Biofyzikální chemie interakce bílkovin s ligandy, koloidy v biochemii, rovnováha na membránách. Zita Purkrtová březen duben 2012

Transkript

1 Biofyzikální chemie interakce bílkovin s ligandy, koloidy v biochemii, rovnováha na membránách Zita Purkrtová březen duben 2012

2 Interakce bílkovin s ligandy vratné interakce množství ligandu vázaného na bílkovinu závisí na jeho koncentraci v roztoku ligand látka vázající se na molekulu bílkoviny (susbtrát, efektor, přenášené látky, ion, mastná kyselina atd.) otázka specifity uplatňuje se celá škála nekovalentních interakcí dle povahy ligandu (ion, polární x nepolární organická látka) kombinace různých typů nekovalentních interakcí Základní otázky: KOLIK? JAK PEVNĚ? KDE? PROČ?

3 Interakce bílkovin s ligandy Biopolymer má jedno vazebné místo P+ L PL A [ LP ] 1 [ L ][ P ] K D K Rozsah vazby (r) počet molů vázaných ligandů na jeden mol bílkoviny r [ LP ] [ LP ] C [ P ] + [ LP ] p 1 + K A K [ L ] [ L ] A

4 Interakce bílkovin s ligandy P+ L PL Biopolymer má jedno vazebné místo r [ LP ] [ LP ] C [ P ] + [ LP ] p + 1 K A K [ L ] [ L ] A r r [L] [L]

5 Scatchardův výnos P+ L PL r r L 1 [ ] K A + K K A [ L ] [ L ] A K A r r/[l] r

6 Interakce bílkovin s ligandy Biopolymer má n vazebných míst pro daný ligand P+ L PL 1 PL1 + L PL2 PL n 1 + L PL n

7 Interakce bílkovin s ligandy Biopolymer má n vazebných míst pro daný ligand, která jsou rovnocenná a nezávislá vnitřní asociační konstanta k A Rozsah vazby průměrný počet ligandů vázaný na jednu molekulu bílkoviny r moly vázaného ligandu moly proteinu Stupeň asociace frakce vazebných míst obsazených ligandem β [ L] moly vázaného L C L vazebná místa v systému nc frakce obsazených míst frakce vol ných míst 1 β β P k A [ L] Rovnice vazebné isothermy nk A [ L ] r 1 + k [ L ] A r n r n 1 r n k A [ L]

8 Rovnocenná a nezávislá vazebná místa r nk 1 + k A [ L ] [ L ] A Scatchardův výnos r/[l] r [ L] n. k A - k A. r r

9 Vzájemně kooperující vazebná místa α 1 α 0,5 α 1,5 Scatchardův výnos r Hillova konstanta nk 1+ k α [ ] α L [ L] α α 1 α n α<1... negativní kooperativa α > 1...positivní kooperativa α n... dokonale kooperativní systém Current Protocolc in Protein Science. DOI: / psa05as16

10 Vzájemně kooperující vazebná místa Current Protocolc in Protein Science. DOI: / psa05as16

11 Lajtha, A:Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology. New York, USA, Několik typů vazebných míst vzájemně nezávislá vazebná centra n [ ] i k i L r 1 + k [ L ] i i Scatchardův výnos

12 Nespecifická vazba Lajtha, A:Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology. New York, USA, 2007.

13 Experimentální určení r nk 1 + A k [ L] [ L] A r [ L] n. k A - k A. r jakkákoliv experimentálně dostupná změna ve struktuře proteinu po vazbě ligandu metody citlivé na změnu relativní molekulové hmotnosti polarisace fluorescence elektroforetické metody ultracentrifugační metody metody využívající rozptyl světla metody dialysačních rovnováh Kodíček, M.; Karpenko, V.: Biofysikální chemie, Academia, 2000.

14 Metoda dialysační rovnováhy systém s polopropustnou membránou propouštějící jen nízkomolekulární látku, jejíž vazba na makromolekulu je zkoumána systém obsahující: A) pouze nízkomolekulární B) nízkomolekulární a vysokomolekulární látku látku vzájemná vazba

15 Metoda dialysační rovnováhy F B F B

16 Stechiometrická titrace pro určení stechiometrie vazby (počtu vazebných míst) pro systémy s vysokou afinitou vazby (nízká disociační konstanta) Current Protocolc in Protein Science. DOI: / psa05as16

17 Disperzní soustavy Homogenní Atomy, malé molekuly koloidní systémy kouř Heterogenní systémy (makroskopické fáze) makromolekuly homogenní koloidy mikroskopické heterogenní 0, m nm micely viry pyl, bakterie

18 Disperzní soustavy Soustava, která obsahuje alespoň dva druhy hmoty, přičemž jeden druh je rozptýlen ve druhém ve formě více nebo méně jemných částic. Rozptýlený druh se nazývá disperzní podíl, spojitý druh disperzní prostředí. Pod pojmem druh hmoty se rozumí složka nebo fáze. Disperzní podíl může i nemusí představovat samostatnou fázi a svým chemickým složením se může, ale nemusí vždy lišit od disperzního prostředí. Podle toho mluvíme o disperzní fázi nebo disperzní složce. (Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005) Analytické disperze (pravé roztoky) < 1 nm Koloidní disperze (1000) nm Hrubé disperze > 500 (1000) nm homogenní systémy, tvoří jedinou fázi roztoky solí, kyselin a zásad Mikroheterogenní systémy (plazma, roztoky makromolekulárních látek) Heterogenní systémy (krev, mléko)

19 Disperzní soustavy Disperzní podíl Plyn Kapalina Pevná látka Disperzní prostředí Plyn - kapalný aerosol pevný aerosol (všechny plyny (mlha, vlasový sprej) (kouř, prach) zcela mísitelné) Kapalina pěna emulze sol (pěna na holení) (mléko, majonéza) (krev) Pevná látka pevná pěna gel pevný sol (aerogel, polystyrenová pěna) (agar, želatina)

20 Koloidní disperze průměr disperzních částic 10-9 < d < 10-6 m viditelné v ultramikroskopu nebo elektronovém mikroskopu vykazují Tyndallův efekt a rozptyl světla procházejí filtračním papírem ale ne některými mebránami vykonávají tepelný pohyb roztok suspenze vykazují pomalou difuzi a sedimentaci vyvolávají malý osmotický tlak (roste se stupněm disperzity) koloidy disperzní částice jsou Roztoky makromolekul Heterogenní koloidy Asociativní koloidy monomolekulární polymolekulární polymolekulární vznikají samovolným rozpouštěním z hrubých disperzí umělým dispergováním nebo z pravých roztoků srážením homogenní heterogenní nestálé koagulují, sedimentují, stárnou vznikají asociací z pravých roztoků amfifilních molekul stabilní v určitém rozmezí podmínek

21 Srovnání disperzních systémů Hrubé disperze Koloidní disperze Analytické disperze Průchod membránou neprojdou semipermeabilními + oddělitelnost papírové filtry membránové filtry - Pozorovatelnost částic oko, viditelná mikroskopie elektronová mikroskopie Sedimentace + ultracentrifugace Tepelný pohyb malý střední vysoký Koligativní vlastnosti malé velké Difuze pomalá rychlá Optické vlastnosti často opalescence opalescence (Tyndallův efekt) průhledné

22 Koloidní systémy lyofilní x lyofobní koloidy

23 Optické vlastnosti koloidů Tyndallův efekt využití rozptylu světla Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005

24 Optické vlastnosti koloidů využití rozptylu světla dynamic laser scattering

25 Lidmila Bartovská: Co je co v povrchové a koloidní chemii, VŠCHT, Praha, 2005 Brownův pohyb ε k m u k B 2 T u větších částic (efektivního průměru kolem 4 μm) již tepelný pohyb není pozorovatelný

26 Asociace disperzních soustav vzájemné interakce dispergace agregace koalescence koagulace vliv gravitace sedimentace krémování

27 Difuze Fickův zákon j g R. T D D0e Δc D Δx

28 Koligativní vlastnosti vlastnosti rozpouštědla, které závisí pouze na množství částic rozpuštěné látky a ne na charakteru těchto částic Raoultův zákon (snížení tenze nasycených par rozpouštědla nad roztokem snížení teploty tuhnutí rozpouštědla a zvýšení teploty varu ve srovnání s čistým rozpouštědlem) osmotický tlak čistá voda látka neprocházející membránou píst van t Hoffova rovnice π c2 RT w M 2 2 RT polopropustná membrána

29 Osmotický tlak koloidních soustav zředěné ideální koloidní systémy π w2 v2 k B T M 2 RT neideální roztoky w π RT ( + Bw M ) osmotický tlak klesá s rostoucí velikostí částic ( vliv agregace) měření osmotického tlaku se využívá ke stanovení molární hmotnosti vysokomolekulárních látek tvořících pravé roztoky

30 Polopropustné membrány polopropustnost (semipermeabilita) membrány je dána vlastnostmi membrány a jejich monomerů

31 Rovnováha na polopropustné membráně ~ 0 μi μi + RT ln ai + z elektrochemický potenciál i Fϕ Δϕ membránový potenciál rozdíl elektrochemických potenciálů pro danou částici je roven rozdílu Gibbsovy energie částice při přechodu přes membránu

32 Membrána je propustná pouze pro jeden typ iontů Na + Cl - 1 ~ 0 μna μna + RT ln ana + z Na 2 Fϕ μ 0 0 Na + RT ln ana 1 + znafϕ1 μna + RT ln ana2 + ϕ RT 2 ϕ1 ΔϕM ln znaf c c Na1 Na2 z Na Fϕ 2

33 Membrána je propustná pro nízkomolekulární látky ale ne pro nabité makromolekuly Na + Cl - Donnanova rovnováha biopolymer Δϕ Δϕ M M RT F RT F ln ln c c c c Na1 Na2 Cl 2 Cl1 RT F ln c c Na Na2 1 RT ln F c Na1 c Cl1 c c Cl 2 Cl1 c c ( c + x). x ( x x)(. x x) Na, protein Na2 Cl 2 0 0

34 Membrána je propustná pouze pro molekuly rozpouštědla glukosa π RT Osmolarita i množství osmoticky aktivních částic v 1 dm 3-1 M glukosa je 1 Osm - 1 M NaCl je 2 Osm - 1 M AlCl 3 je 4 Osm isotonický roztok pro krevní buňky 310 mosm (tj. 310 mm roztok glukosy či 155 mm NaCl) c i

35 Osmotický tlak a buňka hypertonické prostředí isotonické prostředí hypotonické prostředí hypotonické prostředí hypertonické prostředí

36 Fyziologické využití osmotického tlaku sval, šlachy chrupavka kost

37 Fyziologické využití osmotického tlaku membrána polopropustná pouze pro NaCl

38 Děkuji za pozornost.