Obsah. 8.1 Preanalytika: Odbr, skladování a peprava vzork Odbr vzork Skladování vzork Peprava vzork...

Transkript

1 !

2

3 Obsah 1. Obsah Skladování Další potebné vybavení Všeobecná preventivní opatení Informace o pvodcích Princip PCR s hodnocením v reálném ase Popis produktu Protokol Preanalytika: Odbr, skladování a peprava vzork Odbr vzork Skladování vzork Peprava vzork Izolace DNA Doporuení pro izolaci ze vzork moi a výtr pomocí QIAamp Viral RNA Mini Kit Doporuení pro izolaci z výtrových vzork a vzork spermatu pomocí QIAamp DNA Mini Kit Doporuení pro izolaci z lyofilizovaných vzork pomocí QIAamp DNA Mini Kit Interní kontrola Kvantifikace Píprava PCR Programování ABI PRISM SDS Programování ABI PRISM 7000 SDS Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Vytvoení/volba detektor...28 C. trachomatis PCR Kit 03/2007 3

4 Piazení potebných informací k pozicím destiek Vytvoení teplotního profilu Uložení bhu PCR Spuštní bhu PCR Programování ABI PRISM 7700 SDS Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Volba fluorescenního barviva a piazení typu vzorku Piazení potebných informací k pozicím destiek Vytvoení teplotního profilu Dležitá pídavná nastavení Uložení bhu PCR Spuštní bhu PCR Programování ABI PRISM 7900HT SDS Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Vytvoení/volba detektor Piazení potebných informací k pozicím destiek Vytvoení teplotního profilu Uložení bhu PCR Spuštní bhu PCR Vyhodnocení ešení problém Specifikace Analytická senzitivita Specificita Pesnost Robustnost Reprodukovatelnost Diagnostické hodnocení Zvláštní pokyny pro použití produktu C. trachomatis PCR Kit 03/2007

5 13. Bezpenostní informace Kontrola kvality Literatura Vysvtlení symbol C. trachomatis PCR Kit 03/2007 5

6 C. trachomatis PCR Kit * Pro použití s ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection Systems (Applied Biosystems). Upozornní: C. trachomatis PCR Kit nelze použít ani ve spojení s GeneAmp 5700 SDS, ani s 384 formátem destiek systému ABI PRISM 7900HT SDS. 1. Obsah Oznaení a obsah List No. 3K reakcí List No. 3K reakcí Modrá C. trachomatis TM Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns ervená ervená ervená ervená C. trachomatis TM QS 1 1 x 10 4 cop/µl C. trachomatis TM QS 2 1 x 10 3 cop/µl C. trachomatis TM QS 3 1 x 10 2 cop/µl C. trachomatis TM QS 4 1 x 10 1 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Zelená C. trachomatis TM IC 1 x µl 2 x µl Bílá Water (PCR grade) 1 x µl 1 x µl QS IC = Kvantifikaní standard = Interní kontrola 2. Skladování Komponenty C. trachomatis PCR Kit se skladují pi -20 C a mají trvanlivost do data uvedeného na štítku. Zabrate opakovanému rozmrazení a zmrazení (> 2 x), snižuje se tím senzitivita. Pi nepravidelném používání by proto mly být reagencie alikvotovány. V pípad, že je nutné komponenty skladovat pi teplot +4 C, skladujte je takto maximáln po dobu pti hodin. * Vyrobeno firmou QIAGEN GmbH, D Hilden, pro Abbott Diagnostics GmbH. Výrobce podle zákona o zdravotnických prostedcích: QIAGEN GmbH. Applied Biosystems je registrovaná obchodní znaka a ABI PRISM je ochranná známka firmy Applera Corporation v USA a/nebo v jiných zemích. 6 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

7 3. Další potebné vybavení Laboratorní rukavice bez pudru DNA-izolaní souprava (viz 8.2 Izolace DNA) Pipety (nastavitelné) Sterilní pipetovací špiky s filtrem Vortex mixer Stolní centrifuga s rotorem pro 2 ml zkumavky Centrifuga s rotorem pro mikrotitraní destiky (volitelné) 96-ti jamková reakní destika/zkumavky pro optická mení s odpovídajícími optickými uzavíracími prostedky (viz 8.5 Píprava PCR) 96-ti jamkové dvojdílné pídržné rámy k použití optických zkumavek (96-Well Tray/Retainer Set, kat , Applied Biosystems), viz 8.5 Píprava PCR Kompresní podložka pro použití s optickými lepicími foliemi (Optical Cover Compression Pads, kat , Applied Biosystems), viz 8.5 Píprava PCR Aplikátor k uzavení reakních destiek pi použití optických lepicích folií (Adhesive Seal Applicator Kit, kat , Applied Biosystems) ABI PRISM 7000, 7700 nebo 7900HT SDS (Applied Biosystems) Upozornní: Pi uvedení pístroj do provozu je bezpodmínen nutná jsoucí platná kalibrace barviv (Pure Spectra Component File) a pozadí (Background Component File). Použití zkumavek k optickým mením s vypouklými víky je pípustné pouze pro ABI PRISM 7700 SDS a vyžaduje zmnu nastavení doby osvitu (viz Programování ABI PRISM 7700 SDS, Dležitá pídavná nastavení). C. trachomatis PCR Kit 03/2007 7

8 4. Všeobecná preventivní opatení Uživatel by ml dbát na následující: Používejte sterilní pipetovací špiky s filtrem. Skladujte, izolujte a pidávejte pozitivní materiál (vzorky, kontroly, amplifikáty) do reakce na jiném míst než ostatní reagencie. Všechny komponenty ped poátkem testu úpln rozmrazte pi pokojové teplot. Následn komponenty ádn promíchejte a krátce centrifugujte. Pracujte plynule na ledu nebo v chladicím bloku. 5. Informace o pvodcích Bakterie rodu Chlamydia mají celosvtov velký epidemiologický význam. Chlamydia trachomatis (sérovary D L) patí na celém svt k nejastjším pvodcm pohlavn penosných chorob (STD sexually transmitted diseases). Šestnáct sérovar C. trachomatis vyvolává rzná onemocnní: Sérovary A, B, Ba a C zpsobují trachom, chronicky recidivující onemocnní spojivek a rohovky rozšíené v tropech. Sérovary D K zpsobují pohlavn penosné urogenitální infekce a oní infekce, dále také po perinatálním penosu novorozenecké infekce. Sérovary LGV I - III zpsobují lymphogranuloma venereum, pohlavn penosnou chorobu vyskytující se pevážn v tropech. Trachom se vyskytuje tém výhradn v tropických zemích, v podmínkách s nedostatenou hygienou. Pedstavuje nejastjší oní chorobu ve svt a je po šedém zákalu druhou nejastjší píinou oslepnutí. Pedpokládá se, že je infikováno pibližn 150 milión lidí. Pibližn u šesti milión došlo k oslepnutí. V prmyslov vysplých zemích jsou chlamydie nejastjšími bakteriálními pvodci urogenitálních infekcí. V Nmecku se poet nových genitálních infekcí odhaduje na ron. Incidence lymphogranuloma venereum (Lymphogranuloma inguinale, Durand-Nicolas-Favreova choroba) celosvtov klesá. Tato pohlavn penosná choroba je však v Asii, Africe, Jižní Americe a v ástech Karibské oblasti stále ješt endemická. 8 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

9 6. Princip PCR s hodnocením v reálném ase Pi diagnostikování pomocí polymerázové etzové reakce (PCR) se amplifikují specifické oblasti genomu pvodce. Detekce probíhá pi PCR v reálném ase pomocí fluorescenních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v prbhu PCR v reálném ase umožuje prkaz a kvantifikaci produkt, aniž by bylo nutné po PCR znovu otevírat testovací zkumavky (Mackay, 2004). 7. Popis produktu C. trachomatis PCR Kit je systém k pímému použití pro prkaz C. trachomatis DNA pomocí polymerázové etzové reakce (PCR) v ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). C. trachomatis TM Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 100 bp dlouhého úseku genomu C. trachomatis. Detekce amplifikátu se provádí mením fluorescence FAM v ABI PRISM SDS. Krom toho obsahuje C. trachomatis PCR Kit druhý heterologní amplifikaní systém pro prkaz potenciální PCR inhibice. Tento systém je detekován jako Interní kontrola (IC) mením fluorescence VIC. Limit detekce analytické C. trachomatis PCR (viz 11.1 Analytická senzitivita) pitom není negativn ovlivnn. Spolu s produktem se dodávají externí pozitivní kontroly (C. trachomatis TM QS 1-4), s jejichž pomocí lze urit množství pvodce ve vzorku. Prostudujte si prosím oddíl 8.4 Kvantifikace. C. trachomatis PCR Kit 03/2007 9

10 8. Protokol 8.1 Preanalytika: Odbr, skladování a peprava vzork Upozornní: Se všemi vzorky se musí zacházet jako s potenciáln infekními. Pípustné jsou pouze následující vzorky, u kterých se musí bezpodmínen dodržovat následující pravidla a pedpisy pro odbr, skladování a pepravu: 1. Mo (ženy a muži). 2. Endocervikální a uretrální výtry a oní stry. 3. Sperma. Aby byla zaruena vysoká kvalita vzorku, ml by transport vzorku do výzkumné laboratoe probhnout co nejrychleji. Vzorky musí být pepravovány za uvedených teplotních podmínek Odbr vzork 1. Vzorky moi Pacient(ka) nesmí v pedcházejících dvou hodinách moit. Odeberte ml první porce moi do isté polypropylenové nádobky bez konzervaních inidel. Nepoužívejte vzorky moi, které byly odebrány do nádobek s konzervaními inidly. Nádobky uzavete a nadepište. Postupujte podle pedpis pro skladování a transport. 2. Výtrové vzorky Pro odbr endocervikálních a uretrálních výtrových vzork a oních str používejte prosím následující materiály: Používejte pouze výtrové tampony se špikami z Dacronu, Rayonu nebo z kalciumalginátu na násadách z plastu. Nepoužívejte výtrové tampony s devnými nebo hliníkovými násadami. Endocervikální a uretrální výtrové vzorky a oní stry mohou být odebrány a pepraveny v 1-3 ml následujících médií: 10 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

11 AMPLICOR STM (Specimen Transportmedium, Roche, Inc.) Swab Specimen Collection Kit (Digene Corporation) Cervical Sampler (Digene Corporation) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) Venturi Transystem (vhodné pro aeroby a anaeroby), sterilní transportní nádobky pro výtry (SARSTEDT AG & Co.) SPG CTM (Chlamydia Transport Medium, MicroTest, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Inc.) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ClamTrans CTM (Bartels, Inc.) Chlamydia-tampon (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation) Tampon ponechte v transportním médiu. Nádobky uzavete a nadepište. Dbejte pedpis pro pepravu a skladování. Dodržujte doporuený postup pro odbr cylindrických a plochých epitelových buek po odstranní cervikálního hlenu. 3. Vzorky spermatu Odbr vzorku by ml probhnout nejdíve dva až tyi dny po poslední ejakulaci. Vzorek spermatu musí být odebrán v ten samý den, kdy je zaslán do laboratoe. Za použití bžného laboratorního postupu mže být vzorek spermatu odebrán jedním z následujících zpsob: masturbací pímo do sterilní, isté a suché nádobky na vzorek. Ujistte se, že se do nádobky dostal celý vzorek. Došlo-li k úniku ásti vzorku, musí to být zaznamenáno do protokolu o odbru vzorku. Biosafety in Microbiological Laboratories Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) Reference: 1) Andrology Laboratory University of Utah School of Medicine ( 2) Andrology Institute of America ( C. trachomatis PCR Kit 03/

12 masturbací za použití prezervativu. Po ejakulaci kondom sejmte. Je dležité, aby byl nahoe uzaven gumikou kvli udržení vzorku spermatu uvnit prezervativu. Kondom následn vložte do transportní nádobky. Dležité: Používejte pouze nádobky bez konzervaních inidel resp. kondomy bez spermicid a umlých pídavných látek (nap. barviv). Vzorek spermatu postavte na 30 až 45 minut do temna (nap. do zásuvky nebo do skín), dokud nezkapalní. Vzorek ihned po zkapalnní zmrazte v kryozkumavce pi -20 C nebo nižší teplot Skladování vzork Výkonnost testu mže být pravidelným zmrazováním nebo delším skladováním vzork narušena. 1. Vzorky moi Bude-li rozbor moi proveden do 24 hodin, mohou být vzorky uloženy pi pokojové teplot (19-23 C). Pokud bude rozbor proveden do sedmi dn od odbru, musí být vzorky uchovávány v lednici pi 2-8 C. Vzorky moi, které nebudou zpracovány bhem sedmi dn, mohou být skladovány po dobu 30-ti dn pi -20 C nebo mén. 2. Výtrové vzorky Vzorky se skladují pi 2-8 C. (Pokud musí být výtrové vzorky do výzkumné laboratoe zaslány, musí být odeslány co nejdíve po odbru v souladu s laboratorními pedpisy pro pepravu vzork chlamydií). Výtrové vzorky, které nebudou testovány bezprostedn po doruení do laboratoe, musí být uskladnny pi 2-8 C a bhem sedmi dní zpracovány. Výtrové vzorky, které nemohou být zpracovány do sedmi dní po odbru, musí být uskladnny pi -20 C a mén a testovány do 30-ti dn po odbru. 12 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

13 3. Vzorky spermatu Vzorky se skladují pi -20 C nebo nižší teplot. Vzorky spermatu, které nebudou testovány ihned po doruení do laboratoe, musí být skladovány pi -20 C nebo nižší teplot a testovány bhem 30-ti dn po odbru Peprava vzork 1. Vzorky moi Vzorky moi, které jsou ureny k zaslání, musí být až do odeslání uloženy v lednici pi 2-8 C. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a státních pedpis pro pepravu látek vyvolávajících nákazu. 2. Výtrové vzorky Výtrové vzorky musí být pepravovány v chladu. Musí-li být výtrové vzorky do laboratoe zaslány, je nutné je odeslat co nejdíve po odbru v souladu s laboratorními pedpisy pro pepravu v chladu. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a státních pedpis pro pepravu látek vyvolávajících nákazu. 3. Vzorky spermatu Musí-li být výtrové vzorky do laboratoe zaslány, je nutné je odeslat ve stejný den, kdy byly odebrány, v souladu s laboratorními pedpisy pro pepravu vzork chlamydií. Krom toho je nutné dbát na to, aby byly vzorky spermatu zasílány v chladu. Vzorky musí být zaslány podle platných místních a státních pedpis pro pepravu látek vyvolávajících nákazu. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition, C. trachomatis PCR Kit 03/

14 8.2 Izolace DNA DNA-izolaní soupravy nabízejí rzní výrobci. V závislosti na protokolu zvoleného výrobce použijte dané množství vzorku a provete izolaci DNA podle návodu. Doporuujeme následující izolaní soupravy: Vzorek Izolaní souprava Katalogové íslo Výrobce Nosi RNA mo, výtry sperma, výtry QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) QIAamp DNA Mini Kit (50) QIAGEN obsažen QIAGEN neobsažen Užití nosie RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtžek DNA/RNA. Pokud použitá izolaní souprava neobsahuje žádný nosi RNA, povšimnte si prosím, že je pi izolaci nukleových kyselin z nebunných tlesných tekutin resp. materiál s malým obsahem DNA/RNA (nap. likvor) drazn doporueno pidat nosi RNA (RNA homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, kat. ís ). Prosím postupujte následujícím zpsobem: a) Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA v eluním pufru (nepoužívejte lyzaní pufr) izolaní soupravy (nap. AE pufr soupravy QIAamp DNA Mini Kit) a edním vytvote roztok o koncentraci 1 µg/µl. Rozdlte tento roztok nosie RNA na poet alikvot odpovídající Vaším požadavkm a skladujte je pi -20 C. Zabrate opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosie RNA. b) Používejte 1 µg nosie RNA na 100 µl lyzaního pufru. Je-li extrakním protokolem stanoveno 200 µl lyzaního pufru na jeden vzorek, vložte 2 µl nosie RNA (1 µg/µl) pímo do lyzaního pufru. Ped zaátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu erstv vytvoena sms lyzaního pufru a nosie RNA (pop. i Interní kontroly, viz 8.3 Interní kontrola): 14 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

15 Poet vzork 1 12 Lyzaní pufr nap. 200 µl nap µl Nosi RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Celkový objem 202 µl µl Objem pro izolaci 200 µl po 200 µl c) Tuto erstv vytvoenou sms lyzaního pufru a nosie RNA vložte ihned do izolace. Skladování smsi není možné. Užití nosie RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtžek DNA/RNA. Aby bylo dosaženo vyšší stability nosie RNA dodávaného s QIAamp Viral RNA Mini Kit, doporuujeme následující postup lišící se od údaj uvedených v píruce izolaní soupravy: a. Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA ped prvním použitím izolaní soupravy v 310 µl eluního pufru obsaženého v souprav (konená koncentrace 1 µg/µl, nepoužívejte lyzaní pufr). Rozdlte tento roztok nosie RNA na poet alikvot odpovídající Vaším požadavkm a skladujte je pi -20 C. Zabrate opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosie RNA. b. Ped zaátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu erstv vytvoena sms lyzaního pufru a nosie RNA (pop. i Interní kontroly, viz 8.3 Interní kontrola): Poet vzork 1 12 Lyzaní pufr AVL 560 µl µl Nosi RNA (1 µg/µl) 5,6 µl 67,2 µl Celkový objem 565,6 µl 6 787,2 µl Objem pro izolaci 560 µl po 560 µl c. Tuto erstv vytvoenou sms lyzaního pufru a nosie RNA vložte ihned do izolace. Skladování smsi není možné. C. trachomatis PCR Kit 03/

16 Z oblasti automatizovaných izolací se doporuuje následující systém: Vzorek Izolaní systém Izolaní souprava Výrobce mo, výtry ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation Pro obdržení seznamu potebných doplk a validovaného protokolu izolace kontaktujte prosím naší technickou podporu. Applied Biosystems, Foster City, U.S.A. Pi izolaci využívající promývací pufr s obsahem etanolu bezpodmínen zajistte, aby byl ped elucí proveden ješt jeden centrifuganí krok (ti minuty, ot/min) a tím se odstranily zbytky etanolu. Pedejdete tak možným inhibicím PCR. C. trachomatis PCR Kit není vhodný pro izolace na základ fenolu. Dležité: Interní kontrolu soupravy C. trachomatis PCR Kit lze vložit pímo do izolace (viz 8.3 Interní kontrola) Doporuení pro izolaci ze vzork moi a výtr pomocí QIAamp Viral RNA Mini Kit AVL pufr obsažený v QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) byl vyvinut speciáln pro inaktivaci etných inhibitor vyskytujících se v moi. Proto se výslovn doporuuje používat protokol QIAamp Viral RNA Mini Kit pro extrakci bunné, bakteriální a virové DNA z moi. Ekvilibrujte vzorky na pokojovou teplotu (19-23 C). Protože je ve vzorcích moi obsaženo asto jen velmi malé množství bakterií, ml by být zkoumaný materiál koncentrován. Za tímto úelem centrifugujte zkoumané vzorky moi (10-30 ml) po dobu minut pi x g (alternativn: 30 minut pi x g). Supernatant odlijte a provete úplnou resuspenzi peletu pomocí vortexování s intervaly (15-30 sekund) v µl 1 x PBS. Objem resuspenze závisí na vkládaném množství vzorku. Pi používání suchých tampon je prosím tepejte nejmén hodinu pi pokojové teplot v 500 µl 1 x PBS. 16 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

17 Výtrové vzorky, které jsou uchovávány v transportním médiu, musí být dkladn promíchány vortexováním. Sundejte ze zkumavek opatrn víka a dbejte na to, aby nebyly rukavice kontaminovány. Kontaminované rukavice musí být ped zpracováním dalšího vzorku vymnny za nové. Pitisknte tampon na stnu zkumavky, aby odtekla tekutina. Pípadné zbytky hlenu ve vzorku sejmte tamponem. Zbylou tekutinu hlenu v tamponu odstrate výše uvedeným zpsobem. Tampon s pípadnými zbytky hlenu odstrate a zlikvidujte. Pro izolaci DNA by mlo být použito 140 µl takto pedupraveného vzorku. Postupujte podle pokyn protokolu QIAamp Viral RNA Mini Spin (QIAamp Viral RNA Mini Kit Handbook, 01/99) od kroku 1. Bezpodmínen se ujistte, aby byl proveden volitelný centrifuganí krok 9a protokolu ( ot/min, ti minuty) k odstranní zbytk etanolu. Doporuuje se eluní objem o 60 µl Doporuení pro izolaci z výtrových vzork a vzork spermatu pomocí QIAamp DNA Mini Kit Ekvilibrujte vzorky na pokojovou teplotu (19 23 C). Výtrové vzorky, které jsou uchovávány v transportním médiu, musí být dkladn promíchány vortexováním. Sundejte ze zkumavek opatrn víka a dbejte na to, aby nebyly rukavice kontaminovány. Kontaminované rukavice musí být ped zpracováním dalšího vzorku vymnny za nové. Pitisknte tampon na stnu zkumavky, aby odtekla tekutina. Pípadné zbytky hlenu ve vzorku sejmte tamponem. Zbylou tekutinu hlenu v tamponu odstrate výše uvedeným zpsobem. Tampon s pípadnými zbytky hlenu odstrate a zlikvidujte. Bakterie peletujte centrifugací po dobu 10 minut pi x g (7 500 ot/min). C. trachomatis PCR Kit 03/

18 Bakteriální pelet resuspendujte v 180 µl ATL pufru (QIAamp DNA Mini Kit). Suché tampony pevete pímo do 1,5 ml mikrocentrifuganí zkumavky a vortexujte je spolu s 180 µl ATL pufru po dobu 15 sekund. Pro extrakci DNA ze vzork spermatu rozete prosím 60 µl vzorku s 80 µl 1 x PBS v 1,5 ml mikrocentrifuganí zkumavce. Po dkladném vortexování pipetujte prosím 100 µl zedného roztoku k 180 µl ATL pufru. Sms míchejte sekund vortexováním s intervaly. Ke vzorku pidejte 20 µl proteinázy K. Promíchejte jej vortexováním a inkubujte sms pi 56 C po dobu 1 12 hodin. Pro promíchání vzorku jej bhem inkubace píležitostn vortexujte nebo jej vložte do termomixeru. Prosím všimnte si, že musí být použita proteináza K. QIAGEN proteáza má za pítomnosti ATL pufru redukovanou aktivitu. Pi používání suchých tamponu dbejte prosím na to, aby byla tekutina z tamponu vymakána na stn zkumavky. Tampon následn odstrate a zlikvidujte. Postupujte podle Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit a QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, strana 34) od kroku 3. Bezpodmínen se ujistte, aby byl proveden volitelný centrifuganí krok 7a ( ot/min, ti minuty) protokolu k odstranní zbytk etanolu. Doporuuje se eluní objem o 50 µl AE pufru Doporuení pro izolaci z lyofilizovaných vzork pomocí QIAamp DNA Mini Kit Ekvilibrujte vzorky na pokojovou teplotu (19 23 C). Lyofilizovaný vzorek peliv resuspendujte v 500 µl 1 x PBS opatrným pootáením ruky. Vzorek následn tepejte nejmén 30 minut pi pokojové teplot, aby se úpln rozpustil. 18 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

19 Pipetujte 200 µl rozpuštného vzorku k 360 µl ATL pufru do 1,5 ml mikrocentrifuganí zkumavky a dkladn promíchejte pomocí vortexování. Ke vzorku pidejte 20 µl proteinázy K. Sms promíchejte vortexováním a inkubujte ji pi 56 C po dobu 1 12 hodin. Pro promíchání vzorku jej bhem inkubace píležitostn vortexujte nebo jej vložte do termomixeru. Prosím všimnte si, že musí být použita proteináza K. QIAGEN proteáza má za pítomnosti ATL pufru redukovanou aktivitu. Centrifugujte krátce 1,5 ml zkumavky, aby se zabránilo kížovým kontaminacím zpsobeným vystíknutím tekutiny vzorku ve vnitní ásti víka pi otevení nádobky. Ke vzorku pidejte 400 µl AL pufru, rázn jej 15 sekund promíchejte na vortexu a inkubujte po dobu 10 minut pi 70 C. Ke vzorku pidejte 400 µl etanolu ( %), a opt jej promíchejte 15 sekund na vortexu. Sms (vetn precipitátu) opatrn vložte bez pokropení horního okraje na QIAamp kolonku. Uzavete víko a centrifugujte jednu minutu pi x g (8 000 ot/min). Následn vložte QIAamp kolonku do isté 2 ml Collection Tube (obsaženo v diagnostické souprav) a použitou Collection Tube spolu s filtrátem vyhote. Tento krok opakujte vložením zbylého roztoku na kolonku. Postupujte podle Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit a QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 02/2003, strana 35) od kroku 6. Bezpodmínen se ujistte, aby byl proveden volitelný centrifuganí krok 7a protokolu ( ot/min, ti minuty) k odstranní zbytk etanolu. Doporuuje se eluní objem o 50 µl AE pufru. C. trachomatis PCR Kit 03/

20 8.3 Interní kontrola Spolu s produktem se dodává Interní kontrola (C. trachomatis TM IC). Máte tak možnost kontrolovat jak izolaci DNA, tak také možnou inhibici PCR (viz Obr. 1). Pro tuto aplikaci pidejte k izolaci Interní kontrolu v pomru 0,1 µl na 1 µl eluního objemu. Jestliže napíklad používáte QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) a eluujete DNA v 200 µl AE pufru, vložte 20 µl Interní kontroly. Jestliže nap. eluujete ve 100 µl, vložte 10 µl. Množství vkládané Interní kontroly závisí pouze na eluním objemu. Interní kontrola a nosi RNA (viz 8.2 Izolace DNA) by mly být pidávány pouze k smsi lyzaního pufru a vzorku nebo pímo k lyzanímu pufru. Interní kontrola nesmí být pidána pímo ke vzorku. Pi pidání k lyzanímu pufru se musí dbát na to, aby byla sms Interní kontroly, lyzaního pufru a nosie RNA erstv pipravena a ihned použita (skladování smsi pi pokojové teplot nebo v lednici mže již po nkolika hodinách vést k vynechání Interní kontroly a ke snížení efektivity izolace). Interní kontrolu a nosi RNA nepipetujte pímo do vzorku. Aby byla izolace hodnocena jako úspšná, musí Ct hodnota Interní kontroly na ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT SDS ležet u Ct = 22 ± 3 (threshold: 0,05). Uvedená variabilita maximáln tí Ct hodnot je podmínná pístrojovou variabilitou a variabilitou izolace. Vtší odchylka poukazuje na problémy s izolací. V tomto pípad musí být izolace pezkoušena a popípad nov validována. Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy, kontaktujte prosím naší technickou podporu. Voliteln lze Interní kontrolu použít výhradn ke kontrole možné inhibice PCR (viz Obr. 2). V tomto pípad pidejte 0,5 µl Interní kontroly na jednu testovací sms pímo do 15 µl C. trachomatis TM Master. Pro každou PCR reakci použijte 15 µl takto vytvoeného Master Mixu a pidejte následn 10 µl Zvýšení objemu podmínné pidáním Interní kontroly je pi píprav PCR reakce opominuto. Senzitivita není omezena. 20 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

21 izolátu. Jestliže pipravujete jeden bh pro více vzork, zvyšte potebná množství C. trachomatis TM Master a Interní kontroly podle potu vzork (viz 8.5 Píprava PCR). 8.4 Kvantifikace S Kvantifikaními standardy (C. trachomatis TM QS 1-4) dodávanými spolu s produktem se zachází stejn jako s již izolovanými vzorky a pidávají se ve stejném objemu (10 µl). Standardní kivku v ABI PRISM Sequence Detection System vytvoíte tak, že vložíte všechny tyi Kvantifikaní standardy dodávané s produktem a definujete je jako standardy pi zadání odpovídajících koncentrací (viz 8.6 Programování ABI PRISM SDS). Import standardních kivek z pedchozích bh není se softwarem ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT SDS možný. Upozornní: Kvantifikaní standardy jsou definovány jako kopie/µl. Pro pepoet hodnot získaných pomocí standardní kivky na kopie/ml vzorku se používá následující vzorec: výsledek (kopie/ml) = výsledek (kopie/µl) x eluní objem (µl) objem vzorku (ml) Prosím povšimnte si, že se do výše uvedeného vzorce dosazuje zásadn pvodní objem vzorku. Toto se musí zohlednit, byl-li objem vzorku ped izolací nukleových kyselin pozmnn (nap. redukce objemu centrifugací nebo jeho zvýšení naplnním na objem požadovaný pro izolaci). Dležité: Na je k dispozici píruka pro zjednodušení kvantitativního vyhodnocení systém na ABI PRISM 7000 SDS (Technical Note for quantitation on the ABI PRISM 7000 SDS). C. trachomatis PCR Kit 03/

22 8.5 Píprava PCR Pipravte pro plánované reakce potebný poet zkumavek resp. 96-ti jamkovou reakní destiku. Doporuené prostedky jsou uvedeny v následující tabulce: Položka Oznaení Katalogové íslo Výrobce Pídržné rámy Kompresní podložka 96-ti jamková optická reakní destika 96-Well Optical Reaction Plate Applied Biosystems ne - Optické lepicí folie Optical Adhesive Covers Applied Biosystems - ano Optické zkumavky ABI PRISM Optical Tubes, 8 Tubes/Strip Applied Biosystems ano - Optické zkumavky MicroAmp Optical Tubes N Applied Biosystems ano - Optická víka (plochá) ABI PRISM Optical Caps, 8 Caps/Strip Applied Biosystems - ne Upozornní: Použití zkumavek k optickým mením s vypouklými víky je pípustné pouze pro pístroj ABI PRISM 7700 SDS a vyžaduje zmnu nastavení doby osvitu (viz Programování ABI PRISM 7700 SDS, Dležitá pídavná nastavení). Pi píprav PCR dbejte na to, aby byl spolen s každým bhem PCR proveden alespo jeden Kvantifikaní standard a jedna negativní kontrola (Water, PCR grade). Standardní kivku vytvoíte u každého bhu PCR pomocí všech spolu s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4). Všechny reagencie se musí ped zaátkem testu zcela rozmrazit pi pokojové teplot, musí být dobe promíchány (opakovaný nábr pipetou a vypuštní pipety nebo krátký vortex) a následn centrifugovány. Pi použití dvojdílných pídržných rám je nutné zkumavky pi vkládání a pi vyjímání otevít. K zamezení tím zapíinných kontaminací používejte výhradn dolní díl pídržného rámu. 22 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

23 Chcete-li Interní kontrolou kontrolovat jak izolaci DNA, tak možnou inhibici PCR, musí být naped Interní kontrola pidána k izolaci (viz 8.3 Interní kontrola). V tomto pípad používejte následující schéma pipetování (viz také schématický pehled na Obr. 1): 1. Píprava Master Mixu 2. Píprava PCR reakce Poet vzork 1 12 C. trachomatis TM Master 15 µl 180 µl C. trachomatis TM IC 0 µl 0 µl celkový objem 15 µl 180 µl Master Mix 15 µl po 15 µl vzorek 10 µl po 10 µl celkový objem 25 µl po 25 µl Jestliže chcete Interní kontrolu použít výhradn ke kontrole PCR inhibice, je teba ji pidat pímo do C. trachomatis TM Master. V tomto pípad používejte následující schéma pipetování (viz také schématický pehled na Obr. 2): 1. Píprava Master Mixu 2. Píprava PCR reakce Poet vzork 1 12 C. trachomatis TM Master 15 µl 180 µl C. trachomatis TM IC 0,5 µl 6 µl celkový objem 15,5 µl 186 µl Master Mix 15 µl po 15 µl vzorek 10 µl po 10 µl celkový objem 25 µl po 25 µl Pipetujte do každé zkumavky nebo do každé potebné jamky 96-ti jamkové reakní destiky 15 µl Master Mixu. Následn pidejte 10 µl eluátu z izolace DNA. Dbejte na to, aby byly oba roztoky dobe promíchány opakovaným nábrem pipetou a jejím vypuštním. Uzavete zkumavky píslušnými víky. 96-ti jamkovou reakní destiku mžete alternativn uzavít pomocí optických lepicích folií (Optical Adhesive Covers, Applied Biosystems). Pro shromáždní vkládaného objemu na dn zkumavek nebo destiek centrifugujte zkumavky (v držáku ureném pro zkumavky PCR) pop. 96-ti jamkovou reakní destiku Zvýšení objemu podmínné pidáním Interní kontroly je pi píprav PCR reakce opominuto. Senzitivita detekního systému není omezena. C. trachomatis PCR Kit 03/

24 v centrifuze vybavené rotorem pro mikrotitraní desky po dobu 30 sekund pi x g (4 000 ot/min). Pokud takovou centrifugu nemáte k dispozici, dbejte pi píprav reakcí PCR na to, aby byly Master Mix a objem vzorku pipetovány na dno zkumavek pop. reakních jednotek (well). Reakní smsi skladujte pi teplot +4 C, dokud nebude pístroj ABI PRISM SDS naprogramován (viz 8.6 Programování ABI PRISM SDS) a pak je pevete do pístroje. Upozornní: Pi použití optických zkumavek v kombinaci s optickými víky vkládejte do pístroje (ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT SDS) vždy pídržný rám (96-Well Tray/Retainer Set, Applied Biosystems). Pi použití dvojdílného pídržného rámu je nutné zkumavky pi vkládání a pi vyjímání otevít. K zamezení tím zapíinných kontaminací používejte výhradn dolní díl pídržného rámu. Použití 96-ti jamkových optických reakních destiek v kombinaci s optickými lepicími foliemi vyžaduje vložení kompresní podložky (Optical Cover Compression Pads, Applied Biosystems). 24 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

25 Pidání Interní kontroly k izolaci Izolace sms lyzaního pufru a vzorku + 0,1 µl IC* na 1 µl eluního objemu 10 µl izolátu* 15 µl Master* Optická reakní destika/ optické zkumavky ABI PRISM SDS Obr. 1: Schéma pracovního postupu pro kontrolu izolace a inhibice PCR. * Pi každém pipetovacím kroku je teba bezpodmínen dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované. C. trachomatis PCR Kit 03/

26 Pidání Interní kontroly k Master 0,5 µl IC* 15 µl Master* Izolace 15,5 µl Master Mix* 10 µl izolátu* 15 µl Master Mix* Optická reakní destika/ optické zkumavky ABI PRISM SDS Obr. 2: Schéma pracovního postupu pro kontrolu inhibice PCR. * Pi každém pipetovacím kroku je teba bezpodmínen dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované. 26 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

27 8.6 Programování ABI PRISM SDS Software ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection Systems (SDS) potebuje ped spuštním bhu PCR dodatené informace. Postupy pi programování pístroj se od sebe významn odlišují, proto jsou v následujícím textu uvedeny v samostatných kapitolách Programování ABI PRISM 7000 SDS K detekci C. trachomatis DNA vytvote na pístroji ABI PRISM 7000 SDS profil podle následujících šesti pracovních krok ( ). Veškeré údaje se vztahují na ABI PRISM 7000 SDS software verzi Podrobnosti o programování ABI PRISM 7000 SDS si prosím prostudujte v píruce ABI PRISM 7000 SDS User Guide. Pro lepší pehled jsou potebná nastavení na obrázcích zvýraznna ernými rámeky Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Na pístroji ABI PRISM 7000 SDS vyberte pod File položku New a nastavte pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 3). Díve uložená šablona (SDS Template [*.sdt]) je k dispozici v seznamu Template nebo volbou funkce Browse (viz Uložení bhu PCR). Svá zadání potvrte (OK). Obr. 3: Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR (New Document). C. trachomatis PCR Kit 03/

28 Vytvoení/volba detektor V nabídce Tools, v podnabídce Detector Manager, piate dokumentu odpovídající barviva detektoru. K prkazu C. trachomatis DNA a Interní kontroly pomocí C. trachomatis PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher uvedené v následující tabulce: Prkaz Reporter Quencher C. trachomatis DNA FAM TAMRA Interní kontrola (C. trachomatis TM IC) VIC none Tyto detektory vytvoíte tak, že vyberete v položce Detector Manager vlevo dole lokalizovanou volbu File a následn volbu New. Obr. 4: Vytvoení detektoru specifického pro C. trachomatis (Detector Manager). Obr. 5: Vytvoení detektoru specifického pro Interní kontrolu (Detector Manager). V okn, které se zobrazí, definujte (podle Obr. 4 a Obr. 5) kombinaci reporter/quencher FAM/TAMRA pro prkaz C. trachomatis DNA, pro prkaz Interní kontroly zvolte kombinaci VIC/none. Potvrzením údaj (OK) se vrátíte zpt do Detector Manager. Oznate práv vytvoené detektory a každý výbr peneste klepnutím na volbu Add to Plate Document do Well Inspector (viz Obr. 6). Zavete okno (Done). 28 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

29 Obr. 6: Výbr detektor (Detector Manager) Piazení potebných informací k pozicím destiek Pokud nyní v nabídce View otevete položku Well Inspector, naleznete tam Vámi v kapitole zvolené detektory znovu (viz Obr. 7). Obr. 7: Piazení potebných informací k pozicím destiek (Well Inspector). Oznate pozice destiky, které jsou obsazené pro prkaz C. trachomatis DNA. Aktivujte volbu Use u obou detektor, ímž vybrané detektory piadíte k oznaeným pozicím. Objeví se zatržítko. Pro pojmenování jednotlivých reakních smsí vyberte odpovídající pozici na destice a zadejte název do položky Sample Name. Pitom pamatujte na to, že smsi se stejným Sample Name a stejným piazením detektor bude software považovat za replikáty a zprmruje je s ohledem na jejich kvantifikované množství pvodce. Pak C. trachomatis PCR Kit 03/

30 vyberte pro každý typ vzorku odpovídající funkci (Task) podle následující tabulky: Typ vzorku Funkce (Task) Koncentrace (Quantity) Reporter Quencher vzorek Unknown - FAM TAMRA negativní kontrola NTC - FAM TAMRA standard Standard viz 1.Obsah FAM TAMRA Standardní kivku vytvote u každého bhu PCR pomocí všech spolu s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4) a pro každý jednotlivý standard (Quantity) uvete píslušné koncentrace (viz 1. Obsah). Dbejte na to, že pro bh PCR s C. trachomatis PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní reference (Passive Reference). Rovnomrné rozložení barviva ROX na všechny smsi PCR jedné šarže pomocí promíchání C. trachomatis TM Master zaruuje rozpoznání a pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými smsmi PCR) pomocí Sequence Detection Software (normalizace) Vytvoení teplotního profilu K zadání teplotního profilu pepnte software z režimu Setup do režimu Instrument. Podle Obr. 8 zadejte platný teplotní profil pro detekci C. trachomatis DNA. Krok 50 C uložený v pedvoleném nastavení odstraníte tak, že jej oznaíte levým tlaítkem myši, piemž pidržíte stisknuté tlaítko Shift, a následn jej vymažete tlaítkem Backspace. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 25 µl. Volba 9600 Emulation by mla být aktivována. Pedvolená nastavení Auto Incrementu zstávají nezmnná (Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 30 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

31 Obr. 8: Vytvoení teplotního profilu Uložení bhu PCR Na tomto míst mžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je pozdji mohli použít ve zmnném nebo nezmnném stavu. Uložíte-li nastavení jako SDS Template (*.sdt) v adresái Template Directory (místní disk [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates, zavedeného Applied Biosystems), mžete tento soubor zvolit pímo z Template drop-down seznamu v okn New Document. Pedlohy uložené v jiných adresáích musí být oteveny pomocí funkce Browse. Ped spuštním bhu PCR dbejte prosím na to, abyste jej znovu uložili jako SDS Document (*.sds). Tím zajistíte ukládání dat nahromadných v prbhu PCR Spuštní bhu PCR Bh PCR spuste volbou Start v položce nabídky Instrument nebo polem Start v režimu Instrument. C. trachomatis PCR Kit 03/

32 8.6.2 Programování ABI PRISM 7700 SDS K detekci C. trachomatis DNA vytvote na pístroji ABI PRISM 7700 SDS profil podle následujících sedmi pracovních krok ( ). Veškeré údaje se vztahují na ABI PRISM 7700 SDS software verzi Podrobnosti o programování ABI PRISM 7700 SDS si prosím prostudujte v píruce ABI PRISM 7700 SDS User`s Manual. Pro lepší pehled jsou potebná nastavení na obrázcích zvýraznna ernými rámeky Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Na pístroji ABI PRISM 7700 SDS vyberte pod File položku New Plate a nastavte pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 9). Svá zadání potvrte (OK). Obr. 9: Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR (New Plate) Volba fluorescenního barviva a piazení typu vzorku Pomocí položky Sample Type Setup (režim Setup: Sample Type/Sample Type Setup) piate dokumentu odpovídající barviva detektoru a odpovídající typ vzorku. K prkazu C. trachomatis DNA a Interní kontroly pomocí C. trachomatis PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher uvedené v následující tabulce: 32 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

33 Prkaz Reporter Quencher C. trachomatis DNA FAM TAMRA Interní kontrola (C. trachomatis TM IC) VIC TAMRA Pro mení C. trachomatis DNA pomocí C. trachomatis PCR Kit vyberte podle tabulky barvivo reporteru FAM. To platí pro standardy (STND), vzorky (UNKN) a pro negativní kontroly (UNKN). K mení Interní kontroly (IPC+) definujte VIC jako reporter. Jako quencher nastavte TAMRA. Piazení barviv a typ vzork v okn Sample Type Setup je zobrazeno na Obr. 10. Obr. 10: Volba fluorescenních barviv a piazení typu vzorku (Sample Type Setup). Piazení typu vzorku k odpovídající funkci (Acronym) se provádí podle následující tabulky: Typ vzorku Funkce (Acronym) Koncentrace (Quantity) Reporter Quencher vzorek UNKN - FAM TAMRA negativní kontrola UNKN - FAM TAMRA standard STND viz 1. Obsah FAM TAMRA C. trachomatis PCR Kit 03/

34 Piazení potebných informací k pozicím destiek Pro piazení detektor a typ vzork k jednotlivým pozicím destiek zvolte odpovídající pole. Pak otevete v režimu Setup dialogové okno Dye Layer a piate píslušný reporter. Aktivujete-li pop-up menu Sample Type, tak v zobrazeném seznamu znovu naleznete typy vzork piazené reporteru v Sample Type Setup (viz Obr. 11). Vyberte vhodný typ vzorku (viz tabulka v ) a urete pomocí Dye Layer a nabídky Sample Type piazení ke zbývajícím pozicím destiky. V poli Sample Name lze každému vzorku piadit jméno. Pole definovaná jako Replicate (zadání názvu kontrolního vzorku do kolonky Replicate) zprmruje software vzhledem k jejich kvantifikovanému množství pvodce a vypoítá jejich standardní odchylku. Obr. 11/12: Piazení potebných informací k pozicím destiek. Standardní kivku vytvote u každého bhu PCR pomocí všech s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4) a pro každý jednotlivý standard (Quantity, viz Obr. 12) uvete píslušné koncentrace (viz 1. Obsah). To je však možné pouze tehdy, jestliže pozice obsazené standardy byly pedem jako takové definovány pomocí nabídky Sample Type Vytvoení teplotního profilu K zadání teplotního profilu pepnte na nabídku Thermal Cycler Conditions na ploše Setup. Podle Obr. 13 zadejte pro detekci C. trachomatis DNA platný teplotní profil. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 25 µl. Pedvolená nastavení as Ramp a Auto Increment zstávají nezmnná (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 34 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

35 Obr. 13: Vytvoení teplotního profilu. Krom toho se v nabídce Thermal Cycler Conditions nachází volba Show Data Collection. Zvolením této volby se dostanete do okna zobrazeného na Obr. 14. Každá Ramp a Plateau teplota je opatena symbolem sbru dat (Data Collection Icon), který znázoruje pijetí dat v tomto uritém okamžiku bhu. Klepnutím odstrate všechny symboly až na ten ve chvíli kroku Annealing-Extension (Stage2/Step2), ímž ušetíte zbytená fluorescenní mení. Tak udržíte celkovou dobu bhu a množství dat co nejnižší. C. trachomatis PCR Kit 03/

36 Obr. 14: Sbr dat (Data Collection) Dležitá pídavná nastavení K nastavení doby osvitu (vybuzení fluorescenního barviva) a také pro volbu soubor Pure Spectra a Background pejdte z režimu Setup na režim Analysis. V nabídce Instrument, v podnabídce Diagnostics, zvolte nyní aktivovanou položku Advanced Options. Provete nastavení podle Obr. 15. Deaktivací funkce výbru Spectra Components (Analysis) se pi novém vyhodnocování již analyzovaných bh automaticky použijí aktuální kalibraní data, která byla do složky Spectra Components uložena ve chvíli vytváení dat. Pro analýzu starších bh za použití nov natených Spectra Components aktivujte prosím ob tato pole. Dbejte na to, že pro bh PCR s C. trachomatis PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní reference (Reference). Rovnomrné rozložení barviva ROX na všechny reakní smsi PCR jedné šarže pomocí promíchání C. trachomatis TM Master zaruuje rozpoznání a pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými reakními smsmi PCR) pomocí Sequence Detection Software (normalizace). 36 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

37 Upozornní: Doba osvitu (Exposure Time) pi použití 96-ti jamkových reakních destiek pro optická mení ve spojení s optickými lepicími foliemi (Optical Adhesive Covers) nebo optickými zkumavkami s plochými víky je deset milisekund. Používáte-li optické zkumavky s vypouklými víky, nastavte tento asový údaj na 25 milisekund. Obr. 15: Dležitá pídavná nastavení (Advanced Options) Uložení bhu PCR Na tomto míst mžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je mohli pozdji použít ve zmnném nebo nezmnném stavu. Proto uložte tento soubor ve Stationary File Format. Ped spuštním aktuáln programovaného bhu PCR pamatujte na to, že jej musíte znovu uložit ve Normal File Format. Tím zajistíte uložení dat nahromadných v prbhu PCR. C. trachomatis PCR Kit 03/

38 Spuštní bhu PCR Bh PCR spuste volbou Run v položce nabídky Instrument nebo polem Run v režimu Analysis. 38 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

39 8.6.3 Programování ABI PRISM 7900HT SDS K detekci C. trachomatis DNA vytvote na pístroji ABI PRISM 7900HT SDS profil podle následujících šesti pracovních krok ( ). Veškeré údaje se vztahují na ABI PRISM 7900HT SDS software verzi 2.1. Podrobnosti o programování ABI PRISM 7900HT SDS si prosím prostudujte v píruce ABI PRISM 7900HT SDS User Guide. Pro lepší pehled jsou potebná nastavení na obrázcích zvýraznna ernými rámeky Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Na pístroji ABI PRISM 7900HT SDS vyberte pod File položku New a nastavte pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 16). Díve uložená šablona (ABI PRISM SDS Template Document [*.sdt]) je k dispozici v seznamu Template nebo volbou funkce Browse (viz Uložení bhu PCR). Svá zadání potvrte (OK). Upozornní: C. trachomatis PCR Kit nelze použít ve spojení s 384 formátem destiek ABI PRISM 7900HT SDS. Obr. 16: Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR (New Document). C. trachomatis PCR Kit 03/

40 Vytvoení/volba detektor V nabídce Tools, v podnabídce Detector Manager, (alternativn zvolte režim Setup/funkci Add Detector) piate dokumentu odpovídající barviva detektor. K prkazu C. trachomatis DNA a Interní kontroly pomocí C. trachomatis PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher uvedené v následující tabulce: Prkaz Reporter Quencher C. trachomatis DNA FAM TAMRA Interní kontrola (C. trachomatis TM IC) VIC Non Fluorescent Tyto detektory vytvoíte tak, že vyberete v položce Detector Manager vlevo dole lokalizovanou volbu New. Obr. 17: Vytvoení detektoru specifického pro C. trachomatis (Detector Manager). Obr. 18: Vytvoení detektoru specifického pro Interní kontrolu (Detector Manager). V okn, které se zobrazí, definujte (podle Obr. 17 a Obr. 18) kombinaci reporter/quencher FAM/TAMRA pro prkaz C. trachomatis DNA, pro prkaz Interní kontroly vyberte kombinaci VIC/Non Fluorescent. Potvrzením údaj (OK) se vrátíte zpt do Detector Manager. Oznate práv vytvoené detektory a každý výbr peneste klepnutím na volbu Copy to Plate Document do režimu Setup (viz Obr. 19). Zavete okno (Done). 40 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

41 Obr. 19: Výbr detektor (Detector Manager) Piazení potebných informací k pozicím destiek Vámi v kapitole zvolené detektory naleznete znovu po uzavení Detector Manager (Done) seazené v tabulce v režimu Setup (Well Inspector) (viz Obr. 20). Obr. 20: Piazení potebných informací k pozicím destiek. Oznate pozice destiky, které jsou obsazené pro prkaz C. trachomatis DNA. Aktivujte volbu Use u obou detektor, ímž vybrané detektory piadíte k oznaeným pozicím. Objeví se kížek. Pro pojmenování jednotlivých reakních smsí zvolte odpovídající pozici na destice a zadejte název do položky Sample Name. Pitom pamatujte na to, že smsi se stejným Sample Name a stejným piazením detektor bude software považovat za replikáty a zprmruje je s ohledem na jejich kvantifikované množství pvodce. Pak vyberte pro každý typ vzorku odpovídající funkci (Task) podle následující tabulky: C. trachomatis PCR Kit 03/

42 Typ vzorku Funkce (Task) Koncentrace (Quantity) Reporter Quencher vzorek Unknown - FAM TAMRA negativní kontrola NTC - FAM TAMRA standard Standard viz 1. Obsah FAM TAMRA Standardní kivku vytvote u každého bhu PCR pomocí všech s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4) a pro každý jednotlivý standard (Quantity) uvete píslušné koncentrace (viz 1. Obsah). Dbejte na to, že pro bh PCR s C. trachomatis PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní reference (Passive Reference). Rovnomrné rozložení barviva ROX na všechny smsi PCR jedné šarže pomocí promíchání C. trachomatis TM Master zaruuje rozpoznání a pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými smsmi PCR) pomocí Sequence Detection Software (normalizace) Vytvoení teplotního profilu K zadání teplotního profilu pepnte software z režimu Setup do režimu Instrument. Podle Obr. 21 zadejte pro detekci C. trachomatis DNA platný teplotní profil. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 25 µl. Volba 9600 Emulation by mla být aktivována, pedvolená nastavení asu Ramp a Auto Increment zstávají nezmnna (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 42 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

43 Obr. 21: Vytvoení teplotního profilu. Krom toho se v režimu Instrument nachází volba Data Collection. Zvolením této volby se dostanete do okna zobrazeného na Obr. 22. Každá Ramp a Plateau teplota je opatena jedním symbolem sbru dat (Data Collection Icon), který znázoruje pijetí dat v tomto uritém okamžiku bhu. Odstrate všechny symboly až na ten ve chvíli kroku Annealing-Extension (Stage2/Step2), ímž ušetíte zbytená fluorescenní mení. Tak udržíte celkovou dobu bhu a množství dat co nejnižší. C. trachomatis PCR Kit 03/

44 Obr. 22: Sbr dat (Data Collection) Uložení bhu PCR Na tomto míst mžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je mohli pozdji použít ve zmnném nebo nezmnném stavu. Uložíte-li nastavení jako ABI PRISM SDS Template Document (*.sdt) v adresái Template Directory ([D:]\Program Files\ Applied Biosystems\ SDS 2.1\ Templates, zavedeném Applied Biosystems), mžete tento soubor zvolit pímo z Template seznamu v okn New Document. Pedlohy uložené v jiných adresáích musí být oteveny pomocí funkce Browse. Ped spuštním aktuálního bhu PCR dbejte prosím na to, abyste jej znovu uložili jako ABI PRISM SDS Document (*.sds). Tím zajistíte ukládání dat nahromadných v prbhu PCR Spuštní bhu PCR Bh PCR spuste volbou Start v položce nabídky Instrument. 44 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

45 9. Vyhodnocení Pi uvedení pístroje do provozu je bezpodmínen nutná jsoucí platná kalibrace barviv (Pure Spectra Component File) a pozadí (Background Component File). Tyto kalibraní soubory slouží následujícím zpsobem pro pesný výpoet výsledk: Veškeré pístrojem podmínné rušivé signály, které ovlivují mení, jsou eliminovány programem Sequence Detection Software pístroj ABI PRISM Sequence Detection Systems za pomoci Background Component File. Navíc se u vícebarevných analýz vyskytují mezi emisními spektry jednotlivých fluorescenních barviv interference. Software ABI PRISM SDS kompenzuje tyto interference pepoítáním pomocí spektrálních dat jednotlivých barviv uložených v Pure Spectra Component File. Piazení fluorescenních dat shromáždných v prbhu PCR v celém mitelném spektru k naprogramovaným detektorm provádí software také pomocí souboru Pure Spectra Component. Následn se zjištná fluorescenní data jednotlivých barviv rozdlí pro pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými reakními smsmi PCR) pomocí signálu pasivní reference (ROX). Tímto zpsobem normalizované signály lze vyhodnotit pomocí Amplification Plot. Kalibraní soubory použité pi vyhodnocení bhu PCR jsou automaticky zajištny pi ukládání dat. Pokud nejsou instalovány žádné kalibraní soubory, vytvote tyto soubory podle pokyn v ABI PRISM SDS User Guide/Manual. Pokud do bhu PCR integrujete více než jeden systém PCR (dbejte na teplotní profil), analyzujte prosím tyto testovací systémy oddlen. Vzorky s totožným oznaením (Sample Name) a piazením detektoru identifikuje ABI PRISM 7000 a 7900HT SDS Software automaticky jako replikáty a zprmruje je s ohledem na kvantifikované množství pvodce. C. trachomatis PCR Kit 03/

46 Mže dojít k následujícím výsledkm: 1. Je detekován fluorescenní signál FAM. Výsledek analýzy je pozitivní: Vzorek obsahuje C. trachomatis DNA. V tomto pípad je detekce fluorescenního signálu VIC (Interní kontrola) podružná, protože vysoké výchozí koncentrace C. trachomatis DNA (pozitivní fluorescenní signál FAM) mohou vést k redukovanému až chybjícímu fluorescennímu signálu Interní kontroly (kompetice). Pokud se po cyklu 40 objeví pozitivní signál, doporuuje se PCR zopakovat. Pi opakovan pozitivním výsledku se vzorek považuje za pozitivní. Pi negativním výsledku nelze uinit žádný jednoznaný závr. V tomto pípad se doporuuje nová izolace. 2. Není detekován žádný fluorescenní signál FAM, nýbrž pouze fluorescenní signál VIC (signál Interní kontroly). Ve vzorku není prokazatelná žádná C. trachomatis DNA. Lze jej proto považovat za negativní. Pi negativní C. trachomatis PCR vyluuje detekovaný signál Interní kontroly možnost inhibice PCR. 3. Není detekován ani fluorescenní signál FAM, ani fluorescenní signál VIC. Není možné uinit diagnostický závr. Pokyny týkající se zdroj chyb a jejich odstranní jsou uvedeny v kapitole 10. ešení problém. Píklady pozitivních a negativních reakcí PCR jsou uvedeny na obrázcích 23/24 (ABI PRISM 7000 SDS), 25/26 (ABI PRISM 7700 SDS) a 27/28 (ABI PRISM 7900HT SDS). 46 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

47 Obr. 23: Prkaz Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu FAM (ABI PRISM 7000 SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 24: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7000 SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativní kontrola). C. trachomatis PCR Kit 03/

48 Obr. 25: Prkaz Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu FAM (ABI PRISM 7700 SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 26: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7700 SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativní kontrola). 48 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

49 Obr. 27: Prkaz Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu FAM (ABI PRISM 7900HT SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 28: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7900HT SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (C. trachomatis TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativní kontrola). C. trachomatis PCR Kit 03/

50 10. ešení problém Žádný fluorescenní signál FAM pi pozitivních kontrolách (C. trachomatis TM QS 1-4): Volba barviva detektoru pi analýze dat PCR neodpovídá protokolu. K analýze dat zvolte barvivo detektoru FAM pro analytickou C. trachomatis PCR a barvivo detektoru VIC pro PCR Interní kontroly. Nastavení uvedená v položce Options k vyhodnocení získaných dat (Extension Phase Data Extraction) se neshodují s nastaveními Data Collection (viz ABI PRISM 7700 SDS, Vytvoení teplotního profilu). Analyzujte bh PCR s opraveným nastavením a zopakujte vyhodnocení (Analysis). Naprogramování teplotního profilu ABI PRISM Sequence Detection Systems je chybné. Porovnejte teplotní profil s údaji protokolu (viz 8.6 Programování ABI PRISM SDS). PCR reakce byla chybn sestavena. Porovnejte Vaše pracovní kroky s pipetovacím schématem (viz 8.5 Píprava PCR) a pop. PCR zopakujte. Podmínky skladování jednoho nebo více komponent soupravy neodpovídají pedpism uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla pekroena doba použitelnosti soupravy C. trachomatis PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop. novou soupravu. Slabý nebo chybjící signál Interní kontroly (fluorescenní signál VIC; odchylka vtší než Ct = 22 3; threshold: 0,05) pi souasné nepítomnosti fluorescenního signálu FAM specifické C. trachomatis PCR: Podmínky PCR neodpovídají protokolu. Zkontrolujte podmínky PCR (viz výše) a pop. PCR zopakujte s opraveným nastavením. PCR byla inhibována. 50 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

51 Ujistte se, že používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.2 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Pesvdte se, že byl pi izolaci DNA ped elucí proveden dodatený doporuený centrifuganí krok k úplnému odstranní zbytk etanolu (viz 8.2 Izolace DNA). Bhem izolace dochází k úbytku DNA. Byla-li k izolaci pidána Interní kontrola, mže nepítomnost signálu Interní kontroly znamenat úbytek DNA bhem izolace. Ujistte se, že používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.2 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Podmínky skladování jednoho nebo více komponent soupravy neodpovídají pedpism uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla pekroena doba použitelnosti soupravy C. trachomatis PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop. novou soupravu. Fluorescenní signál FAM analytické PCR pi negativních kontrolách. Bhem pípravy PCR došlo ke kontaminaci. Zopakujte PCR v replikátech s novými reagenciemi. Uzavete jednotlivé PCR zkumavky pokud možno ihned po vložení zkoumaného vzorku. Pipetujte pozitivní kontroly zásadn jako poslední. Ujistte se, že jsou pracovní plochy a pístroje pravideln dekontaminovány. Bhem izolace dochází ke kontaminaci. Zopakujte izolaci a PCR zkoumaných vzork za užití nových reagencií. Ujistte se, že jsou pracovní plochy a pístroje pravideln dekontaminovány. Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy, kontaktujte prosím naší technickou podporu. C. trachomatis PCR Kit 03/

52 11. Specifikace 11.1 Analytická senzitivita Pro zjištní analytické senzitivity C. trachomatis PCR Kit byla vytvoena ada ední standard od 100 do nomináln 0,0625 C. trachomatis-ekvivalent kopie /µl. Ta byla následn analyzována za použití C. trachomatis PCR Kit s ABI PRISM 7000, 7700 a 7900HT Sequence Detection Systems. Experimenty byly pro každý pístroj provedeny ve tech rzných dnech formou osminásobných urení. Výsledky byly zjištny probitovou analýzou. Jejich grafické vyhodnocení (ABI PRISM 7000 SDS) je zobrazeno na Obr. 29. Limit detekce (p = 0,05) ABI PRISM 7000 SDS 0,3 kopií/µl ABI PRISM 7700 SDS 0,2 kopií/µl ABI PRISM 7900HT SDS 0,2 kopií/µl To znamená, že je s 95 % pravdpodobností detekováno 0,3 kopií/µl (ABI PRISM 7000 SDS), 0,2 kopií/µl (ABI PRISM 7700 SDS) resp. 0,2 kopií/µl (ABI PRISM 7900HT SDS). U zde použitého standardu se jedná o klonovaný PCR produkt, jehož koncentrace byla zjištna spektrální a fluorescenní fotometrií. 52 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

53 Probitová analýza: Chlamydia trachomatis (ABI PRISM 7000 SDS) Obr. 29: Analytická senzitivita C. trachomatis PCR Kit (ABI PRISM 7000 SDS). C. trachomatis PCR Kit 03/

54 11.2 Specificita Specificita C. trachomatis PCR Kit je v první ad zaruena výbrem primer a sond, jakož i volbou písných reakních podmínek. Primery a sondy byly na základ sekvenní analýzy pezkoušeny na eventuální homologie se všemi sekvencemi publikovanými v genových bankách. Detekovatelnost všech sérovar byla zajištna jak pomocí alignmentu databáze, tak pomocí PCR na ABI PRISM 7000 SDS s následujícími sérovary (viz Tabulka 1): Tabulka 1: Testování specificity sérovar. Chlamydia Sérovary Zdroj C. trachomatis (FAM) Interní kontrola (VIC) C. trachomatis A ATCC VR-571B + + C. trachomatis B ATCC VR C. trachomatis Ba ATCC VR-347 (prep 1) + + C. trachomatis C ATCC VR C. trachomatis D ATCC VR C. trachomatis E ATCC VR-348B + + C. trachomatis F ATCC VR C. trachomatis G ATCC VR C. trachomatis H ATCC VR-879B + + C. trachomatis I ATCC VR C. trachomatis J ATCC VR C. trachomatis K ATCC VR C. trachomatis LGV I ATCC VR-901B + + C. trachomatis LGV II ATCC VR-902B + + C. trachomatis LGV II ATCC VR C. trachomatis LGV III ATCC VR ATCC: American Type Culture Collection Validace specificity byla provedena na 100 rzných C. trachomatis negativních vzorcích moi a 30 negativních výtrových vzorcích, které spolu s C. trachomatis specifickými primery a sondami obsaženými v C. trachomatis TM Master negenerovaly žádný signál. 54 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

55 K urení specificity C. trachomatis PCR Kit byla kontrolní skupina uvedená v Tabulce 2 testována na kížovou reaktivitu. Žádný z testovaných pvodc nebyl reaktivní. Tabulka 2: Testování specificity diagnostické soupravy pomocí potenciáln kížov reaktivních pvodc. Kontrolní skupina C. trachomatis (FAM) Interní kontrola (VIC) Salmonella typhimurium - + Staphylococcus aureus - + Peptostreptococcus productus - + Neisseria gonorrhoeae - + Acinetobacter spp. - + Escherichia coli - + Klebsiella pneumoniae - + Gardnerella vaginalis - + Streptococcus agalactiae - + Streptococcus pyogenes - + Proteus mirabilis - + Haemophilus influenzae - + Herpes simplex virus1 a Candida albicans - + Candida glabrata - + Chlamydia psittaci - + Chlamydia pneumoniae Pesnost Údaje o pesnosti pro C. trachomatis PCR Kit umožují stanovení celkové variability testovacího systému. Tato celková variabilita se skládá z Intra-Assay variability (variabilita vzork stejné koncentrace v rámci jednoho pokusu), z Inter-Assay variability (variabilita zpsobená provedením experimentu rznými osobami v jedné laboratoi a užitím rzných pístroj stejného typu) a z Inter-Batch variability (variabilita zpsobená použitím rzných šarží). Pitom byla vždy vypoítána standardní odchylka, variance a C. trachomatis PCR Kit 03/

56 koeficient variace jak pro specifickou PCR pvodce, tak i pro PCR Interní kontroly. Tyto údaje byly pro C. trachomatis PCR Kit stanoveny na základ Kvantifikaního standardu s nejnižší koncentrací (QS 4; 10 kopií/µl). Experimenty byly provedeny formou osminásobných urení. Vyhodnocení výsledk bylo provedeno na základ Ct hodnot amplifikaních kivek (Ct: threshold cycle, viz Tabulka 3) a z toho urených kvantitativních hodnot v kopiích/µl (viz Tabulka 4). Celková variabilita libovolného vzorku uvedené koncentrace iní tedy 2,80 % (Ct) resp. 13,41 % (konc.), pro prkaz Interní kontroly 2,46 % (Ct). Tyto hodnoty se zakládají na souhrnu všech dílích hodnot zjištných variabilit. Tabulka 3: Údaje o pesnosti na základ Ct hodnot. Intra-Assay variabilita: C. trachomatis TM QS 4 Intra-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Assay variabilita: C. trachomatis TM QS 4 Inter-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Batch variabilita: C. trachomatis TM QS 4 Inter-Batch variabilita: Interní kontrola Celková variabilita: C. trachomatis TM QS 4 Celková variabilita: Interní kontrola Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 0,36 0,13 1,20 0,22 0,05 1,01 0,37 0,13 1,22 0,23 0,05 1,08 0,76 0,58 2,44 0,68 0,46 3,13 0,86 0,74 2,80 0,53 0,28 2,46 56 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

57 Tabulka 4: Údaje o pesnosti na základ kvantitativních hodnot (v kopiích/µl). Intra-Assay variabilita: C. trachomatis TM QS 4 Inter-Assay variabilita: C. trachomatis TM QS 4 Inter-Batch variabilita: C. trachomatis TM QS 4 Celková variabilita: C. trachomatis TM QS 4 Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 0,89 0,79 8,86 1,64 2,68 16,19 1,26 1,58 12,46 1,35 1,83 13, Robustnost Pezkoušení robustnosti slouží k stanovení celkové etnosti chyb C. trachomatis PCR Kit. Za tímto úelem bylo 100 C. trachomatis negativních vzork moi smíseno s 1 kopií/µl eluního objemu kontrolní C. trachomatis DNA (cca tínásobná koncentrace analytické hranice senzitivity), stejn jako 30 výtr s 1 kopií/µl. Všechny výtrové vzorky a vzorky moi byly pomocí QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) izolovány (viz 8.2 Izolace DNA) a pomocí C. trachomatis PCR Kit analyzovány. etnost chyb pro C. trachomatis inila u všech vzork 0 %. Robustnost Interní kontroly byla dodaten pezkoušena izolací a analýzou 100 C. trachomatis negativních vzork moi a 60 negativních výtr. Celková etnost chyb inila 0 %. Inhibice nebyly pozorovány. Robustnost C. trachomatis PCR Kit iní tedy 99 % Reprodukovatelnost Údaje o reprodukovatelnosti jsou poizovány za úelem pravidelného hodnocení výkonnosti C. trachomatis PCR Kit a výkonnostního srovnání s ostatními produkty. Tyto údaje jsou získávány na základ úastí na mezilaboratorních pokusech. C. trachomatis PCR Kit 03/

58 11.6 Diagnostické hodnocení C. trachomatis PCR Kit byl v kombinaci s ABI PRISM 7000 SDS podroben v jedné studii srovnání s LCx C. trachomatis Assay (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) a s APTIMA Combo 2 C. trachomatis Assay (Gen- Probe Incorporated, San Diego, USA). Zkoumáno bylo 150 retrospektivních výtrových vzork (50 uretrálních výtr, 50 výtr z cervixu a 50 z vulvy) a 100 retrospektivních vzork moi (50 mužských a 50 ženských). Všechny vzorky byly pedtím v rámci rutinní diagnostiky testovány pomocí LCx a APTIMA Combo 2 Assay. Vzorky byly pro tyto analýzy zpracovány podle návodu výrobce. Následn byly vzorky až do analýzy pomocí C. trachomatis PCR Kit skladovány pi -20 C. Ped touto analýzou probhla izolace DNA za použití QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN). Pro retrospektivní vzorky moi a výtr iní diagnostická senzitivita C. trachomatis PCR Kit 99,2 % a specificita 98,4 %. Pomr inhibicí ležel u 0 %. Výsledky jsou znázornny v Tabulce 5. Tabulka 5: Výsledky srovnávací validaní studie. Poet vzork Podíl pozitivních vzork (ureno pomocí Srovnání s LCx (C. trachomatis/lcx ) Srovnání s Aptima Combo 2 (C. trachomatis/ Aptima Combo 2 ) LCx /APTIMA Combo 2 Assay) Senzitivita Specificita Senzitivita Specificita Uretrální výtry % 100 % (25/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) Výtry z cervixu % 100 % (25/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) Výtry z vulvy % 96 % (24/25) 100 % (25/25) 96 % (24/25) 100 % (25/25) Mo ženy % 100 % (25/25) 92 % (23/25) 100 % (25/25) 92 % (23/25) Mo muži % 100 % (25/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) 100 % (25/25) Celkov % 99,2 % (124/125) 98,4 % (123/125) 99,2 % (124/125) 98,4 % (123/125) LCx C. trachomatis Assay se zakládá na technologii ligázové etzové reakce (LCR), APTIMA Combo 2 Assay na transcription mediated amplification (TMA). 58 C. trachomatis PCR Kit 03/2007

59 12. Zvláštní pokyny pro použití produktu Všechny reagencie se smí používat výhradn pro diagnostiku in vitro. Prostedek by mli používat pouze pracovníci, kteí jsou speciáln poueni a vyškoleni v metodice diagnostiky in vitro (EN375). Pesné dodržování protokolu je bezpodmínen nutné k dosažení optimálních výsledk PCR. Dbejte na konec doby použitelnosti uvedený na balení a na štítcích jednotlivých komponent. Nepoužívejte reagencie s prošlou trvanlivostí. 13. Bezpenostní informace Bezpenostní informace k souprav C. trachomatis PCR Kit naleznete v odpovídajících bezpenostních listech (material safety data sheets, MSDS). Tyto listy jsou k dispozici v podob kompaktního a snadno použitelného PDF souboru na Kontrola kvality V souladu se systémem managementu jakosti spolenosti QIAGEN certifikovaným podle norem ISO 9001 a ISO byla každá šarže C. trachomatis PCR Kit testována podle pedem stanovených specifikací, aby byla zaruena jednotná kvalita produktu. 15. Literatura (1) Eickhoff M, Laue T, Ruckes T, Cramer SO, Krupp G, Tiemann C. Ultra- Rapid Detection of Chlamydia trachomatis by Real-Time PCR in the LightCycler using SYBR Green Technology or 5 -Nuclease Probes. Clin. Lab. 2003; 49: (2) Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): C. trachomatis PCR Kit 03/

60 16. Vysvtlení symbol Použitelné do íslo šarže Výrobce Katalogové íslo Teplotní rozmezí íslo materiálu Kvantifikaní standard Interní kontrola 60 C. trachomatis PCR Kit 03/2007