LightCycler HSV 1/2 Qual Kit Uživatelská příručka

Transkript

1 LightCycler HSV 1/2 Qul Kit Uživtelská příručk Pro dignostiku In Vitro Tento výrobek využívá technologii Scorpion licencovnou společností DxS pro dignostické použití in vitro u člověk.

2

3 Obsh 3 (26) Obsh 1 Úvodní informce o LightCycler HSV 1/2 Qul Kit... 2 Poždvky n vzorky kontrolní mteriál Poždvky n vzorek Kontrol kvlity... 3 Potřebný mteriál Složení regenční souprvy Potřebný mteriál, který není součástí souprvy... 4 Upozornění bezpečnostní zásdy... 5 Prcovní postup... 6 Přístroj LightCycler Úvodní informce o přístroji LightCycler Příprv přístroje LightCycler Dříve než zčnete Spuštění nlýzy s LightCycler Anlýz dt v softwru LightCycler verze 4.05 nebo vyšší Dříve než zčnete Interpretce výsledků... 7 Chrkteristiky stnovení LightCycler HSV 1/2 Qul Kit... 8 HSV nemoc dignos... 9 Definice prmetrů rel-time PCR Odkzy... 25

4 4 (26) Obsh

5 1 Úvodní informce o LightCycler HSV 1/2 Qul Kit 5 (26) 1 Úvodní informce o LightCycler HSV 1/2 Qul Kit Co je LightCycler HSV 1/2 Qul Kit? LightCycler HSV 1/2 Qul Kit je test pro dignostiku in vitro, který využívá zesílení řetězové rekce polymerázy (PCR) nukleových kyselin pro detekci DNA viru Herpes Simplex (HSV-1 HSV-2) smosttně v lidských klinických vzorcích. Co je součástí této souprvy? LightCycler HSV 1/2 Qul Kit zhrnuje všechny potřebné regenty pro úplnou nlýzu HSV-1 HSV-2 od zesílení po nlýzu výsledků. Tto uživtelská příručk Tto uživtelská příručk popisuje postup mplifikce, detekce nlýzy. Reference: Informce o příprvě vzorku nleznete ve zvláštní příloze pro High Pure Virl Nucleic Acid Kit, která je dodáván s touto sdou. Popis postupu testu Tto tbulk popisuje různé fáze postupu testování. Fáze Příprv vzorku Příprv mplifikce Amplifikce/detekce nlýz výsledků Popis Klinické vzorky musí být připrveny pomocí sdy High Pure Virl Nucleic Acid Kit. Poznámk: Musí se použít uživtelská příručk "Zvláštní příloh pro High Pure Virl Nucleic Acid Kit" dodný pro tuto sdu. Amplifikce se provádí podle pokynů v této uživtelské příručce. Vzorky mohou být zesíleny, detekovány nlyzovány n přístroji LightCycler 2.0. Reference: Podrobný popis v části věnovné přístroji Light- Cycler 2.0. Určení souprvy LightCycler HSV 1/2 Qul Kit je určen pro sledování DNA viru HSV rozdílů mezi HSV-1 HSV-2 ve vzorcích lidské cerebrospinální tekutiny (CSF) nebo vezikulárního mteriálu (výtěry ve fyziologickém roztoku) z využití High Pure Virl Nucleic Acid Kit, přístroje LightCycler 2.0 této sdy v souldu s prcovním postupem. Je to test pro dignostiku in vitro, který využívá zesílení PCR nukleových kyselin pro detekci DNA viru HSV. Není určeno pro vyšetření krve. LightCycler HSV 1/2 Qul Kit není určen pro vyšetření krve nebo krevních produktů n přítomnost Virus Herpes simplex. Pro profesionální použití LightCycler HSV 1/2 Qul Kit je určen pouze pro použití odborně způsobilými nebo řádně vyškolenými prcovníky.

6 6 (26) 2 Poždvky n vzorky kontrolní mteriál 2 Poždvky n vzorky kontrolní mteriál 2.1 Poždvky n vzorek Poždvky n vzorek pcient LightCycler HSV 1/2 Qul Kit je určen pro použití se vzorky lidských vezikulárních výtěrů CSF. Doporučená médi pro výtěry Pro výtěry jsou doporučeny zkumvky jiná přenosová médi n bázi fyziologického roztoku. Interní kontrol při příprvě vzorku Interní kontrol je vždy zhrnut během příprvy vzorku. Reference: Zvláštní příloh pro uživtelskou příručku pro High Pure Virl Nucleic Acid Kit obsžený v této sdě LightCycler HSV 1/2 Qul Kit. Skldování eluentů Eluenty mohou být uchovávány při +2 ž +8 C ž tři dny před nlýzou nebo při -15 ž -25 C ž tři týdny před nlýzou. 2.2 Kontrol kvlity Interní kontrol u produktu Light- Cycler HSV 1/2 Qul Kit Interní kontrol je do klinických vzorků zveden během příprvy vzorku. Interní kontrol je mplifikován ve stejné rekční zkumvce jko vzorek. Pokud není nměřen žádný signál u interní kontroly žádný signál u klinického vzorku, musí být celý postup zopkován, by byly získány spolehlivé výsledky. Kontrol slepým vzorkem (NTC) Kontrol slepým vzorkem (NTC) je součástí postupu provádí se prlelně s klinickými vzorky. NTC je spojen s interní kontrolou zváděnou během příprvy vzorku. Rekce NTC musí vést k signálu pro interní kontrolu. Pokud je zjištěn signál pro cílovou látku, je celé stnovení nepltné musí být zopkováno s čerstvě připrvenými vzorky NTC. Poznámk: NTC musí být zřzen při kždé nlýze LightCycler HSV 1/2 Qul Kit. Pozitivní kontrol Pozitivní kontrol (PC) LightCycler HSV 1/2 se používá pro určení treshold u sledovného signálu kontrolu pltnosti nlýzy.

7 2 Poždvky n vzorky kontrolní mteriál 2.2 Kontrol kvlity Pozitivní kontrol 7 (26) Poznámk: LightCycler HSV PC musí být zřzen při kždé nlýze Light- Cycler HSV 1/2 Qul Kit. Selektivní mplifikce UDG Selektivní mplifikce (prevence vzájemné kontmince) cílové nukleové kyseliny z klinických vzorků se doshuje použitím urcil-dna-glykosylázy (UDG) přívodem deoxyuridin trifosfátu (dutp) místo deoxythymidin trifosfátu (dttp) v mster mixu [1]. UDG rozpoznává ktlyzuje destrukci DNA vláken obshující dutp, nikoli všk DNA s obshem dttp. To vede k potlčení schopnosti mplifikce kontminujících mplikonů náchylných k destrukci UDG před mplifikcí cílové DNA. V inkubčním kroku před termálním cyklem jsou DNA řetězce zlomeny n pozici dutp, čímž je zjištěno, že jsou všechny kontminující mplikony potlčeny nebudou zesíleny. Během denturčního kroku je UDG dektivován při vysoké teplotě, nemůže tedy zničit cílové mplikony. Volitelně: pozitivní virový mteriál Pro kontrolu celého procesu od příprvy vzorku po získání výsledku je možné použít virový mteriál HSV (kompletní viry). Pozitivní mteriál je možné zkoupit npříkld od společnosti Advnced Biotechnologies Inc (Mrylnd, USA).

8 8 (26) 3 Potřebný mteriál 3 Potřebný mteriál 3.1 Složení regenční souprvy Obsh uspořádání souprvy Sd obshuje regenty pro nlýzu mximálně 72 klinických vzorků. Součástí jsou všechny regenty pro zesilování detekci, včetně kontrolních látek. Optimální rozsh stnovení pro tuto sdu je 12 klinických vzorků nebo násobek 12. Sd může být proto použit ž n šest smosttných stnovení. Kždý regent je proto dodáván v šesti smosttných zkumvkách, které jsou rozděleny n tři kontrolní tři detekční sdy. Reference: 5 Prcovní postup Obsh produktu LightCycler HSV 1/2 Control Set (kontrolní sd) Tto tbulk uvádí obsh kždé sdy LightCycler HSV 1/2 Control Set (kontrolní sd) celkový počet zkumvek v kompletní souprvě LightCycler HSV 1/2 Qul Kit. Tble 3.1 Obsh produktu LightCycler HSV 1/2 Control Set (kontrolní sd) Položk Objem zkumvky Light- Cycler HSV1/2 PC Light- Cycler DNA NTC Light- Cycler DNA IC Popis HSV DNA frgment v pufrčním roztoku. Pufrční roztok neobshující sekvence HSV sp. Tlumicí roztok obshující neinfekční syntetickou DNA s IC sekvencemi. 10 µl 200 µl 78 µl Počet zkumvek/kontrolní sd Celkový počet zkumvek v souprvě Light- Cycler HSV 1/2 Qul Kit Obsh produktu LightCycler HSV 1/2 Detection Set (kontrolní sd) Tto tbulk uvádí obsh kždé sdy LightCycler HSV 1/2 Detection Set (kontrolní sd) celkový počet zkumvek v kompletní souprvě LightCycler HSV 1/2 Qul Kit.

9 3 Potřebný mteriál 3.1 Složení regenční souprvy Obsh produktu LightCycler HSV 1/2 Detection Set (kontrolní sd) 9 (26) Tble 3.2 Obsh produktu LightCycler HSV 1/2 Detection Set (kontrolní sd) Položk Popis Objem zkumvky Počet zkumvek/detekční sd Celkový počet zkumvek v souprvě Light- Cycler HSV 1/2 Qul Kit Light- Cycler HSV1/2 MMx Tlumicí roztok obshující nukleotidy, primery/sondu, UDG DNA polymerázu. 80 µl 2 6 Light- Cycler Mg 18 Směšovcí zkumvk Roztok obshující chlorid hořečntý, BSA, trihlozu Tween 20. Prázdná zkumvk pro příprvu prcovní mtice. Poznámk: Mohou se použít i jiné podobné zkumvky. 80 µl N/A Podmínky skldování Dodné regenty je možné před použitím skldovt při teplotě -15 ž -25 C. Alterntivně mohou být všechny regenty s výjimkou LightCycler HSV1/2 MMx LightCycler Mg 18 skldovány při teplotě +2 ž +8 C. Poznámk: LightCycler HSV1/2 MMx LightCycler Mg 18 se musí před použitím skldovt při teplotě -15 ž -25 C. 3.2 Potřebný mteriál, který není součástí souprvy Položky, které nejsou obsženy v této souprvě Následující položky nejsou součástí souprvy, le jsou nutné pro provedení nlýzy: High Pure Virl Nucleic Acid Kit. (kt. č ; Roche Dignostics GmbH, Mnnheim, Německo). Poznámk: Poždovné znčení CE musí pltit v celém postupu. Sd se musí používt společně se zvláštními přílohmi pro LightCycler HSV 1/2 Qul Kit. Přístroj LightCycler 2.0 (kt.. č ; Roche Dignostics GmbH, Mnnheim, Německo) s výrobním číslem vyšším se softwrem verze 4.05 (build 415) nebo vyšší.

10 10 (26) 3 Potřebný mteriál 3.2 Potřebný mteriál, který není součástí souprvy Položky, které nejsou obsženy v této souprvě Poznámk: Přístroje s nižším výrobním číslem by měly být nejprve schváleny pro použití s IVD se speciální ktulizcí. Kontktujte svou místní zákznickou podporu, potřebujete-li informce o postupu ktulizce. LightCycler HSV 1/2 Qul Kit Mcro CD-ROM verze 2.0 (kt. č ; Roche Dignostics GmbH, Mnnheim, Německo). LC Crousel Centrifuge 2.0 (kt. č ; Roche Dignostics GmbH, Mnnheim, Německo). Spotřební mteriál pro přístroj LightCycler 2.0 LightCycler Kpiláry (20 µl) (kt. č ; Roche Dignostics GmbH, Mnnheim, Německo). LW Color Compenstion Kit (kt. č ; Roche Dignostics GmbH, Mnnheim, Německo). LW Color Compenstion Kit Mcro CD-ROM (kt. č ; Roche Dignostics GmbH, Mnnheim, Německo). Mikropipety s erosolovou přepážkou, zlepenou špičkou nebo systémem ktivního vypuzování (200 nd 50 µl). Jednorázové ochrnné rukvice (bez pudru)

11 4 Upozornění bezpečnostní zásdy 11 (26) 4 Upozornění bezpečnostní zásdy Všeobecná lbortorní prxe Nepipetujte ústy. V lbortoři nejezte, nepijte nekuřte. Noste jednorázové rukvice, lbortorní plášť ochrnu očí, když zcházíte se vzorky regenty. Po skončení práce se vzorky regenty si důkldně umyjte ruce. Zcházení s mteriálem Nemíchejte regenty z různých šrží. Nepoužívejte sdu po dtu expirce. Nepoužívejte otevřené nebo poškozené lhvičky s regenty. Postup práce v lbortoři Postup práce v lbortoři musí být prováděn jednosměrným způsobem počínje v prostoru pro příprvu regentů přes prostor příprvy vzorků ž po prostor mplifikce detekce. Činnosti před mplifikcí musí být zhájeny příprvou regentů pokrčovt příprvou vzorků. Činnosti spojené s příprvou regentů vzorků musí být prováděny v smosttném, odděleném prostoru. Mteriál vybvení musí být vyhrzeny pro kždou činnost nesmí být použity pro jiné činnosti nebo přesouvány mezi prostory. Ve všech prostorách se musí používt rukvice, které musí být vyměněny před opuštěním tohoto prostoru. Vybvení mteriál použité pro příprvu regentů se nesmí používt pro činnosti spojené s příprvou vzorků nebo pro pipetování nebo zprcování mplifikce DNA nebo jiného zdroje DNA. Mteriál vybvení pro mplifikci detekci musí trvle zůstt v prostoru mplifikce detekce. Infekční vzorky kontminující mteriál Se vzorky by mělo být nkládáno jko s infekčním mteriálem, proto by se měly používt bezpečné lbortorní postupy, npř. postupy popsné v Biosfety in Microbiologicl nd Biomedicl Lbortories [3] v dokumentu NCCLS M29-T [2].

12 12 (26) 4 Upozornění bezpečnostní zásdy Infekční vzorky kontminující mteriál Důkldně vyčistěte vydesinfikujte všechny prcovní povrchy pomocí 10% bělicího prostředku. Veškeré vybvení nebo mteriál, které přišly do kontktu s klinickými vzorky, sterilizujte před vyhozením v utoklávu. Zbrňte mikrobiální kontminci regentů při odebírání likvotních podílů z lhviček s regenty. Doporučuje se používt sterilní jednorázové pipety pipetovcí špičky. Všechny nepoužité regenty odpd musí být zneškodněny v souldu s pltnými státními předpisy. Bezpečnostní zásdy pro používání přístroje LightCycler Dodržujte všechny obecné bezpečnostní zásdy, které pltí pro elektrické přístroje. Nikdy se nedotýkejte spínčů nebo npájecí šňůry vlhkým rukm. Neotvírejte kryt přístroje. Nikdy nečistěte přístroj, niž byste jej vypnuli hlvním spínčem odpojili npájecí šňůru ze zásuvky. Během provozu neotvírejte termální komoru. Víko komory krusel se vzorky jsou během prcovního cyklu přístroje horké. Poznámk: Údržbu oprvu tohoto přístroje by měli provádět pouze způsobilí servisní prcovníci. Elektrická bezpečnost přístroje LightCycler Přístroj LightCycler 2.0 je nvržen se stupněm ochrny I (IEC). Pokud je síťová šňůr poprskná, zkroucená, ohořelá nebo jink poškozená, musí být ihned vyměněn z ekvivlentní součást od Roche Dignostics. Všeobecné zásdy pro údržbu přístroje LightCycler Chcete-li se informovt o možnostech servisního kontrktu, kontktujte místní tým technické podpory společnosti Roche Dignostics. Reference: Uživtelská příručk pro přístroj LightCycler 2.0. Pokyny pro čištění přístroje LightCycler Nelijte kpliny do termální komory. Mnipulce likvidce infekčního mteriálu by měl být prováděn v souldu s místními bezpečnostními předpisy. Čistěte kryt přístroje šetrným běžným čisticím prostředkem. Pokud je to zpotřebí, použijte 70% ethnol pro desinfekci krytu přístroje.

13 4 Upozornění bezpečnostní zásdy Pokyny pro čištění přístroje LightCycler 13 (26) Vyčistěte LightCycler 2.0 Crousel tk, že odstrníte kpilární úlomky pomocí krtáčů dodávných s přístrojem. Preventivní údržb přístroje LightCycler Prvidelně kontrolujte prostor okolo přístroje. Proudění vzduchu okolo přístroje nesmí být omezeno. Poznámk: Knihy, ppíry ni dlší mteriál nesmí ovlivňovt proudění vzduchu.

14 14 (26) 5 Prcovní postup 5 Prcovní postup Vždy používejte neotevřené zkumvky Pro zbránění kontmince vždy používejte neotevřené zkumvky. Dodržujte popsný prcovní postup. Všechny regenty zbylé v otevřených zkumvkách musí být zneškodněny. Nejprve připrvte hlvní prcovní mster mix. Hlvní prcovní mstermix musí být připrven před příprvou vzorku, pokud je celý proces proveden v jeden den. Je to důležité pro minimlizci rizik kontmince. Pouze pokud jsou vzorky připrveny den před mplifikcí nebo ještě dříve, je přípustné opčné pořdí. Reference týkjící se příprvy vzorků: Příprv vzorků musí být prováděn podle zvláštní přílohy pro High Pure Virl Nucleic Acid Kit v tomto Light- Cycler HSV 1/2 Qul Kit. Reference: 4 Upozornění bezpečnostní zásdy Před použitím regenty rozmrzte Použijte vhodný počet zkumvek pro kždé stnovení. Bezprostředně před použitím musí být všechny regenty zcel rozmrzeny (přibližně 20 minut při pokojové teplotě) promíchány n vortexu. Poznámk: Spotřebujte do 30 minut po rozmrzení promíchání n vortexu. Jk připrvit hlvní prcovní mstermix. Při příprvě hlvního prcovního mstermixu postupujte podle bodů 1-3 níže: 1 Krátce odstřeďte zkumvky s LightCycler HSV1/2 MMx LightCycler Mg Odpipetujte LightCycler HSV1/2 MMx LightCycler Mg 18 do dodné směšovcí zkumvky podle tbulky níže. 3 Připrvte hlvní prcovní mtici promícháním n vortexu (5 sekund) následovným krátkým odstředěním. Poznámk: Promíchání n vortexu je kriticky důležité pro výsledek stnovení. Hlvní prcovní mtice je stbilní při teplotě +2 ž +8 C po dobu 2 hodin. V tbulce je uvedeno, kolik kždého regentu je zpotřebí pro různý počet klinických vzorků pro jeden přístroj LightCycler 2.0 včetně kontrolních látek. Tble 5.1 Jk připrvit hlvní prcovní mstermix pro různý počet klinických vzorků. Počet klinických vzorků Objem Light- Cycler HSV 1/2 MMx Počet potřebných zkumvek pro Light- Cycler HSV 1/2 MMx Objem Light- Cycler Mg 18 Počet potřebných zkumvek pro Light- Cycler Mg µl 1 80 µl 1

15 5 Prcovní postup Jk připrvit hlvní prcovní mstermix. 15 (26) Počet klinických vzorků Objem Light- Cycler HSV 1/2 MMx Počet potřebných zkumvek pro Light- Cycler HSV 1/2 MMx Objem Light- Cycler Mg 18 Počet potřebných zkumvek pro Light- Cycler Mg µl µl 2 Jk nstvit rekci PCR Přidejte 10 µl hlvní prcovní mtice do potřebného počtu zkumvek Kpiláry LightCycler (extrhovné vzorky kontrolní látky) umístěných v předem ochlzených dptérech odstředivky. Jk přidt vzorek k PCR rekci Do vyhrzené zkumvky Kpiláry LightCycler přidejte 10 µl extrhovného vzorku, LightCycler HSV1/2 PC nebo extrhovný LightCycler DNA NTC. Uzvřete kždou kpiláru zátkou okmžitě po přidání vzorku pomocí LC Cpping Tool (kt. č ). Důležité je: Buďte optrní při přidávání vzorků do Kpiláry LightCycler, byste předešli křížové kontminci mezi vzorky. Zbrňte vniknutí bublin vzduchu do Kpiláry LightCycler. Jk připrvit Light- Cycler Crousel. 1 Vložte kpiláry obshující LightCycler DNA NTC do pozice 1 kpiláry obshující LightCycler HSV 1/2 PC do pozice 2 v LightCycler Crousel. 2 Od pozice 3 v LightCycler Crousel umísťujte kpiláry obshující klinické vzorky. 3 Přeneste míchdélko včetně LightCycler Crousel do přístroje LC Crousel Centrifuge LC Crousel Centrifuge spustíte stiskem tlčítk Strt 5 Po odstředění přemístěte LightCycler Crousel do přístroje LightCycler 2.0

16 16 (26) 6 Přístroj LightCycler Přístroj LightCycler Úvodní informce o přístroji LightCycler 2.0 Tto kpitol Tto kpitol popisuje: Postupy potřebné pro provedení nlýzy LightCycler HSV 1/2 Qul Kit n přístroji LightCycler 2.0 od (Roche Dignostics). Anlýz interpretce výsledků pomocí softwru LightCycler verze 4.05 nebo vyšší. Verze softwru Všechny specifikce se vzthují k softwru LightCycler verze 4.05 nebo vyšší. Podrobné informce o progrmování Reference: Pro podrobné informce o progrmování viz návod k obsluze pro LightCycler 2.0 (verze softwru 4.05 nebo vyšší).

17 6 Přístroj LightCycler Úvodní informce o přístroji LightCycler (26) 6.2 Příprv přístroje LightCycler Dříve než zčnete Všechny kroky je nutné dodržet Všechny kroky je nutné dodržet, by bylo zjištěno správné provedení testu n přístroji LightCycler 2.0. Reference: 5. Prcovní tok Jk se přihlásit k Exor Dtbse (DB) Informce o přihlášení do tohoto softwru viz návod k obsluze přístroje Light- Cycler 2.0, verze softwru 4.05 nebo vyšší, pro dignostiku in vitro (část A). Poznámk: Je důležité se přihlásit k Exor Dtbse (DB) s uditovou zkouškou před spuštěním mkr. Poznámk: Pokud jste přihlášeni v režimu uditové zkoušky k Exor DB, je ve stvovém řádku softwru zobrzeno slovo Trceble. Musí být proveden kompenzce brev Při prvním spuštění LightCycler HSV 1/2 Qul Kit je nutné vytvořit brevný kompenzční objekt pomocí LW Color Compenstion Kit (kt. č ). Poznámk: Nový brevný kompenzční objekt vytvářejte kždých šest měsíců. Reference: Uživtelská příručk pro LW Color Compenstion Kit. Jk instlovt mkro Pro informce o instlci mkr viz návod k obsluze pro přístroj LightCycler 2.0, verze softwru 4.05 pro dignostiku in vitro (část A). Mkro obshuje specifické informce pro dnou souprvu. Proto je nutné instlovt správné mkro. Pouze v přípdě, že je ninstlován správná (odpovídjící) verze mkr, je systém připrven k vyhodnocení nlýzy. Během příprvy nlýzy je uživtel informován, pokud není ninstlován správná verze mkr. Poznámk: Je důležité, by bylo ninstlováno správné mkro LightCycler HSV 1/2 Qul Kit (kt. č ). Poznámk: Mkro obshuje všechn nstvení potřebná pro provedení nlýzy pomocí LightCycler HSV 1/2 Qul Kit. Mkro pro Light- Cycler HSV 1/2 Qul Kit neuprvujte Mkro pro LightCycler HSV 1/2 Qul Kit nesmí uživtelé měnit, s výjimkou změny počtu názvu vzorků. Pokud dojde ke změně mkr, zobrzí se ve zprávě následující řádk: User developed or modified test method. Poznámk: Pokud je mkro uprveno, je nlýz nepltná musí být zopkován.

18 18 (26) 6 Přístroj LightCycler Příprv přístroje LightCycler 2.0 Mkro pro LightCycler HSV 1/2 Qul Kit neuprvujte Reference: Uživtelská příručk pro přístroj LightCycler Spuštění nlýzy s LightCycler 2.0 Jk umístit Light- Cycler Crousel do přístroje Jk spustit mkro Vložte LightCycler Crousel včetně kpilár do přístroje LightCycler 2.0. Tto tbulk vysvětluje postup spuštění mkr. Tble 6.1 Jk spustit mkro. Krok 1 2 Činnost Spuťte mkro stisknutím tlčítk Roche Mcro n přední strně zdejte ktlogové číslo souprvy. Poznámk: Ktlogové číslo může být zdáno buď ručně (viz npříkld první strn této uživtelské příručky), nebo nčtením čárového kódu. Vyberte správné mkro klepnutím n nejnovější verzi v poli Select Mcro. Poznámk: Spustí se průvodce, který vám pomůže se spuštěním mkr. Jk definovt kontrolní vzorky v mkru. Poznámk: Pozice kontrolních položek (PC NTC) je v mkru již definován. Názvy pozice nesmí být měněny. Jk definovt klinické vzorky v mkru. Tto tbulk popisuje postup definování klinických vzorků v mkru. Tble 6.2 Jk definovt klinické vzorky v mkru. Krok Činnost Zdejte počet vzorků kontrolních položek v části smple count. Zdejte názvy vzorků n obrzovce Cpillry view. Zdejte číslo šrže souprvy do pole n obrzovce Cpillry view ručně nebo pomocí čárového kódu. Jk spustit nlýzu Anlýzu spustíte klepnutím n tlčítko Strt run v průvodci.

19 6 Přístroj LightCycler (26) 6.3 Anlýz dt v softwru LightCycler verze 4.05 nebo vyšší Dříve než zčnete Úvod k této části V této části je popsáno, jk se generují výsledky pomocí mkr LightCycler HSV 1/2 Qul Kit jk tyto výsledky interpretovt. Všechny kroky je nutné dodržet Všechny kroky je nutné dodržet, by byl zjištěn správná interpretce výsledků Interpretce výsledků Jk vytvořit výslednou zprávu Výsledná zpráv je vytvářen utomticky mkrem LightCycler HSV 1/2 Qul Kit po skončení kždé nlýzy: Jk zkontrolovt pltnost nlýzy Chcete-li zkontrolovt pltnost nlýzy, viz část Results ve zprávě vytvořené mkrem LightCycler HSV 1/2 Qul Kit. V této tbulce je vysvětleno, jk zkontrolovt pltnost nlýzy. Tble 6.3 Jk zkontrolovt pltnost nlýzy Vzorek LightCycler DNA NTC LightCycler HSV 1/2 PC Kritérium Sloupec Cp pro 530: prázdný nebo > 45 Sloupec Cp pro 560: prázdný nebo > 45 Sloupec Cp pro 610: <40 Sloupec Cp pro 530: Sloupec Cp pro 560: Sloupec Cp pro 610: nelze použít Činnost LightCycler DNA NTC je pltný. Žádná činnost není zpotřebí Poznámk: Pokud nejsou některá z těchto kritérií splněn, Light- Cycler DNA NTC je nepltný nlýz musí být zopkován od příprvy po zesílení. LightCycler HSV1/2 PC je pltný. Žádná činnost není zpotřebí Poznámk: Pokud nejsou některá z těchto kritérií splněn, Light- Cycler HSV 1/2 PC je nepltný nlýz musí být zopkován od fáze zesílení. Jk njít výsledky Výsledky detekce pro HSV v kždém klinickém vzorku lze nlézt v části Results sloupec (Cp) zprávy vytvořené mkrem LightCycler HSV 1/2 Qul Kit. Jk interpretovt výsledky Tto tbulk vysvětluje postup interpretce výsledků.

20 20 (26) 6 Přístroj LightCycler Anlýz dt v softwru LightCycler verze 4.05 nebo vyšší. Jk interpretovt výsledky Tble 6.4 Jk interpretovt výsledky Pokud Sloupec Cp pro 530: <45 Sloupec Cp pro 560: prázdný nebo > 45 Sloupec Cp pro 610: nelze použít Sloupec Cp pro 530: prázdný nebo > 45 Sloupec Cp pro 560: <45 Sloupec Cp pro 610: nelze použít Sloupec Cp pro 530: <45 Sloupec Cp pro 560: <45 Sloupec Cp pro 610: nelze použít Sloupec Cp pro 530: prázdný nebo > 45 Sloupec Cp pro 560: prázdný nebo > 45 Sloupec Cp pro 610: <45 Potom Ve vzorku byl detekován HSV-1 Ve vzorku byl detekován HSV-2 Ve vzorku byly detekovány ob viry HSV-1 i HSV-2 Ve vzorku nebyl detekován HSV. Poznámk: Pro odlišné výsledky viz část: "Jk interpretovt odchylné výsledky". Jk interpretovt odchylné výsledky Tto tbulk vysvětluje, jk interpretovt odchylné výsledky ve zprávě vytvořené mkrem LightCycler HSV 1/2 Qul Kit. Tble 6.5 Jk interpretovt odchylné výsledky Pokud Sloupec Cp pro 530: prázdný nebo > 45 Sloupec Cp pro 560: prázdný nebo > 45 Sloupec Cp pro 610: prázdný nebo > 45 Potom Klinický vzorek neobshující DNA pro HSV nebo interní kontrol. Činnost Výsledek klinického vzorku je nepltný. Opkujte příprvu vzorku zopkujte nlýzu vzorku.

21 7 Chrkteristiky stnovení LightCycler HSV 1/2 Qul Kit 21 (26) 7 Chrkteristiky stnovení LightCycler HSV 1/2 Qul Kit Příprv vzorku přístroje pro studie chrkteristik stnovení Pro všechny studie výkonnostních chrkteristik popsné níže byl použit High Pure Virl Nucleic Acid Kit Studie byly prováděny n přístroji LightCycler 2.0 (Roche Dignostics). Mez detekce (LOD) Mez detekce (LOD) je definován jko titrční úroveň, při které je pozitivně určeno 95 % všech vzorků obshujících HSV. LOD ve fyziologickém roztoku LOD ve fyziologickém roztoku byl určen nlýzou zředěných roztoků HSV- 1 kmene McIntyre HSV-2 kmene MS. Vzorek byl pětinásobně zředěn ve fyziologickém roztoku. Kždý zředěný roztok byl připrven 24krát pomocí souprvy High Pure Virl Nucleic Acid Kit. Pro výpočet koncentrce LOD byl použit nlýz Probit. LOD byl určen ve 200 μl fyziologického roztoku n hodnotu 392 kopií/ml (95% intervl spolehlivosti: kopií/ml) pro HSV-1. LOD byl určen ve 200 μl fyziologického roztoku n hodnotu 431 kopií/ml (95% intervl spolehlivosti: kopií/ml) pro HSV-2. LOD v CSF LOD v CSF byl určen nlýzou zředěných roztoků HSV-1 kmene McIntyre HSV-2 kmene MS. Vzorek byl pětinásobně zředěn v roztoku s chováním vlstnostmi připomínjícími lidskou CSF. Kždý zředěný roztok byl připrven 24krát pomocí souprvy High Pure Virl Nucleic Acid Kit. Pro výpočet koncentrce LOD byl použit nlýz Probit. LOD byl určen ve 200 μl CSF n hodnotu 79 kopií/ml (95% intervl spolehlivosti: kopií/ml) pro HSV-1. LOD byl určen ve 200 μl CSF n hodnotu 84 kopií/ml (95% intervl spolehlivosti: kopií/ml) pro HSV-2. Anlytická specificit Křížová rektivit: Křížová rektivit pro LightCycler HSV 1/2 Qul Kit byl posouzen smosttnou nlýzou vzorků HSV-1 HSV-2. Při nlýze 100 vzorků HSV-1 vedlo všech 100 vzorků k signálu HSV-1. Žádný vzorek neposkytl signál pro HSV-2. Při nlýze 100 vzorků HSV-2 vedlo všech 100 vzorků k signálu HSV-2. Žádný z těchto vzorků neposkytl signál pro HSV-1. Mezi těmito dvěm viry nebyl zjištěn žádná křížová rektivit. Inkluzivit: Sekvenční srovnání všech sekvencí GenBnk prokázlo, že veškeré zveřejněné vrinty HSV-1 HSV-2 by měly být touto sdou detekovány.

22 22 (26) 7 Chrkteristiky stnovení LightCycler HSV 1/2 Qul Kit Anlytická specificit Exkluzivit: Ekluzivit pro LightCycler HSV 1/2 Qul Kit byl posouzen nlýzou in vitro relevntních ptogenů. Nebyl zjištěn křížová rektivit pro: HHV-6; HHV-7; HHV-8; VZV; HPV16; Adenovirus typ 2; CMV; HBV; EBV; E.coli; S. ureus; S. epidermidis Aspergillus niger. Klinická specificit Klinická specificit pro LightCycler HSV 1/2 Qul Kit byl určen nlýzou 40 různých vzorků výtěru. Žádný vzorek nebyl pozitivní n HSV. Klinická specificit testu byl tedy 100 %. Robustnost Robustnost byl určen posouzením celkové míry selhání produktu LightCycler HSV 1/2 Qul Kit. Vzorky byly zředěny ve fyziologickém roztoku n obsh HSV-1 HSV-2 rovný 1000 kopií/ml (přibližně trojnásobek LOD koncentrce ve fyziologickém roztoku) nlyzovány se třemi šržemi produktu Light- Cycler HSV 1/2 Qul Kit. U 100 vzorků ze 100 byl výsledek pozitivní pro HSV-1 nebo HSV-2 DNA i pro interní kontrolu. To znmená, že robustnost pro LightCycler HSV 1/2 Qul Kit je > 99 %.

23 8 HSV nemoc dignos 23 (26) 8 HSV nemoc dignos Viry Herpes Simplex Ob viry Herpes Simplex - typ 1 2 (HSV-1 HSV-2) - ptří do podskupiny α-herpesvirine. Zejmén infekce HSV-1 jsou běžné mohou být klinicky nevýznmné nebo mohou být příčinou symptomů od mírného triviálního po závžné onemocnění. Přibližně 90 % dospělé populce v Evropě se v životě setká s infekcí virem HSV-1 nebo 2. Jk tento virus ovlivňuje hostitele Po primární infekci zůstává virus ltentní v nervových buňkách dorsálního gnglionu. Během celého život infikovného pcient se může virus v určitých intervlech rektivovt buď nenápdně odeznít, nebo se projevit jsnými symptomy. Infekce viry HSV jsou velmi čsté závžné u pcientů vystvených cytotoxické terpii, npříkld po trnsplntci orgánů nebo kostní dřeně, u pcientů s AIDS. U těchto skupin pcientů je obvykle zznmenáno vážné místní onemocnění (npříkld CNS) nebo rozptýlená infekce, které mohou být životu nebezpečné. Obvykle volenými léky jsou cyclovir vlcyclovir. Prokázly se být účinné při léčbě infekce HSV u pcientů po trnsplntci kostní dřeně ledvin i u pcientů infikovných HIV. Acyclovir se běžně používá jko profylktická léčb u pcientů po trnsplntci orgánového štěpu. Klinický problém zde všk předstvuje zvyšující se rezistence k cycloviru. Dignos pro HSV Hodnocení HSV pomocí zesílené PCR (polymerázové řetězové rekce) biologických vzorků (npříkld vezikulární výtěr) je spolehlivé citlivé. Je to skvělý nástroj pro pcienty s rozvinutou nebo hrozící ktivní infekcí HSV [4]. Nvíc může být Herpes zoster (pásový opr) spojen s HSV, tkže jsou pro správnou dignózu zpotřebí vhodné lbortorní testy [4].

24 24 (26) 9 Definice prmetrů rel-time PCR 9 Definice prmetrů rel-time PCR Rel-time PCR Rel-time PCR umožňuje uživteli sledovt mplifikci v kždém cyklu. To je umožněno pomocí fluorescenčně oznčené sondy specifické pro cílový subjekt. Rel-time PCR zručuje přesnou nlýzu cílového subjektu měřením kumulovné fluorescence v logritmické fázi mplifikce nukleové kyseliny. Příkld stnovení reltime PCR Následující obrázek uvádí příkld stnovení rel-time PCR. Obrázek 9.1 Příkld stnovení rel-time PCR

25 25 (26) Odkzy [1] Longo, M.C., Berninger, M.S. nd Hrtley, J.L Use of urcil DNA glycosylse to control crry-over contmintion in polymerse chin rections. Gene. 93(1): [2] Ntionl Committee for Clinicl Lbortory Stndrds. Protection of lbortory workers from infectious disese trnsmitted by blood, body fluids nd tissue. Tenttive Guideline. NCCLS Document M29-T Villnov, PA:NCCLS, [3] Biosfety in Microbiologicl nd Biomedicl Lbortories Richmond, J.Y. nd McKinney, R.W. (eds.). HHS Publiction Number (CDC) [4] Strick, L. B., A. Wld Dignostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold stndrd? Mol Dign Ther. 10:17-28

26 26 (26) Poznámk pro kupujícího Zkoupením tohoto produktu získává kupující právo použít jej pro zesílení sekvence nukleové kyseliny pro detekci sekvence nukleové kyseliny pro in vitro dignostiku u člověk. Žádné ptentové nebo licenční právo jkéhokoli typu jiné než specifikovné právo použití není zkoupením udělováno. Obchodní známky ROCHE, LIGHTCYCLER HIGH PURE jsou ochrnné známky společnosti Roche. Informce o výrobci Cepheid AB Röntgenvägen 5 SE Soln ŠVÉDSKO Distribuce: Roche Dignostics GmbH Roche Moleculr Dignostics Mnnheim NĚMECKO Kontktní informce Kontktujte prosím své místní zstoupení Roche