MASARYKOVA UNIVERZITA. Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Brno 2014 Barbora Gromesová

2 MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie AMYLOIDÓZY: MOLEKULÁRNÍ A BUNĚČNÉ MECHANISMY, LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA Bakalářská práce Barbora Gromesová VEDOUCÍ PRÁCE: Mgr. Anna Potáčová, Ph.D. Brno 2014

3 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Barbora Gromesová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Amyloidózy: Molekulární a buněčné mechanismy, laboratorní diagnostika Experimentální biologie Molekulární biologie a genetika Mgr. Anna Potáčová, Ph.D. Akademický rok: 2013/2014 Počet stran: 37 Klíčová slova: amyloid, amyloidóza, konformační onemocnění, tkáňová depozita, fibrily, struktura β skládaného listu, imunoglobulin, transtyretin, agregace, laboratorní diagnostika, konžská červeň, imunohistochemie, DNA analýzy

4 Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Barbora Gromesová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Amyloidoses: Molecular and cellular mechanisms and laboratory diagnostics Degree Programme: Experimental biology Field of Study: Supervisor: Molecular biology and genetics Mgr. Anna Potáčová, Ph.D. Academic Year: 2013/2014 Number of Pages: 37 Keywords: amyloid, amyloidosis, conformational diseases, tissue deposits, fibrils, β-sheet structure, immunoglobulin, transthyretin, aggregation, laboratory diagnostics, Congo red, immunohistochemistry, DNA analysis

5 Abstrakt Amyloidóza je skupina onemocnění, u kterých dochází k ukládání špatně složených proteinů do extracelulárních prostorů tkání a orgánů, čímž narušují jejich strukturu a funkci. Tyto patologické proteiny se nazývají amyloidy. Amyloid je tedy agregovaný protein ve formě nerozpustných fibril, které jsou dlouhé, nevětvené a mají charakteristickou sekundární strukturu β skládaného listu. K přeměně struktury z přirozené na patogenní nedochází samovolně, ale jsou zapotřebí vhodné podmínky. U dědičných forem amyloidóz dochází k mutaci v primární struktuře proteinu, což způsobuje přímo expresi patogenní formy proteinu. Špatně složené proteiny se poté shlukují a vytvářejí amyloidové fibrily, jejichž tvorbu vysvětluje několik hypotéz. Kompletní diagnostika se provádí většinou ve dvou krocích. Nejprve je nutný histologický průkaz amyloidových depozit v tkáních, a poté následuje stanovení chemického složení vlastního amyloidového proteinu. Stanovení správné diagnózy je velmi důležité pro určení prognózy a zavedení vhodné léčby. Abstract Amyloidosis is a group of diseases where there is a saving poorly folded proteins into extracellular spaces of tissues and organs, thereby disrupting its structure and function. These pathological proteins called amyloids. Amyloid is thus aggregated protein in the form of insoluble fibrils, which are long, unbranched and they have a characteristic secondary structure of the β pleated sheet. The transformation from natural structure to pathogenic structure is not spontaneously but there are required suitable conditions. In hereditary forms of amyloidosis mutation occurs in the primary structure of the protein, causing a direct expression of the pathogenic form of the protein. Incorrectly folded proteins are then accumulated to form amyloid fibrils, several hypotheses explain their formation. A complete diagnosis is usually carried out in two steps. First, is need histological evidence of amyloid deposits in tissues, followed by identification of the chemical composition of its own amyloid protein. The correct diagnosis is very important for determining prognosis and the introduction of appropriate treatment.

6

7 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala své vedoucí bakalářské práce Mgr. Anně Potáčové, Ph.D. za odborné rady, cenné připomínky, ochotu a čas, který mi při tvorbě práce věnovala. Poděkování patří také Ústavu patologické fyziologie.

8

9 Obsah Úvod FUNKČNÍ SKLÁDÁNÍ PROTEINŮ VS. PATOLOGICKÉ STRUKTURY Agregace proteinů, tvorba amyloidových fibril Faktory přispívající k tvorbě amyloidu Faktory okolního prostředí Genetické faktory AMYLOIDÓZY Obecná charakteristika Rozdělení amyloidóz Poškození organismu a klinické projevy AL amyloidóza ATTR amyloidóza DIAGNOSTIKA AMYLOIDÓZ Laboratorní průkaz amyloidu Histologický průkaz amyloidových depozit Barvení konžskou červení Elektronová mikroskopie a rentgenová difrakce Identifikace typu amyloidu Imunohistochemie Imunofluorescence Imunoelektronová mikroskopie Proteomika DNA analýzy Závěr Seznam použité literatury: Seznam tabulek:... 37

10 Seznam použitých zkratek: AA amyloidóza ze sérového amyloidu A AApoAI amyloidóza z apolipoproteinu AI AApoAII amyloidóza z apolipoproteinu AII AApoAIV amyloidóza z apolipoproteinu AIV AANF amyloidóza z axiálního natriuretického peptidu Aβ amyloidóza z Aβ proteinového prekurzoru gen kódující beta amyloid A4 prekurzor Aβ 2 M amyloidóza z β 2 -mikroglobulinu gen kódující β 2 - mikroglobulin AβPP Aβ proteinový prekurzor ABri amyloidóza z ABri proteinového prekurzoru gen kódující membránový protein 2B ABriPP ABri proteinový prekurzor ACal amyloidóza z kalcitoninu ACor amyloidóza z korneodesmosinu ACys amyloidóza z cystatinu C ADan amyloidóza z ADan proteinového prekurzoru gen kódující membránový protein 2B ADanPP ADan proteinový prekurzor AEF faktor urychlující vznik amyloidu AFib amyloidóza a Aα řetězce fibrinogenu AGal7 amyloidóza z galektinu 7 AGE produkty pokročilé glykace proteinů AGel amyloidóza z gelsolinu AH amyloidóza z těžkého řetězce imunoglobulinu AIAPP amyloidóza z ostrůvkového amyloidového polypeptidu AIns amyloidóza z insulinu AKer amyloidóza z kerato-epitelinu AL amyloidóza z lehkého řetězce imunoglobulinu Ala alanin ALac amyloidóza z laktoferinu

11 ALect-2 amyloidóza z leukocytárního chemotaktického faktoru 2 ALys amyloidóza z lysozymu AMed amyloidóza z laktaderinu AOaap amyloidóza z odontogenního s ameloblastem asociovaného proteinu AP P složka amyloidu Apo A I gen kódující apolipoprotein AI Apo A II gen kódující apolipoprotein AII Apo C III gen kódující apolipoprotein C III ApoE apolipoprotein E ApoJ apolipoprotein J APP β-amyloidový proteinový prekurzor gen kódující amyloidový prekurzorový protein APro amyloidóza z prolaktinu APrP amyloidóza z prionových proteinů APrp gen kódující prionový protein Arg arginin ASem1 amyloidóza ze semenogolinu 1 Asn asparagin Asp kyselina asparagová ASPC amyloidóza z plicního surfaktantu ATTR amyloidóza z transtyretinu β 2 M β 2 -mikroglobulin CAPS syndromy spojené s mutacemi v genu pro kryopyrin CIAS a CST 3 geny kódující cystatin C Cys cystein DIRA nedostatečnost antagonisty receptoru pro interleukin 1 FAP familiární amyloidová polyneuropatie FCAS familiární chladem vyvolané autoinflamatorní syndromy FGA gen kódující fibrinogen FMF familiární středozemní horečka G CSF faktor stimulující kolonie granulocytů GSN gen kódující gelsolin Glu kyselina glutamová Gly glycin

12 HC těžké řetězce HIDS syndrom spojený s nadprodukcí IgD His histidin HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie IAPP ostrůvkový amyloidový polypeptid IgA imunoglobulin A IgD imunoglobulin D IgE imunoglobulin E IgG imunoglobulin G IgM imunoglobulin M Ile isoleucin ISA mezinárodní společnost pro amyloidózu LC lehké řetězce Leu leucin Lys lysin LYZ gen kódující lysozym M CSF faktor stimulující kolonie makrofágů MEFV gen kódující pyrin Met methionin MIg monoklonální imunoglobulin mrna mediátorová ribonukleová kyselina MVK gen kódující mevalonát kinázu MWS Muckleův Wellsův syndrom NLRP 12 gen kódující cytostatický protein NOD 12 gen kódující nod protein family NOMID multiorgánová zánětlivá onemocnění počínající po narození PAPA syndrom zahrnující kombinaci pyrogenních artritid, pyroderma gangraenosum a akné PCR polymerázová řetězová reakce Phe fenylalanin Pro prolin RFLP polymorfismus délky restrikčních fragmentů SAA sérový amyloid A SAA 1 gen kódující sérový amyloid A1 SAP sérový amyloidový protein P

13 Ser SSA TNFRSF 1A Thr ThS ThT TRAPS Trp TTR Tyr Val serin senilní systémová amyloidóza gen kódující tumor nekrotický faktor treonin thioflavin S thioflavin T syndrom asociovaný s deficitem receptoru 1 pro tumor nekrotický faktor tryptofan transtyretin, gen kódující transtyretin tyrosin valin

14 Úvod Amyloidóza není jednotnou nemocí. Jedná se o skupinu chorobných stavů, které mají společnou charakteristickou vlastnost - extracelulární ukládání amorfní hmoty proteinové povahy v tkáních (amyloid). Amyloid je patologická forma proteinu v β struktuře skládaného listu, k jehož vzniku dochází agregací původně solubilní (degradovatelné) formy proteinu s primárně nebo sekundárně výrazně zastoupenou β strukturou do formy fibrilární, tedy rezistentní na degradaci. Podmínkou vzniku amyloidu je narušený životní cyklus proteinu. Eventuální mutace v genech pro některé proteinové prekurzory může vznik amyloidových depozit značně urychlit. Depozita se ukládají v různých orgánech a ovlivňují tak funkci daného orgánu. Amyloidózy můžeme dělit podle rozsahu poškození orgánů na systémové a lokalizované. U systémových forem jsou napadeny především ledviny, játra, srdce a periferní nervový systém. Podle příčiny zvýšené produkce prekurzoru jde o formy získané či hereditární. U dědičných forem amyloidóz závisí závažnost klinických příznaků na věku, pohlaví a především na typu mutace. Každý typ amyloidózy má svůj specifický fibrilární prekurzor, v současnosti je popsáno asi 30 typů rozdílných proteinů, které mohou vést ke vzniku amyloidózy. Jednotlivé typy amyloidóz jsou označeny podle amyloidového proteinu A (amyloid) a podle fibrilárního prekurzoru (př. AL amyloidóza = imunoglobulin light chain amyloidóza). Názvosloví a dělení jednotlivých forem je pravidelně revidováno nomenklaturním výborem mezinárodní společnosti pro amyloidózu ISA. Onemocnění se manifestuje ve starším věku, pouze hereditární formy amyloidózy se mohou projevit i u mladších pacientů. Medián přežívaní pacientů závisí na typu amyloidózy a na rozsahu poškození orgánů. V současnosti nelze amyloidózu zcela vyléčit, lze pouze prodloužit medián přežívání pacientů. Cílem mé bakalářské práce je popsat a shrnout mechanismy, které vedou ke vzniku onemocnění a podat přehled současně dostupné laboratorní diagnostiky. V klinické části práce se zaměřuji především na nejčastější formy tohoto onemocnění. 13

15 1. FUNKČNÍ SKLÁDÁNÍ PROTEINŮ VS. PATOLOGICKÉ STRUKTURY Proteiny jsou biopolymery složené z aminokyselin. Organizují se do konkrétních trojrozměrných struktur, které jsou určeny aminokyselinovou sekvencí, prostřednictvím mnoha konformačních změn a které jsou potřebné pro správnou funkci proteinu (Onuchic a Wolynes, 2004). Skládání proteinů do jejich finálních struktur je velmi složitý, několikastupňový proces, na němž se podílí i podmínky mikroprostředí, a popis molekulárních mechanismů zodpovědných za tyto děje je jedním z nejnáročnějších úkolů současné biochemie (Iram a Naeem, 2014). Při procesu skládání se molekula snaží najít nejnižší energetický stav, aby byla co nejstabilnější. Výchozí podoba proteinu je lineární neuspořádaný řetězec aminokyselin vzniklý při translaci mrna, jedná se o primární strukturu, v níž jsou aminokyseliny vzájemně spojeny peptidickou vazbou, a která se dále skládá. Vznikající sekundární struktura je lokální prostorové uspořádání hlavního polypeptidového řetězce bez ohledu na jeho postranní řetězce. Nejčastěji se jedná o α-helix nebo β strukturu skládaného listu. Pomocí různých druhů sil (iontové interakce, vodíkové můstky, hydrofobní interakce, disulfidické můstky, atd.) se vytváří terciární neboli trojrozměrná struktura celého polypeptidu, jedná se o prostorovou konformaci, která, jak již bylo zmíněno, určuje funkci daného proteinu. Spojením dvou nebo více trojrozměrných struktur polypeptidů v proteinu vzniká struktura kvartérní. Vyskytuje se u proteinů s molekulární hmotností vyšší než Daltonů. Proces skládání proteinů ovlivňuje samotná primární struktura, teplota a ph prostředí, vysoká koncentrace glukózy, anebo oxidační činitelé. Za jistých podmínek tak mohou mít meziprodukty tohoto procesu tendenci buď nesprávně skládat strukturu, nebo nejsou schopny udržet se ve správně složeném stavu (Fink, 1998). Poškozené a špatně složené proteiny totiž mají tendenci tvořit nerozpustné agregáty a ukládat se do tkáňových ložisek, jako je tomu právě u amyloidóz, čímž způsobují utlačování funkčních tkání a vedou k rozvoji mnoha závažných onemocnění (Loo et al., 2011; Invernizzi et al., 2012). Pokud dojde k poškození proteinu, snaží se různé buněčné mechanismy toto poškození napravit, a to renaturací proteinu nebo jeho odbouráním tak, aby nedošlo k akumulaci toxického produktu v buňce (Iram a Naeem, 2014). Proteinová homeostáza je tak výsledkem koordinované kontroly procesů 14

16 zahrnujících syntézu, skládání či translokace pozměněné části intracelulárních proteinů nebo jejich degradaci. 1.1 Agregace proteinů, tvorba amyloidových fibril Agregace molekul proteinů do filament je běžná forma biologického procesu a je zahrnuta jak ve funkčních, tak i patologických jevech v přírodě (Cohen et al., 2012). Příkladem fyziologické tvorby filament je například tvorba aktinových vláken. Avšak abnormální kumulace nesprávně složených proteinů obvykle vede k tvorbě agregátů (Invernizzi et al., 2012). Tyto struktury mohou být z morfologického hlediska klasifikovány na uspořádané a neuspořádané (amorfní). Inkluzní tělíska, která vznikají hydrofobní agregací denaturovaných proteinů, jsou příkladem in vivo neuspořádaných agregátů (Ventura, 2005), amyloidy jsou modelovým příkladem in vivo i in vitro uspořádaných agregátů (Iram a Naeem, 2014; Invernizzi et al., 2012). Ke vzniku amyloidu dochází agregací původně degradovatelné formy proteinu do fibrilární struktury, která je rezistentní na degradaci (Ryšavá, 2013). Agregace proteinu do amyloidové fibrily je následkem různých poruch v životním cyklu proteinu, od jeho zrodu až do fáze degradace. Proces tvorby fibril může být následkem termodynamické destabilizace sekundární struktury proteinu vyvolané vnější nebo vnitřní odchylkou, která iniciuje proteinovou přestavbu (Sukhanova et al., 2012). Vnitřní přestavění struktury bílkoviny spočívá ve skládání sekundární struktury nebo její přestavby do konformace β skládaného listu, ta je nezbytná pro děje probíhající během amyloidové fibrilace. Protein může nejenom přestavovat svoji strukturu, ale může se také spojovat s dalšími proteiny. Existuje několik hypotéz, které se snaží vysvětlit tvorbu amyloidových fibril. Nejvíce diskutovanými jsou krystalizační a konformační hypotéza. Krystalizační hypotéza předpokládá, že agregace fibril je procesem polymerace. Jednou vzniklé ložisko amyloidu dále působí jako nukleační faktor pro další ukládání nových amyloidů (Pettersson a Konttinen, 2010). V širším smyslu může být molekulární proces agregace proteinů rozdělen na následující děje (Cohen et al., 2012): 1) Primární nukleace proces, při kterém vzájemnou interakcí monomerů vznikají nové agregáty. Tyto děje jsou závislé na koncentraci volných monomerních polypeptidů a na 15

17 množství již vzniklých agregátů. Procesem nukleace např. vznikají i již výše zmiňovaná vlákna aktinu. 2) Pomocí následných růstových procesů dochází ke zvětšování agregátů. 3) Disociační procesy jsou zásadní pro nastolení chemické rovnováhy na konci agregačního procesu. Jedná se o dynamický reverzibilní proces, ve kterém dochází k neustálé výměně proteinů mezi agregátem a prostředím. Disociační děje jsou výrazně pomalejší než procesy nukleace a růstu, což umožňuje vznik agregátů. A Konformační hypotéza předpokládá chybné prostorové uspořádání prekurzoru, který se stává odolným vůči proteázám, a indukuje tak chybné prostorové uspořádání i u dalších bílkovin (Ryšavá, 2013). Potenciálně patogenní špatně složené proteiny se mohou tvořit různými způsoby (Merlini a Bellotti, 2003), avšak vytváření fibril začíná obvykle tvorbou protofilament, která jsou 2,5 3,5 nm široká (Pettersson a Konttinen, 2010; Chinisaz et al., 2014). Mají antiparalelní průběh (ve kterém jsou N- a C-konce orientovány v opačných směrech) a obtáčejí se spirálovitě okolo sebe. Jejich počet v jedné fibrile může kolísat podle typu prekurzoru, obvykle se pohybuje mezi dvěma až šesti. Výsledkem jsou amyloidové fibrily dlouhé až 1µm a široké 7,5 10 nm s typickým uspořádáním v β strukturu skládaného listu. Fibrily jsou uniformní, uspořádané a nevětvené. Ve fibrilární formě proteinů převládají vodíkové vazby mezi amidy a karbonylovými skupinami hlavního řetězce nad specifickými interakcemi postranních řetězců (Merlini a Bellotti, 2003). Antiparalelní strukturální organizace je potřebná pro pokračování procesu polymerizace amyloidu a je nezbytná pro hydrofobní jádro proteinu (Sukhanova et al., 2012). Struktura β-skládaného listu je stabilnější než struktura α-helix, neboť je posílena interakcemi mezi rozvinutými polypeptidovými řetězci, kdy dochází k vazbám i mezi vzdálenými částmi řetězce (Ryšavá, 2013). Skládání nově syntetizovaného polypeptidu nastává v rychlém sledu konformačních modifikací v cytoplazmě, které vyvolávají tvorbu částečně strukturovaných meziproduktů (Merlini a Bellotti, 2003; Pettersson a Konttinen, 2010; Chinisaz et al., 2014). Konformační změna z nepravidelné na uspořádanou strukturu je pomalejší než následná oligomerizace, kdy se vzniklé meziprodukty dále spojují do malých oligomerů se strukturou β skládaného listu, které jsou obvykle stabilizovány intermolekulárními hydrofobními interakcemi (Pettersson a Konttinen, 2010; Sukhanova et al., 2012; Chinisaz et al., 2014). Dalším mechanismem tvorby fibril může být změna v primární struktuře, a to nahrazením jedné aminokyseliny, jako je tomu u hereditárních amyloidóz (viz dále) (Merlini a Bellotti, 2003). V neposlední řadě se může jednat o mechanismus proteolytické remodelace proteinového prekurzoru, jako je tomu v případě β-amyloidového proteinového prekurzoru 16

18 (APP) u Alzheimerovy choroby. Tyto mechanismy mohou působit samostatně nebo ve spojení s některým dalším. Všechny typy amyloidu mají kromě specifické fibrilární komponenty také nefibrilární složky, jako jsou polysacharidy, proteiny a anorganického ionty (Merlini a Bellotti, 2003; Petterson a Konttinen, 2010; Ryšavá 2013). Pozornost se vztahuje na společnou P komponentou (AP), jejímž cirkulujícím prekurzorem je pentamerický sérový amyloidový protein P (SAP), který patří do rodiny pentraxinu a řadí se mezi proteiny akutní fáze. P složka je tvořena 10 glykosylovanými polypeptidovými podjednotkami, které vytvářejí dvě pentamerní matrice pootočené proti sobě o polovinu jednotky. AP spojuje amyloidové fibrily nezávisle na proteinovém původu v kompaktní hmotu a tvoří 5 15% váhy amyloidových depozit. SAP za fyziologických podmínek v organismu chrání buněčný chromatin před působením protilátek, virů a bakterií, pravděpodobně prostřednictvím Ca 2+. Pro tvorbu amyloidových depozit má SAP delší poločas přežívání v plasmě a pro jeho vazbu na amyloidové fibrily je nezbytná přítomnost glykosaminoglykanů. Pokud se na něj naváže kalcium, stává se SAP rezistentním vůči proteolytické degradaci, což zřejmě přenáší i na amyloidová depozita. Kromě dvou základních složek (fibril a P komponenty) se na formaci amyloidových depozit podílejí ještě apolipoproteiny (především ApoE, ApoJ) a již zmíněné glykosaminoglykany (např. heparansulfát) (Ryšavá, 2013). Ty mají vliv na přeměnu solubilních prekurzorů na nerozpustné fibrily a podporují tím uspořádání do formace β- skládaného listu. Nefibrilární složky amyloidových depozit mohou usnadňovat počáteční fázi nukleace fibril a mohly by mít roli v lokalizaci amyloidových depozit v tkáních (Merlini a Bellotti, 2003). Vědci se domnívají, že úplný, neporušený proces amyloidózy byl vybrán evolucí, protože funguje jako poslední řešení pro špatně složené proteiny a peptidy k zajištění toho, že špatně složené molekuly jsou koncentrovány v jedné části buňky nebo tkáně, čímž jsou omezeny jejich možné patologické interakce s fyziologickými molekulami. Tento systém omezuje také účinek špatně složených molekul (Sukhanova et al., 2012). 17

19 1.2 Faktory přispívající k tvorbě amyloidu Přirozená struktura proteinu sama o sobě nekonvertuje snadno k amyloidovému stavu, k přeměně struktury jsou zapotřebí příznivé okolní podmínky (Chinisaz et al., 2014). Ve většině případů právě různé genetické i okolní události mohou iniciovat transformaci velmi rozdílných peptidů nebo proteinů z jejich fyziologických struktur k patologickým komplexům (Sukhanova et al., 2012) Faktory okolního prostředí Na tvorbu agregátů mají velký vliv i podmínky okolního prostředí. Tyto okolnosti vyvolávají mutace, které vedou k různému překroucení přirozené konformace na strukturu částečně složeného meziproduktu (Chrunyk, 1993; Fink, 1998; Iram a Naeem; 2014). Podmínky mikroprostředí tedy ovlivňují ultrastrukturální organizaci proteinových depozit (Merlini a Bellotti, 2003). Modifikace prostředí mohou být vyvolány změnami v teplotě, ph, iontové síle, oxidaci, osmolyty a dalšími parametry, které také narušují strukturu proteinu (Chrunyk, 1993; Fink, 1998; Merlini a Bellotti, 2003; Iram a Naeem; 2014). Například změna teploty vede k destrukci vodíkových vazeb proteinu bez ovlivnění peptidových můstků (Sukhanova et al., 2012). Teplotní rozklad způsobuje ztrátu proteinové 3D struktury a následně biochemických funkcí. Změna teploty může také vyvolat tvorbu amyloidu z proteinů nebo peptidů. Změna iontové síly může vyvolat amyloidovou přestavbu, čímž se zvyšuje stabilita daného proteinu. Příkladem je amylin nebo ostrůvkový amyloidový polypeptid (IAPP). Nadprodukce IAPP je zodpovědná za smrt pankreatických β-buněk. Vlastnosti amyloidu IAPP jsou určeny nepřítomností významné iontové síly blízko aniontové buněčné membrány pankreatických β-buněk. Tento nedostatek tvoří abnormální prostředí blízko buněčné membrány, která zvyšuje nestabilitu IAPP peptidů a vede tak k jejich přestavbě na amyloidovou formu. Přeskládané peptidy mají tendenci k agregaci a tvoří malé rozpustné agregáty. PH například ovlivňuje zpracování imunoglobulinových lehkých řetězců, což je přiměje k tvorbě buď fibrilárních amyloidových agregátů nebo amorfních agregátů charakteristických pro chorobu z ukládání lehkých řetězců (LC) (Merlini a Bellotti, 2003). Na mikroprostředí závisejí také specifické sekvence aminokyselinových zbytků, které existují v primární struktuře proteinu náchylného k amyloidóze (Sukhanova et al. 2012). Pozitivně nabité aminokyselinové zbytky zvyšují preferenci α-helix sekundární struktury, zatímco aromatické aminokyselinové zbytky tvoří především β strukturu skládaného listu. 18

20 Současné studie však prokázaly, že některé amyloidové proteiny vykazující amyloidózové chování, i když dané aminokyselinové sekvence v jejich struktuře chybí, a naopak. Přítomnost sekvencí obsahujících pozitivně nabité a aromatické aminokyselinové zbytky není tedy nezbytná pro amyloidový proces, ale výrazně zvyšuje riziko proteopatie. Na vzniku amyloidových prekurzorů mohou mít vliv i některé další faktory. Jedněmi z nich jsou např. AGE (produkty pokročilé glykace proteinů), jejichž zvýšené hladiny pravděpodobně modifikují i β 2 M, čímž přispívají k jeho zvýšené reaktivitě a tvorbě depozit u Aβ 2 M amyloidózy, nebo AEF, tkáňový extrakt vyrobený z amyloidem zatížených orgánů (Pettersson a Kontinen, 2010; Ryšavá, 2013). Je schopen urychlovat vznik amyloidu. Jedná se pravděpodobně o lysozomální proteázu neutrofilních leukocytů nebo makrofágů, jejíž přesné složení není doposud známé, ale byla popsána její funkční aktivita. Objevuje se ve tkáních hodin před vlastním ukládáním amyloidu. Na její aktivitu by mohly mít vliv i některé růstové faktory, jako například faktory stimulující kolonie (G CSF, M CSF). Další patogenetický model předpokládá přímý vliv volných lehkých řetězců na metabolismus mezangiálních buněk ledvin (Ryšavá, 2013). Váží se na povrch mezangiálních buněk, čímž intracelulárně spouští některé signální děje. Aktivované mezangiální buňky mohou zvýšeně exprimovat enzymy, které vedou k destrukci extracelulární matrix, kam se následně ukládají amyloidové fibrily. Již uvedené nefibrilární složky amyloidových depozit, mezi něž patří i glykosaminoglykany a sérový amyloid P (SAP), mohou také urychlovat sjednocení rozpustných polypeptidů do stabilnějších fibril a stabilizovat tak amyloid (Merlini a Bellotti, 2003; Pettersson a Konttinen, 2010) Genetické faktory Dalším přispěním ke vzniku některých forem amyloidózy může být mutace v genu, který kóduje vznik daného prekurzoru (Ryšavá, 2013). Je-li důsledkem mutace změna sekvence aminokyselin v proteinu, stávají se takto patologicky změněné bílkoviny obtížně degradovatelné pro chybné prostorové uspořádání a v důsledku toho snáze tvoří agregáty fibril a následně depozita amyloidu (týká se většiny familiárních forem amyloidózy). Určují se dvě skupiny genetických mutací, které mohou vyvolat tvorbu k amyloidu náchylných proteinů: nonsense mutace, které dávají vznik krátké formě proteinu, a missense mutace, které mění odpovídající si aminokyselinové zbytky proteinu (Sukhanova et al., 2012). 19

21 Nonsense mutace může radikálně změnit termodynamiku počátečního skládání proteinu (př. α-synuklein) (Sukhanova et al., 2012). Tento protein se může také skládat do konformeru s β-strukturou skládaného listu, známý projevem k amyloidu náchylnému chování a zodpovědný za objevení proteinových plak (např. uvnitř neuronů tzv. Lewyho tělíska, která jsou charakteristická pro Parkinsonovu nemoc). Missense mutace jsou způsobeny různými modifikacemi aminokyselinových zbytků v primární struktuře proteinu a mohou drasticky změnit chování proteinů, neboť jim dávají silnější pro-amyloidovou primární strukturu (např. γ-synuklein) (Sukhanova et al., 2012). Kromě toho, tyto mutace mohou také poskytnout doplňující interakční domény u proteinů příbuzných s proteiny náchylnými k amyloidóze, takto nepřímo zvyšují jejich amyloidózové chování. Velmi málo peptidů této formy, které jsou známy jako k amyloidóze náchylné, jsou uvolňovány za normálních fyziologických podmínek. Některé mutace, které nepřímo souvisejí s chováním amyloidového proteinu, mohou také hrát významnou roli v proteinové patologii (např. nitrace α-synukleinu oxidem uhličitým vyvolá přestavbu tohoto proteinu na konformer s β-strukturou skládaného listu). 2. AMYLOIDÓZY 2.1 Obecná charakteristika Amyloidózy patří do skupiny konformačních onemocnění, pro která je charakteristické ukládání špatně složených proteinových hmot fibrilární struktury do extracelulárního prostoru různých tkání a orgánů, čímž narušují jejich strukturu a funkci (Benson, 2003; Desport et al., 2012; Loo et al., 2011; Pinney a Hawkins, 2012). Nejedná se o klinicko-patologickou jednotku, ale o obecný patologický fenomén společný pro heterogenní skupinu onemocnění s různými příčinami, odlišnou léčbou a prognózou. Společnou vlastností této skupiny onemocnění je způsob patogeneze ukládajícího se proteinu, který se nazývá amyloid (Loo et al., 2011). Termín amyloid byl poprvé použit v 19. století v botanice pro označení škrobových substancí obsažených v rostlinách (Sipe et al., 2010). V medicíně jej pak v roce 1854 použil Rudolf Virchow pro popis tkáňových depozit, které mají velmi podobný vzhled 20

22 právě jako zmíněné substance v rostlinách (Buxbaum a Linke, 2012; Sipe et al., 2010). V roce 1878 zavedl Paul Ehrlich pro popis vzhledu amyloidových depozit nový pojem - metachromatický (Ryšavá, 2013). Amyloid je agregovaný protein ve formě nerozpustných fibril, které jsou velmi dlouhé a nevětvené (Buxbaum a Linke, 2012; Härd a Lendel, 2012; Iram a Naeem, 2014; Sipe et al., 2010). Morfologie vláken se může lišit, ale všechny amyloidové fibrily mají charakteristickou sekundární strukturu β-skládaného listu. Fibrily mohou být odvozené od různých nebo i stejných prekurzorů, za odlišných podmínek známých jako amyloidózy (Buxbaum a Linke, 2012; Härd a Lendel, 2012). V současnosti je identifikováno a uznáno 30 lidských extracelulárních amyloidogenních fibrilárních prekurzorů tvořících amyloidová depozita (Desport et al., 2012; Härd a Lendel, 2012; Loo et al., 2011; Ryšavá, 2013; Sipe et al., 2010). Navzdory heterogenním skupinám a funkcím, všechny tyto proteiny mohou tvořit morfologicky nerozeznatelné amyloidové fibrily (Merlini a Belloti, 2003). Amyloidová struktura je nyní považována za běžnou formu, které může potenciálně dosáhnout jakýkoliv protein (Chinisaz et al., 2014) Rozdělení amyloidóz Dříve byly amyloidózy rozdělovány na primární (AL amyloidóza), sekundární neboli reaktivní (AA amyloidóza), tvořící tumory a asociované s mnohočetným myelomem (Ryšavá, 2013). Dnes je toto dělení však překonané a zastaralé, a proto se používá dělení amyloidóz podle rozsahu postižených orgánů na systémové a lokalizované formy (Härd a Lendel, 2012; Loo et al., 2011). Lokalizované postihují pouze jeden orgán nebo typ tkáně, zatímco systémové formy napadají více orgánů. Amyloidózy lze také rozlišovat podle typu amyloidogenního proteinového prekurzoru (jak již bylo uvedeno, lidských existuje 30, viz tab. č. 1) a dále podle příčiny, která způsobila zvýšenou nadprodukci daného prekurzoru, na získané nebo hereditární (dědičné) formy (Bhat et al., 2010; Johnson et al., 2012; Sipe et al., 2010). Tabulka č. 1: Amyloidové proteiny, jejich prekurzory a onemocnění Amyloidový protein Prekurzor Forma poškození Syndrom nebo postižené orgány AA sérový amyloid A systémová autoinflamatorní syndromy Aβ proteinový prekurzor Alzheimerova choroba, cerebrální Aβ lokalizovaná (AβPP) amyloidová angiopatie 21

23 AL imunoglobulinové lehké systémová asociovaná s mnohočetným řetězce (lokalizovaná) myelomem AH imunoglobulinové těžké systémová asociovaná s mnohočetným řetězce (lokalizovaná) myelomem Aβ 2 M β 2 - mikroglobulin systémová (lokalizovaná) chronická hemodialýza, klouby ATTR transtyretin systémová familiární amyloidová polyneuropatie senilní systémová amyloidóza AApoA I apolipoprotein AI familiární amyloidóza systémová (aorta, meniskus) (lokalizovaná) ledviny, játra, srdce AApoA II apolipoprotein AII systémová familiární amyloidóza, ledviny, srdce AApoA IV apolipoprotein AIV systémová sporadická, amyloidóza asociovaná se stárnutím APrP prionové proteiny lokalizovaná Creutzfeld-Jakobova choroba alternativně získaná, familiární, Gerstmann-Sträussler-Scheinkerova choroba, fatální familiární insomnie, spongiformní encefalopatie ABri ABri proteinový systémová/ prekurzor (ABriPP) lokalizovaná? britská familiární demence ADan ADan proteinový dánská familiární demence lokalizovaná prekurzor (ADanPP) (katarakta, hluchota, demence) ACys cystatin C systémová familiární amyloidóza, cerebrální amyloidová angiopatie AGel gelsolin systémová finská hereditární amyloidóza, familiární amyloidóza ALys lysozym systémová familiární amyloidóza, ledviny, játra, slezina AIAPP ostrůvkový amyloidový ostrůvky slinivky břišní (diabetes lokalizovaná polypeptid (amylin) mellitus, inzulinom) AIns inzulin lokalizovaná iatrogenně vznikající v místech aplikace inzulinu AFib fibrinogen α-řetězec systémová familiární amyloidóza, ledviny ALect-2 leukocytární chemotaktický faktor 2 systémová ledviny ACal (pro) kalcitonin lokalizovaná C buňky u nádorů tyreoidey AANF axiální natriuretický peptid lokalizovaná srdce APro prolaktin lokalizovaná adenohypofýza, stárnutí hypofýzy, prolaktinomy ASPC plicní surfaktant lokalizovaná plíce AGal7 galektin 7 lokalizovaná kůže ACor corneodesmosin lokalizovaná epitel rohovky, vlasové folikuly AMed lactadherin lokalizovaná senilní aorta, cévní stěna AKer kerato-epitelin lokalizovaná familiární amyloidóza, dystrofie 22

24 rohovky ALac laktoferin lokalizovaná v rohovce při trichiáze ASem1 semenogelin 1 lokalizovaná atrofie semenných váčků AOaap odontogenní s ameloblastem asociovaný protein (Sipe et al., 2010 upraveno) lokalizovaná u kalcifikovaných odontogenních tumorů Přestože se používá určité dělení, některé amyloidózy nelze přesně zařadit do dané skupiny. U některých amyloidóz není jisté, jestli vedle jejich lokalizované formy, neexistuje ještě forma systémová a naopak, např. ABri amyloidóza nebo AH amyloidóza. Některé amyloidózy se zase mohou vyskytovat jak v získané, tak v hereditární podobě. Každá podoba poté může způsobovat jiné poškození organismu, jedná se například o ATTR amyloidózu Poškození organismu a klinické projevy Amyloidóza je skupina onemocnění spadající mezi onemocnění konformační a to proto, že patologické proteiny mají sníženou stabilitu a silnou tendenci k získání více než jedné konformace (Merlini a Bellotti, 2003). Dochází při nich tedy k ukládání špatně složeného proteinu do extracelulárního prostoru tkání a orgánů, čímž narušují jejich strukturu a funkci (Benson, 2003; Desport et al., 2012; Loo et al., 2011). Místo ukládání může záviset na několika souběžných faktorech podporujících tvorbu fibril, například vysoká koncentrace lokálního proteinu, nízké ph, výskyt proteolytických procesů a přítomnost fibrilárních jader (Merlini a Bellotti, 2003). Velmi důležitým faktorem pro vznik amyloidózy je také věk (Härd a Lendel, 2012). Onemocnění se většinou projevuje mezi rokem života, z čehož vyplývá, že zasahuje především postarší jedince. Jsou však známy i případy pacientů mladších 40. nebo starších 80. let (Ryšavá, 2013). Množství onemocnění, která způsobují, zahrnují všechna běžná neurodegenerativní onemocnění, včetně Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby, a různé poruchy jako je diabetes mellitus II. typu (Härd a Lendel, 2012; Potter et al., 2009). Intenzita poškození závisí na typu amyloidózy, vnějším i vnitřním prostředí a v případě hereditárních amyloidóz i na typu mutace v genu pro daný amyloidogenní prekurzor. Jak již bylo uvedeno, podle rozsahu poškození můžeme amyloidózy dělit na systémové a lokalizované (Härd a Lendel, 2012; Loo et al., 2011). Systémová amyloidóza postihuje více než jeden orgán nebo typ tkáně. Lokalizovaná amyloidóza je méně častá a 23

25 ovlivňuje jednotlivé orgány, typicky jsou to střeva nebo ledviny. Zasažené orgány mají bledý tukově voskový vzhled a jsou tužší a těžší (Ryšavá, 2013). Příznaky projevující se v důsledku ukládání amyloidu mohou často napodobovat jiné stavy, což vede k obtížnému stanovení správné diagnózy. 2.2 AL amyloidóza AL amyloidóza je celkově nejčastějším typem amyloidózy, až 70% všech případů (Desport et al., 2012; Ščudla et al., 2013). Její odhadovaná četnost výskytu je asi 8 10 pacientů na 1 milion obyvatel. Jedná se o onemocnění vyznačující se pozvolnou monoklonální proliferací plazmocytů v kostní dřeni provázenou tkáňovou depozicí amyloidu, jehož prekurzorem jsou lehké řetězce (LC) monoklonálního imunoglobulinu (MIg) nebo jejich fragmentů (Benson, 2003; Desport et al., 2012; Loo et al., 2011). Více amyloidogenní jsou lambda λ LC oproti kappa κ LC v poměru asi 3:1 (Desport et al., 2012). Při nadprodukci mohou poškození způsobovat všechny typy imunoglobulinů (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) (Ščudla et al., 2013). AL amyloidóza může nastat také jako komplikace mnohočetného myelomu a dalších maligních hematologických onemocnění, jako je např. chronická lymfatická leukémie nebo Waldenströmova makroglobulinémie (Kourelis et al., 2013; Palladini a Merlini, 2013). Tento typ amyloidózy obvykle řadíme mezi systémová onemocnění postihující více tkání a orgánů (pouze v cca 19% případů se vyskytuje jen lokalizovaná forma Kyle et al, 1995). Postižení srdce bylo pozorováno u 65% pacientů, renální u 55% a jaterní u 20% pacientů (Ščudla a Adam, 2013) Nemocní, kteří mají AL amyloidózu z LC λ, mají predilekčně postižené ledviny a srdce, tam kde amyloidové fibrily obsahují LC κ, bývají dominantně postižená játra (Kumar et al., 2010; Perfetti et al., 2012). 2.3 ATTR amyloidóza Transtyretinová amyloidóza je nejčastější formou hereditární amyloidózy a mohli bychom ji zařadit také mezi amyloidózy systémové (Benson a Kincaid, 2007; Saraiva, 2001). Prevalence tohoto onemocnění se odhaduje celosvětově na 1: obyvatel, výskyt však 24

26 velmi kolísá v závislosti na regionu, z čehož vyplývá, že na projev tohoto onemocnění má výrazný vliv kromě variability fenotypové také vnější prostředí (Benson a Kincaid, 2007). Svými příznaky může velmi napodobovat AL amyloidózu (Picken, 2010). V případě ATTR amyloidózy dochází k mutaci v genu pro vlastní amyloidový prekurzor, transtyretin (Benson a Kincaid, 2007; Esplin a Gertz, 2013; Saraiva, 2001). Transtyretinový gen (TTR) je lokalizován na chromozomu 18 a je kódován čtyřmi exony (Benson a Kincaid, 2007; Esplin a Gertz, 2013). Mutace spojené s amyloidózou mohou nastat v exonu 2, 3 a 4, celkově bylo objeveno přes 100 mutací způsobujících ATTR amyloidózu (viz Tab. č. 2) (Benson a Kincaid, 2007; Esplin a Gertz, 2013; Ščudla et al., 2013). Většina z nich je následkem jednonukleotidových substitucí, z nichž nejčastější jsou Val30Met, Val122Ile a Val94Ala. Vzácně se mohou vyskytnout i dvounukleotidové substituce, které změní primární strukturu proteinu. Modifikovaný transtyretin je z 90% syntetizován v játrech, zbytek je produkován v plexus choroideus a v sítnici oka (Benson a Kincaid, 2007; Esplin a Gertz, 2013). Za normálních podmínek se transthyretin v séru vyskytuje jako tetramer složený ze čtyř identických monomerů. Díky pozměněné struktuře obtížně podléhá proteolýze a vytváří amyloidová depozita. Tabulka č. 2: Vybrané mutace v genu pro transtyretin Mutace Změna nukleotidu v kodonu Postižené orgány a klinické projevy Cys10Arg TGT - CGT Srdce, oko, periferní neuropatie Leu12Pro CTG - CCG Leptomeningeální Val20Ile GTC - ATC Srdce, syndrom karpálního tunelu Ser23Asn AGT AAT Srdce, periferní neuropatie, oko Pro24Ser CCT TCT Srdce, syndrom karpálního tunelu, periferní neuropatie Val28Met GTG - ATG Autonomní neuropatie, periferní neuropatie Val30Met GTG - ATG Periferní i autonomní neuropatie, oko, leptomeningeální Val30Ala GTG - GCG Srdce, autonomní neuropatie Val30Leu GTG - CTG Srdce, periferní neuropatie Val30Gly GTG - GGG Leptomeningeální, oko Val32Ala GTG - GCG Periferní neuropatie Arg34Thr AGA - ACA Srdce, periferní neuropatie Arg34Gly AGA - GGA Oko Ala36Pro GCT - CCT Oko, syndrom karpálního tunelu Asp38Ala GAT - GCT Srdce, periferní neuropatie Trp41Leu TGG - TTG Oko, periferní neuropatie Phe44Ser TTT - TCT Srdce, periferní neuropatie, autonomní neuropatie Glu51Gly GAG - GGG Srdce 25

27 Ser52Pro TCT - CCT Srdce, ledviny, periferní i autonomní neuropatie Gly53Glu GGA - GAA Srdce Glu54Leu GAG CTG (dvojitá substituce) Leu55Glu CTG - CAG Srdce, periferní i autonomní neuropatie His56Arg CAT - CGT Srdce Gly57Arg GGG - AGG Srdce Thr59Lys ACA - AAA Srdce, periferní i autonomní neuropatie Thr60Ala ACT - GCT Srdce, syndrom karpálního tunelu Ile68Leu ATA - TTA Srdce Lys70Asn AAA - AAC Oko, periferní neuropatie, syndrom karpálního tunelu Val71Ala GTG - GCG Oko, periferní neuropatie, syndrom karpálního tunelu Ile73Val ATA - GTA Periferní i autonomní neuropatie Tyr78Phe TAC - TTC Kůže, periferní neuropatie, syndrom karpálního tunelu Ala81Thr GCA - ACA Srdce Ala81Val GCA - GTA Srdce His88Arg CAT - CGT Srdce His90Asp CAT - GAT Srdce Ala91Ser GCA - TCA Srdce, periferní neuropatie, syndrom karpálního tunelu Glu92Lys GAG - AAG Srdce Val94Ala GTA - GCA Srdce, ledviny, periferní i autonomní neuropatie Ile107Phe ATT - TTT Periferní i autonomní neuropatie Ala109Ser GCC - TCC Periferní i autonomní neuropatie Leu111Met CTG - ATG Srdce Ser112Ile AGC - ATC Srdce, periferní neuropatie Tyr116Ser TAT - TCT Periferní i autonomní neuropatie, syndrom karpálního tunelu Ala120Ser GCT - TCT Srdce Val122Ile GCT - TCT Srdce Val122 GCT - Srdce, periferní neuropatie Val122Ala GCT - GCC Srdce, oko, periferní neuropatie (Benson, 2003; Benson a Kincaid, 2007 upraveno) Studie transtyretinové amyloidózy postupně vedly k objevení dalších typů hereditárních amyloidóz (ACys, AFiB, AApoAI, AApoAII a další) (Benson a Kincaid, 2003). Celkový počet genů, které kódují prekurzorový protein pro tvorbu amyloidu, je prozatím 22 (ABri, ADan, Apo AI, Apo AII, Apo CIII, APP, APrp, Aβ 2 M, Aβ, CIAS, CST 3, FGA, GSN, LYZ, MEFV, MVK, NLRP 12, NOD 12, TNFRSF 1A, TTR, SAA 1) (Kufová et al., 2014). Hereditární formy amyloidóz jsou obecně charakterizovány autozomálně dominantním přenosem, pomalou progresí onemocnění a odlišnou penetrancí (Benson, 2003; Ryšavá, 2013). Jde většinou o heterozygotní stav s mutací na jedné alele (Benson a Kincaid, 2007). Druhá alela může, ale nemusí nést mutaci v příslušném genu. Jelikož se jedná o autozomálně dominantní onemocnění, ke klinickému projevu stačí pouze jedna mutantní alela. Pokud 26

28 druhá alela mutaci vykazuje, vzniká homozygotní stav, u kterého lze předpokládat závažnější průběh onemocnění, tak jako je tomu u většiny autozomálně dominantních dědičných onemocnění. Bylo však zjištěno, že na ukládání amyloidu se může podílet také tzv. wild type forma transtyretinu (Picken, 2010; Ščudla et al., 2013). Jedná se o přirozenou formu proteinu, která se za normálních okolností vyskytuje v každém lidském organismu a nezpůsobuje žádné patologické stavy. Tento typ amyloidózy je považován za získanou formu, zvanou senilní systémovou amyloidózou (SSA). Napadá zejména srdce, ale objevuje se také v plicích, cévních stěnách jakéhokoliv orgánu a karpálním tunelu. Průběh bývá asymptomatický, a proto je většinou až nálezem pitevním. 3. DIAGNOSTIKA AMYLOIDÓZ Amyloidóza je vzácné obtížně diagnostikovatelné onemocnění. Nedostatečně zvládnuté diagnostické metody jsou často důvodem falešně negativních vyšetření. Časná a přesná diagnóza je však obtížná, poněvadž neexistuje žádný samostatný laboratorní ukazatel, ani zobrazovací technika, které by umožnily jednoznačné určení typu nemoci (Gertz, 2013), a je komplikovaná mnoha faktory (Benson a Kincaid, 2007; Leung et al., 2012; Loo et al., 2011; Merlini a Bellotti, 2003), mezi něž patří: nedostatečné uvážení amyloidózy v počátečním hodnocení pacienta přehlédnutí amyloidových depozit v časných stádiích onemocnění variabilita ukládání amyloidových depozit v tkáních stále se rozšiřující počet rozpoznaných amyloidogenních proteinů překrývání fenotypů onemocnění různých podtypů amyloidů velké množství příznaků a syndromů, které mohou být způsobeny běžnějšími patologickými podmínkami Stanovení správné diagnózy je velmi důležité pro určení prognózy a zavedení vhodné léčby, která zahrnuje radikální a agresivní postupy lišící se u jednotlivých typů amyloidóz (Loo et al., 2011; Merlini a Bellotti, 2003). Specifická léčba pro určitý typ amyloidózy může být totiž nevhodná a dokonce škodlivá pro jiný typ amyloidózy. 27

29 3.1 Laboratorní průkaz amyloidu Diagnostický přístup je multidisciplinární a vyžaduje pečlivé klinické hodnocení kombinované s různými metodami, testy a analýzami (Merlini a Bellotti, 2003). Kompletní diagnostika amyloidu se provádí ve dvou krocích (Linke, 2012). Nejprve je nutný histologický průkaz amyloidových depozit v tkáních, a poté následuje stanovení chemického složení amyloidu, které určí, o jaký typ amyloidózy se jedná Histologický průkaz amyloidových depozit Pro diagnostiku jakéhokoliv typu amyloidózy je požadována tkáňová biopsie pro průkaz ukládání amyloidu v tkáních (Benson a Kincaid, 2007; Leung et al., 2012). Biopsie může být z postiženého orgánu, je tak dosaženo nejvyšší citlivosti a specifity (Benson, 2003; Benson a Kincaid, 2007; Leung et al., 2012). Provádí se u orgánů, jako jsou ledviny, nervy, játra nebo srdce (u srdce se provádí spíše elektrokardiografie, echokardiografie nebo magnetická rezonance), a citlivost biopsie těchto orgánů je vyšší než 90%. V případě, že je biopsie postižené tkáně nepraktická nebo je nebezpečná, provede se biopsie z nespecifického místa, která představuje pro pacienta menší riziko (Benson, 2003; Benson a Kincaid, 2007; Gertz et al., 2005; Leung et al., 2012). Nejjednodušší způsob je odsátí abdominálního tuku, má citlivost až 80%. Relativně vysokou citlivost má také biopsie sliznice žaludku nebo konečníku. Může být provedena biopsie kostní dřeně, která může také obsahovat amyloidová depozita, ale citlivost se pohybuje pouze kolem 50%. Dále se provádí biopsie slinných žláz, dásně nebo kůže. Vzorek odebrané tkáně se dále zpracovává pro následující vyšetření, která se provádějí na zamražených řezech, formalinem fixovaných a do parafínu zalitých řezech nebo na řezech vložených do hydroxyletylmetakrylátu (Leung,et al., 2012; Linke, 2012; Ryšavá, 2013). Tloušťka řezů by se měla pohybovat mezi 5 až 10µm Barvení konžskou červení Základem histologicky přesné diagnózy amyloidózy je pozitivní barvení amyloidových depozit konžskou červení a následný zelený dvojlom neboli dichroizmus pozorovaný pod polarizovaným světlem (Bauxman a Linke, 2012; Gerrz, 2004; Gertz et al., 2005; Leung et al., 2012; Linke, 2012; Loo et al., 2011; Pettersson a Konttinen, 2010; Ryšavá, 28

30 2013). Všechny formy amyloidu vykazují afinitu ke konžské červeni pravděpodobně díky své β-konformaci, která se mnohonásobně opakuje (Bauxman a Linke, 2012; Pettersson a Konttinen, 2010). Přesný mechanismus, který je zodpovědný za vazbu konžské červeně na amyloidové fibrily, však ještě není znám. Při barvení konžskou červení se amyloidová depozita jeví jako oranžovo-červené okrsky amorfní hmoty (Linke, 2012). Samotné barvivo může vázat i mnoho jiných složek než amyloid, proto pro průkaz amyloidových depozit musí vzorek obarvené tkáně vykazovat ještě zelený dvojlom pod polarizovaným světlem. Zelený dvojlom by však neměl být zaměňován se žluto-zeleným dvojlomem kolagenu, a ačkoli je zelený dvojlom velmi specifický pro amyloid, nastává i pro celulózu, a proto by se mělo co nejlépe zabránit kontaminaci vzorku (Leung et al., 2012). Průkaz amyloidu ve vzorcích tkáně je ovlivňován různými vlivy, například nerovnoměrnou distribucí amyloidu v orgánu na počátku onemocnění, různou intenzitou zbarvení, odlišnou vazbou barviva na různé typy amyloidu nebo tloušťkou histologických řezů (Linke, 2012; Ryšavá, 2013). Dříve se pro průkaz amyloidu používaly i jiná barviva, jako krystalová violeť, kdy se depozita barvila fialově červeně, nebo thioflavin S (ThS) a T (ThT), kde depozita vykazovala zelenožlutou fluorescenci (Bauxman a Linke, 2012; Leung et al., 2012). Vzhledem k tomu, že ThT a ThS se váží i k jiným částem tkáně, nejsou zcela vhodné pro diagnostickou histologii, a proto se dnes už nepoužívají Elektronová mikroskopie a rentgenová difrakce Tyto dvě metody se běžně klinicky téměř nepoužívají, jsou považovány spíše za vedlejší, pomocné metody pro diagnostiku amyloidu (Linke, 2012; Pettersson a Konttinen, 2010). Elektronová mikroskopie umožnila pochopit vzhled amyloidových depozit. Jedná se o shluky amyloidových fibril, které jsou uspořádané náhodně, jsou nevětvené a jejich průměr je 5 12 nm (Bauxman a Linke, 2012; Leung et al., 2012; Petterson a Konttinen, 2010). Rentgenová difrakční analýza odhalila, že amyloidová vlákna mají konformaci uspořádanou do β struktury skládaného listu a že polypeptidová páteř je kolmá na osu fibril (Bauxman a Linke, 2012; Gertz et al., 2005; Sipe a Cohen, 2000). 29

31 3.1.2 Identifikace typu amyloidu Každá amyloidóza identifikovaná v tkáních musí být přesně klasifikována s cílem poskytnout lékařům pevný základ pro terapii (Linke, 2012). Typizování amyloidu tedy představuje identifikování chemické podstaty vlastního amyloidového proteinu (Linke, 2012). Nejpoužívanější metodou je imunohistochemie, která je založená na protilátkách zaměřených proti amyloidu (Linke, 2012; Pettersson a Konttinen, 2010; Picken a Herrera, 2007). K dispozici jsou však také jiné metody, například hmotnostní spektrometrie, imunoelektronová mikroskopie, či imunofluorescenční mikroskopie. V případě identifikování hereditárního typu amyloidózy se používají různé DNA analýzy především pro určení sekvence aminokyselin (Linke, 2012). Typizování amyloidu představuje velmi těžký úkol a měly by být brány v úvahu různé okolnosti. Může dojít ke kontaminaci sérovými proteiny, k omezené reaktivitě s komerčními protilátkami, nebo například u pacienta se nacházejí smíšená depozita (Loo et al., 2011; Picken a Herrera, 2007). Určení primárního onemocnění a klinický obraz pacienta mohou pomoci při typizování (Loo et al., 2011; Pettersson a Konttinen, 2010). Se vznikem výrazně odlišných léčebných procedur, namířených proti konkrétnímu typu amyloidu, typizování zvyšuje klinický význam a mělo by být prováděno s velkou opatrností (Picken a Herrera, 2007). První amyloid identifikovaný a chemicky charakterizovaný byl lidský imunoglobulinový lehký řetězec izolovaný z tkáně pacienta (Bauxman a Linke, 2012) Imunohistochemie Při této metodě se využívá imunohistochemického značení amyloidu pomocí škály specifických protilátek (Gerrz, 2004; Gertz et al., 2005; Pettersson a Konttinen, 2010). Ve standardním spektru, které se používá pro běžné typizování, se vyskytují protilátky namířené proti amyloidům AA, AL, AH, ATTR, Aβ 2 M, AFib a AApoAI (Leung et al., 2012; Linke, 2012). Tyto protilátky jsou komerčně dostupné a pokrývají až 97% systémových amyloidů. V případě, že standardní spektrum neprokáže pozitivní reakci, použije se další spektrum protilátek namířených proti více vzácným typům amyloidu, jako je Aβ, APrP, ALys, ACys, AGel, AApoAII a další (Linke, 2012). Tyto protilátky by měly být dále zkoumány k prokázání jejich použitelnosti a spolehlivosti. 30

32 Každý typ amyloidu obsahuje sérový amyloid P, antisérum na tuto složku amyloidu poskytuje vhodnou pozitivní kontrolu pro imunohistochemické studie (Gerrz, 2004; Gertz et al., 2005; Leung et al., 2012). V imunohistochemii se využívá tzv. dvojitého důkazu (Linke, 2012). Ten je založen na tom, že pozitivní diagnóza je potvrzena negativními diagnózami, tedy vyloučením jiných amyloidových typů. Výhodou této metody je snadné provedení, cenová dostupnost, časová nenáročnost, a stanovená diagnóza se shoduje s klinickým obrazem pacienta. Imunohistochemie je vhodná pro již známé amyloidy, pro dosud neobjevené nebo velmi vzácné amyloidy je lepší použít metody proteomiky (viz dále). Problémem imunohistochemie jsou falešně negativní výsledky, které mohou vzniknout, když amyloid nereaguje s danou komerční protilátkou nebo reaguje pouze omezeně (Picken a Herrera, 2007). Existuje pro to několik vysvětlení: 1) Komerčně vyráběné protilátky se zaměřují proti konstantním oblastem (Gerrz, 2004; Leung et al., 2012; Loo et al., 2011; Picken a Herrera, 2007). Co se týká AL a AH amyloidu, fibrily mohou být odvozeny z variabilních částí imunoglobulinového řetězce, proto nejsou rozpoznány komerčními protilátkami. 2) Různé genetické mutace v amyloidových prekurzorech mohou způsobit ztrátu epitopu, na který se navazují protilátky (Leung et al., 2012; Loo et al., 2011). Tento problém může nastat u hereditárních amyloidóz, především u ATTR, která je z nich nejčastější. 3) A nakonec proces fixace formalinem vychytává sérové proteiny v tkáňových řezech a způsobuje tak kontaminaci, což vede k nespecifickému barvení pozadí, a lehké řetězce jsou omezeně detekovány (Leung et al., 2012; Loo et al., 2011; Picken a Herrera, 2007) Imunofluorescence Jedná se o metodu, která slouží pro průkaz jednotlivých typů amyloidů ve vzorcích (Leung et al., 2012). Využívají protilátky proti různým složkám imunitního systému (např. imunoglobuliny nebo části komplementu) (Ryšavá, 2013). Je nejužitečnější v případě amyloidu složeného z imunoglobulinových řetězců (Leung et al., 2012). Jelikož se v této technice používají protilátky, mohou nastat stejné problémy jako u imunohistochemie. 31