Obsah. HSV-1/2 PCR Kit 03/ Izolace DNA Interní kontrola Kvantifikace Píprava PCR... 13

Transkript

1 !

2 Obsah 1. Obsah Skladování Další potebné vybavení Všeobecná preventivní opatení Informace o pvodcích Princip PCR s hodnocením v reálném ase Popis produktu Protokol Izolace DNA Interní kontrola Kvantifikace Píprava PCR Programování ABI PRISM SDS Programování ABI PRISM 7000 SDS Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Vytvoení/volba detektor Piazení potebných informací k pozicím destiek Vytvoení teplotního profilu Uložení bhu PCR Spuštní bhu PCR Programování ABI PRISM 7900HT SDS Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Vytvoení/volba detektor Piazení potebných informací k pozicím destiek Vytvoení teplotního profilu Uložení bhu PCR...30 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007 3

3 Spuštní bhu PCR Vyhodnocení ešení problém Specifikace Analytická senzitivita Specificita Pesnost Robustnost Reprodukovatelnost Diagnostické hodnocení Zvláštní pokyny pro použití produktu Bezpenostní informace Kontrola kvality Literatura Vysvtlení symbol HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

4 HSV-1/2 PCR Kit * Pro použití s ABI PRISM (Applied Biosystems) a 7900HT Sequence Detection Systems Upozornní: HSV-1/2 PCR Kit nelze použít ve spojení s GeneAmp 5700 SDS, ABI PRISM 7700, ani s 384 formátem destiek systému ABI PRISM 7900HT SDS. 1. Obsah Oznaení a obsah List No. 8K reakcí List No. 8K reakcí Modrá HSV TM Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns Žlutá HSV TM Mg-Sol 1 x µl 1 x µl ervená ervená ervená ervená ervená ervená ervená ervená HSV1 LC/RG/TM QS 1 1 x 10 4 cop/µl HSV1 LC/RG/TM QS 2 1 x 10 3 cop /µl HSV1 LC/RG/TM QS 3 1 x 10 2 cop /µl HSV1 LC/RG/TM QS 4 1 x 10 1 cop /µl HSV2 LC/RG/TM QS 1 1 x 10 4 cop /µl HSV2 LC/RG/TM QS 2 1 x 10 3 cop /µl HSV2 LC/RG/TM QS 3 1 x 10 2 cop /µl HSV2 LC/RG/TM QS 4 1 x 10 1 cop /µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Zelená HSV TM IC 1 x µl 2 x µl Bílá Water (PCR grade) 1 x µl 1 x µl QS = Kvantifikaní standard IC = Interní kontrola Mg-Sol = Roztok hoíku * Vyrobeno firmou QIAGEN GmbH, D Hilden, pro Abbott Diagnostics GmbH. Výrobce podle zákona o zdravotnických prostedcích: QIAGEN GmbH. Applied Biosystems je registrovaná obchodní znaka a ABI PRISM je ochranná známka firmy Applera Corporation v USA a/nebo v jiných zemích. HSV-1/2 PCR Kit 03/2007 5

5 2. Skladování Komponenty HSV-1/2 PCR Kit se skladují pi -20 C a mají trvanlivost do data uvedeného na štítku. Zabrate opakovanému rozmrazení a zmrazení (> 2 x), snižuje se tím senzitivita. Pi nepravidelném používání by proto mly být reagencie alikvotovány. V pípad, že je nutné komponenty skladovat pi teplot +4 C, skladujte je takto maximáln po dobu pti hodin. 3. Další potebné vybavení Laboratorní rukavice bez pudru DNA-izolaní souprava (viz 8.1 Izolace DNA) Pipety (nastavitelné) Sterilní pipetovací špiky s filtrem Vortex mixer Stolní centrifuga s rotorem pro 2 ml zkumavky Centrifuga s rotorem pro mikrotitraní destiky (volitelné) 96-ti jamková reakní destika/zkumavky pro optická mení s odpovídajícími optickými uzavíracími prostedky (viz 8.4 Píprava PCR) 96-ti jamkové dvojdílné pídržné rámy k použití optických zkumavek (96-Well Tray/Retainer Set, kat , Applied Biosystems), viz 8.4 Píprava PCR Kompresní podložka pro použití s optickými lepicími foliemi (Optical Cover Compression Pads, kat , Applied Biosystems), viz 8.4 Píprava PCR Aplikátor k uzavení reakních destiek pi použití optických lepicích folií (Adhesive Seal Applicator Kit, kat , Applied Biosystems) ABI PRISM 7000 nebo 7900HT SDS (Applied Biosystems) Upozornní: Pi uvedení pístroj do provozu je bezpodmínen nutná jsoucí platná kalibrace barviv (Pure Spectra Component File) a pozadí (Background Component File). 6 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

6 4. Všeobecná preventivní opatení Uživatel by ml dbát na následující: Používejte sterilní pipetovací špiky s filtrem. Skladujte, izolujte a pidávejte pozitivní materiál (vzorky, kontroly, amplifikáty) do reakce na jiném míst než ostatní reagencie. Všechny komponenty ped poátkem testu úpln rozmrazte pi pokojové teplot. Následn komponenty ádn promíchejte a krátce centrifugujte. Pracujte plynule na ledu nebo v chladicím bloku. 5. Informace o pvodcích Herpes simplex virus (HSV) se nachází v tekutin puchýku, ve slinách a vaginálním sekretu. Penáší se pímým kontaktem s postiženými místy, pohlavním stykem a perinatáln. U velké ásti onemocnní vyvolaných HSV dominuje tvorba puchýk na kži a sliznicích (ústa a genitálie). Infekce HSV se mže vyskytovat jako primární infekce, která u více než 90 % pípad probíhá asymptomaticky, pípadn jako recidiva. Mezi primární infekce zpsobené zvlášt HSV-1 patí gingivostomatitida, ekzema herpeticum, keratokonjunktivitida a encefalitida. HSV-2 se vyskytuje v rámci primární infekce pedevším jako vulvovaginitida, meningitida a jako generalizovaný herpes novorozenc. Pi recidiv infekce HSV dochází pedevším k tvorb puchýk v nazolabiální a genitální oblasti. Recidivy keratokonjunktivitidy a meningitidy se klasifikují jako více nebezpené. 6. Princip PCR s hodnocením v reálném ase Pi diagnostikování pomocí polymerázové etzové reakce (PCR) se amplifikují specifické oblasti genomu pvodce. Detekce probíhá pi PCR v reálném ase pomocí fluorescenních barviv. Barviva jsou zpravidla vázaná na oligonukleotidové sondy, které se specificky vážou na PCR amplifikát. Detekce intenzity fluorescence v prbhu PCR v reálném ase umožuje HSV-1/2 PCR Kit 03/2007 7

7 prkaz a kvantifikaci produkt, aniž by bylo nutné po PCR znovu otevírat testovací zkumavky (Mackay, 2004). 7. Popis produktu HSV-1/2 PCR Kit je systém k pímému použití pro prkaz a rozlišení DNA herpes simplex viru 1 a 2 pomocí polymerázové etzové reakce (PCR) v ABI PRISM 7000 a 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). HSV TM Master obsahuje reagencie a enzymy pro specifickou amplifikaci 148 bp dlouhého úseku genomu herpes simplex viru. Detekce amplifikátu se provádí mením fluorescence FAM (HSV-1) a fluorescence NED (HSV-2) v ABI PRISM SDS. Krom toho obsahuje HSV-1/2 PCR Kit druhý heterologní amplifikaní systém pro prkaz potenciální PCR inhibice. Tento systém je detekován jako Interní kontrola (IC) mením fluorescence VIC. Limit detekce analytické HSV PCR (viz 11.1 Analytická senzitivita) pitom není negativn ovlivnn. Spolu s produktem se dodávají externí pozitivní kontroly (HSV1 LC/RG/TM QS 1 4 & HSV2 LC/RG/TM QS 1 4), s jejichž pomocí lze urit množství pvodce ve vzorku. Prostudujte si prosím oddíl 8.3 Kvantifikace. 8. Protokol 8.1 Izolace DNA DNA-izolaní soupravy nabízejí rzní výrobci. V závislosti na protokolu zvoleného výrobce použijte dané množství vzorku a provete izolaci DNA podle návodu. Doporuujeme následující izolaní soupravy: Vzorek Izolaní souprava Katalogové íslo Výrobce Nosi RNA sérum, plazma, likvor, výtry QIAamp UltraSens Virus Kit (50) QIAamp DNA Mini Kit (50) QIAGEN obsažen QIAGEN neobsažen 8 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

8 Užití nosie RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtžek DNA/RNA. Pokud použitá izolaní souprava neobsahuje žádný nosi RNA, povšimnte si prosím, že je pi izolaci nukleových kyselin z nebunných tlesných tekutin resp. materiál s malým obsahem DNA/RNA (nap. likvor) drazn doporueno pidat nosi RNA (RNA homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences, kat. ís ). Prosím postupujte následujícím zpsobem: a) Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA v eluním pufru (nepoužívejte lyzaní pufr) izolaní soupravy (nap. AE pufr soupravy QIAamp DNA Mini Kit) a edním vytvote roztok o koncentraci 1 µg/µl. Rozdlte tento roztok nosie RNA na poet alikvot odpovídající Vaším požadavkm a skladujte je pi -20 C. Zabrate opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosie RNA. b) Používejte 1 µg nosie RNA na 100 µl lyzaního pufru. Je-li extrakním protokolem stanoveno 200 µl lyzaního pufru na jeden vzorek, vložte 2 µl nosie RNA (1 µg/µl) pímo do lyzaního pufru. Ped zaátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu erstv vytvoena sms lyzaního pufru a nosie RNA (pop. i Interní kontroly, viz 8.2 Interní kontrola): Poet vzork 1 12 Lyzaní pufr nap. 200 µl nap µl Nosi RNA (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Celkový objem 202 µl µl Objem pro izolaci 200 µl po 200 µl c) Tuto erstv vytvoenou sms lyzaního pufru a nosie RNA vložte ihned do izolace. Skladování smsi není možné. Užití nosie RNA má rozhodující význam pro efektivitu izolace a tím pro výtžek DNA/RNA. Aby bylo dosaženo vyšší stability nosie RNA dodávaného s QIAamp UltraSens Virus Kit, doporuujeme následující postup lišící se od údaj uvedených v píruce izolaní soupravy: a. Resuspendujte lyofilizovaný nosi RNA ped prvním použitím izolaní soupravy v 310 µl eluního pufru obsaženého v souprav (konená koncentrace 1 µg/µl, nepoužívejte lyzaní pufr). Rozdlte tento roztok HSV-1/2 PCR Kit 03/2007 9

9 nosie RNA na poet alikvot odpovídající Vaším požadavkm a skladujte je pi -20 C. Zabrate opakovanému rozmrazení (> 2 x) alikvotu nosie RNA. b. Ped zaátkem každé izolace musí být podle následujícího pipetovacího schématu erstv vytvoena sms lyzaního pufru a nosie RNA (pop. i Interní kontroly, viz 8.2 Interní kontrola): Poet vzork 1 12 Lyzaní pufr AC 800 µl µl Nosi RNA (1 µg/µl) 5,6 µl 67,2 µl Celkový objem 805,6 µl 9 667,2 µl Objem pro izolaci 800 µl po 800 µl c. Tuto erstv vytvoenou sms lyzaního pufru a nosie RNA vložte ihned do izolace. Skladování smsi není možné. Použitím QIAamp UltraSens Virus Kit lze docílit zkoncentrování vzorku. Pokud se v pípad vašeho vzorku nejedná o sérum nebo plazmu, pidejte k vzorku alespo 50 % (v/v) negativní lidské plazmy. Pi izolaci využívající promývací pufr s obsahem etanolu bezpodmínen zajistte, aby byl ped elucí proveden ješt jeden centrifuganí krok (ti minuty, ot/min) a tím se odstranily zbytky etanolu. Pedejdete tak možným inhibicím PCR. HSV-1/2 PCR Kit není vhodný pro izolace na základ fenolu. Dležité: Interní kontrolu soupravy HSV-1/2 PCR Kit lze vložit pímo do izolace (viz 8.2 Interní kontrola). 8.2 Interní kontrola Spolu s produktem se dodává Interní kontrola (HSV TM IC). Máte tak možnost kontrolovat jak izolaci DNA, tak také možnou inhibici PCR (viz Obr. 1). Pro tuto aplikaci pidejte k izolaci Interní kontrolu v pomru 0,1 µl na 1 µl eluního objemu. Jestliže napíklad používáte QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) a eluujete DNA v 200 µl AE pufru, vložte 20 µl Interní kontroly. Jestliže nap. eluujete ve 100 µl, vložte 10 µl. Množství vkládané Interní kontroly závisí 10 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

10 pouze na eluním objemu. Interní kontrola a nosi RNA (viz 8.1 Izolace DNA) by mly být pidávány pouze k smsi lyzaního pufru a vzorku nebo pímo k lyzanímu pufru. Interní kontrola nesmí být pidána pímo ke vzorku. Pi pidání k lyzanímu pufru se musí dbát na to, aby byla sms Interní kontroly, lyzaního pufru a nosie RNA erstv pipravena a ihned použita (skladování smsi pi pokojové teplot nebo v lednici mže již po nkolika hodinách vést k vynechání Interní kontroly a ke snížení efektivity izolace). Interní kontrolu a nosi RNA nepipetujte pímo do vzorku. Voliteln lze Interní kontrolu použít výhradn ke kontrole možné inhibice PCR (viz Obr. 2). V tomto pípad pidejte 2 µl Interní kontroly a 10 µl HSV TM Mg-Sol na jednu testovací sms pímo do 20 µl HSV TM Master. Pro každou PCR reakci použijte 30 µl takto vytvoeného Master Mixu a pidejte následn 20 µl izolátu. Jestliže pipravujete jeden bh pro více vzork, zvyšte potebná množství HSV TM Master, HSV TM Mg-Sol a Interní kontroly podle potu vzork (viz 8.4 Píprava PCR). 8.3 Kvantifikace S Kvantifikaními standardy (HSV1 LC/RG/TM QS 1 4 & HSV2 LC/RG/TM QS 1 4) dodávanými spolu s produktem se zachází stejn jako s již izolovanými vzorky a pidávají se ve stejném objemu (20 µl). Standardní kivku v ABI PRISM Sequence Detection System vytvoíte tak, že vložíte pro HSV-1 i pro HSV-2 všechny tyi Kvantifikaní standardy dodávané s produktem a definujete je jako standardy pi zadání odpovídajících koncentrací (viz 8.5 Programování ABI PRISM SDS). Import standardních kivek z pedchozích bh není se softwarem ABI PRISM 7000 a 7900HT SDS možný. Zvýšení objemu podmínné pidáním Interní kontroly je pi píprav PCR reakce opominuto. Senzitivita není omezena. HSV-1/2 PCR Kit 03/

11 Upozornní: Kvantifikaní standardy jsou definovány jako kopie/µl. Pro pepoet hodnot získaných pomocí standardní kivky na kopie/ml vzorku se používá následující vzorec: výsledek (kopie/ml) = výsledek (kopie/µl) x eluní objem (µl) objem vzorku (ml) Prosím povšimnte si, že se do výše uvedeného vzorce dosazuje zásadn pvodní objem vzorku. Toto se musí zohlednit, byl-li objem vzorku ped izolací nukleových kyselin pozmnn (nap. redukce objemu centrifugací nebo jeho zvýšení naplnním na objem požadovaný pro izolaci). Dležité: Na je k dispozici píruka pro zjednodušení kvantitativního vyhodnocení systém na ABI PRISM 7000 SDS (Technical Note for quantitation on the ABI PRISM 7000 SDS). 12 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

12 8.4 Píprava PCR Pipravte pro plánované reakce potebný poet zkumavek resp. 96-ti jamkovou reakní destiku. Doporuené prostedky jsou uvedeny v následující tabulce: Položka Oznaení Katalogové íslo Výrobce Pídržné rámy Kompresní podložka 96-ti jamková optická reakní destika 96-Well Optical Reaction Plate Applied Biosystems ne - Optické lepicí folie Optical Adhesive Covers Applied Biosystems - ano Optické zkumavky ABI PRISM Optical Tubes, 8 Tubes/Strip Applied Biosystems ano - Optické zkumavky MicroAmp Optical Tubes N Applied Biosystems ano - Optická víka (plochá) ABI PRISM Optical Caps, 8 Caps/Strip Applied Biosystems - ne Pi píprav PCR dbejte na to, aby byl spolen s každým bhem PCR proveden alespo jeden Kvantifikaní standard a jedna negativní kontrola (Water, PCR grade). Standardní kivku vytvoíte u každého bhu PCR pomocí všech s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (HSV1 LC/RG/TM QS 1-4 & HSV2 LC/RG/TM QS 1 4). Všechny reagencie se musí ped zaátkem testu zcela rozmrazit pi pokojové teplot, musí být dobe promíchány (opakovaný nábr pipetou a vypuštní pipety nebo krátký vortex) a následn centrifugovány. Chcete-li Interní kontrolou kontrolovat jak izolaci DNA, tak možnou inhibici PCR, musí být naped Interní kontrola pidána k izolaci (viz 8.2 Interní kontrola). V tomto pípad používejte následující schéma pipetování (viz také schématický pehled na Obr. 1): Pi použití dvojdílných pídržných rám je nutné zkumavky pi vkládání a pi vyjímání otevít. K zamezení tím zapíinných kontaminací používejte výhradn dolní díl pídržného rámu. HSV-1/2 PCR Kit 03/

13 1. Píprava Master Mixu 2. Píprava PCR reakce Poet vzork 1 12 HSV TM Master 20 µl 240 µl HSV TM Mg-Sol 10 µl 120 µl HSV TM IC 0 µl 0 µl celkový objem 30 µl 360 µl Master Mix 30 µl po 30 µl vzorek 20 µl po 20 µl celkový objem 50 µl po 50 µl Jestliže chcete Interní kontrolu použít výhradn ke kontrole PCR inhibice, je teba ji pidat pímo do HSV TM Master. V tomto pípad používejte následující schéma pipetování (viz také schématický pehled na Obr. 2): 1. Píprava Master Mixu 2. Píprava PCR reakce Poet vzork 1 12 HSV TM Master 20 µl 240 µl HSV TM Mg-Sol 10 µl 120 µl HSV TM IC 2 µl 24 µl celkový objem 32 µl 384 µl Master Mix 30 µl po 30 µl vzorek 20 µl po 20 µl celkový objem 50 µl po 50 µl Pipetujte do každé zkumavky nebo do každé potebné jamky 96-ti jamkové reakní destiky 30 µl Master Mixu. Následn pidejte 20 µl eluátu z izolace DNA. Dbejte na to, aby byly oba roztoky dobe promíchány opakovaným nábrem pipetou a jejím vypuštním. Uzavete zkumavky píslušnými víky. 96-ti jamkovou reakní destiku mžete alternativn uzavít pomocí optických lepicích folií (Optical Adhesive Covers, Applied Biosystems). Pro shromáždní vkládaného objemu na dn zkumavek nebo destiek centrifugujte zkumavky (v držáku ureném pro zkumavky PCR) pop. 96-ti jamkovou reakní destiku v centrifuze vybavené rotorem pro mikrotitraní desky po dobu 30 sekund pi x g (4 000 ot/min). Pokud takovou centrifugu nemáte k dispozici, dbejte pi píprav reakcí PCR na to, aby byly Master Mix a objem vzorku pipetovány Zvýšení objemu podmínné pidáním Interní kontroly je pi píprav PCR reakce opominuto. Senzitivita detekního systému není omezena. 14 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

14 na dno zkumavek pop. reakních jednotek (well). Reakní smsi skladujte pi teplot +4 C, dokud nebude pístroj ABI PRISM SDS naprogramován (viz 8.5 Programování ABI PRISM SDS) a pak je pevete do pístroje. Upozornní: Pi použití optických zkumavek v kombinaci s optickými víky vkládejte do pístroje (ABI PRISM 7000 a 7900HT SDS) vždy pídržný rám (96- Well Tray/Retainer Set, Applied Biosystems). Pi použití dvojdílného pídržného rámu je nutné zkumavky pi vkládání a pi vyjímání otevít. K zamezení tím zapíinných kontaminací používejte výhradn dolní díl pídržného rámu. Použití 96-ti jamkových optických reakních destiek v kombinaci s optickými lepícími foliemi vyžaduje vložení kompresní podložky (Optical Cover Compression Pads, Applied Biosystems). HSV-1/2 PCR Kit 03/

15 Pidání Interní kontroly k izolaci Izolace sms lyzaního pufru a vzorku + 0,1 µl IC* na 1 µl eluního objemu 10 µl Mg-Sol* 20 µl Master* 20 µl izolátu* 30 µl Master Mix* Optická reakní destika/ optické zkumavky ABI PRISM SDS Obr. 1: Schéma pracovního postupu pro kontrolu izolace a inhibice PCR. * Pi každém pipetovacím kroku je teba bezpodmínen dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované. 16 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

16 Pidání Interní kontroly k Master 10 µl Mg-Sol* 2 µl IC* 20 µl Master* Izolace 32 µl Master Mix* 20 µl izolátu* 30 µl Master Mix* Optická reakní destika/ optické zkumavky ABI PRISM SDS Obr. 2: Schéma pracovního postupu pro kontrolu inhibice PCR. * Pi každém pipetovacím kroku je teba bezpodmínen dbát na to, aby byly používané roztoky dokonale roztáté, ádn promíchané a krátce centrifugované. HSV-1/2 PCR Kit 03/

17 8.5 Programování ABI PRISM SDS Software ABI PRISM 7000 a 7900HT Sequence Detection Systems (SDS) potebuje ped spuštním bhu PCR dodatené informace. Postupy pi programování pístroj se od sebe významn odlišují, proto jsou v následujícím textu uvedeny v samostatných kapitolách Programování ABI PRISM 7000 SDS K detekci HSV DNA vytvote na pístroji ABI PRISM 7000 SDS profil podle následujících šesti pracovních krok ( ). Veškeré údaje se vztahují na ABI PRISM 7000 SDS software verzi Podrobnosti o programování ABI PRISM 7000 SDS si prosím prostudujte v píruce ABI PRISM 7000 SDS User Guide. Pro lepší pehled jsou potebná nastavení na obrázcích zvýraznna ernými rámeky Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Na pístroji ABI PRISM 7000 SDS vyberte pod File položku New a nastavte pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 3). Díve uložená šablona (SDS Template [*.sdt]) je k dispozici v seznamu Template nebo volbou funkce Browse (viz Uložení bhu PCR). Svá zadání potvrte (OK). Obr. 3: Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR (New Document). 18 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

18 Vytvoení/volba detektor V nabídce Tools, v podnabídce Detector Manager, piate dokumentu odpovídající barviva detektoru. K prkazu HSV DNA a Interní kontroly pomocí HSV-1/2 PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher uvedené v následující tabulce: Prkaz Reporter Quencher HSV-1 DNA FAM none HSV-2 DNA NED none Interní kontrola (HSV TM IC) VIC none Tyto detektory vytvoíte tak, že vyberete v položce Detector Manager vlevo dole lokalizovanou volbu File a následn volbu New. Obr. 4: Vytvoení HSV-1 specifického detektoru (Detector Manager). Obr. 5: Vytvoení HSV-2 specifického detektoru (Detector Manager). HSV-1/2 PCR Kit 03/

19 Obr. 6: Vytvoení detektoru specifického pro Interní kontrolu (Detector Manager) pro HSV-1 a HSV-2. V okn, které se zobrazí, definujte (podle Obr. 4 - Obr. 6) kombinaci reporter/quencher FAM/none resp. NED/none pro prkaz HSV-1 DNA resp. HSV-2 DNA, pro prkaz Interní kontroly zvolte kombinaci VIC/none. Potvrzením údaj (OK) se vrátíte zpt do Detector Manager. Oznate práv vytvoené detektory a každý výbr peneste klepnutím na volbu Add to Plate Document do Well Inspector (viz Obr. 7). Zavete okno (Done). Obr. 7: Výbr detektor (Detector Manager). 20 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

20 Piazení potebných informací k pozicím destiek Pokud nyní v nabídce View otevete položku Well Inspector, naleznete tam Vámi v kapitole zvolené detektory znovu (viz Obr. 8 - Obr. 9). Obr. 8: Piazení potebných informací (HSV-1) k pozicím destiek (Well Inspector). Obr. 9: Piazení potebných informací (HSV-2) k pozicím destiek (Well Inspector). Oznate pozice destiky, které jsou obsazené pro prkaz HSV DNA. Aktivujte volbu Use u obou detektor, ímž vybrané detektory piadíte k oznaeným pozicím. Objeví se zatržítko. Pro pojmenování jednotlivých reakních smsí vyberte odpovídající pozici na destice a zadejte název do položky Sample Name. Pitom pamatujte na to, že smsi se stejným Sample Name a stejným piazením detektor bude software považovat za replikáty a zprmruje je s ohledem na jejich kvantifikované množství pvodce. Pak vyberte pro každý typ vzorku odpovídající funkci (Task) podle následující tabulky: HSV-1/2 PCR Kit 03/

21 Typ vzorku Funkce (Task) Koncentrace (Quantity) Reporter HSV-1 Reporter HSV-2 Quencher vzorek unknown - FAM NED none negativní kontrola NTC - FAM NED none standard standard siehe 1. Obsah FAM NED none Standardní kivku vytvote u každého bhu PCR pomocí všech spolu s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (HSV1 LC/RG/TM QS 1 4 & HSV2 LC/RG/TM QS 1 4) a pro každý jednotlivý standard (Quantity) uvete píslušné koncentrace (viz 1. Obsah). Dbejte na to, že pro bh PCR s HSV-1/2 PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní reference (Passive Reference). Rovnomrné rozložení barviva ROX na všechny smsi PCR jedné šarže pomocí promíchání HSV TM Master zaruuje rozpoznání a pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými smsmi PCR) pomocí Sequence Detection Software (normalizace) Vytvoení teplotního profilu K zadání teplotního profilu pepnte software z režimu Setup do režimu Instrument. Podle Obr. 10 zadejte platný teplotní profil pro detekci HSV DNA. Krok 50 C uložený v pedvoleném nastavení odstraníte tak, že jej oznaíte levým tlaítkem myši, piemž pidržíte stisknuté tlaítko Shift, a následn jej vymažete tlaítkem Backspace. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 50 µl. Volba 9600 Emulation by mla být aktivována. Pedvolená nastavení Auto Incrementu zstávají nezmnná (Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 22 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

22 Obr. 10: Vytvoení teplotního profilu Uložení bhu PCR Na tomto míst mžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je pozdji mohli použít ve zmnném nebo nezmnném stavu. Uložíte-li nastavení jako SDS Template (*.sdt) v adresái Template Directory (místní disk [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates, zavedeného Applied Biosystems), mžete tento soubor zvolit pímo z Template drop-down seznamu v okn New Document. Pedlohy uložené v jiných adresáích musí být oteveny pomocí funkce Browse. Ped spuštním bhu PCR dbejte prosím na to, abyste jej znovu uložili jako SDS Document (*.sds). Tím zajistíte ukládání dat nahromadných v prbhu PCR Spuštní bhu PCR Bh PCR spuste volbou Start v položce nabídky Instrument nebo polem Start v režimu Instrument. HSV-1/2 PCR Kit 03/

23 8.5.2 Programování ABI PRISM 7900HT SDS K detekci HSV DNA vytvote na pístroji ABI PRISM 7900HT SDS profil podle následujících šesti pracovních krok ( ). Veškeré údaje se vztahují na ABI PRISM 7900HT SDS software verzi 2.1. Podrobnosti o programování ABI PRISM 7900HT SDS si prosím prostudujte v píruce ABI PRISM 7900HT SDS User Guide. Pro lepší pehled jsou potebná nastavení na obrázcích zvýraznna ernými rámeky Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR Na pístroji ABI PRISM 7900HT SDS vyberte pod File položku New a nastavte pro nový dokument následující základní nastavení (viz Obr. 11). Díve uložená šablona (ABI PRISM SDS Template Document [*.sdt]) je k dispozici v seznamu Template nebo volbou funkce Browse (viz Uložení bhu PCR). Svá zadání potvrte (OK). Upozornní: HSV-1/2 PCR Kit nelze použít ve spojení s 384 formátem destiek ABI PRISM 7900HT SDS. Obr. 11: Pedvolená nastavení pi vytváení nového bhu PCR (New Document). 24 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

24 Vytvoení/volba detektor V nabídce Tools, v podnabídce Detector Manager, (alternativn zvolte režim Setup/funkci Add Detector) piate dokumentu odpovídající barviva detektor. K prkazu HSV DNA a Interní kontroly pomocí HSV-1/2 PCR Kit je nutné definovat reporter/quencher uvedené v následující tabulce: Prkaz Reporter Quencher HSV-1 DNA FAM Non Fluorescent HSV-2 DNA NED Non Fluorescent Interní kontrola (HSV TM IC) VIC Non Fluorescent Tyto detektory vytvoíte tak, že vyberete v položce Detector Manager vlevo dole lokalizovanou volbu New. Obr. 12: Vytvoení HSV-1 specifického detektoru (Detector Manager). Obr. 13: Vytvoení HSV-2 specifického detektoru (Detector Manager). HSV-1/2 PCR Kit 03/

25 Obr. 14: Vytvoení detektoru specifického pro Interní kontrolu (Detector Manager) pro HSV-1 a HSV-2. V okn, které se zobrazí, definujte (podle Obr Obr. 14) kombinaci reporter/quencher FAM/Non Fluorescent resp. NED/Non Fluorescent pro prkaz HSV-1 DNA resp. HSV-2 DNA, pro prkaz Interní kontroly vyberte kombinaci VIC/Non Fluorescent. Potvrzením údaj (OK) se vrátíte zpt do Detector Manager. Oznate práv vytvoené detektory a každý výbr peneste klepnutím na volbu Copy to Plate Document do režimu Setup (viz Obr. 15). Zavete okno (Done). Obr. 15: Výbr detektor (Detector Manager). 26 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

26 Piazení potebných informací k pozicím destiek Vámi v kapitole zvolené detektory naleznete znovu po uzavení Detector Manager (Done) seazené v tabulce v režimu Setup (Well Inspector) (viz Obr Obr. 17). Obr. 16: Piazení potebných informací (HSV-1) k pozicím destiek. Obr. 17: Piazení potebných informací (HSV-2) k pozicím destiek. Oznate pozice destiky, které jsou obsazené pro prkaz HSV DNA. Aktivujte volbu Use u obou detektor, ímž vybrané detektory piadíte k oznaeným pozicím. Objeví se kížek. Pro pojmenování jednotlivých reakních smsí zvolte odpovídající pozici na destice a zadejte název do položky Sample HSV-1/2 PCR Kit 03/

27 Name. Pitom pamatujte na to, že smsi se stejným Sample Name a stejným piazením detektor bude software považovat za replikáty a zprmruje je s ohledem na jejich kvantifikované množství pvodce. Pak vyberte pro každý typ vzorku odpovídající funkci (Task) podle následující tabulky: Typ vzorku Funkce (Task) Koncentrace (Quantity) Reporter HSV-1 Reporter HSV-2 vzorek Unknown - FAM NED negativní kontrola NTC - FAM NED standard Standard viz 1. Obsah FAM NED Quencher Non Fluorescent Non Fluorescent Non Fluorescent Standardní kivku vytvote u každého bhu PCR pomocí všech s produktem dodávaných Kvantifikaních standard (HSV1 LC/RG/TM QS 1 4 & HSV2 LC/RG/TM QS 1 4) a pro každý jednotlivý standard (Quantity) uvete píslušné koncentrace (viz 1. Obsah). Dbejte na to, že pro bh PCR s HSV- 1/2 PCR Kit musí být ROX nastaven jako pasivní reference (Passive Reference). Rovnomrné rozložení barviva ROX na všechny smsi PCR jedné šarže pomocí promíchání HSV TM Master zaruuje rozpoznání a pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými smsmi PCR) pomocí Sequence Detection Software (normalizace) Vytvoení teplotního profilu K zadání teplotního profilu pepnte software z režimu Setup do režimu Instrument. Podle Obr. 18 zadejte pro detekci HSV DNA platný teplotní profil. Zkontrolujte, zda je objem reakce nastaven na 50 µl. Volba 9600 Emulation by mla být aktivována, pedvolená nastavení asu Ramp a Auto Increment zstávají nezmnna (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 28 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

28 Obr. 18: Vytvoení teplotního profilu. Krom toho se v režimu Instrument nachází volba Data Collection. Zvolením této volby se dostanete do okna zobrazeného na Obr. 19. Každá Ramp a Plateau teplota je opatena jedním symbolem sbru dat (Data Collection Icon), který znázoruje pijetí dat v tomto uritém okamžiku bhu. Odstrate všechny symboly až na ten ve chvíli kroku Annealing-Extension (Stage2/Step2), ímž ušetíte zbytená fluorescenní mení. Tak udržíte celkovou dobu bhu a množství dat co nejnižší. HSV-1/2 PCR Kit 03/

29 Obr. 19: Sbr dat (Data Collection) Uložení bhu PCR Na tomto míst mžete uvedená nastavení (Setup) uložit jako masku, abyste je mohli pozdji použít ve zmnném nebo nezmnném stavu. Uložíte-li nastavení jako ABI PRISM SDS Template Document (*.sdt) v adresái Template Directory ([D:]\Program Files\Applied Biosystems\ SDS 2.1\ Templates, zavedeném Applied Biosystems), mžete tento soubor zvolit pímo z Template seznamu v okn New Document. Pedlohy uložené v jiných adresáích musí být oteveny pomocí funkce Browse. Ped spuštním aktuálního bhu PCR dbejte prosím na to, abyste jej znovu uložili jako ABI PRISM SDS Document (*.sds). Tím zajistíte ukládání dat nahromadných v prbhu PCR Spuštní bhu PCR Bh PCR spuste volbou Start v položce nabídky Instrument. 30 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

30 9. Vyhodnocení Pi uvedení pístroje do provozu je bezpodmínen nutná jsoucí platná kalibrace barviv (Pure Spectra Component File) a pozadí (Background Component File). Tyto kalibraní soubory slouží následujícím zpsobem pro pesný výpoet výsledk: Veškeré pístrojem podmínné rušivé signály, které ovlivují mení, jsou eliminovány programem Sequence Detection Software pístroj ABI PRISM Sequence Detection Systems za pomoci Background Component File. Navíc se u vícebarevných analýz vyskytují mezi emisními spektry jednotlivých fluorescenních barviv interference. Software ABI PRISM SDS kompenzuje tyto interference pepoítáním pomocí spektrálních dat jednotlivých barviv uložených v Pure Spectra Component File. Piazení fluorescenních dat shromáždných v prbhu PCR v celém mitelném spektru k naprogramovaným detektorm provádí software také pomocí souboru Pure Spectra Component. Následn se zjištná fluorescenní data jednotlivých barviv rozdlí pro pepoítání tube-to-tube variací (fluorescenní rozdíly mezi rznými reakními smsmi PCR) pomocí signálu pasivní reference (ROX). Tímto zpsobem normalizované signály lze vyhodnotit pomocí Amplification Plot. Kalibraní soubory použité pi vyhodnocení bhu PCR jsou automaticky zajištny pi ukládání dat. Pokud nejsou instalovány žádné kalibraní soubory, vytvote tyto soubory podle pokyn v ABI PRISM SDS User Guide/Manual. Pokud do bhu PCR integrujete více než jeden systém PCR (dbejte na teplotní profil), analyzujte prosím tyto testovací systémy oddlen. Vzorky s totožným oznaením (Sample Name) a piazením detektoru identifikuje ABI PRISM 7000 a 7900HT SDS Software automaticky jako replikáty a zprmruje je s ohledem na kvantifikované množství pvodce. HSV-1/2 PCR Kit 03/

31 Mže dojít k následujícím výsledkm: 1. Je detekován fluorescenní signál FAM pro HSV-1 resp. fluorescenní signál NED pro HSV-2. Výsledek analýzy je pozitivní: Vzorek obsahuje HSV DNA. V tomto pípad je detekce fluorescenního signálu VIC (Interní kontrola) podružná, protože vysoké výchozí koncentrace HSV DNA (pozitivní fluorescenní signál FAM pro HSV-1 a fluorescenní signál NED pro HSV-2) mohou vést k redukovanému až chybjícímu fluorescennímu signálu Interní kontroly (kompetice). 2. Není detekován ani fluorescenní signál FAM pro HSV-1 ani fluorescenní signál NED pro HSV-2, nýbrž pouze fluorescenní signál VIC (signál Interní kontroly). Ve vzorku není prokazatelná žádná HSV DNA. Lze jej proto považovat za negativní. Pi negativní HSV PCR vyluuje detekovaný signál Interní kontroly možnost inhibice PCR. 3. Není detekován žádný fluorescenní signál FAM pro HSV-1, fluorescenní signál NED pro HSV-2 nebo fluorescenní signál VIC. Není možné uinit diagnostický závr. Pokyny týkající se zdroj chyb a jejich odstranní jsou uvedeny v kapitole 10. ešení problém. Píklady pozitivních a negativních reakcí PCR jsou uvedeny na obrázcích (ABI PRISM 7000 SDS) a (ABI PRISM 7900HT SDS). 32 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

32 Obr. 20: Prkaz Kvantifikaních standard (HSV1 LC/RG/TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu FAM (ABI PRISM 7000 SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 21: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7000 SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (HSV1 LC/RG/TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativní kontrola). HSV-1/2 PCR Kit 03/

33 Obr. 22: Prkaz Kvantifikaních standard (HSV2 LC/RG/TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu NED (ABI PRISM 7000 SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 23: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7000 SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (HSV2 LC/RG/TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativní kontrola). 34 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

34 Obr. 24: Prkaz Kvantifikaních standard (HSV1 LC/RG/TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu FAM (ABI PRISM 7900HT SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 25: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7900HT SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (HSV1 LC/RG/TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativní kontrola). HSV-1/2 PCR Kit 03/

35 Obr. 26: Prkaz Kvantifikaních standard (HSV2 LC/RG/TM QS 1-4) detekcí fluorescenního signálu NED (ABI PRISM 7900HT SDS). NTC: non-template control (negativní kontrola). Obr. 27: Prkaz Interní kontroly (IC) detekcí fluorescenního signálu VIC (ABI PRISM 7900HT SDS) pi souasné amplifikaci Kvantifikaních standard (HSV2 LC/RG/TM QS 1-4). NTC: non-template control (negativní kontrola). 36 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

36 10. ešení problém Žádný fluorescenní signál FAM pro HSV-1 ani fluorescenní signál NED pro HSV-2 pi pozitivních kontrolách (HSV1 LC/RG/TM QS 1 4 & HSV2 LC/RG/TM QS 1 4): Volba barviva detektoru pi analýze dat PCR neodpovídá protokolu. K analýze dat zvolte barvivo detektoru FAM pro HSV-1 a NED pro HSV-2 pro analytickou HSV PCR a barvivo detektoru VIC pro PCR Interní kontroly. Naprogramování teplotního profilu ABI PRISM Sequence Detection Systems je chybné. Porovnejte teplotní profil s údaji protokolu (viz 8.5 Programování ABI PRISM SDS). PCR reakce byla chybn sestavena. Porovnejte Vaše pracovní kroky s pipetovacím schématem (viz 8.4 Píprava PCR) a pop. PCR zopakujte. Podmínky skladování jednoho nebo více komponent soupravy neodpovídají pedpism uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla pekroena doba použitelnosti soupravy HSV-1/2 PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop. novou soupravu. Slabý nebo chybjící signál Interní kontroly (fluorescenní signál VIC) pi souasné nepítomnosti fluorescenního signálu FAM pro HSV-1 a fluorescenního signálu NED pro HSV-2 specifické HSV PCR: Podmínky PCR neodpovídají protokolu. Zkontrolujte podmínky PCR (viz výše) a pop. PCR zopakujte s opraveným nastavením. PCR byla inhibována. Ujistte se, že používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Pesvdte se, že byl pi izolaci DNA ped elucí proveden dodatený doporuený centrifuganí krok k úplnému odstranní zbytk etanolu (viz 8.1 Izolace DNA). HSV-1/2 PCR Kit 03/

37 Bhem izolace dochází k úbytku DNA. Byla-li k izolaci pidána Interní kontrola, mže nepítomnost signálu Interní kontroly znamenat úbytek DNA bhem izolace. Ujistte se, že používáte námi doporuený postup izolace (viz 8.1 Izolace DNA) a držte se pesn pedpis výrobce. Podmínky skladování jednoho nebo více komponent soupravy neodpovídají pedpism uvedeným v kapitole 2. Skladování nebo byla pekroena doba použitelnosti soupravy HSV-1/2 PCR Kit. Prosím zkontrolujte jak podmínky skladování, tak i dobu použitelnosti reagencií (viz štítek soupravy) a použijte pop. novou soupravu. Fluorescenní signál FAM pro HSV-1 a fluorescenní signál NED pro HSV-2 analytické PCR pi negativních kontrolách. Bhem pípravy PCR došlo ke kontaminaci. Zopakujte PCR v replikátech s novými reagenciemi. Uzavete jednotlivé PCR zkumavky pokud možno ihned po vložení zkoumaného vzorku. Pipetujte pozitivní kontroly zásadn jako poslední. Ujistte se, že jsou pracovní plochy a pístroje pravideln dekontaminovány. Bhem izolace dochází ke kontaminaci. Zopakujte izolaci a PCR zkoumaných vzork za užití nových reagencií. Ujistte se, že jsou pracovní plochy a pístroje pravideln dekontaminovány. Pokud se vyskytnou další otázky nebo problémy, kontaktujte prosím naší technickou podporu. 38 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

38 11. Specifikace 11.1 Analytická senzitivita Pro zjištní analytické senzitivity HSV-1/2 PCR Kit byla vytvoena ada ední standard pro HSV-1 od 25,7 do nomináln 0,008 HSV-ekvivalent kopie /µl a pro HSV-2 od 35,31 do nomináln 0,012 HSV-ekvivalent kopie /µl. Tyto ady byly následn analyzovány za použití HSV-1/2 PCR Kit s ABI PRISM 7000 a 7900HT Sequence Detection Systems. Experimenty byly pro každý pístroj provedeny ve tech rzných dnech formou osminásobných urení. Výsledky byly zjištny probitovou analýzou. Jejich grafické vyhodnocení (ABI PRISM 7900HT SDS) je zobrazeno na Obr Obr. 29. Limit detekce (p = 0,05) ABI PRISM 7000 SDS (HSV-1) 0,9 kopií/µl ABI PRISM 7000 SDS (HSV-2) 0,5 kopií/µl ABI PRISM 7900HT SDS (HSV-1) 1,8 kopií/µl ABI PRISM 7900HT SDS (HSV-2) 2,0 kopií/µl To znamená, že je s 95 % pravdpodobností detekováno 0,9 kopií/µl (HSV-1) resp. 0,5 kopií/µl (HSV-2, ABI PRISM 7000 SDS) a 1,8 kopií/µl (HSV-1) resp. 2,0 kopií/µl (HSV-2, ABI PRISM 7900HT SDS). U zde použitého standardu se jedná o klonovaný PCR produkt, jehož koncentrace byla zjištna spektrální a fluorescenní fotometrií. HSV-1/2 PCR Kit 03/

39 Probitová analýza: HSV-1 (ABI PRISM 7900HT SDS) Obr. 28: Analytická senzitivita pro HSV-1 soupravy HSV-1/2 PCR Kit (ABI PRISM 7900HT SDS). Probitová analýza: HSV-2 (ABI PRISM 7900HT SDS) Obr. 29: Analytická senzitivita pro HSV-2 soupravy HSV-1/2 PCR Kit (ABI PRISM 7900HT SDS). 40 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

40 11.2 Specificita Specificita HSV-1/2 PCR Kit je v první ad zaruena výbrem primer a sond, jakož i volbou písných reakních podmínek. Primery a sondy byly na základ sekvenní analýzy pezkoušeny na eventuální homologie se všemi sekvencemi publikovanými v genových bankách. Tímto zpsobem byla kontrolována také detekovatelnost všech relevantních kmen. K urení specificity HSV-1/2 PCR Kit byla kontrolní skupina uvedená v Tabulce 1 testována na kížovou reaktivitu. Žádný z testovaných pvodc nebyl reaktivní. Tabulka 1: Testování specificity diagnostické soupravy pomocí potenciáln kížov reaktivních pvodc. Kontrolní skupina HSV-1/2 (FAM/NED) Interní kontrola (VIC) Lidský herpesvirus 3 (Varicella zoster virus) - + Lidský herpesvirus 4 (virus Epsteina a Barrové) - + Lidský herpesvirus 5 (Cytomegalovirus) - + Lidský herpesvirus 6A - + Lidský herpesvirus 6B - + Lidský herpesvirus Lidský herpesvirus Virus hepatitidy A - + Virus hepatitidy B - + Virus hepatitidy C - + Virus lidské imunodeficience - + Lidský virus leukémie T-bunk typu 1 & Západonilský virus - + Enterovirus - + Parvovirus B HSV-1/2 PCR Kit 03/

41 11.3 Pesnost Údaje o pesnosti pro HSV-1/2 PCR Kit umožují stanovení celkové variability testovacího systému. Tato celková variabilita se skládá z Intra-Assay variability (variabilita vzork stejné koncentrace v rámci jednoho pokusu), z Inter-Assay variability (variabilita zpsobená provedením experimentu rznými osobami v jedné laboratoi a užitím rzných pístroj stejného typu) a z Inter-Batch variability (variabilita zpsobená použitím rzných šarží). Pitom byla vždy vypoítána standardní odchylka, variance a koeficient variace jak pro specifickou PCR pvodce, tak i pro PCR Interní kontroly. Tyto údaje byly pro HSV-1/2 PCR Kit stanoveny na základ Kvantifikaního standardu s nejnižší koncentrací (QS 4; 10 kopií/µl). Experimenty byly provedeny formou osminásobných urení. Vyhodnocení výsledk bylo provedeno na základ Ct hodnot amplifikaních kivek (Ct: threshold cycle, viz Tabulka 2/Tabulka 4) a z toho urených kvantitativních hodnot v kopiích/µl (viz Tabulka 3/Tabulka 5). Celková variabilita libovolného vzorku uvedené koncentrace iní tedy 2,62 % (Ct, HSV-1) a 2,07 % (Ct, HSV-2) resp. 14,02 % (konc., HSV-1) a 14,82 % (konc., HSV-2), pro prkaz Interní kontroly 1,84 % (Ct, HSV-1) a 1,92 % (Ct, HSV-2). Tyto hodnoty se zakládají na souhrnu všech dílích hodnot zjištných variabilit. 42 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

42 Tabulka 2: Údaje o pesnosti pro HSV-1 na základ Ct hodnot. Intra-Assay variabilita: HSV-1 LC/RG/TM QS 4 Intra-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Assay variabilita: HSV-1 LC/RG/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Batch variabilita: HSV-1 LC/RG/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: Interní kontrola Celková variabilita: HSV-1 LC/RG/TM QS 4 Celková variabilita: Interní kontrola Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 0,18 0,03 0,51 0,24 0,06 0,87 0,25 0,06 0,70 0,37 0,14 1,36 0,23 0,05 0,67 0,17 0,03 0,65 0,92 0,84 2,62 0,49 0,24 1,84 Tabulka 3: Údaje o pesnosti pro HSV-1 na základ kvantitativních hodnot (v kopiích/µl). Intra-Assay variabilita: HSV-1 LC/RG/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: HSV-1 LC/RG/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: HSV-1 LC/RG/TM QS 4 Celková variabilita: HSV-1 LC/RG/TM QS 4 Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 1,32 1,75 13,12 1,60 2,56 15,81 1,22 1,50 12,14 1,42 2,00 14,02 HSV-1/2 PCR Kit 03/

43 Tabulka 4: Údaje o pesnosti pro HSV-2 na základ Ct hodnot. Intra-Assay variabilita: HSV-2 LC/RG/TM QS 4 Intra-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Assay variabilita: HSV-2 LC/RG/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: Interní kontrola Inter-Batch variabilita: HSV-2 LC/RG/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: Interní kontrola Celková variabilita: HSV-2 LC/RG/TM QS 4 Celková variabilita: Interní kontrola Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 0,17 0,03 0,49 0,10 0,01 0,37 0,23 0,05 0,68 0,30 0,09 1,10 0,24 0,06 0,74 0,25 0,06 0,93 0,70 0,49 2,07 0,52 0,27 1,92 Tabulka 5: Údaje o pesnosti pro HSV-2 na základ kvantitativních hodnot (v kopiích/µl). Intra-Assay variabilita: HSV-2 LC/RG/TM QS 4 Inter-Assay variabilita: HSV-2 LC/RG/TM QS 4 Inter-Batch variabilita: HSV-2 LC/RG/TM QS 4 Celková variabilita: HSV-2 LC/RG/TM QS 4 Standardní odchylka Variance Koeficient variace [%] 1,44 2,06 14,25 1,60 2,56 15,80 1,48 2,18 14,62 1,50 2,25 14,82 44 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

44 11.4 Robustnost Pezkoušení robustnosti slouží k stanovení celkové etnosti chyb HSV-1/2 PCR Kit. Za tímto úelem bylo 30 HSV negativních vzork likvoru smíseno s vždy 5,4 kopiemi/µl eluního objemu kontrolní HSV-1 DNA (tínásobná koncentrace analytické hranice senzitivity), pomocí QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) izolováno (viz 8.1 Izolace DNA) a pomocí HSV-1/2 PCR Kit analyzováno. Stejným zpsobem byly provedeny testy pro HSV-2 (30 vzork likvoru; 6 kopií/µl kontrolní HSV-2 DNA). etnost chyb pro HSV-1 i HSV-2 inila u všech vzork 0 %. Robustnost Interní kontroly byla dodaten pezkoušena izolací a analýzou 30 negativních vzork likvoru. Celková etnost chyb inila 0 %. Inhibice nebyly pozorovány. Robustnost HSV-1/2 PCR Kit iní tedy 99 % Reprodukovatelnost Údaje o reprodukovatelnosti jsou poizovány za úelem pravidelného hodnocení výkonnosti HSV-1/2 PCR Kit a výkonnostního srovnání s ostatními produkty. Tyto údaje jsou získávány na základ úastí na mezilaboratorních pokusech Diagnostické hodnocení HSV-1/2 PCR Kit je v souasné dob evaluován ve více studiích. 12. Zvláštní pokyny pro použití produktu Všechny reagencie se smí používat výhradn pro diagnostiku in vitro. Prostedek by mli používat pouze pracovníci, kteí jsou speciáln poueni a vyškoleni v metodice diagnostiky in vitro (EN375). Pesné dodržování protokolu je bezpodmínen nutné k dosažení optimálních výsledk PCR. Dbejte na konec doby použitelnosti uvedený na balení a na štítcích jednotlivých komponent. Nepoužívejte reagencie s prošlou trvanlivostí. HSV-1/2 PCR Kit 03/

45 13. Bezpenostní informace Bezpenostní informace k souprav HSV-1/2 PCR Kit naleznete v odpovídajících bezpenostních listech (material safety data sheets, MSDS). Tyto listy jsou k dispozici v podob kompaktního a snadno použitelného PDF souboru na Kontrola kvality V souladu se systémem managementu jakosti spolenosti QIAGEN certifikovaným podle norem ISO 9001 a ISO byla každá šarže HSV-1/2 PCR Kit testována podle pedem stanovených specifikací, aby byla zaruena jednotná kvalita produktu. 15. Literatura Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

46 16. Vysvtlení symbol Použitelné do íslo šarže Výrobce Katalogové íslo Teplotní rozmezí íslo materiálu Kvantifikaní standard Interní kontrola Roztok hoíku HSV-1/2 PCR Kit 03/

47 48 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

48 HSV-1/2 PCR Kit 03/

49 50 HSV-1/2 PCR Kit 03/2007

50 HSV-1/2 PCR Kit 03/

51 Distribuuje spolenost Abbott Laboratories Abbott GmbH Max-Planck-Ring Wiesbaden Nmecko Telefon: Fax: Celosvtový prodej a podpora Informace o prodejních místech a technické podpoe získáte u Vaší místní poboky Abbott Diagnostics QIAGEN GmbH QIAGEN Strasse Hilden Nmecko!"#$%"&'#!$$#$