PCR Kit, zvolte prosím pohledovou funkci F2/Back-F1 a F3/Back-F1 pro TPMT PCR. Pi použití artus TPMT LC PCR Kit nelze ve vtšin pípad bhem bhu pístroje LightCycler pozorovat kvantitativní amplifikace. Komponenty soupravy artus TPMT LC PCR Kit slouží k prkazu genetických variant (divoký typ = wt; varianta = var) na nukleotidových pozicích (nt) 238, 460 a 719 v TPMT genu. Urení genetických variant probíhá pomocí programu Melting Curve. V analýze kivek tání poukazují body tání u teplot uvedených v následující tabulce (viz Tabulka 1) na pítomnost divokého typu resp. genetické varianty. V pípad heterozygozity vykazuje kivka dva vrcholy. Tabulka 1: Body tání divokého typu (wt) resp. genetických variant (var). Master Kanál F2 Kanál F3 nt wt var nt wt var A C 64 C B C 47 C C 54 C Prosím povšimnte si, že se body tání mohou od uvedených teplot odlišovat o ± 2 C. V mnoha pípadech se k lepšímu zobrazení analýzy kivek tání doporuuje vypnout Digital Filter. 14 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

15 Následující vyobrazení (viz Obr. 7 a 9) zobrazují analýzu kivek tání prkazu polymorfism na nukleotidových pozicích nt 238, nt 460 a nt 719 v homozygotní form divokého typu, a také v heterozygotní pop. homozygotní modifikované form. Pozitivní kontroly (TPMT LC Control A (Aw/Av) a B) dodávané se soupravou artus TPMT LC PCR Kit vykazují heterozygotní stav genetické varianty. Obr. 7: Analýza kivek tání k prkazu nukleotidové výmny nt 238 pomocí artus TPMT LC PCR Kit (Master A) ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1. NTC: non-template control (negativní kontrola). Upozornní: Analyzujte v jednom PCR bhu maximáln dvanáct vzork. Paralelní analýza více než dvanácti vzork mže vést k technicky podmínnému netypickému prbhu kivky tání heterozygotní varianty nt 238. artus TPMT LC PCR Kit 04/

16 Obr. 8: Analýza kivek tání k prkazu nukleotidové výmny nt 460 pomocí artus TPMT LC PCR Kit (Master B) ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1. NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 9: Analýza kivek tání k prkazu nukleotidové výmny nt 719 pomocí artus TPMT LC PCR Kit (Master B) ve fluorimetrickém kanálu F3/Back-F1. NTC: non-template control (negativní kontrola). Urení genotypu je možné díky kombinaci alelických variant (viz Tabulka 2). Pitom se musí dbát na to, že v pípad pítomnosti dvou heterozygotních variant mohou být tyto lokalizovány buto na jedné nebo na dvou alelách. V každém pípad lze pi pítomnosti nejmén jedné genetické varianty oekávat redukci enzymatické aktivity TPMT. 16 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

17 U nosi dvou alel divokého typu lze pedpokládat normální enzymatickou aktivitu, pokud není ovlivnna jinými negenetickými faktory. Snížená enzymatická aktivita se oekává u nosi nejmén jedné modifikované alely. Napíklad výskyt heterozygozity na pozicích nt 460 a nt 719 mže vést jak ke genotypu TPMT*3A/*1, tak TPMT*3B/*3C. Jsou-li postiženy ob alely, stoupá riziko geneticky podmínných vedlejších úink. Pomocí artus TPMT LC PCR Kit jsou provovány nukleotidové varianty na tech rzných pozicích v TPMT genu, což umožuje prkaz alel TPMT*1, TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B a TMPT*3C. Tabulka 2: Genetické varianty v TPMT genu. Alely TPMT*1 nt 238 F2 nt 460 F2 nt 719 F3 Enzymatická aktivita normální TPMT*2 x snížená TPMT*3A x x žádná aktivita TPMT*3B x snížená TPMT*3C x snížená artus TPMT LC PCR Kit 04/

18 Výše popsané alely rezultují v rzných možných genotypech. Tyto jsou uvedeny v následující tabulce (viz Tabulka 3). Tabulka 3: Vliv genotypu na enzymatickou aktivitu. Homozygotní genotyp divokého typu Heterozygotní nebo homozygotní genotyp varianty Homozygotní genotyp varianty TPMT*1/*1 TPMT*1/*2 TPMT*3A/*3A normální enzymatická aktivita TPMT*1/*3A TPMT*1/*3B TPMT*1/*3C TPMT*2/*2 TPMT*2/*3A TPMT*2/*3B TPMT*2/*3C TPMT*3A/*3B TPMT*3A/*3C TPMT*3B/*3B TPMT*3B/*3C TPMT*3C/*3C redukovaná enzymatická aktivita žádná enzymatická aktivita 18 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

19 10. ešení problém Žádný signál pi pozitivní kontrole (TPMT LC Control Aw, Av nebo B) nebo u vzork ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1 pop. F3/Back-F1: Naprogramování teplotního profilu pístroje LightCycler je chybné. Porovnejte teplotní profil s údaji protokolu (viz 8.3 Programování pístroje LightCycler ). PCR reakce byla chybn sestavena. Porovnejte Vaše pracovní kroky s pipetovacím schématem (viz 8.2 Píprava PCR) a pop. PCR zopakujte. Podmínky skladování jednoho nebo více komponent soupravy neodpovídají pedpism uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla pekroena doba použitelnosti soupravy artus TPMT LC PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop. novou soupravu. PCR byla inhibována. Ujistte se, že používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Pesvdte se, že byl pi izolaci DNA ped elucí proveden dodatený doporuený centrifuganí krok k úplnému odstranní zbytk etanolu (viz 8.1 Izolace DNA). Bhem izolace dochází k úbytku DNA. Ujistte se, že používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Žádný signál pi TPMT LC Master A ve fluorimetrickém kanálu F3/Back-F1 TPMT LC Master A generuje jen jeden signál ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1. Netypický prbh kivky tání pi prkazu nukleotidové výmny nt 238 ve fluorimetrickém kanálu F2/Back-F1 Bylo analyzováno více než dvanáct vzork paraleln. artus TPMT LC PCR Kit 04/

20 Slabé maximum fluorescence Ped použitím komponenty dkladn promíchejte. Zkontrolujte podmínky amplifikace. Cooling Block s obsaženými adaptéry pedchlate na +4 C. Udržujte všechny reagencie bhem pipetování v chladu. Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy, kontaktujte prosím naší technickou podporu. 11. Specifikace 11.1 Analytická senzitivita artus TPMT LC PCR Kit slouží za pomoci technologie LightCycler k prkazu individuální genetické konstituce vzhledem ke genetickým variantám nt 238, nt 460 a nt 719 v lidském genu TPMT. Lidská genomická DNA byla purifikována z krevních vzork, spektrofotometricky kvantifikována a zedna v sériových fázích ední. Minimum o 0,12 ng genomické DNA (20 kopií) pro PCR (odpovídá 0,005 0,02 µl krve, podle dárce krve a izolace) vystaí pro detekci genetické varianty Analytická specificita Specificita artus TPMT LC PCR Kit je v první ad zaruena výbrem primer a sond, jakož i volbou písných reakních podmínek. Primery a sondy byly na základ sekvenní analýzy pezkoušeny na eventuální homologie se všemi sekvencemi publikovanými v genových bankách. Dále byla specificita k prkazu tchto genetických polymorfism zajištna sekvencováním jednotlivých alelických variant a následným sekvenním srovnáním v mezinárodních genových bankách Diagnostická senzitivita a specificita Frekvence polymorfismu v europoidní populaci, jak byla popsána v literatue, byla na základ 300 DNA vzork a za užití komponent diagnostické soupravy potvrzena. 20 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

21 12. Zvláštní pokyny pro použití produktu Všechny reagencie se smí používat výhradn pro diagnostiku in vitro. Prostedek by mli používat pouze pracovníci, kteí jsou speciáln poueni a vyškoleni v metodice diagnostiky in vitro (EN375). Pesné dodržování protokolu je bezpodmínen nutné k dosažení optimálních výsledk PCR. Dbejte na konec doby použitelnosti uvedený na balení a na štítcích jednotlivých komponent. Nepoužívejte reagencie s prošlou trvanlivostí. 13. Bezpenostní informace Bezpenostní informace k souprav artus TPMT LC PCR Kit naleznete v odpovídajících bezpenostních listech (material safety data sheets, MSDS). Tyto listy jsou k dispozici v podob kompaktního a snadno použitelného PDF souboru na Kontrola kvality V souladu se systémem managementu jakosti spolenosti QIAGEN certifikovaným podle norem ISO 9001 a ISO byla každá šarže artus TPMT LC PCR Kit testována podle pedem stanovených specifikací, aby byla zaruena jednotná kvalita produktu. artus TPMT LC PCR Kit 04/

22 15. Literatura (1) Andersen JB, Szumlanski C, Weinshilboum RM, Schmiegelow K. Pharmacokinetics, dose adjustments, and 6-mercaptopurine/ methotrexate drug interactions in two patients with thiopurine methyltransferase deficiency. Acta Paediatr Jan; 87 (1): (2) Krynetski EY, Schuetz JD, Galpin AJ, Pui CH, Relling MV, Evans WE. A single point mutation leading to loss of catalytic activity in human thiopurine S-methyltransferase. Proc Natl Acad Sci USA Feb 14; 92 (4): (3) Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): (4) Schwab M, Schaffeler E, Marx C, Fischer C, Lang T, Behrens C, Gregor M, Eichelbaum M, Zanger UM, Kaskas BA. Azathioprine therapy and adverse drug reactions in patients with inflammatory bowel disease: impact of thiopurine S-methyltransferase polymorphism. Pharmacogenetics Aug; 12 (6): artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

23 16. Vysvtlení symbol Použitelné do íslo šarže Výrobce Katalogové íslo íslo materiálu Manuál Diagnostický zdravotnický prostedek in vitro <N> Obsah postaující pro <N> test Teplotní rozmezí Roztok hoíku artus TPMT LC PCR Kit 04/

24 24 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

25 artus TPMT LC PCR Kit 04/

26 26 artus TPMT LC PCR Kit 04/2007

27 artus TPMT LC PCR Kit 04/

28 : +@+5)5)IN+@+5)5)*7;<;+@+5)5)) +/6 G %8 : 9H2 +9 : +5H%5*)IN+5%)5H*H)7;<;+5# 2/561+55%%%! ",9+**)*%,: G 67/F: 1G I,1# 1O : )55*5*IN)55*5*H7;<;)55*5* #./012-)%3 : )5*5)IN)5*57;<;)5*5) # " $ '0 4)@))H)8 : 55))IN557;<;+5%+%*+ %$ I D 7 L)5)4;<,<,< 547 > )5H 7< 5HH%5+))IN5HH%5+)+7;<;5HH%5+)) "& ' 0 L++3 $;< : HH5H55))INHH5H55)7;<;HH5H55) (" %7$>9';,/*)HH : +55+)H%IN+5%)+5H7;<;+5# 2/561+55%%% )*+,-)%))*