- Kontrolní proužek sloužící k vyhodnocení: 1 testovací proužek s pozitivním kontrolním sérem

Transkript

1 Protilátky proti /-gg (IgG) Návod n provedení WESTERNBLOTU Objedncí číslo Protilátky proti Tříd Ig Substrát Formát DY G / IgG celk.ag 16 x 01 (16) DY G glykoprotein G2 gg2 24 x 01 (30) Indikce: Infekce herpes simplex virem Princip testu: WESTERNBLOT souprv umožňuje kvlittivní in- vitro určení lidských protilátek proti virům Herpes simplex 1 proti glykoproteinu G-2 viru typu Herpes - simplex-2. Testovcí souprv obshuje proužky membrány s elektroforeticky rozdělenými extrkty ntigenů Herpes-simplex 1 virů finitní chromtogrfií čištěný glykoprotein G-2. Blotovné pružky se zblokují v prvním rekčním kroku se inkubují se zředěným sérem získným od pcient. V přípdě ch vzorků se specifické protilátky třídy IgG ( IgA, IgM) nvážou n ntigen. K detekování nvázných protilátek slouží druhý inkubční krok, který se provádí pomocí enzymem znčených nti-lidských IgG (enzymový konjugát), který potom zjistí vývin brevné rekce. Obsh souprvy: - Testovcí proužky s elektroforeticky rozdělenými kompletními ntigeny finitní chromtogrfií čištěný glykoprotein G-2; 16 testovcích proužků. - Kontrolní proužek sloužící k vyhodnocení: 1 testovcí proužek s m kontrolním sérem - Koncentrát konjugátu s lklickou fosftázou kozích nti-lidských IgG: 1 x 3 ml 10 x koncentrovného činidl, což poskytne 30 ml konjugátu nředěného pro použití - Koncentrát pufru: 1 x 50 ml 10 x koncentrovného pufru, což poskytne 500 ml univerzálního pufru Plus nředěného pro použití - roztok substrátu: 1 x 30 ml, připrven k okmžitému užití, nitrotetrzoliumchlorid/5- bromo-4chloro-3-indolylfosfát (NBT/BCIP) - Vyhodnocovcí protokol: 1 ppír - Inkubční misk: 2 x 8 žlábků - Plstová folie - Návod k použití Skldování: Souprvu uchovávejte při teplotách od +2 C do + 8 C.

2 Poznámk pro použití: Používejte pouze komponenty testu pocházející ze šrže se stejným číslem. Vrování: Kontrolní sérum použité pro inkubci kontrolního proužku bylo testováno n výskyt Hbs-Ag, nti-hiv-1 nti-hiv-2 pomocí metod enzymoimunologických testů imunofluorescence. Avšk přesto se vším užívným mteriálem se musí zcházet optrně, jko s potenciálně nebezpečným infekčním. Některé z regencií jsou jedovté (pufr, roztok substrátu). Vyhněte se kontktu s pokožkou, v přípdě potřísnění omyjte postižené místo mýdlem velkým množstvím vody. Příprv regencií: Pozor: Všechny regencie se musí před upotřebením necht vytemperovt n teplotu místnosti. - Potžené testovcí proužky: Příprvené k použití. Jkmile byly proužky vytemperovány n teplotu místnosti, nenstne po otevření blení riziko kondenzce, můžete blení otevřít. Po vyjmutí proužků, které chcete upotřebit, opět blení pečlivě uzvřete skldujte při doporučené teplotě od +2 C do + 8 C. - Univerzální pufr Plus: Pufr je dodávný jko 10 x koncentrovný roztok. Pro použití se nejprve musí lhvičk s koncentrátem (50 ml) řádně promícht třepáním. Poté se odebere čistou pipetou množství pufru, které budete používt nředí se destilovnou nebo deionizovnou vodou 1 : 10. N jeden použitý proužek odeberte 2 ml koncentrovného pufru nřeďte ho 18 ml destilovné či deionoizovné vody. Nředěný pufr je stbilní při teplotě od +2 C do + 8 C mximálně po dobu dvou dnů. - Enxzymový konjugát: Koncentrát nti-lidských IgG je desetkrát koncentrovný, pro příprvu konjugátu k užití odeberte čistou pipetou z lhvičky poždovné množství konjugátu nřeďte ho 1 : 10 univerzálním pufrem Plus. K provedení testu n jednom proužku budete potřebovt 0,15 ml koncentrátu nti-lidských IgG s 1,35 ml univerzálního pufru Plus. - Substrátový roztok: Připrvený k použití. Lhvičku ihned po odebrání likvotu uzvřete, obsh je citlivý n světlo. Příprv vzorků: Vzorky sér pro nlýzu nřeďte 1:51 univerzálním pufrem Plus ( 30 µl sér se přidá k 1,5 ml univerzálního pufru dobře promíchá).

3 Inkubce Blokování: Nplňte žlábky inkubční misky podle počtu vzorků sér, které mjí být testovány, univerzálním pufrem Plus, do kždého žlábku dejte 1 ml pufru. Vyjměte určený počet proužků z blení umístěte je po jednom do žlábků. Zviditelní se číslo n proužku. Proužky ve žlábcích inkubujte 15 minut při pokojové teplotě n třepčce. Poté odsjte ze žlábků všechnu kplinu. Inkubce sér- 1.krok: Nplňte kždý žlábek v inkubční misce 1,5 ml zředěného testovného sér inkubujte při pokojové teplotě 30 minut n třepčce. Promývání: Odsjte opět všechnu kplinu z kždého žlábku promyjte kždý žlábek 1,5 ml univerzálního pufru Plus 3 x 5 minut s použitím třepčky. Inkubce konjugátu 2.krok: Pipetujte 1,5 ml nředěného konjugátu (konjugát lklické fosftázy s nti lidským IgG) do kždého žlábku. Inkubujte 30 minut při pokojové teplotě n třepčce. Promývání: Odsjte opět všechnu kplinu z kždého žlábku promyjte kždý žlábek 1,5 ml univerzálního pufru Plus 3 x 5 minut s použitím třepčky. Inkubce substrátu: Pipetujte 1,5 ml roztoku substrátu do kždého žlábku inkubční misky. Inkubujte po dobu 10 minut při pokojové teplotě n třepčce. Zstvení rekce: Odsjte opět všechnu kplinu z kždého žlábku promyjte kždý žlábek 3 x deionizovnou nebo destilovnou vodou.

4 ANTI-/ GLYKOPROTEIN G-2 WESTERNBLOT Protokol inkubcí Před zčátkem testu: Vložte blotovné proužky do žlábků inkubční misky obshujících 1,5 ml univerzálního pufru Plus 15 minut třepání 1. Inkubce vzorku : Odsjte obsh, do kždého inkubčního žlábku npipetujte 1,5 ml ředěného vzorku sér (1 :1) Promývání: 3 x 5 min 2.Inkubce s konjugátem: Odsjte obsh, do inkubčních žlábků npipetujte po 1,5 ml ředěného konjugátu (1 :10) 30 minut třepání Promývání: 3 x 5 min 3.Inkubce se substrátem: Odsjte obsh, do inkubčních žlábků npipetujte po1,5 ml roztoku substrátu 10 minut třepání Zstvení: : Odsjte obsh, promyjte vodou Vizuálně vyhodnoťte

5 Vyhodnocení interpretce testů ANTI-/ GLYKOPROTEIN G-2 WESTERNBLOT (IgG) Mnipulce: Položte inkubovné pružky n filtrční ppír, překryjte je svým ppírem jemným poklepáváním vysušte. Pomocí průhledné lepící pásky připevněte proužky n plstový film, který je součástí vyhodnocovcího protokolu. Přiložte vyhodnocovcí mtrici k blotovným proužkům umístěte ji tk, že černá čár nd čísly blotů tvoří přímku s čárou n vyhodnocovcí mtrici, která slouží k porovnání. Číslo šrže n vyhodnocovcí mtrici musí být shodné s číslem šrže testu, ze kterého byly použité proužky. K vyhodnocení slouží pouze jsně ptrné proužky n blotech, které odpovídjí znčkám n vyhodnocovcí mtrici. N proužcích je pod číslem kontrolní proužek. Inkubce proběhl správně, jestliže je viditelná brevná rekce n kontrolním proužku. Antigeny: Zdroj ntigenů pro EUROIMMUN Anti-/ glykoprotein G-2 WESTERNBLOT je tvořen kompletními ntigeny finitní chromtogrfií čištěným glykoproteinem G-2 (1-2). Kultivovné Herpes simplex viry byly rozděleny podle molekulové hmotnosti pomocí diskontinuální polykrylmidové gelové elektroforézy seprovné proteiny byly přeneseny n nitrocelulózovou membránu. Potom byl n membránu nnesen slbá linie purifikovného glykoproteinu G-2. Z kždé testovcí souprvy byly vyjmuty 2 kontrolní testovcí proužky byly inkubovány s referenčním sérem. Jeden z těchto obrvených kontrolních proužků je součástí souprvy, druhý zůstává v EUROIMMUN pro účely dokumentce. Specifit ntigenů n testovcích proužcích Proužek Molekulová hmotnost Antigen Specifit gc kd glykoprotein C-1 (gc-1) Vysoce specifické pro Herpes simplex virus -1 gb kd glykoprotein B-1 (gb-1) Specifické pro Herpes simplex virus gd-1 60 kd glykoprotein D-1 (gd-1) Specifické pro Herpes simplex virus gd-2 glykoprotein G-2 (gg-2) Vysoce specifické pro Herpes simplex virus -2 IgG tříd protilátek proti Herpes simplex viru K vyhodnocení získných signálů slouží jednk umístění proužků, jednk jejich brevná intenzit. Viz inkubovný kontrolní proužek n vyhodnocovcí mtrici. Interpretce výsledků pro IgG protilátky: N zákldě zkušenosti s výsledky souprvy ANTI-/ GLYKOPROTEIN G-2 WESTERNBLOT (IgG) lze detekovt infekci Herpes simplex virem. Proužek odpovídjící ntigenu gg-2 slouží k odlišení protilátek proti /nebo ( gg je ve vyhodnocovcím protokolu vystínován šedě).

6 Výsledky Chrkteristik Nejsou k rozeznání žádné proužky odpovídjící ntigenům, nebo jen proužky, které ntigenům neodpovídjí gc-1 lespoň jeden dlší ntigen proužek; gg-2 gg-2 již žádné dlší proužky gc-1 lespoň jeden dlší ntigen proužek; gg-2 IgM tříd protilátek proti Herpes simplex viru Interpretce výsledků s IgM protilátkou: Pro detekci IgM protilátek se používá stejný prcovní postup, jko pro IgG protilátky, jen je v souprvě použit jiný enzymový konjugát (nti-lidské IgM protilátk znčená lklickou fosftázou). Výsledky Chrkteristik Nejsou k rozeznání žádné proužky odpovídjící ntigenům, nebo jen proužky, které ntigenům neodpovídjí gc-1 ; gg-2 gc-1 ; gg-2 gc-1 gg-2 Klinický význm: Herpes simplex způsobuje onemocnění, které vyvolává vznik puchýřů n kůži sliznicích. Je celosvětově rozšířen normálně onemocnění probíhá mírně. Komplikce mohou nstt, dojde-li k zsžení i vnitřních orgánů, ve kterých může dojít k nekrotizujícím zánětům.

7 Herpes simplex-1 viry preferují oblsti úst nosu, herpes simplex 2 viry genitálie. Velmi čsté je opkování onemocnění. Protilátky proti mohou být detekovány v séru skoro všech pcientů, u nichž se projevilo onemocnění. Více než polovin dospělých byl infikován. Avšk protilátky nejsou schopny zbránit opkování onemocnění, či reinfekci. Literární odkzy: 1. Kuhn, J., Biber, M., Doerr, H.W., Brun, R.: Dignostik der Herpes-Simplex-Virus (HSV)-Infection. Artz.Lb (32).1986: Rbenu, H., Eibner, J., Weber, B., Bhrdt, B., Doerr, H.W.: Detection of Herpes simplex virus (HSV) type specific ntibodies by microtechnique Western blot ssy. Lb.med. 16, 1992: Simmonds, P., Smith, I.W., Peutherer, J.F.: Detection of ntibody to virl proteins following primry infection with Herpes simplex virus. J.Med.Virol : Ashley, R., Benedetti, J., Corey, L.: Humorl immune response to nd virl proteins in ptients with primry genitl herpes. J. Med. Virol 17,1985: