Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/

Transkript

1 Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/

2 Materiály k přednáškám z předmětu Mikrobiologie a virologie část mikrobiologie BOT/MVP a BOT/MVPX Katedra botaniky PřF UP v Olomouci RNDr. Barbora Mieslerová, Ph.D. Doc. RNDr. Michaela Sedlářová, Ph.D. VERZE LS 2010/2011 Byly inovovány v rámci projektu: Zvyšování konkurenceschopnosti studentů oboru botanika a učitelství biologie CZ.1.07/2.2.00/

3 IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ Postupy vedoucí k určení mikroorganismu jsou často značně složité a nezřídka i zdlouhavé Spočívají ve vyhodnocování mikroskopických kultivačních a biochemických znaků a vlastností mikrobů, které porovnáváme s popisy známých rodů a druhů uvedených v literatuře Bergey s Manual of determinative Bacteriology 1. Mikroskopické vyšetření morfologických vlastností tvar, velikost a seskupení buněk pohyblivost a umístění bičíků barvení dle Grama barvení spor barvení na acidorezistenci důkaz pouzder a inkluzí 2. Kultivační vlastnosti tvar a pigmentace kolonií na pevném médiu růst v tekutém médiu (např. v bujónu)

4 3. Fyziologické vlastnosti vztah ke kyslíku teplotní rozmezí pro růst rezistence k teplotě tolerance k NaCl citlivost ke žlučovým solím, na antibiotika 4. Biochemické testy využívání zdrojů uhlíku (např. glukózy, laktozy aj.) důkaz redukce dusičnanů, hydrolýzy škrobu, želatiny a eskulinu důkaz tvorby indolu, sirovodíku, acetoinu a dekarboxyláz lyzinu nebo ornitinu důkaz produkce některých enzymů, jako např. katalázy, oxidázy, fosfatázy, ureázy, koagulázy, ß-galaktozidázy aj. 5. Molekulárně biologické metody (analýza DNA štěpení, hybridizace, radioaktivní próby; PCR) 6. Doplňující testy zjištění sérologických vlastností, citlivosti k bakteriofágům. El. mikroskopie ultratenkých řezů buněk, chemická analýza buněčné stěny (přítomnost peptidoglykanů, teikoových kyselin), stanovení obsahu G + C v DNA a další

5 1. MIKROSKOPICKÉ HODNOCENÍ MIKROORGANISMŮ Mikroskopem můžeme stanovit pohyblivost mikrobů, jejich morfologii /vnější vzhled/, velikost a základní cytologické uspořádání buněčné. U bakterií je přímé mikroskopické určení až do druhů prakticky nemožné. Některé mikromycety určit můžeme. MIKROSKOPIE VE SVĚTELNÉM POLI v přímém působení světelných paprsků, osvětlení vestavěno v noze stativu. Imerzní objektivy používáme k prohlížení bakterií a jemných struktur, kde potřebujeme dosáhnout zvětšení kolem 1000x. Označení 2 čarami Mezi preparát a čelní čočku imerzního objektivu se umístí kapka imerzního oleje (tj. cedrový olej s indexem lomu 1,515 při teplotě 18 C). MIKROSKOPIE V TEMNÉM POLI při osvětlování šikmými paprsky předměty dávají kontrastní obraz; předmět září v zorném poli FÁZOVÝ KONTRAST Použití na preparáty způsobující fázovou modulaci světla (vliv indexu lomu). Při stejné amplitudě světelné vlny změna její fáze Zařízení fázového kontrastu slouží obecně k tomu, že přeměňuje fázové změny vlnění vzniklé po průchodu fázovým objektem na změny intenzity světla Do objektivu se vkládá fázová destička; V ohniskové rovině kondenzoru je prstencová fázová clonka. Zřetelnější rozlišení částic nezbarveného preparátu tak, že jsou struktury jasnější nebo tmavší než pozadí;

6 Obraz objektu v obrazovém ohnisku objektivu vzniká interferencí vlnění přímého, které jakoby procházelo preparátem beze změny, a vlnění difrakčního posunutého na fázovém objektu. Vzniklý obraz je nepozorovatelný, protože rozdíly v indexu lomu předmětu a okolí jsou velmi malé. Vlnění přímé a difrakční lze oddělit, což je velmi významné, protože to umožňuje modulovat amplitudu a fázi světla přímého bez ovlivnění světla difrakčního a naopak. Provádí se to tak, že se do obrazového ohniska objektivu umisťuje tzv. fázová deska (ve tvaru prstence), která posunuje fázi přímého světla a výsledkem interference obou druhů vlnění pak vzniká kontrastní obraz fázového objektu.

7 Normální obraz Zástin (temné pole) Fázový kontrast

8 FLUORESCENČNÍ MIKROSKOPIE schopnost některých sloučenin fluoreskovat při ozáření UV světlem. Jsou-li zmíněné látky přítomny v buňce (např. riboflavin, chlorofyl), mluvíme o primární fluorescenci (přirozené). Sekundární fluorescence je vyvolána zabarvením sledovaných částí fluoreskujícími barvivy tzv. fluorochromy. Sekundární fluorescenci lze využít pro detekci mikroorganismů, v diagnostice mykobakterií, při studiu povrchových struktur hub Buňka kvasinky Mycelium Morchella esculenta. Barvení DAPI

9

10 ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP Je obdobou optického mikroskopu, kde jsou fotony nahrazeny elektrony a optické čočky elektromagnetickými čočkami, což je vlastně vhodně tvarované magnetické pole. Využívá se toho, že vlnové délky urychlených elektronů jsou o mnoho řádů menší než fotonů viditelného světla. Proto má elektronový mikroskop mnohem vyšší rozlišovací schopnost a může tak dosáhnout mnohem vyššího zvětšení (až ). Rozdíl od světelného mikroskopu je 4 až 5 řádů. Transmisní (TEM) x rastrovací (= skenovací SEM)

11 Escherichia coli Listerie monocytogenes SEM Fotografie Golovinomyces cichoracearum (padlí)

12 Mikroskopování živých mikroorganismů NATIVNÍ PREPARÁT Nejčastěji používáme v diagnostice parazitologické, mykologické a bakteriologické (při sledování pohyblivosti a dělení bakterií). Podložní, krycí skla, vhodný roztok (destilovaná voda, fyziologický roztok) Chceme-li pozorovat mikroba delší dobu, abychom sledovali růst stále stejných buněk: Kochova komůrka pozorujeme mikroby ve visuté kapce Agarová komůrka pozorování suspenzí mikrobů nebo spor ve vytemperovaném agaru, okraje se zalepí sterilním parafinem či vazelínou. Kochova komůrka

13 MIKROSKOPICKÝ PREPARÁT BAKTERIÍ A HUB Kokální tvar bakterií Tyčinkovitý tvar bakterií Konidie a konidiofory r. Penicillium

14 VITÁLNÍ BARVENÍ Vitální barvení metylénovou modří (0,01%) (živé buňky nezbarvené) Vitální barvení kongo červení (0,01-0,05%) (živé buňky nezbarvené) Barvení cotton modří (1%) živá vlákna mikromycet se intenzivně barví, mrtvá jsou bezbarvá Pseudomonas aeruginosa Kongo červeň Oidium neolycopersici cotton blue

15 MIKROSKOPIE FIXOVANÝCH ORGANISMŮ Na čisté odmaštěné podložní sklo naneseme kapku mikrobiální suspenze nebo do kapky vody přeneseme mikroby z kultury na agarové plotně. Preparáty na podložním skle nejčastěji fixujeme protažením plamenem kahanu Fixování chemickými činidly methylalkoholem, ethanolem, acetonem

16 JEDNODUCHÉ BARVENÍ - slouží k rozlišení tvarů buněk. Barvení karbolfuschsinem Negativní barvení tuší Barvení spor - používá se na diferenciaci spor bacilů a klostridií DIAGNOSTICKÉ BARVENÍ MIKROORGANISMŮ Je barvící postup předepsaný typem barviv, jehož positivní či negativní výsledek je určovacím znakem při rozlišování mikrobů Nejvýznamnější Gramovo barvení bakterií

17 BARVENÍ KARBOLFUCHSINEM Escherichia coli Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisisae Bacillus subtilis

18 NEGATIVNÍ BARVENÍ Bacillus atrophaeus

19 BARVENÍ SPOR Spory jsou rezistentní tělíska vytvářená uvnitř buněk některých mikroorganismů. Velmi těžko se barví i po fixaci, neboť mají silný, špatně prostupný obal. Chceme-li spory obarvit, musíme použít koncentrovaná barviva za tepla nebo různá mořidla. Tím se uvolní stěna spory a stane se pro barvivo prostupnější. Takto obarvené spory se těžko odbarvují kyselinami a jinými sloučeninami (např. alkoholem), čehož se využívá k diferenciaci spor Barvení podle Wirtze a Conklina nátěr na podložním skle fixujeme teplem. Převrstvíme 5% vodným roztokem malachitové zeleně, necháme působit bez zahřívání 1-2 minuty a pak opatrně zahřejeme až do výstupu par. Barvivo nesmí vařit ani se odpařit. Po slití barviva barvivo znovu doplníme a postup ještě 2x zopakujeme. Opláchneme vodou a dobarvíme karbolfuchsinem 1-2 minuty. Těla baktérií se při tomto postupu obarví růžově, spory jsou zelené Bacillus subtilis

20 Ziehl-Neelsenovo barvení Zeihl-Neelsenovo barvení je metoda, jež se používá k průkazu tzv. acidorezistentních bakterií, konkrétně mykobakterií a nokardií a některých aktinomycet. Metodu objevili a popsali Franz Ziehl a patolog Friedrich Neelsen. Jedná se o jednu z nejpoužívanějších metod diagnostiky tuberkulózy. Princip barvení Metoda je založena na principu, že acidorezistetní bakterie mají schopnost přijímat zahřátá barviva (karbolfuchsin), která se udrží ve stěně i po následném odbarvení kyselým alkoholem. Postup Preparát fixovaný nad plamenem se přelije koncentrovaným karbolfuchsinem. Opláchne se vodou. Preparát se odbarví kyselým alkoholem (1% HCl v 70% etanolu), dokud neodtéká z preparátu čirý alkohol. Opláchne se vodou a dobarví se buď metylenovou modří nebo malachitovou zelení. Acidorezistentní bakterie se jeví po výsledném barvení červeně (až růžově) na modrém (v případě metylenové modři) nebo zeleném pozadí (v případě malachitové zeleně) (viz obrázek).

21 Mycobacterium tuberculosis

22 DIFERENCIÁLNÍ GRAMOVO BARVENÍ

23 SCHÉMA STAVBY G+ A G- BAKTERIÁLNÍ STĚNY Peptidoglykan (mukopeptid, murein) + teichoová kyselina lipoteichoová kys., polysacharidy + lipopolysacharidy, lipoproteiny

24 Micrococcus luteus Dále Staphylococcus aureus, Streptococcus, Bacillus subtilis Escherichia coli Dále Pseudomonas, Salmonella,

25 MĚŘENÍ MIKROORGANISMŮ Stanovení jejich velikosti Okulárové měřítko dílky stupnice Skutečná délka dílků závisí na délce tubusu a použitém objektivu Objektivový mikrometr stanovení velkosti 1 dílku Př. 12 dílků okulárové stupnice odpovídá 7 dílků objektivové stupnice (tj. 70 um), 1 dílek pak měří 70:12 = 5,8 um. V současné době měřítka jsou přímo vložena do snímacího zařízení počítač nám na obrázku ukáže měřítko, pokud zadáme správnou velikost použitého objektivu.

26 2. KULTIVAČNÍ URČOVÁNÍ MIKROORGANISMŮ Při této metodě nepozorujeme vlastní mikroorganismus co do jeho morfologie, ale sledujeme jeho životní projevy v tekutých i pevných médiích Volba média je dána především druhem mikroorganismu (jiná média volíme pro bakterie heterotrofní či autotrofní, jiná pro mikromycety) Kultivační živné půdy musí vyhovovat všem nárokům na živiny a současně musí mikroorganismům poskytovat podobné prostředí, jaké mají v přirozených substrátech, v nichž se v přírodě vyskytují a rostou. Kromě optimálního zastoupení živin musí živná média splňovat tyto podmínky: vhodná vlhkost optimální ph vhodný osmotický tlak optimální redoxpotenciál (vhodné aerobní a anaerobní podmínky) přítomnost růstových faktorů Neexistuje jediné univerzální kultivační médium které by umožňovalo kultivovat všechny druhy mikroorganismů

27 KULTIVAČNÍ MÉDIA Neexistuje univerzální médium, na kterém by rostly všechny bakterie! Podle konzistence: TUHÉ - agary - izolační TEKUTÉ - bujón pomnožovací POLOTEKUTÉ mají krémovitou konzistenci (obsahují nízkou koncentraci ztužující komponenty 0,5 % agaru nebo želatiny), slouží např. ke stanovení pohyblivosti bakterií, pro kultivaci anaerobů či k jiným speciálním účelům. Podle použití: Masopeptonový agar (MPA): ZÁKLADNÍ - MPA, krevní agar, bujón. masový extrakt 2,5 g SELEKTIVNÍ - Slanetz-Bartley agar pepton 10,0 g DIAGNOSTICKÉ - Endo-agar, Tergitol 7 chlorid sodný 5,0 g glukóza 5,0 g Podle přípravy: agar 15,0 g PŘIROZENÁ - z mléka, masového výluhu, rýže, destil.voda 1000,0 ml mrkve, bramboru, půdního extraktu SYNTETICKÁ - voda, min. látky, zdroj uhlíku, dusíku, stopové prvky, růstové faktory, vitamíny, aminokyseliny POLOSYNTETICKÁ - syntetické + pepton, kasein, sladina

28 UNIVERZÁLNÍ ŽIVNÉ PŮDY roste na nich velký počet fyziologicky různorodých mikroorganismů (např. masopeptonový agar). Vzhledem k metabolické různorodosti mikroorganismů, zejména bakterií, však nelze předpokládat, že by na nějaké živné půdě vyrostly absolutně všechny druhy mikrobů obsažené ve vzorku. Taková živná půda neexistuje SELEKTIVNÍ ŽIVNÉ PŮDY tyto půdy podporují svým složením růst pouze určité skupiny mikroorganismů a ostatní potlačují. Selektivity se dosahuje přidáváním některých chemikálií, barviv, antibiotik nebo i úpravou ph DIAGNOSTICKÉ ŽIVNÉ PŮDY - obsahují určitý substrát, který je schopna využívat pouze určitá skupina mikroorganismů a indikátor, signalizující využívání tohoto substrátu. Mikroorganismy na těchto půdách rostou v charakteristických koloniích. Příkladem je Endův agar, který je určen pro zjišťování schopnosti gram negativcních bakterií využívat laktózu jako zdroj uhlíku Indikátorem je siřičitanem odbarvený fuchsin. Bakterie využívající laktózu rostou na této půdě v podobě červeně zbarvených kolonií, ostatní jsou růžové nebo bezbarvé.

29 Kultivační půdy - příprava, složení

30 OČKOVÁNÍ ŽIVNÝCH PŮD

31 OČKOVÁNÍ ŽIVNÝCH PŮD

32 OČKOVÁNÍ ŽIVNÝCH PŮD

33

34 ROZDĚLENÍ MIKROORGANISMŮ PODLE VZTAHU KE KYSLÍKU OBLIGÁTNĚ AEROBNÍ jsou aktivní pouze v prostředí s dostatečnou koncentrací kyslíku (např. rody Pseudomonas, Mycobacterium, Vibrio, plísně a kvasinky) FAKULTATIVNĚ ANAEROBNÍ v přítomnosti kyslíku rostou obvykle lépe, mohou však růst i za jeho nepřítomnosti (např. rody Escherichia, Staphylococcus) MIKROAEROFILNÍ rostou v přítomnosti kyslíku, ale za nižší koncentrace než je ta atmosférická (asi 20%) a mikroaerofilové vyžadují koncentraci kolem 2% (např. rody Campylobacter, Lactobacillus) OBLIGÁTNĚ ANAEROBNÍ rostou pouze v nepřítomnosti kyslíku, který je pro toxický (např. Většina druhů rodu Clostridium)

35 CHARAKTER RŮSTU PODÉL VPICHU DO AGAROVÉ PŮDY (POUZE U BAKTERIÍ) Vpichem se očkuje 24 h stará bujónová kultura a kultivace při C a) Aerobní (v horní části vpichu), b)mikroaerofilní c) fakultativně anaerobní (rostou po celé délce vpichu), d)anaerobní mikroorganismy (rostou na spodní části vpichu)

36 AEROBNÍ KULTIVACE Aerobní mikroorganismy pěstujeme na Petriho miskách, šikmých agarech nebo v nízkých vrstvách kapalin Pro rychlé pomnožení aerobních mikroorganismů sycení kyslíkem - třepáním na třepačkách, aerací ANAEROBNÍ KULTIVACE Fakultativně anaerobní a mikroaerofilní mikroorganismy rostou v prostředí se sníženým obsahem kyslíku a zvýšeným tlakem CO 2. Očkujeme vpichem, rozmícháním do svislých agarů do vysokých vrstev kapaliny o malém povrchu, redukující látky. Obligátně anaerobní mikroorganismy rostou jen v prostředí bez kyslíku a kyslík je pro ně jedem. Z jejich kultivačního prostředí musíme odstranit kyslík -Přidáním redukujících sloučenin (siřičitan sodný, redukované železo) -Povařením tekuté půdy (zbavení kyslíku), -Kultivace v anaerostatech (vyčerpání kyslíku, nahrazení dusíkem, CO 2 ) -Soužití anaerobních organismů s aerobními (které spotřebovávají kyslík)

37 Anaerobní kultivační hrnec

38 HODNOCENÍ NAROSTLÝCH KOLONIÍ RŮST NA PEVNÝCH PŮDÁCH Rozlišení na BAKTERIÁLNÍ KOLONIE HOUBOVÉ KOLONIE

39 U BAKTERIÍ A KVASINEK ZJIŠŤUJEME: Tvar kolonií Povrch kolonií Okraj Reliéf Konzistenci kolonie: kašovitá, hlenovitá Transparenci kolonie Barva kolonie Změnu půdy v okolí kolonie Vrůstání kolonií do půdy

40 TYPY BAKTERIÁLNÍCH KOLONIÍ

41 MORFOLOGIE KOLONIÍ BAKTERIÍ Lactobacillus plantarum Staphylococcus aureus Okrouhlý tvar kolonií

42 Mycobacterium smegmatis Neznámý izolát Zvlněný tvar kolonií Laločnatý tvar kolonií

43 Neznámý izolát Sektorovitý tvar kolonií

44 TYPY PROFILU KOLONIÍ Pseudomonas aeruginosa Profil zvýšený Streptomyces albus Profil vypouklý

45 Streptococcus salivarius Tvar vypouklý Neznámý izolát Tvar knoflíkovitý

46 Bacillus licheniformis Tvar bradavčitý

47 TYPY OKRAJŮ KOLONIÍ Serratia marcescens Okraje hladké Bacillus anthracis Okraje vroubkované

48 Nocardia asteroides Okraje vláknité Thiomonas sp. Okraje prstovité (caput medusae)

49 Escherichia coli S koncentrickou stavbou Neznámý izolát Okraje svraštělé

50 Paenibacillus dendritiformis ve stresových podmínkách Rhizoidní okraje

51 Hladké (smooth) x drsné (rough) kolonie bakterií Rough colonies on blood agar (right) and smooth colonies on bicarbonate agar (left) of cultured Bacillus anthracis

52 3. FYZIOLOGICKÉ VLASTNOSTI Vyšetření na pohyblivost Lze k tomu použít nativní preparát připravený z vyšetřované kultury, který po překrytí krycím sklíčkem mikroskopujeme v zástinu nebo na temném poli. Nezaměnit s Brownovým pohybem. Kultivačním vyšetřením: kultura se očkuje do polotuhé agarové půdy s % agaru a má různé způsoby provedení: Do polotuhého média ve zkumavce očkujeme bakteriální kulturu vpichem do hloubky 4-5 cm, po inkubaci (1-3 dny) pohyblivé kultury prorůstají z vpichu celým médiem a vytvářejí zákal. Nepohyblivé kultury rostou jen ve vpichu. Důležitým diagnostickým znakem může být zjištění závislosti pohyblivosti na inkubační teplotě (např. Yersinia enterocolitica je pohyblivá při 22 C a nepohyblivá při 37 C). Odlišení blízkých rodů z č. Enterobactericeae (laktózapozitivních) Enterobacter pohyb + Klebsiella pohyb -

53 4. URČOVÁNÍ MIKROORGANISMŮ PODLE BIOCHEMICKÉ ČINNOSTI Mikroorganismy se vyznačují velmi bohatou biochemickou činností Rozmanitost této činnosti využití výroba antibiotik, různých organických kyselin, vitamínů, kvasné procesy Některé druhy biochemických reakcí jsou u jednotlivých mikroorganismů stálé, jsou pro ně typické a často jsou specifické pro jednotlivé druhy uvnitř rodu. schopnost fermentace různých sacharidů schopnost utilizace různých substrátů jakožto zdroje uhlíku hydrolýza určitých substrátů aktivita příslušných enzymů produkce specifických metabolitů schopnost hemolýzy různé další testy

54 A. SCHOPNOST FERMENTACE RŮZNÝCH SACHARIDŮ HYDROLÝZA ŠKROBU (DŮKAZ AMYLAS) Škrob je polysacharid, který se působením enzymů (α- i β-amylas) hydrolyzován přes dextriny až na disacharid maltosu (enzymy porušují glykosidické vazby). Škrob se barví jodovým roztokem modře, zatímco jeho rozkladné produkty barevnou reakci nedávají. Zkoumanou kulturu bakterií naočkujeme tenkou rovnou čarou na Petriho misku se škrobovým agarem. Stejně tak zaočkujeme kontrolní mikroorganismus (na další misku) a inkubujeme obě misky při 37 C 48 hodin. Po inkubaci polijeme povrch živné půdy Lugolovým roztokem a pozorujeme, zda došlo k hydrolýze škrobu. Pokud ano, kolem nátěru vzniknou nezbarvené zóny. Pokud k hydrolýze nedošlo, půda s nerozloženým škrobem se zbarví intenzivně modře. Výsledky je nutno odečítat hned, modré zbarvení po krátké době mizí. Pokud vznikne červené až hnědé zbarvení, znamená to, že škrob byl rozložen částečně (na dextriny).

55 PRŮKAZ ZKVAŠOVÁNÍ CUKRŮ Průkaz zkvašování cukrů - do zkumavek, které obsahují peptonovou vodu s 1%cukru /glukózu, sacharózu, laktózu, manitol, xylózu/ a bromthymolovou modř jako indikátor inokulujeme kolonii. V reakci se využívá změny ph při zkvašování cukrů. V pozitivním případě dochází k okyselení bujónu a tím k zežloutnutí. Tvorba plynu - testujeme vždy současně s testováním zkvašování cukrů. Používáme tzv. plynovku (malá zkumavka umístěná dnem vzhůru do zkumavky testující zkvašování glukózy). Pokud daný kmen produkuje plyn, hromadí se v plynovce jako bublinka.

56 B. TESTY ZALOŽENÉ NA PŘEMĚNÁCH DUSÍKATÝCH LÁTEK DŮKAZ UREASY (HYDROLÝZA MOČOVINY) Test je založen na principu toho, že močovina (urea) je některými mikroby využívána jako substrát enzymem ureasou, který tyto mikroby produkují. Urea je hydrolyzována na amoniak a oxid uhličitý. Rozkladem močoviny se zvýší ph živného média, což se projeví změnou barvy přidaného acidobazického indikátoru (nejčastěji fenolové červeně). Test se používá např. pro rozlišení rodu Proteus od některých jiných G- tyčinek.

57 DEKARBOXYLACE AMINOKYSELIN (TEST NA STANOVENÍ AKTIVITY DEKARBOXYLAS) Při dekarboxylaci aminokyselin působením enzymů některých bakterií dochází ke vzniku CO 2 a příslušného aminu, čímž se zvýší ph půdy. Enzym je specifický pro danou aminokyselinu a působí za anaerobních podmínek. Zvýšení ph se zjistí přídavkem vhodného indikátoru, např. bromkresolpurpuru. Na stanovení dekarboxylas aminokyselin byla vypracována řada metod. V současné době se nejčastěji používá metoda dle Möllera, která je univerzální metodou na stanovování dekarboxylas pro více aminokyselin (lysin, ornithin, arginin, kys. glutamová). K základnímu médiu stačí pouze přidat příslušnou aminokyselinu. Detekce dekarboxylas aminokyselin se obecně využívá k biochemické diagnostice zejména čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter).

58 DŮKAZ TVORBY INDOLU (TEST NA AKTIVITU TRYPTOPHANASY) Některé mikroorganismy rozkládají aminokyselinu tryptofan působením enzymu tryptophanasy za vzniku indolu. Vedlejšími produkty jsou kyselina pyrohroznová a amoniak. Důkaz tvorby indolu se provádí v živném médiu se zvýšeným obsahem tryptofanu (zdrojem aminokyseliny tryptofanu je pepton v kultivačním médiu) a za nepřítomnosti glukosy, neboť glukosa produkci indolu inhibuje. Indol se prokáže specifickou chemickou reakcí s některým z uvedených činidel. Důkaz tvorby indolu Kovaczovým činidlem (potvrzení Escherichia coli)

59 C. PROTEÁZY A PEPTIDÁZY Z těchto enzymů mají význam pro diagnostiku ty, které jsou vylučovány do prostředí. Na proteolytické vlastnosti izolované bakteriální kultury usuzujeme na základě degradace bílkovin (nejčastěji kaseinu, želatiny, elastinu) v diagnostické půdě. Plotnová metoda - podle FRAZIERa: médiem je masopeptonový agar s přídavkem 0.4% želatiny. Vyšetřované kmeny očkujeme izolačním způsobem a inkubujeme 3 dny při 37 C. Po inkubaci kulturu převrstvíme 5-10 ml 1,2% roztoku HgCl 2 a sledujeme její okraje. Želatinolýza se projeví projasněním média v okolí kultivační čáry.

60 Schopnost hydrolyzovat želatinu může být využita při diferenciaci mnoha druhů čeledi Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae Test s karbogel-disky: vyšetřovaný kmen očkujeme do MPB, do kterého přidáme několik karbogelových disků (želatinou spojený práškový uhlík). Želatinolýza se projeví uvolňováním uhlíku z disků do média. Tato modifikace je využívána i v komerčních testech např. API.

61 KOAGULÁZOVÝ TEST Suspektní kolonie se přeočkují do zkumavky s tekutým médiem, kterým je králičí plazma. Inkubace probíhá ve vodní lázni 4 až 6 hod při teplotě 37 C. test je pozitivní v případě, kdy se vytvoří velké gelové sraženiny. Pozitivní koagulázový test

62 D. OSTATNÍ BIOCHEMICKÉ TESTY PRODUKCE SULFANU (SIROVODÍKU) Stanovení produkce H 2 S z aminokyselin v tekuté půdě Některé bakterie uvolňují z aminokyselin obsahujících síru (methionin, cystein) sirovodík. Důkaz vzniklého H 2 S lze provést reakcí se solemi těžkých kovů (Fe, Pb, Bi), kdy vznikají tmavé sulfidy. Tvorba sirovodíku je charakteristická pro hnilobné bakterie jsou nežádoucí kontaminací zejména v potravinářském průmyslu.

63 TEST NA TVORBU KATALASY Některé bakterie tvoří enzym katalasu, který rozkládá peroxid vodíku na vodu a molekulární kyslík. Katalasu tvoří především aerobní bakterie (anaerobním bakteriím chybí). Na sterilní podložní sklíčko naneseme kapku 3% roztoku peroxidu vodíku, do které asepticky přeneseme očkovací kličkou testovanou kulturu bakterií. Totéž provedeme s kontrolním mikroorganismem. Přítomnost katalasy se projeví unikáním plynu (bublinky kyslíku).

64 DŮKAZ PRODUKCE HEMOLYSINŮ (HEMOLYTICKÁ ČINNOST BAKTERIÍ) Stanovení některých fyziologických vlastností (tvorba extracelulárních enzymů a hemolysinů) se úzce prolíná s kultivačními metodami. Ke zjištění hemolytické aktivity se používá krevního agaru. V okolí kolonie může dojít buď k úplné nebo neúplné hemolýze. Při neúplné hemolýze neboli viridaci dochází k částečnému rozrušení hemoglobinu na zelenohnědý pigment methemoglobin (nebo verdoglobin) a erytrocyty nejsou lyzovány. Při úplné hemolýze dojde k úplnému rozložení hemoglobinu i lýzi erytrocytů, takže kolem kolonie dojde k vytvoření průhledného dvorce. Tvorba hemolysinů je typická pro řadu patogenních bakterií, ale i některých nepatogenních (některé streptokoky, Staphylococcus aureus, hemolytické Escherichia coli, Pseudomonas, některé bacily apod.). Tvorbu hemolysinů a jejich interakce lze využít i při různých CAMP testech.

65 Krevní agar = základ většiny půd v klinické bakteriologii 5-10% defibrinované ovčí/koňské krve k ochlazenému agaru Identifikace bakterií podle hemolytické aktivity (rozkladu erytrocytů pod kolonií): α hemolýza (částečná) vzniká zelený verdoglobin (Streptococcus viridans) β-hemolýza kompletní rozklad červených krvinek v okolí kolonie (např. Streptococcus haemolyticus, S. pyogenes, Staphylococcus aureus) γ-hemolýza žádná hemolytická aktivita

66 IDENTIFIKACE BAKTERIÍ STANDARDIZOVANÝMI TESTOVACÍMI SYSTÉMY Obvykle se jedná o reprezentativní soubor biochemických reakcí, uspořádaný do minimalizovaných kultivačních objemů, dovolující i za těchto podmínek co nejdokonalejší určení mikroba K identifikaci bakterií do rodů je třeba mít k dispozici minimálně desítku biochemických reakcí, zahrnující jak reakce buněčných složek, tak výsledky biochemické činnosti bakteriální populace. Pro zařazení do druhů se počet potřebných znaků mnohonásobně zvyšuje. Získané údaje jsou ponejvíce porovnávány s kompendiem Bergey s Manual of Determinated Bacteriology. V této práci je v podstatě zařazen každý dokonale popsaný bakteriální druh se všemi znaky, které bylo do současné doby možno získat. Neustálé doplňování a zpřesňování Vždy je potřeba porovnat určenou bakterii s typovým druhem, uloženým v příslušné sbírce mikroorganismů. K serióznímu určení bakteriálního kmene je nutno testovat a vyhodnocovat výhradně čistou kulturu.

67 IDENTIFIKACE MIKROORGANISMŮ POMOCÍ DIAGNOSTICKÝCH TESTŮ MIKROTESTŮ Tyto diagnostické soupravy vyráběné centrálně jsou na rozdíl od klasických biochemických metod rychlejší a standardnější. Obvykle se jedná o reprezentativní soubor biochemických testů uspořádaných na plastových mikrodestičkách. V jamkách těchto destiček jsou dehydratovaná diagnostická média s příslušnými substráty. Očkuje se suspenzí z čistých kultur o předem dané hustotě. Po hodinové inkubaci, kdy dochází ke změnám ve zbarvení médií, se výsledky odečítají a vyhodnocují se buď převedením na příslušný kód, podle něhož se pak provede identifikace v identifikačním registru, nebo se výsledky vyhodnotí pomocí počítačových programů. Každá souprava obsahuje návod na použití, tabulky pro zapisování výsledků, pomocná činidla (parafinový olej a reagencie). Všechny tyto soupravy jsou určeny pro rychlou a poměrně spolehlivou identifikaci bakterií izolovaných z klinického materiálu, potravin, pitné i povrchové vody, půdy apod. V současné době se vyrábějí desítky diagnostických systémů a distribuuje je řada firem. Tyto systémy se neustále inovují a doplňují.

68 Miniaturizované a standardizované klasické testy (ukázka API testu k identifikaci příslušníků č. Enterobacteriaceae).

69 5. MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY Rychlá a spolehlivá identifikace mikroorganismů Velmi perspektivní, poskytují spolehlivé informace, vhodné pro zpracování velkého množství vzorků. Jsou nezávislé na kultivaci mikroorganismů Metody se uplatňují v situacích, kdy infekční agens roste pomalu, kultivuje se obtížně, případně se zatím pěstovat nedá - Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Legionella, Mycoplasma pneumoniae Zahrnuje studium DNA a RNA (nejčastější), potom také specifických proteinů 1. EXTRAKCE A IZOLACE NUKLEOVÝCH KYSELIN (přímá lyze buněk) 2. PURIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN (Odstranění buněčných struktur včetně cukerných složek a proteinů) 3. ŠTÍPÁNÍ DNA Zkrácení na menší fragmenty restrikce (použití restrikčních endonukleáz)

70 4. PCR- POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE Jednoduchá metoda zmnožení (amplifikace) DNA in vitro pomocí DNApolymerázy. Využívá opakovaných cyklů syntézy kousku DNA vymezeného dvěma primery Velice citlivá na detekci mikroorganismu Průběh: 1. Počáteční denaturace několik minut při teplotě 95 C 30 cyklu: 2. Denaturace 94 C 30 sek 3. Nasednutí primeru annealing 50 C 1 min 4. Syntéza DNA extenze primeru 72 C 1 min 5. Konečná extenze dokončení syntézy částečných produktů 72 C 10 minut Prakticky se PCR provádí v termocykleru PRIMERY - krátké úseky jednořetězcové DNA bází - unikátní sekvence = vážou se na oblast na začátku úseku DNA, který se má namnožit (komplementární) - mezi primery sekvence dlouhá bází, použití 2 primerů, nasedají v protisměrné orientaci

71 Taq polymeráza DNA polymeráza katalyzuje syntézu DNA z volných nukleotidů. Termostabilní polymeráza izolovaná z Thermus aquaticus, bakterie žijící v horkých pramenech přežije podmínky PCR.

72 TŘÍDĚNÍ MOLEKUL NUKLEOVÝCH KYSELIN, GELOVÁ ELEKTROFORÉZA Potřeba na rozlišení jednotlivých fragmentů Třídění je založeno na odlišnosti v jejich délce Gel molekulární prostorová síť agarózový, polyakrylamidový gel Elektroforéza pohyb v elektrickém poli od záporné ke kladné elektrodě Obarvení gelu fluorescenčním barvivem ethidium bromidem Pod UV transluminátorem molekuly DNA začnou v gelu zářit Přidání markerů molekulové hmotnosti známých molekul nukleových kyselin

73

74 6. IMUNOLOGICKÉ METODY K identifikaci bakterií je možno též použít imunologických metod, pokud vyrobíme specifické protilátky pro skupiny, druhy či serotypy mikrobů. Imunologická reakce se zviditelňuje srážením,ale nejlépe odštěpením nebo naopak navázáním fluorochromu, což je možno detekovat fluorescenčním mikroskopem. I kmeny téhož druhu mohou mít větší množství serotypů je možno použít na detekci druhů tzv. polyklonální protilátky, které účinkují na více kmenů a typů.

75 POTVRZENÍ LEGIONELLA PNEUMOPHILA Potvrzují se sérologicky tzv. Legionella Latex testem Sérotyp 1, sérotyp 2-15 Kápne se do připraveného místa kapka roztoku s protilátkou a přenese se tam kolonie Legionella sp. Když dojde ke vzniku sraženiny Legionella pneumophila daného sérotypu se potvrdila

76 ELISA - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY Analytická metoda využívaná ke stanovení různých antigenů. Metoda je založena na vysoce specifické interakci antigenu a protilátky, přičemž na jednoho z těchto partnerů je kovalentně navázán enzym (nejčastěji peroxidáza nebo alkalická fosfatáza). Tento enzym katalyzuje chemickou přeměnu substrátu, který je přidán do reakční směsi, na produkt, který je barevný (stanovuje se spektrofotometricky) nebo fluoreskující (fluorimetrické stanovení); Koncentrace produktu je úměrná koncentraci antigenu nebo protilátky ve vzorku. Dalším společným znakem metod ELISA je zakotvení (adsorpce nebo kovalentní navázání) antigenu nebo protilátky na nerozpustný nosič (často povrch reakční nádobky nebo mikrotitrační destičky), což usnadňuje separaci imunochemicky navázaných molekul.